असुरक्षित चूहे में एक मजबूत निमोनिया मॉडल के खिलाफ जीवाणुरोधी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए

Immunology and Infection
 

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Hoover, J. L., Lewandowski, T. F., Mininger, C. L., Singley, C. M., Sucoloski, S., Rittenhouse, S. A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii. J. Vis. Exp. (119), e55068, doi:10.3791/55068 (2017).

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Abstract

उम्मीदवार जीवाणुरोधी उपचार की प्रभावकारिता, खोज और विकास की प्रक्रिया के हिस्से के रूप में संक्रमण के पशु मॉडल में प्रदर्शन किया जाना चाहिए अधिमानतः मॉडल जो इरादा नैदानिक ​​संकेत नकल में। असुरक्षित चूहों और चूहों में मजबूत फेफड़ों में संक्रमण उत्प्रेरण के लिए एक विधि का वर्णन किया जो एस निमोनिया, एच इन्फ्लुएंजा, पी aeruginosa, लालकृष्ण निमोनिया या ए baumannii की वजह से गंभीर निमोनिया के एक मॉडल में उपचार के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। पशु anesthetized हैं, और एक आगर-आधारित inoculum nonsurgical intratracheal इंटुबैषेण के माध्यम से फेफड़ों में गहरी जमा है। जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण, लगातार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और कम से कम 48 घंटे के लिए स्थिर और सबसे वियोजन के लिए 96 घंटे तक है। विपणन antibacterials के साथ अध्ययन में विवो प्रभावकारिता के बीच और इन विट्रो संवेदनशीलता में अच्छे संबंध का प्रदर्शन किया है, और फ़ार्माकोकायनेटिक / pharmacodynamic लक्ष्यों के बीच सामंजस्य चुना गयाइस मॉडल और नैदानिक ​​स्वीकार कर लिया लक्ष्यों में देखा गया है। हालांकि वहाँ एक प्रारंभिक समय के निवेश जब तकनीक सीख रहा है, इसे जल्दी से और कुशलता से किया जा सकता है एक बार प्रवीणता हासिल की है। मॉडल के लाभ न्यूट्रोपेनिया आवश्यकता के उन्मूलन, वृद्धि की मजबूती और reproducibility, और अधिक रोगज़नक़ों और आइसोलेट्स, एक असुरक्षित मेजबानी में अध्ययन डिजाइन और एक चुनौतीपूर्ण संक्रमण की स्थापना में सुधार लचीलापन का अध्ययन करने की क्षमता शामिल है।

Introduction

संक्रमण के पशु मॉडल में संभावित दवा उम्मीदवारों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन जीवाणुरोधी दवाओं की खोज की प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक है। विवो में प्रभावकारिता के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण डेटा उपलब्ध कराने के निर्णय लेने की खोज के प्रयासों के अंतराल के पार, संरचना गतिविधि रिश्तों elucidating से (एसएआर) और निर्धारित फ़ार्माकोकायनेटिक-pharmacodynamic (पी / पीडी) के माध्यम से नेतृत्व रासायनिक श्रृंखला के अनुकूलन यौगिकों की विशेषताओं और के लिए खुराक चयन समर्थन नैदानिक ​​विकास और नियामक की मंजूरी। कई पशु संक्रमण मॉडल इन उद्देश्यों के लिए साहित्य में वर्णित हैं। सबसे आम है और व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडलों में से एक न्यूट्रोपेनिया माउस जांघ संक्रमण है, जो ईगल 1, 2 ने बीड़ा उठाया गया था और बाद में Vogelman और क्रेग 3, 4 से विस्तार किया है। यह मॉडल बैक्टीरियल संवेदनशीलता ब्रेकप्वाइंट का दृढ़ संकल्प के समर्थन के लिए और पी / पीडी लक्ष्यों को उपलब्ध कराने के लिए मानव खुराक मार्गदर्शन करने के लिए अमूल्य है। कई परीक्षा रहे हैंमंदिरों में जहां इस मॉडल का भविष्य कहनेवाला क्षमता 4-7 सिद्ध किया गया है। हालांकि, जांघ संक्रमण मॉडल की खामियों में से एक फेफड़ों में संक्रमण के लिए प्रत्यक्ष प्रासंगिकता की कमी है। वहाँ अब मानव में संक्रमण की साइट के लिए पशु मॉडल में संक्रमण की साइट मिलान पर ज्यादा जोर दिया है; और इस तरह, निमोनिया के इलाज के लिए यौगिकों का अध्ययन करने के लिए, यह पशुओं में फेफड़े में संक्रमण मॉडल का उपयोग करने के लिए आदर्श है।

प्रयोगशाला पशुओं में फेफड़ों में संक्रमण उत्प्रेरण के लिए कई तरीकों का वर्णन किया और intranasal साँस लेना, oropharyngeal मार्ग के माध्यम से आकांक्षा, एयरोसोल जोखिम, और शल्य चिकित्सा intratracheal टीका 8 सहित जीवाणुरोधी प्रभावकारिता के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। कई मामलों में, जानवरों (विशेष रूप से चूहों) पहले के आदेश के एक मजबूत फेफड़ों के संक्रमण को प्राप्त करने के न्यूट्रोपेनिया प्रदान किया जाना चाहिए। इस गंभीर रूप से प्रतिरक्षा राज्य होने के बावजूद, बैक्टीरियल रोगज़नक़ों और दबाव की संख्या जो कृन्तकों में व्यवहार्य के संक्रमण का उत्पादन होता हैसीमित। उदाहरण के लिए, इसे सफलतापूर्वक निमोनिया मॉडल 9, 10, और इस तरह स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया, Pseudomonas aeruginosa और क्लेबसिएला निमोनिया के रूप में भी अधिक उग्र रोगजनकों, में हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा या असिनेतोबक्टेर स्थापित करने के लिए मुश्किल हो सकता है, चुनौतियों 11-13 खड़ी कर सकते हैं।

1991 में, स्मिथ असुरक्षित weanling चूहों में जो संक्रमण के लिए एक सरल nonsurgical intratracheal इंटुबैषेण विधि 14 के माध्यम से सीधे फेफड़ों में बैक्टीरिया पैदा द्वारा स्थापित किया गया था में एक फेफड़े में संक्रमण मॉडल का वर्णन किया। बेरी एट अल। बाद में चूहों 15 से संक्रमण के लिए विधि संशोधित। एक अगर आधारित inoculum का उपयोग करना, यह टीका तकनीक दोनों असुरक्षित चूहों और एस निमोनिया, एच इन्फ्लुएंजा, लालकृष्ण निमोनिया, पी aeruginosa और ए baumannii के साथ चूहों में मजबूत फेफड़ों में संक्रमण लाती है। यह वियोजन की एक विस्तृत श्रृंखला, शरण विभिन्न विरोध उन सहित करने के लिए उत्तरदायी हैमंजूरी निर्धारकों और उन लोगों के जो अन्य टीका मार्गों के माध्यम से एक व्यवहार्य संक्रमण की उपज नहीं है। यह भी अनुमति देता प्रभावकारिता असुरक्षित पशुओं में निर्धारित किया जाना है, एक शर्त है जिसमें रोगी आबादी है कि गंभीर रूप से प्रतिरक्षा नहीं हैं के लिए पारंपरिक न्यूट्रोपेनिया माउस मॉडल की तुलना में अधिक प्रासंगिक है। स्थिरता और कई रोगज़नक़ों और वियोजन भर में इस मॉडल की विश्वसनीयता जीवाणुरोधी प्रभावकारिता के अध्ययन के लिए यह अच्छी तरह से अनुकूल बनाता है।

Protocol

एस pneumonie

सभी प्रक्रियाओं जीएसके संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार कर रहे हैं, और मिलने या प्रयोगशाला पशु की देखभाल के प्रत्यायन के लिए अमेरिकन एसोसिएशन (AAALAC), स्वास्थ्य और मानव के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग के मानकों से अधिक सेवा और सभी स्थानीय और संघीय पशु कल्याण कानूनों।

नोट: जब तक अन्यथा निर्दिष्ट, सभी प्रक्रियाओं सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए।

1. संस्कृति बैक्टीरियल आइसोलेट्स

  1. के रूप में शोरबा संस्कृति आम तौर पर टीका के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान नहीं करता है, एस निमोनिया या एच इन्फ्लुएंजा के साथ 6 अगर प्लेट के लिए 3 तैयार करें।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से एक जमे हुए शेयर संस्कृति निकालें, पूरी तरह से गल, और भेड़ रक्त (एस निमोनिया) के साथ पूरक tryptic सोया अगर पर प्रति प्लेट 100 μL अप करने के लिए लकीर या चॉकलेट अगर (एच इन्फ्लुएंजा) पर मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी तकनीक का उपयोग। के साथ या बिना 5% सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. लालकृष्ण निमोनिया, पी aeruginosa या ए baumannii साथ शोरबा संस्कृतियों तैयार करें।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से एक जमे हुए शेयर संस्कृति निकालें, पूरी तरह से गल, और 50 एमएल में मस्तिष्क दिल अर्क (भी) शोरबा स्टॉक से विभाज्य 100 μL। कोमल मिलाते (लगभग 120 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    2. [वैकल्पिक] एक लॉग चरण संस्कृति वांछित है, विभाज्य 50 एमएल ताजा BHI शोरबा में परिणामी रातोंरात संस्कृति से 1 एमएल। कोमल मिलाते (लगभग 120 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सेते हैं।

