מודל דלקת ריאות חזק במכרסמי immunocompetent להערכת יעילות אנטיבקטריאלי נגד

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hoover, J. L., Lewandowski, T. F., Mininger, C. L., Singley, C. M., Sucoloski, S., Rittenhouse, S. A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii. J. Vis. Exp. (119), e55068, doi:10.3791/55068 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

יעילות של טיפולים אנטי-בקטריאלי מועמד חייבת להיות מופגנת במודלים של בעלי חיים של זיהום כחלק מתהליך הגילוי ופיתוח, רצוי במודלים אשר לחקות את האינדיקציה הקלינית המיועדת. שיטת התרמת דלקות ריאות חזקות אצל חולדות ועכברים עם מערכת חיסון תקינים מתוארת אשר מאפשרת ההערכה של טיפולים במודל של דלקת ריאות חמורות הנגרם על ידי S. pneumoniae, H. אינפלואנזה, פ aeruginosa, ק pneumoniae או baumannii א. בעלי חיים מורדמים, וכן בידוד אגר מבוססת מופקד עמוק לתוך הריאות באמצעות אינטובציה intratracheal הניתוחית. הזיהום הנובע עולה בקנה אחד, לשחזור, ויציב לפחות 48 שעות ועד 96 שעות עבור רוב הבידודים. מחקרים עם antibacterials משווקים הוכיחו קורלציה טובה בין יעילות in vivo ו רגישות במבחנה, הלימה בין מטרות pharmacokinetic / pharmacodynamic נקבעהבמודל זה ויעדים קבלו קליני נצפה. אמנם יש השקעה ראשונית זמן כאשר לומדים את הטכניקה, זה יכול להתבצע במהירות וביעילות פעם מיומנת מושג. יתרונות של המודל כוללים חיסול של דרישת נויטרופני, חוסן מוגבר שחזור, יכולת ללמוד יותר פתוגנים ומבודדים, גמישות משופרת בעיצוב מחקר והקמת זיהום מאתגר מארח עם מערכת חיסון תקין.

Introduction

הערכת היעילות של לתרופות פוטנציאליות במודלים של בעלי חיים של זיהום הוא מרכיב קריטי של תהליך גילוי תרופות אנטיבקטריאלי. בשנת vivo מחקרי יעילות לספק נתונים חשובים לקבלת החלטות על פני האורך של מאמצי גילוי, מן הבהרת יחסים-פעילות מבנה (SAR) ואופטימיזציה סדרה כימית להוביל דרך קביעה-pharmacodynamic pharmacokinetic (PK / PD) מאפיינים של תרכובות ותמיכת בחירה במינון פיתוח ואישור רגולטורים קליניים. דגמים רבים זיהום חיה מתוארים בספרות למטרות אלה. אחד המודלים הנפוצים ביותר בשימוש נרחב הוא זיהום ירך עכבר נויטרופני, אשר היה חלוץ ידי 1 נשר, 2 והרחיבו לאחר מכן פוגלמן וקרייג 3, 4. מודל זה כבר לא יסולא בפז לתמיכת קביעת נקודות עצירה רגישה חיידקים למתן מטרות PK / PD להנחות מינון אדם. ישנם בחינה רבהPles שבהם היכולת החזויה של מודל זה הוכחה 4-7. עם זאת, אחד החסרונות של מודל זיהום הירך הוא חוסר הרלוונטיות ישירה למחל ריאה. כיום ישנו דגש רב יותר על התאמת האתר של זיהום במודלים של בעלי חיים לאתר של זיהום בבני אדם; וכך, ללמוד תרכובות לטיפול בדלקת ריאות, הוא אידיאלי כדי לנצל מודל דלקת ריאות בחיות.

כמה שיטות גרימת זיהומים בריאות בחיות מעבדה תוארו ושימשו מחקרי יעילות אנטיבקטריאלי כולל שאיפה אפי, השאיפה דרך המסלול הלוע התחתון, חשיפה אירוסול, וכירורגי intratracheal חיסון 8. במקרים רבים, בעלי החיים (במיוחד עכברים) צריכים קודם כל להיות שניתנו נויטרופני על מנת להשיג זיהום ריאות חזק. למרות קשה זו מדינת מדוכאי חיסון, מספר חיידקים פתוגנים זנים אשר מייצרים זיהומי קיימא במכרסמים הואמוגבל. לדוגמה, זה יכול להיות קשה לקבוע אינפלואנזה המופילוס בהצלחה או baumannii Acinetobacter במודלים דלקת ריאות 9, 10, ופתוגנים אפילו יותר ארסית, כגון Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ו Klebsiella pneumoniae, יכול להוות אתגר 11-13.

