Desenvolvimento de um Modelo-capeamento pulpar direto para a Avaliação dos pulpar cicatrização de feridas e Formação reparadora dentina em Ratos

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Summary

Descreve-se um método passo-a-passo de realização de polpa directo capping em ratos dentes para a avaliação da cicatrização de feridas e formação de dentina pulpar reparadora in vivo.

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Song, M., Kim, S., Kim, T., Park, S., Shin, K. H., Kang, M., Park, N. H., Kim, R. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. J. Vis. Exp. (119), e54973, doi:10.3791/54973 (2017).

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Abstract

Protocol

Os ratos foram adquiridos de Jackson Laboratory e mantidos em um viveiro livre de patógenos na Divisão UCLA de Medicina Laboratorial Animal (DLAM). Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais aprovados pela Comissão de Pesquisa com Animais da chanceler (ARC # 2016-037).

1. Rato anesthetization

  1. Use feminino camundongos C57 / BL6 de oito semanas de idade (n = 3).
  2. Anestesiar os ratos usando cetamina (80-120 mg / kg de peso de rato) / xilazina soluções (5 mg / kg de peso de rato) e administrar por via intraperitoneal (ip) a uma dose de 10 ml / kg.
  3. Preparar cetamina (80-120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluções e administrá-los por via intraperitoneal (ip) a uma dose de 10 ml / kg.
  4. Confirmar que os ratos são anestesiados completamente através da realização de um aperto do dedo do pé.

2. Procedimento-capeamento pulpar

  1. Coloque o suporte da boca na boca do mouse.
  2. Fixar o suporte da boca sobre a mesa de tal modo que a eleanúncio é voltado para cima.
  3. Coloque o microscópio (10X) em cima da boca de modo que o primeiro molar superior é totalmente visível.
  4. Usando a ¼-round broca em uma caneta de alta rotação em 200.000 rpm, remover a parte do esmalte do dente no meio até que a polpa é visível através da dentina transparente. Não expor a polpa com a broca.
  5. Usando um K-lima endodôntica # 15 (diâmetro de 150 mm), perfuram a dentina e expor a polpa.
    NOTA: Cuidados especiais devem ser tomados para que os detritos dentina não se empurrado para dentro da polpa. Isto pode ser evitado através da rotação do ficheiro-K trimestral e, em seguida, puxando o K-arquivo para fora.
  6. Misture MTA com H 2 O esterilizada de acordo com as instruções do fabricante. Entregar e colocar o MTA sobre a polpa exposta com a ponta do explorador. Use o lado de trás do papel ponto (fino) para embalar o MTA na polpa exposta, agitando ligeiramente. O lado mais grosso do ponto de trabalho é plana e, portanto, permitepara a condensação apropriada do MTA na polpa exposta.
  7. Etch o dente por 15 s, colocando o etchant ácido fosfórico 35% em que apenas cobre o dente. Tome especial cuidado para limitar a colocação do produto corrosivo, uma vez que pode irritar os tecidos gengivais.
    NOTA: O produto corrosivo vem em uma seringa e é usado para irritar as superfícies dos dentes de modo que os adesivos dentários podem fluir em para mediar a ligação de micromecânica para o dente. Porque eles são viscoso, que pode ser auto-suficiente pela aplicação de pequenas quantidades directamente no dente.
  8. Use sucção negativa pressionados para remover o produto corrosivo. Utilize uma bolinha de algodão que é levemente embebido com H 2 O para remover os resíduos do decapante. Repetir esta etapa até que o agente condicionador é completamente removido do dente.
  9. Usando um espanador de ar comprimido, secar suavemente o dente.
  10. Aplicar os adesivos dentárias utilizando a parte de trás do ponto de papel.
  11. Faça a camada adesiva fina com ar comprimido por 3 s.
  12. Cure os adesivos dentais durante 20 s utilizando a unidade de cura luz.
  13. Colocar o composta fluida em pequenas quantidades para o dente que foi tampado com MTA. Use a ponta do explorador a fluir o compósito nas ranhuras de dentes.
  14. Curar o composto por 30 s utilizando um aparelho fotopolimerizador para polimerizar-lo. Confirmar que o composto está totalmente curado e dura usando o explorador.