2. खारा बैक्टीरियल निलंबन तैयार

  1. सभी निलंबन तैयारी चरणों (2.3 करने के लिए 2.1) के लिए, परिवेशी वायु और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर बाँझ खारा का उपयोग। हार्वेस्ट रात भर स्क्रैप कालोनियों से अगर प्लेट से एस निमोनिया या एच इन्फ्लुएंजा के विकासएक बाँझ पाश के साथ सतह से। एक बादल जब तक बाँझ खारा के 5 एमएल में काटा सामग्री हस्तांतरण, अपारदर्शी निलंबन प्राप्त की और धीरे सजातीय जब तक भंवर है।
  2. लालकृष्ण निमोनिया की अपकेंद्रित्र 50 एमएल, पी aeruginosa या ए baumannii अंतिम शोरबा संस्कृतियों टीका के लिए इरादा है (उदाहरण के लिए रात भर या चरण संस्कृतियों लॉग इन करें) पर 4500 x जी 5 मिनट के लिए। एक पिपेट और त्यागने के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें। कम से कम 5 एमएल बाँझ खारा में गोली, और धीरे भंवर Resuspend एक सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए।
  3. यदि आवश्यक हो, निलंबन आगे 8 9 लॉग करने के लिए 10 कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) / एमएल की सीमा में एक घनत्व प्राप्त करने के लिए बाँझ खारा का उपयोग पतला। CFU / एमएल के निर्धारण के लिए एक विभाज्य निकालें। क्रमानुसार पतला और धारा 7.5 और 7.6 में वर्णित के रूप में विभाज्य थाली।

3. आगर-आधारित Inoculum तैयार

  1. पोषक तत्व अगर एक्कोर की एक छोटी बोतल (लगभग 50 एमएल) तैयारनिर्माता के निर्देशों के डिंग या कि पहले से तैयार किया गया था और संग्रहीत ठोस पोषक तत्व अगर की एक बोतल पिघला। यह लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
  2. प्रक्रिया ऐसा क्षेत्र है जहां जानवरों को संक्रमित हो जाएगा करने के लिए संक्रमण की प्रक्रिया के लिए तरल अगर और सभी आवश्यक उपकरण और उपकरणों के परिवहन। एक छोटे से पानी के स्नान क्षेत्र में 42 डिग्री सेल्सियस पर सेट बनाए रखें।
  3. अगर एक बाँझ ट्यूब उचित रूप से नहाने के पानी में फिट करने के लिए आकार में लगभग 50 डिग्री सेल्सियस के तापमान, और फिर विभाज्य 9 एमएल तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं। नहाने के पानी में इस ट्यूब को छोड़ दें जब तक अगर लगभग 42 डिग्री सेल्सियस के लिए equilibrates। सुनिश्चित पानी की गहराई जो अपने कंटेनर में अगर की सतह को कवर किया जाएगा, लेकिन टोपी या ढक्कन स्पर्श नहीं कर रही है।
  4. नहाने के पानी में 9 एमएल अगर युक्त ट्यूब में 2.3 कदम से खारा जीवाणु निलंबन के 1 एमएल जोड़ें। ट्यूब टोपी, मिश्रण करने के लिए कई बार पलटना, और यह पानी से स्नान करने के लिए वापसी।

4. एकnesthetize, intubate और टीका लगाना पशु

नोट: - 120 ग्राम या वजन 20 पुरुष सीडी 1 चूहों - विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) असुरक्षित पुरुष Sprague-Dawley वजन 100 चूहों 25 ग्राम सिफारिश कर रहे हैं। भोजन और पानी यथेच्छ के साथ सभी जानवरों को प्रदान करें और उन्हें लकड़ी के चिप्स या मानक 12 घंटे प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ अन्य शोषक बिस्तर पर सामाजिक रूप से घर।