בשנת 1991, סמית 'תארה מודל דלקת ריאות אצל חולדות יַנוּקָא immunocompetent שבו הזיהום הוקם על ידי הקניית חיידקים ישירות לריאות באמצעות שיטת אינטובציה intratracheal ניתוחית פשוט 14. ברי et al. מאוחר יותר שינה את שיטת הדבקת עכברים 15. שימוש בידוד אגר מבוסס, טכניקת חיסון זה גורמת למחל ריאה חזקות בשני חולדות ועכברים עם מערכת החיסון התקינות עם ס pneumoniae, H. אינפלואנזה, ק pneumoniae, פ aeruginosa ו baumannii א. זה מקובל מגוון רחב של בידודים, כולל אלה מחסה שונה להתנגדהגורם אהה ואלה אשר אינם מייצרים זיהום קיימא דרך נתיבי חיסון אחרים. זה גם מאפשר יעילות שתיקבע בחיות immunocompetent, מצב שבו הוא רלוונטי יותר מאשר דגם העכבר המסורתי נויטרופני עבור אוכלוסיות חולים שאינם מדוכאי חיסון קשה. העקביות והאמינות של המודל הזה על פני פתוגנים רבים ומבודדים עושות את זה היטב מתאים מחקרי יעילות אנטיבקטריאלי.

Protocol

ס pneumonie

כל הנהלים הם בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים GSK ושימוש (IACUC), ולפגוש או יעלה את הסטנדרטים של האגודה האמריקאית להסמכת של טיפול בבעלי חיים מעבדה (AAALAC), מחלקת ארצות הברית הבריאות ושירותי האנוש שירותים וכל חוקי צער בעלי החיים המקומיים ופדרליים.

הערה: אם לא צוין אחרת, כל ההליכים צריכים להתבצע באמצעות טכניקה מזוהמת.

1. מבודד התרבות חיידקי

  1. כן 3 עד 6 צלחות אגרו עם ס pneumoniae או H. אינפלואנזה, כתרבות מרק בדרך כלל אינה מספקת מספיק חומר חיסון.
    1. הסר תרבות המניות קפוא מאחסון ב -80 ° C, להפשיר לחלוטין, פס עד 100 μL לכל צלחת על אגר סויה tryptic בתוספת דם כבשים (ס pneumoniae) או על אגר שוקולד (אינפלואנזה ח) באמצעות טכניקות מיקרוביולוגיות תקן. דגירה לילה בשעה 37 ° C עם או בלי 5% CO 2.
  2. הכן תרבויות מרק עם ק pneumoniae, פ aeruginosa או baumannii א.
    1. הסר תרבות המניות קפוא מאחסון ב -80 ° C, להפשיר לחלוטין, ו aliquot 100 μL של המניה לתוך 50 אינפוזיה מ"ל המוח-לב מרק (BHI). דגירה לילה בשעה 37 ° C עם רעד עדין (כ 120 סל"ד).
    2. [אופציונאלי] אם תרבות שלב יומן היא רצויה, aliquot 1 מיליליטר מתרבה הלילה כתוצאה לתוך 50 מיליליטר מרק הצח BHI. דגירה של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (כ 120 סל"ד).

2. כן מלוח בקטריאלי השעיות

  1. עבור כל הצעדים הכנים השעיה (2.1 כדי 2.3), לנצל מלח סטרילית בטמפרטורה בין באוויר הסביבה ו -37 מעלות צלזיוס. קציר צמיחת לילה של ס pneumoniae או H. אינפלואנזה מהצלחות אגרו ידי מושבות גירודמפני השטח עם לולאה סטרילי. העברתי את החומר שנקטף לתוך 5 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית עד מעונן, השעיה אטומה מתקבלת מערבולת בעדינות עד הומוגניות.
  2. צנטריפוגה 50 מ"ל של pneumoniae ק, פ aeruginosa או א baumannii תרבויות מרק סופי אשר מיועד עבור חיסון (למשל לילה או להתחבר תרבויות שלב) במשך 5 דקות ב 4500 x ז. הסר supernatant עם טפטפת וזורקים. Resuspend גלולה לפחות מלוחים 5 מ"ל סטרילי, מערבולת בעדינות כדי להשיג השעיה הומוגנית.
  3. במידת צורך, לדלל את ההשעיה באמצעות תמיסת מלח סטרילית נוסף כדי להשיג צפיפות בטווח של 8 עד 9 יומן 10 יחידות מושבת יוצרים (CFU) / mL. הסרת aliquot זיהוי CFU / mL. סדרתי לדלל ואת הצלחת aliquot כמתואר בסעיפים 7.5 ו -7.6.