3. Post-op Cuidados

  1. Administrar carprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea (SC), imediatamente após o processo de nivelamento de celulose.
  2. Coloque os ratos sobre uma almofada de aquecimento em baixa potência para manter os animais quente antes de acordar.
  3. Devolver os ratos para o biotério para a habitação.

Procurement 4. Tissue

  1. Depois de 5 - 6 semanas, sacrificar os ratinhos por deslocamento cervical, sob uma condição de anestesia completa com isoflurano.
  2. Remova cuidadosamente a maxila para fora da base do crânio e colocá-lo em um tubo de 50 ml. Fixar o entire maxila que contém tanto o dente cobertas de celulose e o dente destapado contralateral em 4% de paraformaldeído em PBS, pH 7,4, a 4 ° C durante a noite, e em seguida armazená-lo em uma solução de etanol a 70%.
    NOTA: O paraformaldeído é tóxico e cancerígeno. O uso paraformaldeído adequada devem ser monitorados, conforme descrito nos procedimentos operacionais padrão (SOP).
  3. Digitalizar o maxillae mouse usando a digitalização μCT. Para garantir a maxila durante a digitalização, enrole as amostras com gaze embebida com 70% de etanol e colocá-los no tubo de cultura de células de 15 mL.

5. μCT Scanning

  1. Preparar as amostras para digitalização μCT. Resumidamente, enrole as amostras com gaze embebida com 70% de etanol e fixá-los em um tubo cônico de cultura de células genérico de 15 mL. Montar o tubo sobre a plataforma de varrimento μCT, conforme descrito nas instruções do fabricante.
  2. Definir a fonte de raios-X para uma corrente de 145 mA, uma tensão de 55 kVp, e um tempo de exposição de 200 ms.
  3. Realizar a aquisição de imagens com o scanner μCT com uma resolução de 20 um e com um filtro de Al de 0,5 mm.
  4. Reconstruir a imagem e visualizá-lo 11.
  5. Uma vez que o varrimento está completo μCT, iniciar a descalcificação com EDTA a 5% e 4% de sacarose em PBS (pH 7,4) durante 2 semanas.

6. Processamento de tecido e da coloração

  1. Incorporar os tecidos descalcificados em parafina. Antes de embutir, a guarnição da maxila, fazendo um corte sagital imediatamente anterior ao primeiro molar. Enquanto a incorporação, a posição desta superfície para baixo, de tal modo que a secção longitudinal do primeiro molar é a superfície de corte.
  2. Usando o micrótomo, preparar 5 slides mm de espessura. As áreas de capeamento polpa geralmente coincidem com a raiz distopalatal (DP), o qual pode ser utilizado como um ponto de referência. Determinar a área exacta de interesse examinando a histologia sob o microscópio de luz e comparar as imagens μCT.
  3. Para H & E coloração, Deparaffinize e hidratar as lâminas com xileno (2 x) e etanol diluídos em série (100% de EtOH 2x, EtOH a 95% 2x e 70% de EtOH 1x).
  4. Lavar as lâminas com água corrente da torneira.
  5. Mancha com uma solução de hematoxilina de 2,5 minutos e enxaguar com água da torneira.
  6. Mergulhar as lâminas em etanol a 95% durante 1 min.
  7. Mancha com uma solução Eosina durante 1 minuto e enxágüe com água da torneira.
  8. Desidratar com etanol diluído em série (EtOH a 70% 1x, 95% 2x de EtOH, e 100% de EtOH 3x) e xileno (3x).
  9. Montar as lâminas com solução de montagem.

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Representative Results

Aqui, nós mostramos os procedimentos passo-a-passo para realizar pulpar direta em ratos dentes. Um dos aspectos-chave de proteção pulpar direta em ratos é ter o aparelho apropriado. A este respeito, tendo o microscópio com uma ampliação de 10X de energia é essencial (Figura 1A). Para criar uma preparação Class-I-like no dente, usamos uma rebarba de ¼ de volta em uma alta rotação elétrica em 200.000 rpm (Figura 1B). Em alternativa, quaisquer outros motores, incluindo os que utilizam ar comprimido, pode ser utilizado para preparar um dente.