  1. किसी भी प्रयोगों का आयोजन करने से पहले, प्राप्त करने और जानवरों की प्रजातियों के लिए उपयुक्त आकार की एक धातु प्रवेशनी और पॉलीथीन ट्यूबिंग बाँझ। बाँझ 1 एमएल डिस्पोजेबल सीरिंज और बाँझ डिस्पोजेबल 25 गेज सुई प्राप्त करते हैं।
    सावधानी: हमेशा इन सीरिंज और एक तेजधार कंटेनर में सुइयों के निपटान के।
    1. 1.0 मिमी और 1.0 के आयुध डिपो - - चूहों, खरीद या एक धातु प्रवेशनी लंबाई में है कि लगभग 12 सेमी निर्माण के लिए, 0.9 का एक आईडी है 1.2 मिमी, और एक छोर पर एक अनुमानित 45 डिग्री कोण को तुला हुआ है। 0.4 मिमी और आयुध डिपो 0.8 मिमी आईडी के साथ पॉलीथीन टयूबिंग की एक 11 करने के लिए 12 इंच की लंबाई में कटौती। (को देखें
    2. चूहों के लिए, एक # 20 पशु खिला ट्यूब खरीद। सरौता के साथ यह लोभी और तेजी से खींच कर ट्यूब के अंत से गेंद को निकालें, और फिर धीरे से एक अनुमानित 45 डिग्री कोण करने के लिए अंत मोड़। 0.28 मिमी और आयुध डिपो 0.61 मिमी आईडी के साथ पॉलीथीन टयूबिंग की एक 11 करने के लिए 12 इंच की लंबाई में कटौती। इसके अलावा खरीद और एक गिलास 100 μL सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज और एक 30 गेज धातु सूक्ष्म इंजेक्शन सुई बाँझ। (1 बी चित्रा को देखें।)
    3. एक गिलास, पेंच टोपी ट्यूब में धातु प्रवेशनी की जगह और मानक तरीकों से आटोक्लेव बाँझ। लेना और दुकान एक कवर बीकर युक्त शराब में पॉलीथीन टयूबिंग की लंबाई में कटौती।
  2. काम की सतह और इंटुबैषेण डिवाइस तैयार करें।
    1. काम की सतह पर एक साफ डिस्पोजेबल चटाई, नहाने के पानी के करीब रखें। धातु प्रवेशनी स्थानांतरण, अपने गिलास भंडारण ट्यूब में, इस सतह के लिए। भंडारण ट्यूब से टोपी निकालें और cannu की "संभाल" अंत स्लाइडLa ट्यूब के खुले अंत करने के लिए।
    2. बाँझ संदंश का प्रयोग, बीकर से पॉलीथीन ट्यूबिंग से एक की लंबाई को हटाने और बाँझ धातु प्रवेशनी के अंदर के माध्यम से यह सम्मिलित करते हैं, यकीन है कि यह स्वतंत्र रूप से चलता रहता है बना रही है। ट्यूबिंग में सुई कई मिमी फिसलने से एक बाँझ डिस्पोजेबल 25 गेज सुई (चूहों के लिए) या निष्फल एक गिलास सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज के 30 गेज धातु सुई (चूहों के लिए) पॉलीथीन ट्यूबिंग के मुक्त अंत पर फिट। (चूहों के लिए चूहे के लिए 1 ए और चित्रा 1 बी चित्रा को देखें)।
    3. दोनों धातु प्रवेशनी और पॉलीथीन ट्यूबिंग पर प्लेस गाइड के निशान इंटुबैषेण प्रक्रिया एक भी euthanized जानवर पर नीचे वर्णित का पालन करते हुए जानवर में प्रविष्टि की गहराई से संकेत मिलता है। अवलोकन के लिए छाती गुहा खोलें, तो धातु प्रवेशनी जगह ठीक से और उचित रूप से पॉलीथीन ट्यूबिंग अग्रिम (धारा 4.7 में वर्णित के रूप में)। एक अमिट कलम का प्रयोग, धातु प्रवेशनी जहां यह जानवर और पाली के मुंह को पूरा करती है निशानएथिलीन ट्यूबिंग जहां यह धातु प्रवेशनी के शीर्ष मिलता है शेष पशुओं में उचित स्थान सहायता करने के लिए।
  3. एक धूआं हुड (या एक उचित सफाई प्रणाली का उपयोग) के भीतर, एक बंद कक्ष 1.5 एल / मिनट ऑक्सीजन में ≤5 isoflurane% के साथ आपूर्ति में एक समय में 6 पशुओं के लिए ऊपर anesthetize तक धोखा पलटा हिचकते है (लगभग 1 मिनट)।
    नोट: किसी भी प्रयोगों का आयोजन करने से पहले, सुरक्षित खुराक और जोखिम समय isoflurane के लिए विशिष्ट परिस्थितियों के तहत इस्तेमाल किया जा रहा (चैम्बर और आकार / प्रजातियों / जानवर के तनाव के जैसे आकार / प्रकार) अनजाने घातक प्रदर्शन को रोकने के लिए की स्थापना।
  4. खारा में बाँझ टिप रखने और सवार पर वापस खींच कर एक बाँझ डिस्पोजेबल 1 मिलीलीटर बाँझ खारा के साथ (चूहों के लिए) सिरिंज भरें। बाँझ कांच सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज (चूहों के लिए) भरें नीचे के रूप में वर्णन किया। सुई पॉलीथीन ट्यूबिंग पर फिट करने के लिए सिरिंज संलग्न है, और जब तक syring ट्यूबिंग के माध्यम से खारा की पूरी मात्रा निकलवानेई खाली कर दिया है।
    1. (चूहों के लिए) सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज भरने के लिए, पूरी तरह से सिरिंज से धातु सवार और सुई (पॉलीथीन ट्यूबिंग पर फिट) को हटाने और दोनों अलग निर्धारित करें।
    2. बाँझ खारा के साथ एक बाँझ डिस्पोजेबल 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें (जैसा कि ऊपर वर्णित है) और एक बाँझ डिस्पोजेबल 25 गेज सुई देते हैं। सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज (जहां धातु सवार डाला जाएगा) के शीर्ष में सुई डालें, और डिस्पोजेबल सिरिंज के सवार दबाना जब तक यह नमक के साथ सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज भरता है।
    3. डिस्पोजेबल सिरिंज और सुई है कि एक तेजधार कंटेनर में सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज भरने के लिए इस्तेमाल किया गया त्यागें। सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज की नोक करने के लिए धातु सूक्ष्म इंजेक्शन सुई (पॉलीथीन ट्यूबिंग पर फिट) पुनः देते हैं और धातु सवार फिर से डालने, निराशाजनक तक खारा की पूरी मात्रा सिरिंज और ट्यूबिंग के माध्यम से प्लावित कर दिया गया है।
  5. आगर-आधारित inoculum के साथ सिरिंज इधर-उधर भरेंट्यूबिंग अभी तक ट्यूबिंग primed है (उदाहरण के लिए पूरी तरह से अगर साथ भरा) के माध्यम से पानी के स्नान में कंटेनर, और फ्लश अगर हूँ।
    1. चूहों के लिए, डिस्पोजेबल सिरिंज से 25 गेज सुई (पॉलीथीन ट्यूबिंग पर फिट) को हटा दें। एक तेजधार कंटेनर में इस्तेमाल सिरिंज त्यागें। inoculum में बाँझ टिप रखने और सवार पर वापस खींच कर एक नया, बाँझ डिस्पोजेबल 1 एमएल पानी में स्नान कंटेनर से आगर-आधारित inoculum के साथ सिरिंज भरें। सवार अभी तक पूरी तरह से ट्यूबिंग अगर साथ भर जाता है निराशाजनक द्वारा ट्यूबिंग के माध्यम से सुई (पॉलीथीन ट्यूबिंग पर फिट) और फ्लश अगर पुनः देते हैं।
    2. चूहों के लिए, सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज से धातु सूक्ष्म इंजेक्शन सुई (पॉलीथीन ट्यूबिंग पर फिट) और धातु सवार निकालें और अलग निर्धारित करें। एक बाँझ डिस्पोजेबल सिरिंज 1 एमएल और बाँझ डिस्पोजेबल 25 गेज सुई का प्रयोग, में कंटेनर से आगर-आधारित inoculum के साथ सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज भरनेनहाने के पानी भरने की प्रक्रिया की धारा 4.4 में वर्णित का उपयोग कर। फिर से जोड़ना धातु सूक्ष्म इंजेक्शन सुई (पॉलीथीन ट्यूबिंग पर फिट), धातु सवार, और ट्यूबिंग के माध्यम से फ्लश अगर अभी तक पूरी तरह से ट्यूबिंग अगर साथ भर जाता है डालें।
  6. संवेदनाहारी कक्ष से एक पशु निकालें। सही और बाईं ओर पूंछ को सिर के साथ डिस्पोजेबल चटाई पर एक लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस के रूप में चित्रा 1C में दिखाया गया है।
  7. इंटुबैषेण डिवाइस (यानी धातु प्रवेशनी पॉलीथीन ट्यूबिंग के साथ लगे) का उपयोग करना, पशु intubate और बाएं फेफड़े की बड़ी पालि में प्रवेशनी डालने (देखें चित्रा -1)।
    1. पशु के मुंह में धातु प्रवेशनी के मुक्त अंत डालें। प्रवेशनी बारी इतनी है कि मुक्त अंत ऊपर की ओर angled है और धीरे श्वासनली में यह अग्रिम, ध्यान से एक मामूली घुमा गति के साथ laryngeal संरचनाओं को दरकिनार। के रूप में करने का विरोध किया श्वासनली में प्रविष्टि की पुष्टिधीरे प्रवेशनी थोड़ा आगे और पीछे कई बार फिसलने बाईं तर्जनी के साथ सांस की नली के छल्ले छूकर जबकि के रूप में चित्रा 1C में दिखाया द्वारा घेघा।
    2. प्रवेशनी विभाजन जहां श्वासनली छोड़ दिया और सही ब्रांकाई में विभाजन तक पहुँच जाता है, जानवर के बाईं ओर की ओर एक मामूली घुमा गति सुनिश्चित करने के लिए कि प्रवेशनी छोड़ दिया श्वसनी में डाला जाता है। धातु प्रवेशनी अग्रिम जब तक अंत बाएं फेफड़े नीचे तीन-चौथाई, पहले से रखा गाइड के निशान का उपयोग करते हुए इस बात की पुष्टि करने के लिए कि उचित गहराई तक पहुँच गया है करने के लिए आधे रास्ते में है।
    3. जगह में धातु प्रवेशनी के साथ, पॉलीथीन कई मिमी टयूबिंग अग्रिम। ट्यूबिंग पर पहले से रखा गाइड चिह्न का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए यह उन्नत है ही दूर धातु प्रवेशनी के अंत में बाहर निकलने के लिए और फेफड़ों पंचर पर्याप्त नहीं है।
  8. जगह में दोनों cannulae के साथ, अगर suspe की (चूहों के लिए) 100 μL या 20 μL (चूहों के लिए) टपकाना से जुड़ी सिरिंज का उपयोग करेंnsion बाएं फेफड़े की बड़ी पालि में गहरी (देखें चित्रा -1)। पॉलीथीन ट्यूबिंग के कई मिमी वापस लेने, और फिर धीरे बरकरार इंटुबैषेण डिवाइस को हटा दें। यह कांच भंडारण ट्यूब में वापस सेट, और एक ताजा पिंजरे में पशु ले जाने के ठीक करने के लिए।
  9. , Anesthetizing intubating और शेष जानवरों inoculating जारी रखें।
    1. anesthetized जानवरों के बैचों के बीच, सिरिंज से सुई (ट्यूबिंग पर फिट) को हटा दें। चूहों के लिए, एक तेजधार कंटेनर में इस्तेमाल डिस्पोजेबल सिरिंज त्यागने और नहाने के पानी में inoculum से एक नया, बाँझ डिस्पोजेबल सिरिंज भरने के लिए। चूहों के लिए, भरने तकनीक धारा 4.4 में वर्णित का उपयोग नहाने के पानी में inoculum से एक ही गिलास सूक्ष्म इंजेक्शन सिरिंज फिर से भरना।
    2. अगर इंटुबैषेण डिवाइस में और अधिक मोटा होना शुरू होता है, ट्यूबिंग के माध्यम से सभी शेष अगर फ्लश। सिरिंज (सुई पॉलीथीन ट्यूबिंग पर फिट छोड़कर) से सुई निकालें। वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करेंधारा 4.4 में इंटुबैषेण डिवाइस के माध्यम से गर्म, बाँझ खारा फ्लश करने के लिए, पूरी तरह से स्पष्ट किसी भी रुकावट के रूप में आवश्यक दोहरा। धारा 4.5 में वर्णित के रूप में सिरिंज से खाली सब खारा और फिर अगर inoculum तैयार करते हैं।
    3. CFU खारा निलंबन से निर्धारित का उपयोग कर पशु प्रति अंतिम बैक्टीरियल inoculum की गणना करें, अगर में खारा निलंबन (जैसे दस गुना) के अंतिम कमजोर पड़ने कारक है, और मात्रा (जानवरों में डाले उदाहरण के लिए 100 μL के लिए (धारा 2.3 देखें) चूहों या चूहों के लिए 20 μL)।

5. संभावित गलत टीका या अन्य प्रतिकूल घटनाक्रम के लिए पशु का आकलन

  1. ध्यान से सभी जानवरों इंटुबैषेण के दौरान, अगर की टपकाना और वसूली संज्ञाहरण से संभावित गलत टीका के लिए आकलन करने के लिए निरीक्षण करते हैं। तुरंत किसी भी जानवर जो bleeds (स्थानीय IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार) euthanize, (जैसे कि कृत्रिम श्वास या हांफते) के रूप में असामान्य श्वसन दर्शाती है, कदम नहीं करता हैसामान्य रूप से पिंजरे के बारे में, या चमकदार आंखों और संज्ञाहरण से वसूली पर स्वस्थ प्रकट नहीं होता है।
  2. साँस लेने की सहज समाप्ति होती है, तो (आमतौर पर जब inoculum गहरी पर्याप्त नहीं रखा गया है और ब्लॉक एयरवे), अवलोकन से मौत की पुष्टि करें और (जैसे कि गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या thoracotomy के रूप में) इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि प्रदर्शन करते हैं।
  3. कम से कम समय जानवरों की लंबाई isoflurane को उजागर कर रहे हैं, के रूप में संज्ञाहरण केवल प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए कई मिनट के लिए आवश्यक है। इंजेक्शन anesthetics इस्तेमाल कर रहे हैं, तो सुनिश्चित जानवरों पूरी तरह से जाग जब तक निगरानी में हैं। जब इंजेक्शन anesthetics का उपयोग कर वसूली के लिए जानवरों को, विशेष रूप से चूहों की जगह, एक गर्म वातावरण में।
  4. स्पष्ट श्वास, piloerection, कम गतिविधि और कम शरीर का तापमान: सांस की बीमारी के निम्नलिखित लक्षण के लिए अध्ययन की अवधि के दौरान जानवरों का निरीक्षण कम से कम दो बार दैनिक। इसके तत्काल बाद euthanize किसी भी जानवर है कि मरणासन्न है, experie (स्थानीय IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार)NCES कृत्रिम श्वास या श्वसन संकट से निपटने पर एक काफ़ी कम शरीर का तापमान है, असमर्थ या अनिच्छुक स्थानांतरित करने के लिए है, या भोजन और पानी तक नहीं पहुँच सकते।