3. מכינים את אגר מבוססי הבידוד

  1. הכינו בקבוק קטן (כ 50 מ"ל) של אקור אגר מזיןדינג להוראות היצרן או להמיס בקבוק אגר מזין מוצק שהוכנה ומאוחסנים בעבר. ולאפשר לו להתקרר כ 50 מעלות צלזיוס.
  2. הובלת אגר נוזלים וכל הכלים הדרושים וציוד תהליך ההדבקה לאזור הליך שבו החיות יידבק. יש לשמור על אמבט מים קטן נקבע על 42 מעלות צלזיוס באזור.
  3. אפשר אגר כדי להגיע לטמפרטורה של כ -50 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן aliquot 9 מ"ל לתוך צינור סטרילי בגודל מתאים להשתלב באמבט מים. השאירו הצינור הזה באמבט מים עד אגר equilibrates כ 42 מעלות צלזיוס. ודא המים בעומק אשר יכסה את פני השטח של אגר במכל שלה אבל לא לגעת כובע או מכסה.
  4. הוסף 1 מ"ל של ההשעיה חיידקי מלוחים משלב 2.3 לתוך שפופרת המכילה 9 אגר מ"ל באמבט מים. כיסוי או צינור, להפוך מספר פעמים כדי לערבב, ולהחזיר אותו באמבט מים.

4.nesthetize, לצנרר ולחסן בעלי חיים

הערה: Specific הפתוגן חינם (SPF) זכר עם מערכת חיסון תקינה ספראג-Dawley חולדות במשקל 100 - 120 גר 'או עכברים CD-1 זכר במשקל 20 - 25 גרם המומלצים. לספק את כל החיות עם כרצונך מזון ומים ולשכן אותם חברתי על שבבי עץ או מצעים סופגים אחרים עם מחזורי אור כהה תקן 12 שעות.