Na Figura 2A-2E, passos representativos para a realização de capeamento pulpar são mostrados. A preparação de classe-I como foi realizado (Figura 2B). Porque um spray de água pode afogar os ratos durante o procedimento, seu uso não é recomendado. Por esta razão, é essencial para a preparação do dente com suave e intermittent cursos para evitar o superaquecimento. A utilização de ar comprimido, também é recomendado para proporcionar efeitos de arrefecimento. Enquanto expondo a polpa com uma lima endodôntica, tome cuidado para não empurrar os detritos dentina na polpa, pois isso pode interferir com a interpretação dos dados na formação da dentina reparadora (Figura 2C). Isto pode ser evitado pelo uso de ar comprimido. Da mesma forma, o MTA deve ser colocado sobre a polpa exposta sem empurrar demasiado para dentro da polpa. Colocação MTA pode ser conseguido através da utilização da parte traseira da ponta de papel com movimentos agitando ligeiramente (Figura 2D). Após a colocação do MTA, o dente deve ser limpo com H 2 O-pelotas de algodão embebido para remover qualquer remanescente MTA nas ranhuras, o que pode interferir com a ligação do composto para o dente. Os métodos convencionais de restauração de compósito são usadas, inclusive gravando as superfícies dos dentes, priming e colagem com adesivos, e colocando e curar as compósito de baixa viscosidade (Figura 2E).

Seis semanas depois capeamento polpa, os ratinhos foram colhidos, e a vista de topo foi fotografado para confirmar que o composto estava ainda intacta (Figura 3A). μCT varrimento mostrou recessão significativa de espaço pulpar no grupo cobertas de celulose (Figura 3B), sugerindo que a dentina reparativa foi formado na polpa. As amostras de tecidos foram descalcificados submetidos a coloração com H & E para examinar histologicamente ainda mais a formação de dentina reparativa in vivo. No grupo de controlo, as camadas odontoblásticos (OB) foram proeminentemente evidentes em torno das bordas da dentina (Figura 4A - 4C). Em contraste, o grupo-capeamento polpa tinha quantidades significativas de dentina reparadora (RD) formado no espaço pulpar (Figura 4D - 4F). Curiosamente, um exame mais detalhado revelou que a dentina reparativa (RD) exibiu uma característica típica da dentina (por exemplo, s linhas triated representando túbulos dentinários, seta vermelha), bem como do osso (por exemplo, osteócitos representam osteoblastos presos, setas pretas). Quando coradas para a dentina Matrix Protein 1 (DMP1), um marcador para a diferenciação odontogénica 12, verificou-se um aumento significativo na expressão DMP1 na polpa do dente cobertas de polpa quando comparada com a do dente destapado (Figura 5A e 5B) , indicando que a dentina reparativa foi formada dentro da pasta de papel.