6. प्रशासन टेस्ट उपचार

  1. तैयार है और योजना बनाई अध्ययन डिजाइन के अनुसार परीक्षण उपचार प्रशासन। 1 या 2 घंटे के बाद संक्रमण पर उपचार के प्रशासन शुरू (या आगे के इलाज में देरी करता है, तो एक उच्च आधारभूत बैक्टीरियल बोझ वांछित है)। तैयारी और परीक्षा उपचार के प्रशासन के लिए विशिष्ट विवरण के रूप में यह अध्ययन करने के उद्देश्य के साथ ही प्रत्येक व्यक्ति के इलाज के गुणों पर निर्भर है नहीं दिया जा सकता। (एक उदाहरण के रूप में 3 चित्रा को देखें।)
  2. संक्रमित, इलाज जानवरों के लिए अलग से एक समूह के रूप में सेट आधारभूत नियंत्रण सेवा के लिए। समय के उपचार पर इन जानवरों के फेफड़ों में बैक्टीरिया बोझ अन्य समूहों के लिए शुरू की है गिनना, प्रक्रियाओं धारा 7 में उल्लिखित के बाद।
  3. पी / पीडी विश्लेषण के लिए, का आकलनरक्त और / या संक्रमित जानवरों के ऊतकों में प्रशासित उपचार (एस) के फ़ार्माकोकायनेटिक प्रोफ़ाइल। फ़ार्माकोकायनेटिक अध्ययन के लिए विशिष्ट प्रक्रियाओं इस लेख के दायरे से बाहर हैं।

7. फेफड़ों से व्यवहार्य जीवाणुओं की गणना करें

  1. धीरे-धीरे कार्बन का स्तर बढ़-समय पर उपचार अध्ययन अवधि (आमतौर पर 24, 48 या 96 घंटे के बाद संक्रमण) साँस लेना जोखिम से के अंत में अन्य समूहों (आधारभूत) और शेष सभी जानवरों के लिए शुरू की है पर इलाज जानवरों में से एक समूह Euthanize एक बंद कक्ष या एक वैकल्पिक विधि के भीतर डाइऑक्साइड के रूप में स्थानीय IACUC दिशा निर्देशों द्वारा सिफारिश की। अवलोकन से मौत जाँच करें, और (जैसे कि गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या thoracotomy के रूप में) इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि प्रदर्शन करते हैं।
  2. एक साफ डिस्पोजेबल चटाई पर एक लापरवाह स्थिति में जानवरों की जगह है, और अच्छी तरह से शराब के साथ सीने पर फर गीला।
  3. बाँझ कैंची का प्रयोग, त्वचा के माध्यम से काटा, मांसपेशियों परत और ribcage अंतर्निहितउरोस्थि के समानांतर छाती गुहा को खोलने के लिए। धीरे बाँझ संदंश के साथ फेफड़ों समझ और दूर करने के लिए खींच, कैंची का उपयोग कर उन्हें श्वासनली से अलग करने के लिए यदि आवश्यक है। फेफड़ों बाँझ धुंध पर रखें अतिरिक्त रक्त को अवशोषित करने के लिए। दिल भी हटा दिया गया है, तो इसे दूर काटना और त्यागें।
  4. बाँझ कैंची आंतरिक वर्गों को बेनकाब और बाँझ संदंश का उपयोग फेफड़ों (प्लस किसी भी टुकड़े कि अनजाने में बंद कतरना थे) एक प्रयोगशाला ब्लेंडर बैग के तल में जगह करने के लिए के साथ फेफड़ों में छोटे snips बनाओ। संक्षेप में एक मोटी गोल वस्तु बैग ऊतक सानी के बाहर पर (जैसे एक पेन या मार्कर के रूप में) रोल। बैग में बाँझ खारा की पिपेट 1 एमएल, एक प्रयोगशाला ब्लेंडर में बैग जगह है, और 2 मिनट के लिए उच्च गति पर प्रयोगशाला ब्लेंडर चलाते हैं।
  5. ट्यूब या प्लेटें एक पिपेट का उपयोग में मिश्रित बैग से homogenated नमूने स्थानांतरण। 9-भागों खारा में 1 भाग homogenate aliquotting द्वारा homogenate दस गुना पतला (जैसे 100 μL 900 μL सलिन में homogenateई)। एक समान तरीके से फिर से दस गुना से परिणामी निलंबन पतला। कम से कम 6 धारावाहिक dilutions मूल homogenate से तैयार किया गया है, जब तक एक और दस गुना पहलू से प्रत्येक नए परिणामी निलंबन गिराए जारी रखें।
  6. Trypticase सोया अगर भेड़ रक्त के साथ पूरक प्लेटों पर सभी dilutions से प्रत्येक 20 μL (एस निमोनिया, लालकृष्ण निमोनिया, पी aeruginosa या ए baumannii) की या चॉकलेट अगर प्लेट (एच इन्फ्लुएंजा) पर पिपेट तीन प्रतियों aliquots। के साथ या सीओ 2 के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। (एक परिणामी प्लेट का एक उदाहरण के लिए चित्रा 1E देखें।)
  7. पहले कमजोर पड़ने लगता है कि एक "गणनीय" संख्या (यानी नहीं भी कई कालोनियों यथोचित गिनती करने के लिए) शामिल हैं पर तीन प्रतिकृति में से प्रत्येक में कालोनियों गिनती। तीन प्रतिकृति के औसत मूल्य की गणना। कुल 1 एमएल के 20 μL चढ़ाना के लिए खाते में 50 (औसत मूल्य से गुणा करके फेफड़ों प्रति CFU निर्धारित बनाने के लिएhomogenate) और मूल homogenate जिस पर कालोनियों गिना रहे थे से अंतिम कमजोर पड़ने कारक में फैक्टरिंग।

Representative Results

उपकरण, आवश्यक जानवर के उन्मुखीकरण, और इंटुबैषेण की गहराई चित्र 1 में दिखाया गया है। यह भी पता चला धारावाहिक कमजोर पड़ने और एक फेफड़ों homogenate नमूने की तीन प्रतियों चढ़ाना के बाद एक अगर प्लेट पर बढ़ रही कालोनियों के एक प्रतिनिधि उदाहरण है। आधारभूत नियंत्रण के ऊपर कई लॉग 10 CFU के जीवाणु बोझ में वृद्धि आम तौर पर भी 96 घंटे के बाद संक्रमण पर, सबसे बैक्टीरियल आइसोलेट्स के लिए संक्रमित फेफड़ों में मनाया जाता है, और पशुओं के बीच परिवर्तनशीलता कम (चित्रा 2) है। कुछ एच इन्फ्लुएंजा के लिए, वहाँ थोड़ा विकास हो सकता है; हालांकि, संक्रमण एक 48 या 96 घंटे का समय अवधि (चित्रा 2 बी) के भीतर आत्म-संकल्प करने के लिए शुरू नहीं करना चाहिए। यह फेफड़ों के संक्रमण के मॉडल के रूप में दो अलग श्रृंखला 16, 17 का प्रतिनिधि यौगिकों के लिए 3 चित्र में दिखाया गया है, खोज एवं बचाव का समर्थन करने के लिए नेतृत्व रासायनिक श्रृंखला के अनुकूलन के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एक सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मुलाकात प्रदान करता हैविभागाध्यक्ष एस निमोनिया के खिलाफ अवरोध असुरक्षित पशुओं में पी / पीडी का आकलन करने और न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (fAUC / एमआईसी) एक उपन्यास पॉलीपेप्टाइड deformylase (पीडीएफ) की प्रभावकारिता के साथ सहसंबद्ध से अधिक एकाग्रता समय वक्र के अंतर्गत है कि मुफ्त दवा क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और एच इन्फ्लुएंजा (चित्रा 4)। इसके अतिरिक्त, ठहराव के लिए fAUC / एमआईसी लक्ष्य और एक CFU में 10 कमी आधारभूत नियंत्रण से 11 एस निमोनिया और 5 एच इन्फ्लुएंजा वियोजन (तालिका 1) 18 के पार निर्धारित किया गया है 1-लॉग इन करें। एक दवा वितरण प्रणाली के साथ इस संक्रमण मॉडल चूहों में मानव फ़ार्माकोकायनेटिक प्रोफाइल विश्राम करने के लिए युग्मन नैदानिक ​​अध्ययन करने के लिए पहले मानव खुराक परहेजों के मूल्यांकन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाता है। इस का एक उदाहरण तालिका 2 में संक्षेप किया जाता है, जो यह दर्शाता है कि amoxicillin-clavulanate की एक विस्तारित रिलीज सूत्रीकरण ELEVA साथ जीवों के लिए मौजूदा खुराक परहेजों की तुलना में अधिक प्रभावी थाटेड एमआईसी 19 महत्व देता है।