  1. לפני ביצוע כל ניסויים, השג לעקר צינורות צינורית ופוליאתילן מתכת של הגודל המתאים עבור המינים של בעלי החיים. השג סטרילי 1 מ"ל מזרקים חד פעמיים ומחטים 25-מד הפנויה סטרילי.
    זהירות: תמיד להשליך מזרקים ומחטים אלה במכל חד.
    1. עבור חולדות, רכישה או לייצר צינורית מתכת כי הוא כ 12 סנטימטר אורך, אשר מזהה של 0.9 - 1.0 מ"מ ו OD של 1.0 - 1.2 מ"מ, והוא כפוף בזווית משוערת 45 ° בקצה אחד. חותכים באורך 11- 12 אינץ 'של צינורות פוליאתילן עם תעודת זהות של 0.4 מ"מ מ"מ 0.8 OD. (מתייחס
    2. עבור עכברים, לרכוש צינור להזנת בעלי חיים 20 #. הסר את הכדור בקצה הצינור ידי אחיזה בו במלקחים ומושך בחדות, ואז בעדינות תכופף את קצו בזווית משוערת 45 °. חותכים באורך 11- 12 אינץ 'של צינורות פוליאתילן עם תעודת זהות של 0.28 מ"מ מ"מ 0.61 OD. כמו כן לרכוש לעקר מזרק הזרקת מיקרו זכוכית 100 μL ומחט מתכת 30-מד הזרקת מיקרו. (עיין באיור 1 ב.)
    3. מניחים את צינורית מתכת בתוך שפופרת זכוכית, בורג מכסה החיטוי על ידי שיטות סטנדרטיות לעקר. משרים ולאחסן לחתוך באורכים של צינורות פוליאתילן בתוך אלכוהול המכיל כוס מכוסה.
  2. הכן את משטח העבודה ואת מכשיר אינטובציה.
    1. מניח מחצלת הפנויה נקיה על גבי משטח העבודה, קרובה באמבט המים. מעבירים את צינורית מתכת, צינור אחסון הזכוכית שלה, על פני השטח זה. הסר את המכסה מצינור האחסון וחלק סוף "הידית" של cannuלה אל הקצה הפתוח של הצינור.
    2. בעזרת מלקחיים סטריליות, להסיר אורך אחד של צינורות פוליאתילן מהקנקן ולהכניס אותו דרך החלק הפנימי של צינורית מתכת סטרילי, כדי לוודא שהוא נע בחופשיות. התאם מחט 25-מד פנוי סטרילי (לחולדות) או מחט מתכת 30-מד המעוקר של מזרק הזרקת מייקרו זכוכית (עבור עכברים) על הקצה החופשי של צינורות פוליאתילן על ידי החלקת מ"מ המחט כמה לתוך הצינורות. (עיין איור 1A עבור עכברוש ואיור 1B עבור עכברים).
    3. סימני מדריך מקום משני צינורית מתכת צינורות פוליאתילן כדי לציין עומק ההכנסה חיה על ידי ביצוע ההליך המתואר להלן אינטובציה על חיה מורדמת יחידה. פתח את חלל בית החזה לצורך השגחה, ולאחר מכן למקם את צינורית מתכת כראוי ולהתקדם צינורות פוליאתילן כראוי (כמפורט בסעיף 4.7). באמצעות עט מחיק, לסמן את צינורית מתכת שבו הוא מקיים את הפה של חיה ואת פוליצינורות אתילן איפה זה פוגש העליון של צינורית המתכת לסייע מיקום נכון בחי נותרים.
  3. בתוך במנדף (או באמצעות מערכת הדחה מתאימה), להרדים עד 6 חיות בכל פעם בתא סגור מסופק עם isoflurane ≤5% חמצן 1.5 ליטר / דקה עד רפלקס ההקאה מעוכב (כ 1 דק ').
    הערה: לפני ביצוע כל ניסויים, להקים זמן מינון חשיפה הבטוח עבור isoflurane בתנאים הספציפיים שבשימוש (למשל גודל / סוג של תא וגודל / מינים / זן של בעלי חיים), כדי למנוע חשיפה קטלנית בשוגג.
  4. ממלאי מזרק מיליליטר סטרילי חד פעמי 1 (לחולדות) עם תמיסת מלח סטרילית על ידי צבת הקצה סטרילי לתוך המליחים שהפילו על הבוכנה. מלאו את המזרק מיקרו הזרקה זכוכית סטרילית (עכברים) כמפורט להלן. צרף את מזרק מחט המצויד על צינורות פוליאתילן, ולשטוף את כל הנפח של תמיסת מלח דרך הצינורות עד syringדואר מתרוקן.
    1. כדי למלא את המזרק מיקרו הזרקה (עבור עכברים), להסיר לחלוטין את המתכת הבוכנה ואת המחט (מצויד על צינורות פוליאתילן) מן המזרק להגדיר גם בצד.
    2. ממלאי מזרק מיליליטר סטרילי חד פעמי 1 עם תמיסת מלח סטרילית (כמתואר לעיל) ולצרף מחט 25-מד פנויה סטרילי. הכנס את המחט לתוך החלק העליון של המזרק מיקרו הזרקה (שבו הבוכנה מתכת יוכנס), ומדכאים את הבוכנה של מזרק חד פעמי עד שהוא ממלא את המזרק מיקרו הזרקה עם מי מלח.
    3. מחק את המזרק ומחט הפנויים כי שמש כדי למלא את מזרק מייקרו הזרקה לתוך במכל חד. לצרף מחדש את המחט הזרקת מיקרו מתכת (מצויד על צינורות פוליאתילן) אל קצה המזרק מיקרו הזרקה מחדש להכניס את הבוכנה מתכת, מדכא עד נפח שלם של מלוחים כבר סמוקות דרך המזרק צינורות.