figura 1
Figura 1: A configuração de equipamento para o procedimento Pulp-nivelamento. (A) Um microscópio (10X) para a visualização do dente de rato. (B) A peça manual de alta velocidade e o mecanismo de motor eléctrico para a preparação de uma preparação de Classe I para expor a polpa.= "_ Blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Passos representante no procedimento de capeamento. (A) dente Unprepared no primeiro molar superior em um mouse. (B) a remoção do esmalte inicial usando o bur quartas-de-round. (C) a exposição da polpa usando a lima endodôntica. (D) MTA colocação na polpa exposta. (E) a colocação de restauração Composite sobre o dente. A barra representa 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: apresentação clínica e μCT Scanning do Dente Pulp-tampado e destampado em camundongos. (A) Vista oclusal da maxila do mouse sobre o dente cobertas de celulose (esquerda) e dente sem tampa (direita). (B) As imagens μCT transversais das maxilas. A barra representa 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: evidência histológica de Formação reparadora dentina in vivo. (AC) H & E coloração do primeiro molar superior não nivelada em um mouse no 100X, 200X e 400X. (DE) H & E coloração do primeiro molar superior cobertas de celulose em um rato em 100X, 200X e 400X. A barra representa 100 mm (OB = odontoblástica camadas; RD = dentina reparadora; pontas de seta preto =osteócitos; seta vermelha = túbulos dentinários). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Coloração imuno-histoquímica de DMP1. Coloração (A) DMP1 do primeiro molar superior não nivelada em um mouse no 400X. (B) coloração DMP1 do primeiro molar superior cobertas de celulose em um rato em 400X. A barra representa 100 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Atualmente, existem vários modelos experimentais disponíveis para validar os efeitos in vivo de materiais dentários, andaimes, ou fatores de crescimento sobre a diferenciação odontogênico de células-tronco da polpa dentária (DPSC) 13. Estes modelos incluem o transplante autólogo de ectópica DPSC em um órgão, tal como a cápsula renal, ou a transplantação subcutânea de DPSC em ratinhos imunocomprometidos com andaimes 14,15. No entanto, estes métodos estão limitados no que o seu efeito sobre odontogénica DPSC não é realizado no ambiente de polpa ortotópico. Por outro lado, o transplante ortotópico em procedimentos de celulose ou polpa-capping em um dente são utilizados em animais maiores 16,17. Embora estes modelos são úteis para avaliar o potencial odontogénica ortotópico no ambiente, a utilização desses modelos é em grande parte de observação na natureza, fornecendo informações mecanicistas limitados sobre a cicatrização de feridas e formação de polpa de dentina reparadora. Neste artigo, apresentamos um método detalhado para executar celulose de nivelamento em camundongos. Este procedimento passo-a-passo inclui a anestesia dos ratinhos, preparando a cavidade Classe-I semelhante, colocando os materiais de capeamento polpa, a colheita da maxila, com a análise μCT digitalizar, e avaliar as amostras de tecido para formação de dentina reparadora. O nosso modelo de rato-capeamento pulpar será fundamental para investigar os mecanismos moleculares fundamentais da cicatrização pulpar in vivo no contexto da dentina reparadora, permitindo a utilização de ratinhos transgénicos ou knockout, que são amplamente disponíveis na comunidade de pesquisa.

Estudos recentes demonstraram vários modelos de ratos nos quais a formação de dentina foi observada 18,19. Saito et al. criou uma preparação Class-I-like, sem exposição pulpar, que estimula, não reparador, formação de dentina reacionária. Ambos dentina reacional e da dentina reparativa são classificadas como dentina terciária, Que forma a seguir à estimulação externa ao dente. No entanto, ao contrário de dentina reacional, que é formado por odontoblastos existentes, dentina reparativa é formada por células de odontoblastos-like, como DPSC, quando a polpa fica exposta e as camadas são violados odontoblásticos 20. Portanto, não representa um processo de nivelamento de celulose efectiva na prática clínica. Em outro estudo, ionômero de vidro foi usado para tampar a exposição pulpar 19. No entanto, um estudo clínico demonstrou que o ionômero de vidro induzida inflamação crónica, mas não reparador dentina 21. A este respeito, o nosso modelo de ratinho-capeamento polpa melhor representa o procedimento de capeamento polpa real em pacientes.

É digno de nota que, quando colhemos camundongos depois de mais de 6 semanas, a formação de dentina reparadora ocorreu ao longo da câmara pulpar e os canais radiculares (Figura 4). Tal observação é bastante inesperado, como prevíamos formação de dentina reparadora na junhocção entre o material de capeamento-celulose e a polpa. No entanto, potente mineralização da polpa também é observada em ambientes clínicos, especialmente em pacientes relativamente jovens 22. Porque os ratos 8 semanas de idade utilizados neste estudo são considerados "adultos jovens" 23, a possibilidade existe pelo qual esses ratos ainda abrigam potencial odontogênico significativo. Portanto, seria útil analisar os efeitos do envelhecimento da formação da dentina reparadora em camundongos.

Os nossos exames histológicos revelaram que, apesar de dentina reparativa foi claramente formada no dente cobertas de polpa, existiam características de ambos formação da dentina e osso, como evidenciado pela presença de túbulos dentinários (seta vermelha) e osteócitos (pontas de setas pretas) no reparativa dentina (Figura 5). Tais observações sugerem que a formação da dentina reparativa pode ser induzida por residem no local células estaminais da polpa dentária de odontoblastos-semelhantes, bem como infiltrating células-tronco mesenquimais do osso circundante.