आकृति 1
चित्रा 1: Nonsurgical intratracheal इंटुबैषेण। उपकरण चूहा (ए) और माउस (बी) intubating के लिए दिखाए जाते हैं। एक बार anesthetized, पशु के रूप में सही और बाईं ओर पूंछ को सिर के साथ सी में दिखाया गया है, अगर व्यक्ति तकनीक के प्रदर्शन के दाएं हाथ है तैनात किया जाना चाहिए। गले पर धीरे छोड़ दिया तर्जनी की जगह सही प्रवेशनी स्थापन की पुष्टि के लिए सांस की नली के छल्ले टटोलना मदद करने के लिए। Inoculum, बाएं फेफड़े में गहरी रखा जाना चाहिए के रूप में एक चूहा फेफड़ों (डी) के उदर दृश्य में दिखाया गया है। धारावाहिक कमजोर पड़ने और एक नमूना के चढ़ाना के बाद अगर पर बढ़ रही कालोनियों में दिखाया गया है कि इसी तरह प्रकट करना चाहिए। चित्रा -1, कॉपीराइट © गिल स्मिथ [प्रयोगशाला पशु, खंड 25 (1991), जी स्मिथ, ए49] 14 - चूहे में श्वसन संक्रमण, पृष्ठों की स्थापना के लिए 46 intrabronchial टपकाना के सरल गैर-शल्य चिकित्सा पद्धति। अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: संक्रमित पशुओं के फेफड़ों में बैक्टीरिया विकास के प्रतिनिधि उदाहरण। एन = 5 पशु / समूह से मानक विचलन CFU डेटा मतलब ± एस निमोनिया (ए), एच इन्फ्लुएंजा (बी), पी aeruginosa (सी), लालकृष्ण निमोनिया (डी) और ए baumannii के विभिन्न वियोजन के लिए दिखाया गया है (ई)। प्रत्येक जोड़ी (हल्के भूरे रंग) की पहली बार आधारभूत bacte है1 या 2 घंटे के बाद संक्रमण पर रियाल बोझ है, जबकि दूसरी बार 48 घंटे के बाद संक्रमण (डार्क ग्रे) या 96 घंटे के बाद संक्रमण (काला) पर अंत के अध्ययन के विकास पर नियंत्रण है। कोई डेटा नहीं रोक लगाए तरीकों से लागू किया गया था; इस प्रकार, इन परिणामों समूह के प्रति सभी 5 जानवरों से डेटा शामिल हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: लीड अनुकूलन के दौरान विभिन्न रासायनिक श्रृंखला की प्रभावकारिता का मूल्यांकन। फेफड़ों के संक्रमण से वर्णित तकनीकों का उपयोग कर मॉडल abacterial प्रकार आईआईए topoisomerase कार्यक्रम के हिस्से के रूप में संरचना गतिविधि संबंधों का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया। होनहार यौगिकों 7 और 1 के खिलाफ मूल्यांकन किया गया क्विनोलोन-अतिसंवेदनशील (ए) 16 या क्विनोलोन प्रतिरोधी(बी) एस निमोनिया के 17 वियोजन, क्रमशः। प्रत्येक प्रतीक CFU के साथ समूह का प्रतिनिधित्व लाइनों मतलब है और मानक विचलन एक चूहे के फेफड़ों से निर्धारित प्रतिनिधित्व करता है। मात्रा का ठहराव (LLQ) की ऊपरी सीमा 1.7 लॉग 10 CFU / फेफड़ों था। यौगिकों, (शुद्ध मुक्त माता पिता अणु की 56 या 112 मिलीग्राम) तौला गया बाँझ पानी की 9 एमएल में भंग, 3 एमएल पानी में 3 एमएल पतला (1: 1) और दो बार दैनिक 1 एमएल / 125 ग्राम चूहे के मौखिक gavage द्वारा प्रशासित ( 6 - 7 ज अलावा) 2 दिनों के लिए, 1 घंटे के बाद संक्रमण पर शुरू। Nontreated नियंत्रण (एनटीसी) के लिए आधारभूत 1 घंटे के बाद संक्रमण पर जांचा या नमक के साथ इलाज किया और विकास के नियंत्रण के लिए अध्ययन (48 घंटे) के अंत में नमूना थे। चित्रा 3 ए बैक्टीरियल प्रकार आईआईए टोपोईसोमेरासिज़ को निशाना शक्तिशाली antibacterials के रूप में Bioorganic और औषधीय रसायन विज्ञान पत्र, खंड 21, टी जे मीलों एट अल, उपन्यास Cyclohexyl-amides से reprinted, पेज 7483 -। 7488, कॉपीराइट (2011) 16, Elsevier से अनुमति के साथ।चित्रा 3 बी Bioorganic और औषधीय रसायन विज्ञान पत्र, खंड 26, टी जे मीलों एट अल, उपन्यास tricyclics (जैसे GSK945237) बैक्टीरियल प्रकार आईआईए टोपोईसोमेरासिज़ के रूप में शक्तिशाली निरोधक, पेज 2464 से reprinted -। 2469, कॉपीराइट (2016) 17, Elsevier से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: पी / एक उपन्यास पीडीएफ अवरोध की पीडी विशेषता। Emax मॉडल एस निमोनिया (ए) या एच इन्फ्लुएंजा (बी) के वियोजन के साथ फेफड़ों में संक्रमित असुरक्षित चूहों में प्रभावकारिता डेटा लेकर खुराक का उपयोग कर एक उपन्यास पीडीएफ अवरोध 18 पी / पीडी लक्ष्यों को निर्धारित करने के लिए बनाया गया था। सर्किलोंपरिसर के अलग-अलग खुराक के साथ इलाज 4-5 चूहों / समूह से मतलब बैक्टीरियल बोझ का प्रतिनिधित्व करते हैं। विश्लेषण के साथ मुक्त दवा 24 घंटे नीलामी (खुला हलकों) या नीलामी / एमआईसी (भरा हलकों) प्रभावकारिता सहसंबंधी प्रदर्शन किया गया। अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित, सूक्ष्म जीव विज्ञान, [रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, मात्रा 60, 2016, पेज 180 - 189] के लिए कॉपीराइट © अमेरिकन सोसायटी 18। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ठहराव 1-लॉग 10 में कमी
जीव एमआईसी
(माइक्रोग्राम / एमएल)
आर 2 के लिए
लाइन फाई
टी (%)
fAUC fAUC / एमआईसी fAUC fAUC / एमआईसी मैक्स हत्या
(प्रवेश 10 कमी)
एस निमोनिया
10,127 0.25 99.9 2.0 8.1 3.6 14.4 2.8
1316009S 0.25 96.1 6.5 26.0 15.1 60.3 1.8
ATCC10813 0.5 100 8.4 16.9 22.2 44.5 1.2
1307007S 1 95.8 16.1 16.1 20.1 20.1 2.7
ATCC6303 1 99.8 19.8 19.8 24.8 24.8 2.8
1629 2 100 15.8 7.9 21.2 10.6 2.4
298,443 2 99.9 26.5 13.2 31.0 15.5 2.3
336,808 2 86 8.2 4.2 19.0 9.5 2.6
338,860 2 99.5 2.9 1.5 6.7 3.4 2.8
& #160; 340,449 2 94.6 8.0 4.0 14.9 7.4 2.1
L11259 2 100 7.1 3.5 9.0 4.5 2.0
मतलब ± एसडी एनए एक NA 11.0 ± 7.5 11.0 ± 7.9 17.0 ± 8.2 19.5 ± 17.8 2.3 ± 0.5
मंझला NA NA 8.2 8.1 19.0 14.4 2.4
एच इन्फ्लुएंजा
1998-100-126H 1 99.7 7.3 7.3 13.4 13.4 2.9
503-008H 1 99.8 7.1 7.1 13.9 13.9 2.7
08003H 2 99.9 14.5 7.2 16.7 8.3 2.7
H128 2 96.6 15.3 7.6 26.0 13.0 2.7
19001H 4 91.9 14.8 3.7 37.3 9.3 3.0
मतलब ± एसडी NA NA 11.8 ± 4.2 6.6 ± 1.6 21.5 ± 10.2 11.6 ± 2.6 2.8 ± 0.1
मंझला NA NA 14.5 7.2 16.7 13.0 2.7
एक एनए, लागू नहीं।

तालिका 1: पी / पीडी एस निमोनिया और एच इन्फ्लुएंजा आइसोलेट्स के खिलाफ एक उपन्यास पीडीएफ एफडीए के लिए लक्ष्य। नि: शुल्क दवा नीलामी और ठहराव के लिए नीलामी / एमआईसी लक्ष्य और एक 1-लॉग इन करें आधारभूत से CFU में 10 कमी फेफड़ों में संक्रमित और यौगिक 18 के साथ इलाज किया असुरक्षित चूहों में 11 एस निमोनिया और 5 एच इन्फ्लुएंजा के लिए निर्धारित किया गया है। Datएक नैदानिक ​​विकास के लिए चयन मानव खुराक मदद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस तालिका में रूपांतरित किया गया है और अनुमति के साथ reprinted, सूक्ष्म जीव विज्ञान, [रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, मात्रा 60, 2016, पेज 180 - 189] के लिए कॉपीराइट © अमेरिकन सोसायटी 18।