  5. מלא את המזרק עם הבידוד מבוסס אגר הלוך ושובמ 'המכל באמבט המים, ואת אגר סומק דרך הצינורות רק עד הצינורות ערוכים (למשל מלא לחלוטין עם אגר).
    1. עבור חולדות, להוציא את המחט 25-מד (מצויד על צינורות פוליאתילן) מן מזרק חד פעמי. מחק את המזרק בשימוש במכל חד. ממלאי מזרק 1 מיליליטר חד פעמי חדש, סטרילי עם הבידוד אגר מבוססת מהמכל באמבט המים על ידי נחת הקצה סטרילי לתוך הבידוד ומושך בחזרה על הבוכנה. Re-לצרף מחט (מצוידת על צינורות פוליאתילן) ואת אגר סומק דרך הצינורות מדכא את הבוכנה רק עד צינורות מלאים לחלוטין עם אגר.
    2. עבור עכברים, להוציא את המחט הזרקת מיקרו מתכת (מצויד על צינורות פוליאתילן) ואת הבוכנה מתכת מן המזרק מיקרו הזרקה ומניחים בצד. באמצעות מזרק 1 מ"ל חד פעמיות סטריליות מחט 25-מד הפנויה סטרילי, למלא את המזרק מיקרו הזרקה עם הבידוד אגר מבוססי מן המיכלבאמבט מים באמצעות ההליך מילוי כמתואר בסעיף 4.4. לצרף מחדש את מחט הזרקת מייקרו מתכת (מצוידת על צינורות פוליאתילן), הכנס את בוכנת המתכת, ואת אגר סומק דרך הצינורות רק עד צינורות מלאים לחלוטין עם אגר.
  6. הסר חי אחת מאולם ההרדמה. מניחים את חיה במצב פרקדן על מחצלת הפנויה עם הראש ימינה והזנב שמאלה כפי שמוצג באיור 1C.
  7. שימוש במכשיר אינטובציה (כלומר צינורית המתכת מצוידת צינורות פוליאתילן), לצנרר החיה והכנס את הצינורית לתוך האונה הגדולה של הריאה השמאלית (ראה האיור 1D).
    1. הכנס את הקצה החופשי של צינורית המתכת לתוך הפה של החיה. סובב את הצינורית כך את הקצה החופשי הוא זווית כלפי מעלה בעדינות לקדם אותו לתוך קנה הנשימה, תוך עקיפת המבנים בגרון בזהירות עם תנועת פיתול קלה. אשר להכנסה לתוך קנה הנשימה בניגודהוושט ידי החלקת צינורית בעדינות מעט קדימה ואחורה מספר פעמים תוך מישוש מצלצל קנה הנשימה עם האצבע שמאלה כפי שמוצג באיור 1C.
    2. כאשר הצינורית מגיעה ההסתעפות שבו קנה הנשימה מתפצלת הסמפונות על ימין ועל שמאל, לבצע תנועת פיתול קלה לעבר הצד השמאלי של החיה כדי להבטיח את הצינורית מוחדרת לתוך הסמפונות עזב. לקדם את צינורית המתכת עד הסוף הוא באמצע הדרך עד שלושה רבעים לאורך הריאה השמאלית, באמצעות סימן המדריך להציב בעבר כדי לאשר את העומק המתאים הושג.
    3. עם צינורית מתכת במקום, לקדם את פוליאתילן צינורות כמה מ"מ. השתמש בסימן המדריך להציב בעבר על הצינורות כדי להבטיח היא מתקדמת רק רחוק מספיק כדי לצאת סוף צינורית המתכת ולא לנקב את הריאות.
  8. בשני cannulae במקום, להשתמש במזרק המצורף להנחיל 100 μL (לחולדות) או 20 μL (עבור עכברים) של suspe אגרnsion עמוק לתוך האונה הגדולה של הריאה השמאלית (ראה האיור 1D). למשוך כמה מ"מ של צינורות פוליאתילן, ולאחר מכן הסר בעדינות את המכשיר אינטובציה ללא פגע. הגדר אותו בחזרה לתוך צינור אחסון זכוכית, ולעבור את החיה לכלוב טרי להתאושש.
  9. המשך הרדמה, intubating וכך גם יחסנו החיות שעדיין נותרו.
    1. בין קבוצות של חיות הרדימו, להוציא את המחט (מצוידת על הצינורות) מן המזרק. עבור חולדות, לבטל את המזרק חד פעמי בשימוש במכל חד ולמלא מזרק חד פעמי חדש, סטרילי מן הבידוד באמבט המים. עבור עכברים, למלא את המזרק מיקרו הזרקה אותה כוס מן הבידוד באמבט מים באמצעות טכניקה מילוי כמתואר בסעיף 4.4.
    2. אם אגר מתחיל להתעבות במכשיר אינטובציה, לרוקן את כל אגרו הנותרים דרך הצינורות. הסר את המחט מן המזרק (עזיבת מחט מצויד על צינורות פוליאתילן). פעל על פי ההליכים המתואריםבסעיף 4.4 כדי לשטוף מלח חם, סטרילי דרך מכשיר אינטובציה, חוזר כנדרש כדי סתימה ברורה כל לחלוטין. מלוח רוקנו את כל מן המזרק ולהכין את הבידוד אגר שוב כמתואר בסעיף 4.5.
    3. חשבת את בידוד החיידקים הסופי לכל חיה באמצעות CFU נקבע מן ההשעיה המלוחה (ראה סעיף 2.3), גורם לדילול הסופי של ההשעיה המלוחה לתוך אגר (למשל פי עשר), ואת הנפח החדיר לתוך החיות (למשל 100 μL עבור חולדות או 20 μL עבור עכברים).