Em comparação com as células formadoras de dentina, não foram encontradas células de reabsorção de dentina dentro da pasta de papel, tal como determinado por fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) de coloração (dados não mostrados). Na verdade, a inflamação pulpar ou periapical induz a formação de osteoclastos nas superfícies ósseas ao redor do dente, mas não sobre as superfícies de dentina devido a como ainda desconhecidos os mecanismos 24. É de notar, houve uma clara demarcação entre a dentina existente e da dentina reparativa recém-formado (Figura 4). Um estudo anterior demonstrou um fenômeno similar; quando um dente é extraído na presença de bisfosfonato ou anticorpo anti-RANKL, ambos os quais inibem as funções de osteoclastos, não eram claras demarcações entre o osso lamelar existente e formação de novo osso tecido 25. Esta noção é igualmente favorável a ausência de células de reabsorção de dentina na polpa. Colectivamente, o nosso modelo de rato estabelecida faria provide oportunidades únicas para examinar os mecanismos de cicatrização de feridas celulose e formação de dentina reparadora in vivo.

Há uma limitação ao modelo do rato-capeamento pulpar. maquiagens genéticas entre humanos e camundongos são claramente diferentes. O genoma completo foi sequenciado em humanos e ratinhos, e há cerca de 85% de semelhança nas regiões que codificam proteínas, entre murganhos e seres humanos 26,27. Em linha com esta noção, foi sugerido que as descobertas relacionadas com a proteção pulpar direta em animais não refletem necessariamente aqueles em humanos 28. No entanto, os modelos animais são usados extensivamente na comunidade de pesquisa de recapitular doenças humanas in vivo, tais como artrite induzida por colágeno para a artrite reumatóide 29, a perda óssea induzida por ovariactomy para a osteoporose 30, lipopolissacarídeo administração (LPS) para o choque sistêmico 31, e ligadura colocação para periodontite 32. Como tal, o mou-capeamento pulparmodelo se será necessário estudar os mecanismos moleculares da cicatrização pulpar e formação de dentina reparadora in vivo. No entanto, assim como outros modelos animais, interpretação e validação dos resultados do modelo de rato-capeamento pulpar deve ser cuidadosamente avaliada.

Em resumo, o presente estudo demonstra polpa sucesso capping em ratinhos. Ao contrário de outros modelos conhecidos, este modelo de rato-capeamento pulpar irá fornecer uma ferramenta de pesquisa de valor inestimável no campo da regeneração de celulose e formação de dentina reparadora, pois fornece: 1) uma oportunidade de utilizar linhagens de camundongos geneticamente modificados amplamente disponíveis para elucidar os mecanismos subjacentes ao nível molecular e 2) uma forma economicamente eficiente para obter resultados estatisticamente significativos, aumentando o tamanho das amostras. Mais estudos aguardam, incluindo quantificação objetiva da formação de dentina reparadora in vivo, efeitos dependentes da idade de formação de dentina reparadora, avação de materiais de capeamento pulpar clinicamente disponíveis, e validação dos determinantes moleculares que são necessários para pulpar cicatrização de feridas adequada e regeneração da dentina reparadora.

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Acknowledgments

Este estudo foi apoiado por R01DE023348 (RHK) a partir NIDCR / NIH ea Research Grant Faculdade (RHK) do Conselho de Investigação do Senado Académico da Divisão de Los Angeles, da Universidade da Califórnia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BM-LED stereo microscope MEIJI Techno Microscope 
Optima MCX-LED  Bien Air Dental 1700588-001 Electic motor engine
isoflurane Henry schein animal health NDC 11695-0500-2
1/4 round bur Brasseler 001092T0
Endodontic K-file Roydent 98947
ProRoot MTA Dentsply PROROOT5W MTA
Paper point Henry schein 100-3941
Ultra-Etch Ultradent product Inc. Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlus Kerr 29669 Adhesives
Coltolux LED Coltene/whaledent Inc. C7970100115 Curing light unit
Characterization tint Bisco T-14012 Flowable composite
Skyscan Breuker 1275 uCT scanner
Microm Thermo HM355S Microtome
Hematoxyline-1 Thermo Scientific 7221
Eosin-Y Thermo Scientific 7111
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-16 Mounting solution

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References

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