<टीडी> 875/125 मिलीग्राम TID (अनुपात 7: 1)
उपचार समूह एक लॉग इन करें मतलब 10 एस निमोनिया (CFU / फेफड़ों) ± बी तनाव (AMX / सीए एमआईसी) के लिए एसडी:
05010S
(2 माइक्रोग्राम / एमएल)
16001S
(4 माइक्रोग्राम / एमएल)
16001S
(4 माइक्रोग्राम / एमएल)
30005S
(4 माइक्रोग्राम / एमएल)
20009S
(4 माइक्रोग्राम / एमएल)
05003S
(8 माइक्रोग्राम / एमएल)
404,053
(8 माइक्रोग्राम / एमएल)
47003S
(8 माइक्रोग्राम / एमएल)
नियंत्रण 7.3 ± 0.4 7.0 ± 0.8 5.7 ± 1.2 7.1 ± 0.7 7.1 ± 0.4 6.4 ± 0.6 6.8 ± 0.4 6.0 ± 0.3
AMX / सीए
2,000 / 125 मिलीग्राम बोली (अनुपात 16: 1) ≤ 1.7 ** 2.8 ± 1.2 ** 2.2 ± 0.8 ** 2.3 ± 0.9 ** 2.5 ± 0.9 ** 2.0 ± 0.9 ** 3.8 ± 1.4 ** 1.8 ± 0.2 **
1000/125 मिलीग्राम TID (अनुपात 8: 1) एनटी एनटी 2.8 ± 0.5 ** 2.7 ± 1.3 ** 3.3 ± 0.9 ** 4.9 ± 0.5 ** 6.6 ± 1.3 4.7 ± 0.7 **
एनटी एनटी 3.0 ± 1.3 * 2.1 ± 0.7 ** 3.2 ± 0.4 ** 5.2 ± 0.9 * 6.4 ± 0.6 4.9 ± 0.4 **
875/125 मिलीग्राम बोली (अनुपात 7: 1) एनटी एनटी 4.5 ± 1.2 * 5.6 ± 1.3 * 5.2 ± 0.7 ** 6.3 ± 0.7 6.4 ± 0.7 5.5 ± 0.4
500/125 मिलीग्राम TID (अनुपात 4: 1) 3.1 ± 1.3 ** 4.5 ± 0.9 ** एनटी एनटी एनटी एनटी एनटी एनटी
Azithromycin, 1000/500 मिलीग्राम आयुध डिपो एनटी एनटी एनटी 5.8 ± 2.0 7.1 ± 0.9 3.1 ± 1.0 ** 6.6 ± 0.4 6.07; 0.6
लिवोफ़्लॉक्सासिन, 500 मिलीग्राम आयुध डिपो एनटी एनटी 4.2 ± 0.8 * 5.7 ± 0.8 * 4.9 ± 0.8 ** 3.0 ± 1.3 ** 3.5 ± 0.2 ** 3.9 ± 0.8 **
उपचार समूह मतलब लॉग 10 एच इन्फ्लुएंजा (CFU / फेफड़ों) ± तनाव के लिए एसडी:
H128
(β-lactamase सकारात्मक)
चेस्टफ़ील्ड
(β-lactamase नकारात्मक, एम्पीसिलीन प्रतिरोधी)
नियंत्रण 6.4 ± 0.6 6.7 ± 0.6
AMX / सीए
2,000 / 125 मिलीग्राम बोली (अनुपात 16: 1) 2.0 ± 0.7 ** 3.1 ± 0.9 **
1000/125 मिलीग्राम TID (अनुपात 8: 1) 2.1 ± 1.0 ** 3.6 ± 1.1 **
875/125 मिलीग्राम TID (अनुपात 7: 1) 2.8 ± 1.3 ** 3.8 ± 1.3 **
875/125 मिलीग्राम बोली (अनुपात 7: 1) 2.0 ± 0.8 ** 5.1 ± 1.1 **
Azithromycin, 1000/500 मिलीग्राम आयुध डिपो 3.2 ± 1.7 * 5.8 ± 1.1
लिवोफ़्लॉक्सासिन, 500 मिलीग्राम आयुध डिपो ≤ 1.7 ** ≤ 1.7 **
एक AMX / सीए, amoxicillin-clavulanate; बोली, दिन में दो बार; TID।, दिन में तीन बार; आयुध डिपो, एक बार एक दिन।
पता लगाने की सीमा 1.7 था <; * नियंत्रण से काफी अलग (0.05 ≤ पी); **, नियंत्रण से काफी अलग (0.01 ≤ पी); NT, परीक्षण नहीं किया।
तनाव 16001S दो अलग-अलग प्रयोगों में परीक्षण किया गया था।
डी Amoxicillin-clavulanate 500/125 मिलीग्राम (4: 1) तीन बार एक दिन में एच इन्फ्लुएंजा उपभेदों के खिलाफ जांच नहीं की गई थी।

तालिका 2: विभिन्न Amoxicillin / Clavulanate Dosing Regimens के लिए निर्मित मानव प्लाज्मा एक्सपोजर प्रोफाइल की प्रभावकारिता। एस निमोनिया या एच इन्फ्लुएंजा के वियोजन इस मॉडल का उपयोग के साथ फेफड़ों में संक्रमित असुरक्षित चूहों में उत्पन्न डेटा दिखा दिया है कि amoxicillin-clavulanate के एक बढ़ाया सूत्रीकरण (2000/125 मिलीग्राम दो बार दैनिक) विट्रो संवेदनशीलता 19 में ऊंचा साथ वियोजन के खिलाफ मानक खुराक परहेजों की तुलना में अधिक प्रभावी था। इस तालिका में रूपांतरित किया गया है और अनुमति के साथ reprinted, सूक्ष्म जीव विज्ञान, [रोगाणुरोधी एजेंटों और रसायन चिकित्सा, मात्रा 49, 2005, पृष्ठ 908 - 915] के लिए कॉपीराइट © अमेरिकन सोसायटी 19।

Discussion

इस संक्रमण मॉडल reproducing में इष्टतम सफलता के लिए, निम्न अतिरिक्त सुझाव पर विचार किया जाना चाहिए। एक अध्ययन में उपयोग करने से पहले इन विवो में 3 बार - नई वियोजन की डाह 2 passaging द्वारा बढ़ाया जा सकता है। जमे हुए बैक्टीरियल शेयरों हमेशा मूल से संभव के रूप में कुछ अंश के साथ एक प्राथमिक इन विवो व्युत्पन्न स्रोत से तैयार किया जाना चाहिए, और refreezing या thawed शेयर का पुन: उपयोग को हतोत्साहित किया जाता है। निमोनिया के साथ रोगियों से बरामद हाल ही में नैदानिक ​​वियोजन लॉग चरण विकास में संस्कृतियों का उपयोग करना, और / या तैयारी भी संक्रमण की स्थापना में सुधार करने में मदद कर सकते हैं। अगर (जैसे 2 एमएल खारा निलंबन 8 एमएल अग्रवाल को जोड़ा) में एक पांच गुना कमजोर पड़ने के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता बैक्टीरियल inoculum बढ़ाने के लिए दस गुना, और inoculum मात्रा समायोजित जानवर के आकार के आधार पर किया जा सकता है (उदाहरण 200 μL / जानवर आमतौर पर 250 ग्राम चूहों में टीका है)। खारा में जीवाणु निलंबन जोड़ने से पहलेअगर (यानी 2.3 कदम पर), बैक्टीरियल घनत्व भविष्यवाणी या दृश्य निरीक्षण, MacFarland मानकों या ऑप्टिकल घनत्व माप से अनुमान लगाया जा सकता है। यह प्रत्येक विवो प्रयोगों में आयोजित करने से पहले अलग-थलग करने के लिए इन विट्रो विकास विशेषताओं से परिचित बनने के लिए उपयोगी है। विकास और हैंडलिंग में निरंतरता किसी भी अलग के लिए जीवाणु घनत्व का सबसे सटीक आकलन के लिए सक्षम बनाता है। स्टैंडर्ड सूक्ष्मजीवविज्ञानी तरीकों कि इस तरह के वैकल्पिक मीडिया और ऊतक homogenizers के रूप में वर्णित उन लोगों से अलग, inocula तैयारी और संक्रमित ऊतकों से बैक्टीरिया की गणना के लिए उचित रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह अत्यधिक तैयार है या दिन अगर पिघल प्रयोग से पहले और एक अलग पानी से स्नान 50 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट में रात भर यह स्टोर करने की सिफारिश की है। इस प्रक्रिया को सरल और के खिलाफ अगर संक्रमण के समय में भी गर्म किया जा रहा गार्ड में मदद मिलेगी। 41 का तापमान - 42 डिग्री सेल्सियस maintai के बीच एक अच्छा संतुलन को प्राप्त होता हैनिंग अल्पकालिक बैक्टीरियल अस्तित्व के लिए बहुत गर्म किया जा रहा बिना तरल अवस्था में अगर। पोषक तत्व अगर करने के लिए एक संभावित विकल्प के रूप में, नोबल अगर सफलतापूर्वक कुछ प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है। अगर inoculum की एक ट्यूब के एक पूरे प्रयोग के लिए आमतौर पर पर्याप्त है (और सिफारिश की है), लेकिन कई ट्यूबों जानवरों की एक बड़ी संख्या को संक्रमित करने के लिए तैयार किया जा सकता है (जैसे 60 से अधिक) या संक्रमित करने की प्रक्रिया 30 से अधिक समय लेता है जब - 45 मिनट तो कई inoculum ट्यूबों के लिए आवश्यक हैं, अगर की प्रत्येक ट्यूब खारा जीवाणु निलंबन जोड़ने के रूप में यह आवश्यक है। यह जोखिम है कि बैक्टीरियल अस्तित्व और / या फिटनेस एक ऊंचा तापमान टीका करने से पहले करने के लिए विस्तारित जोखिम से प्रभावित हो जाएगा कम कर देता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई inoculum ट्यूब का उपयोग भी अतिरिक्त पशु यादृच्छिकीकरण प्रक्रियाओं की आवश्यकता हो सकती है। जब भी संभव हो, एक ही inoculum तैयारी से सभी जानवरों को संक्रमित। यह ते साथ प्रवीणता के वर्तमान स्तर को प्रयोगों के आकार से तैयार करने की सिफारिश की हैchnique।

एक कुशल वैज्ञानिक intubate और कम से कम 30 एस में एक पशु टीका लगाना और 5 के लिए ऊपर टीका लगाना कर सकते हैं - (एक अगर inoculum से भरा सिरिंज के साथ आईई) बैच प्रति 6 जानवरों। तकनीक सीखने वालों के लिए, गति जमना शुरू हो जाएगा अगर के रूप में महत्वपूर्ण है; हालांकि, inoculum के सटीक स्थान ज्यादा महत्वपूर्ण है। प्रति बैच 1 या 2 जानवरों के साथ शुरू, और वृद्धि के रूप में तकनीक को और अधिक परिचित हो जाता है। जानवरों इंटुबैषेण के दौरान सांस लेने के लिए जारी; 3 मिनट - इस प्रकार, टीका के लिए समय खिड़की कैसे जल्दी से पशु isoflurane, जो लगभग 2 होना चाहिए से ठीक हो जाए पर निर्भर करता है। पशु कि प्रक्रिया के दौरान फिर से जगाने anesthetized जा सकता है और एक दूसरी बार प्रयास किया, लेकिन यह तो बार-बार ऐसा करने की सिफारिश नहीं है। पहले ही प्रयास में सफल टीका जानवरों के लगभग 100% में होने की उम्मीद एक बार प्रवीणता हासिल की है। नोट में यह पहली बार चूहों का उपयोग तकनीक सीखना आसान है कि; चूहों और अधिक नाजुक होते हैं और छोटे भीरास अधिक जम अगर साथ रुकावट यदि जल्दी से चालाकी से नहीं होने का खतरा है। पूर्व वार्मिंग सीरिंज, ट्यूबिंग और खारा के रूप में अच्छी तरह से इस तरह के कम सेटिंग पर एक हीटिंग पैड के रूप में एक गर्म (गर्म नहीं) सतह पर इंटुबैषेण डिवाइस रखने, के रूप में, अगर की solidification को रोकने में मदद कर सकते हैं। जब तकनीक सीखने, यह भी एक काले रंग का डाई (जैसे केंद्रित methylene नीले रंग के रूप में) के बजाय अगर में जीवाणु निलंबन का उपयोग कर inoculum के उचित स्थान अभ्यास करने के लिए उपयोगी है। तुरंत डाई का टीका निम्नलिखित (पशु संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु के बीच ठीक करने के लिए अनुमति नहीं) के रूप में वर्णित प्रक्रिया को पूरा करें, लेकिन पशु euthanize। निर्धारित जहां डाई रखा गया है, और तदनुसार तकनीक समायोजित करने के लिए काटना।

इस मॉडल में प्राथमिक समापन बिंदु संक्रमित फेफड़ों से CFU है। जीवन रक्षा बैक्टीरियल बोझ का एक अच्छा संकेत नहीं है और एक सिफारिश समापन बिंदु नहीं है। समूह के अनुसार 6 जानवरों के रूप में इस predicte है - प्रभावकारिता पढ़ाई के लिए, सुझाव एन 5घ कम से कम 90% बिजली के साथ ≥1 लॉग समूहों के बीच 10 CFU मतभेद का पता लगाने के लिए। पशु समूहों में संक्रमित हो सकता है कि इस तरह के पिंजरे साथियों को एक साथ रहते हैं, या एक सच्चे randomization प्रक्रिया का पालन किया जा सकता है। (है कि बैक्टीरियल अस्तित्व की पुष्टि के लिए ध्यान दें कि यदि समूहों पिंजरे से आवंटित कर रहे हैं, समूहों अंत के अध्ययन वृद्धि पिछले संक्रमित नियंत्रण के साथ एक यादृच्छिक अनुक्रम में संक्रमित किया जाना चाहिए / फिटनेस एक ऊंचा तापमान के संपर्क में समय की लंबाई से प्रभावित नहीं था नहाने के पानी में)। कोई डेटा नहीं रोक लगाए तरीकों आवश्यक होना चाहिए, और कोई भी किसी भी जानवर है कि स्पष्ट रूप से गलत टीका अध्ययन की शुरुआत में (किसी भी उपचार की दीक्षा से पूर्व) में किया गया है की तत्काल हटाने के अपवाद के साथ की सिफारिश की है। पशु कि अध्ययन के अंत से पहले euthanized हैं जांचा जाना चाहिए और परिणाम डेटा सेट जब तक बहिष्कार के लिए एक वैध कारण भावी पहचान की थी में शामिल (यानी एक घटना संक्रमण या उपचार के लिए असंबंधित)। ड्रग भार एएफएफ मईect के कुछ नमूने और सभी में विवो संक्रमण मॉडल भर में एक महत्वपूर्ण विचार है। एक यौगिक अक्सर, इच्छामृत्यु के समय के करीब दिया या एक लंबे आधा जीवन है जाता है, यह (बैक्टीरियल गणना की प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया पूर्व vivo की हत्या के कमजोर पड़ने और चढ़ाना जारी रखने के लिए एक उच्च पर्याप्त एकाग्रता में ऊतक homogenate में मौजूद हो सकता है अगर प्लेटों पर नमूने या रात ऊष्मायन के दौरान)। यही नहीं, सक्रिय लकड़ी का कोयला और / या एक additive जो बैक्टीरियल कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाने नमूना homogenization करने से पहले करने के लिए जोड़ा जा सकता है बिना सक्रिय अणु degrades रोकने के लिए। अन्य तरीकों सक्रिय यौगिक (जो सतह पर तैरनेवाला में रहना चाहिए) के बहुमत को दूर करने के लिए नमूने centrifuging और विभिन्न कमजोर पड़ने रोजगार और योजनाओं चढ़ाना पर्याप्त एक गैर निरोधात्मक एकाग्रता के लिए सक्रिय यौगिक को कमजोर करने में शामिल हैं।

चित्रा 2 में दिखाया उदाहरण इसका सबूत है, इस मॉडल को सफलतापूर्वक मैं के रूप मेंउन है कि अच्छी तरह से अन्य मॉडल (जैसे एच इन्फ्लुएंजा) में जाना नहीं है सहित जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ कृन्तकों में फेफड़ों में संक्रमण nduces। इन संक्रमणों सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत कर रहे हैं, संभावना है कि प्रयोगों एक दिया अलग से मॉडल की विफलता और / या खराब प्रदर्शन के कारण बार-बार करने की आवश्यकता होगी कम करने। हालांकि जानवरों असुरक्षित हैं, वे तेजी से संक्रमण को हल करने के लिए अगर सब में असमर्थ हैं। इस अध्ययन की लंबाई में बढ़ लचीलेपन के लिए अनुमति देता है, कई वियोजन दोहराया इंजेक्शन neutropenia बनाए रखने के लिए की आवश्यकता के बिना कम से कम 96 घंटे के माध्यम से एक व्यवहार्य संक्रमण को बनाए रखने के रूप में। असुरक्षित पशुओं में जीवाणुरोधी प्रभावकारिता का अध्ययन करने की क्षमता का लाभ पहले से 20 का उल्लेख किया गया है, 21, और सबूत है कि, कुछ यौगिकों (जैसे ओक्षज़ोलिदिनोनेस) के लिए, गैर न्यूट्रोपेनिया मूषक से डेटा और अधिक सही मानव जोखिम लक्ष्यों को उन प्रदान की गई न्यूट्रोपेनिया के साथ तुलना की भविष्यवाणी कर सकते है 5। टी के बहुउद्देश्यीय उपयोगितावह मॉडल आंकड़े 3 और 4 और टेबल्स 1 और 2 के इन अध्ययनों में प्रदर्शन किया है की तुलना के लिए, प्रकाशित और अप्रकाशित डेटा का एक बड़ा संग्रह है कि नेतृत्व अनुकूलन के प्रयासों 16, 17 का समर्थन करने के लिए इस मॉडल के साथ उत्पन्न किया गया है, 22-24 का हिस्सा हैं और प्रस्तावित मानव खुराक की पुष्टि regimens 19, 25-29 और पी / पीडी लक्षण वर्णन के लिए 18, 30-32 .While इस मॉडल शुरू में अधिक intranasal साँस लेना विधि के साथ तुलना में संचालन करने के लिए जटिल है, वहाँ कई लाभ के रूप में ऊपर वर्णित हैं। अभ्यास और नियमित उपयोग के साथ, तकनीक प्रदर्शन करने के लिए सरल हो जाना चाहिए।

यह कुछ अध्ययन बताते हैं कि आधारभूत में बैक्टीरियल बोझ है कि आम तौर पर अन्य फेफड़े में संक्रमण मॉडल में लक्षित तुलना में कम थी में उल्लेख किया जा सकता है। यह अगर में आवश्यक कमजोर पड़ने और छोटे चुनौती मात्रा, विशेष रूप से चूहों में बड़े हिस्से में कारण है। हालांकि, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिएकि बैक्टीरिया विकास के सभी मामलों में भी जब प्रारंभिक बोझ अपेक्षाकृत कम था में देखा गया था। लक्ष्य आधारभूत जीवाणु भार है 6 6.5 10 CFU / फेफड़ों (6.8 7.3 लॉग 10 CFU / औसत फेफड़ों के वजन के आधार पर चूहों में ऊतक के ग्राम) जो गंभीर निमोनिया 33 के साथ मानव रोगियों में अनुमानित घनत्व से मेल खाती करने के लिए लॉग इन करें। एक उच्च आधारभूत बोझ आगे बैक्टीरियल inoculum ध्यान केंद्रित करके या अतिरिक्त बैक्टीरिया विकास की अनुमति के लिए यौगिक प्रशासन की शुरुआत में देरी से प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, बहुत ज्यादा चुनौती लोड बढ़ असामान्य रूप से गंभीर है और गंभीर बीमारी (यानी कम से कम 24 घंटे मृत्यु) कि संवेदनशीलता की परवाह किए बिना सभी जीवाणुरोधी उपचार के लिए आग रोक है हो सकता है। हालांकि शुरू में inoculum जानवर के बाएं फेफड़े में रियायत के तौर पर रखा गया है, संक्रमण आम तौर पर दोनों फेफड़ों भर में फैलता है। प्रगतिशील फेफड़ों के रोग, अन्य अंगों को बैक्टीरिया के प्रसार, और अंततः रुग्णता अक्सर observ हैएस निमोनिया, लालकृष्ण निमोनिया और पी aeruginosa के साथ एड। ब्याज की, एच इन्फ्लुएंजा और ए baumannii साथ संक्रमण आमतौर पर अधिक समाहित कर रहे हैं और शायद ही कभी निर्धारित बैक्टीरियल inocula में मौत का कारण हो।

इस मॉडल से प्राप्त प्रभावकारिता परिणामों में इन विट्रो संवेदनशीलता प्रोफाइल के रूप में अच्छी तरह के रूप में परिभाषित पी / पीडी लक्ष्य के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध है। बैक्टीरियल बोझ में कटौती नियमित तौर पर, एजेंट के लिए अतिसंवेदनशील परीक्षण किया जा रहा माना वियोजन के लिए मनाया जाता है, जबकि उन पर विचार प्रतिरोधी प्रदर्शनी आधारभूत 16, 17, 19, 24-29 से ऊपर कोई परिवर्तन या बैक्टीरिया का विकास। दो क़ुइनोलोनेस और एक macrolide इस मॉडल का उपयोग कर 32 के मूल्यांकन के चूहों में अध्ययन से पता चला है कि पी / पीडी लक्ष्य के लिए आवश्यक एक 1-लॉग एस निमोनिया में 10 कमी न्यूट्रोपेनिया चूहों में निर्धारित लक्ष्य और अधिक महत्वपूर्ण बात के साथ सहसंबद्ध आधारभूत के साथ तुलना में, के साथ समुदाय का अधिग्रहण बैक्टीरियल Pneum के लिए नैदानिक ​​लक्ष्योंOnia 6, 7, 34, 35। Gepotidacin, एक उपन्यास तंत्र एंटीबायोटिक, कई एस निमोनिया के खिलाफ परीक्षण किया गया था और एक 1-लॉग 10 न्यूट्रोपेनिया जांघ मॉडल में एक 1-लॉग 10 कम करने के लिए आवश्यक है कि इस के रूप में फेफड़ों के संक्रमण मॉडल 31 में कमी के लिए एक समान पी / पीडी लक्ष्य की आवश्यकता 36 जब फेफड़ों के प्रवेश को ध्यान में रखा गया था (फाइल पर डेटा)। इसी तरह, पी / पीडी पी aeruginosa के खिलाफ GSK2251052 के लिए चूहों में निर्धारित लक्ष्यों, 38 ठहराव, 1- और इस फेफड़ों मॉडल 30 और न्यूट्रोपेनिया जांघ संक्रमण मॉडल के बीच CFU में 10 में कटौती 2-लॉग इन करने के लिए संगत कर रहे थे जब फेफड़ों के प्रवेश 37 माना जाता था । एक न्यूट्रोपेनिया फेफड़े में संक्रमण intranasal टीका गरीब था का उपयोग कर मॉडल के साथ संबंध; हालांकि, GSK2251052 कि अध्ययन 38 में एक स्थिर प्रतिक्रिया की तुलना में अधिक उत्पादन नहीं किया था। यह 6 प्रवेश के साथ तुलना के रूप में उच्च बैक्टीरियल inoculum, जो 8 लॉग 10 CFU / माउस था के कारण हो सकता है 37 और intratracheal इंटुबैषेण 30 मॉडल में माउस। के रूप में यह translational भविष्य कहनेवाला क्षमता का आकलन करने के मौजूदा मॉडल और नैदानिक ​​डेटा के साथ संबंध के साथ प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है इस तरह के रूप डेटा का संग्रह, बेंच मार्किंग के लिए महत्वपूर्ण है। intratracheal इंटुबैषेण फेफड़े में संक्रमण मॉडल के अधिक व्यापक उपयोग विश्लेषण के इन प्रकार के लिए अतिरिक्त डेटा प्रदान करेगा।

इस असुरक्षित निमोनिया मॉडल के कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह नहीं सहज प्रतिरोध के उद्भव का मूल्यांकन क्योंकि उच्च बैक्टीरियल inoculum आम तौर पर बहुत गंभीर एक संक्रमण में इस तरह के अध्ययन के परिणामों के लिए आवश्यक करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। प्रयासों के बाद (फाइल पर डेटा) पूर्व मौजूदा विषाक्त पदार्थों को दूर करने के लिए inocula के पूरी तरह से धोने के बावजूद (में कम से कम 24 घंटे मरणासन्न बनने यानी जानवरों) 7 या 8 लॉग बेस लाइन पर 10 CFU, तेजी से रुग्णता देखा गया है की बैक्टीरियल बोझ को प्राप्त करने के लिए। यहबड़े मूषक का उपयोग करके इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए संभव हो सकता है। चूहे, विशेष रूप से भारी चूहों (> 250 ग्राम), बेहतर रूप में चूहों के साथ तुलना में उच्च inocula बर्दाश्त करने के लिए दिखाई देते हैं और अध्ययन के इन प्रकार के लिए उपयुक्त हो सकता है। रोगज़नक़ बातचीत: एक दूसरी सीमा है कि एक संक्रमण-बढ़ाने के रूप में अगर के उपयोग के कुछ मेजबान के मूल्यांकन के लिए मॉडल का उपयोग कर छीन सकता है। यह माना जाता है कि अगर एक संरक्षित केन्द्र बिन्दु तक संक्रमण पूरी तरह से फेफड़ों के भीतर स्थापित किया है प्रदान करता है। बल्कि यह अगर मदद करने के लिए इस मुद्दे पर काबू पाने से खारा में inoculum वितरित करने के लिए संभव है; हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह केवल कुछ वियोजन के साथ संक्रमण का उत्पादन होगा। तीसरा, वहाँ एक तेजी से सीखने की अवस्था तकनीक में कुशल बनने के लिए आवश्यक है। प्रक्रिया नाजुक हो सकता है, विशेष रूप से चूहों में। यह गलती से घेघा में धातु प्रवेशनी जगह के लिए आसान है, और अत्यधिक बल या तो घेघा या श्वासनली के पंचर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। inoculum की सावधानी स्थान भी हैआवश्यकता है या जानवरों या तो ठीक हो या नहीं हो सकता है नहीं पर्याप्त रूप से संक्रमित हो। हालांकि, धैर्य और दृढ़ता के साथ, एक अत्यधिक कुशल हो और जल्दी तकनीक का प्रदर्शन कर सकते हैं, आसानी से और सही।

neutropenia के लिए आवश्यकता को दूर करने, मजबूती और reproducibility बढ़ रही है, जांचकर्ताओं अधिक रोगज़नक़ों और वियोजन अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, प्रयोगात्मक डिजाइन के लचीलेपन में सुधार और निमोनिया के लिए फार्माकोडायनामिक्स को चिह्नित करने के लिए एक चुनौतीपूर्ण संक्रमण प्रदान करके, इस असुरक्षित फेफड़े में संक्रमण मॉडल एंटीबायोटिक की खोज करने के लिए पर्याप्त मूल्य कहते हैं समुदाय। अतिरिक्त जांचकर्ताओं द्वारा इस मॉडल के उपयोग में वृद्धि में मदद मिलेगी आवश्यक बेंच मार्किंग प्रदान इसे और अधिक व्यापक स्वीकृति हासिल है और उचित व्याख्या के लिए सहायक सूचना उपलब्ध कराने के लिए जारी करने के लिए।

Disclosures

लेखकों सभी कंपनी के भीतर शेयर की ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन फार्मास्युटिकल्स के कर्मचारियों और अपने शेयरों का भुगतान किया जाता है।

Acknowledgments

झा स्वीकार करते हैं और हमें पहले इस मॉडल को पढ़ाने के लिए गुरु, मित्र और पूर्व प्रबंधक वैलेरी बेरी का शुक्रिया अदा करना चाहता है; और गैरी Woodnutt, जो हमें की नींव पढ़ाया जाता है और जीवाणुरोधी पी / पीडी के क्षेत्र के लिए हमारी प्रतिबद्धता को प्रेरित किया। सभी लेखकों ने अपने समर्थन और हमारे विज्ञान के लिए प्रशंसा के लिए डेविड पायने का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम विवो माइक्रोबायोलॉजी उनके सहयोगियों ने जो इन तरीकों, विशेष रूप से पीट DeMarsh, रोब स्ट्रॉब, Roni पेज और Nerissa साइमन का उपयोग कर उत्पन्न डेटा के शरीर के लिए योगदान में हमारे पूर्व स्वीकार करना चाहते हैं। अंत में, हमारे धन्यवाद हमारे इन विट्रो माइक्रोबायोलॉजी सहयोगियों को उनकी सहायता के लिए, विशेष रूप से सभी mics हम अनुरोध करते हैं (लिन मैकक्लोस्की, जोश पश्चिम और शेरोन मिन) प्रदान करने के लिए जाना; और हमारे नैदानिक ​​सूक्ष्म जीव विज्ञान टीम है जो विशेषज्ञ सलाह और समर्थन (लिंडा मिलर, निकोल Scangarella-ओमान और डेबोरा बटलर) प्रदान करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood Becton Dickinson and Company 4321261
Chocolate II Agar Becton Dickinson and Company 4321267
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified Becton Dickinson and Company 299070
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol Becton Dickinson and Company 297808 storage media for frozen stock
Inoculating loop Nunc 251586
0.9% Sodium Chloride, USP Baxter Healthcare Corporation NDC 0338-0048-04
Difco Nutrient Agar Becton Dickinson and Company 213000
30 mL free standing centrifuge tube with cap EverGreen Scientific 222-3530-G80
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Falcon, a Corning Brand 352070
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm Falcon, a Corning Brand 352059
Guide Tool Intek Services Ltd GT01 custom-made metal cannula for rats
90' Portex tubing SAI POR-080-100 plastic cannula for rats
1 mL TB syringe slip tip Becton Dickinson and Company 309659
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 Becton Dickinson and Company 305122
Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 Popper and Sons, Inc 7903 used to create metal cannula for mice
Intramedic polyethylene tubing Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company 427401 plastic cannula for mouse 
75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 Hamilton 87930 HPLC glass injection syringe
Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner Corning 9825-25 to autoclave/store metal cannulae
70% isopropyl alcohol Vi-Jon (Swan) NDC 0869-0810-43
Isoflurane, USP Piramal Healthcare NDC 66794-013-10
Stomacher  Seward Stomacher80
Stomacher 80 classic bags Seward BA6040
Assay plate, 96 well, round bottom Costar, Corning Inc 3795 optional, for serial diluting
Blood Omni Plates Hardy #A127 optional, rectangular blood plates

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References

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  38. Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, Abstract A-1271 (2012).

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