5. הערכת בעלי חיים עבור Mis חיסון פוטנציאלי או תופעות לוואי אחרות

  1. אנא קראו בעיון את כל בעלי החיים במהלך אינטובציה, החדרה של אגרתי התאוששות מן ההרדמה להעריך עבור mis-חיסון פוטנציאלי. מייד להרדים (על פי הנחיות מקומיות IACUC) כל בעל חיים אשר מדמם, מפגין נשימה נורמלית (כגון נשימה מאומצת או מתנשף), לא זזבדרך כלל על הכלוב, או אינו מופיע בהיר עיניים ובריאות על התאוששות מן ההרדמה.
  2. אם הפסקת ספונטנית של הנשימה מתרחשת (בדרך כלל כאשר הבידוד לא ממוקם עמוק מספיק וחוסם את דרכי הנשימה), לאשר למוות על ידי תצפית ולבצע שיטה משנית של המתת חסד (כגון נקע בצוואר הרחם או פתיחת בית החזה).
  3. מזער את אורך חי זמן נחשף isoflurane, כמו הרדמה נדרשת רק במשך מספר דקות כדי לבצע את ההליך. אם משמשים הרדמה בזריקות, להבטיח את בעלי החיים הם תחת השגחה עד ער לחלוטין. מניחי חיות, במיוחד עכברים, בסביבה חממה להתאוששות בעת שימוש הרדמה בזריקות.
  4. תצפיות על בעלי חיים לפחות פעמיים ביום במהלך תקופת המחקר את הסימנים הבאים לחלות במחלות נשימתיות: נשימה מודגשת, piloerection, פעילות מופחתת טמפרטורת הגוף מופחת. מייד להרדים (על פי הנחיות מקומיות IACUC) כל בעל חיים הוא גוסס, experiences קשיי נשימה או מצוקה נשימתית, יש טמפרטורת גוף מופחתת במידה ניכרת על טיפול, הוא מסוגל או לא רוצה לעבור, או לא יכול להגיע מזון ומים.

6. טיפולי ניהול 'מבחן

  1. להכין את טיפולי בדיקה על פי מערך מחקר מתוכנן. בגין מתן טיפולי זיהום 1 או 2 שעות שלאחר (או לדחות את הטיפול עוד יותר אם ניטל חיידקי בסיסי גבוה יותר הוא רצוי). פרטים ספציפיים להכנה ומנהל של טיפולי בדיקה אינו יכולים להינתן כפי שהוא תלוי מטרת המחקר, כמו גם את המאפיינים של כל טיפול אינדיבידואלי. (עיין באיור 3 כדוגמה.)
  2. הקבוצה להפריש אחד של בעלי חיים נגועים, מטופל לשרת שולטת בסיס כמו. למנות את הנטל חיידקי בתוך הריאות של בעלי חיים אלה על הטיפול פעם היא יזמה עבור קבוצות אחרות, בעקבות ההנחיות המתוארות בסעיף 7.
  3. לקבלת PK / PD מנתח, להעריךהפרופיל pharmacokinetic של טיפול מנוהל (ים) בדם ו / או רקמות של חיות נגועות. נהלים ספציפיים עבור מחקרי פרמקוקינטיקה הם מחוץ להיקף של מאמר זה.

7. למנות חיידקים בת קיימא מהריאות

  1. להרדים קבוצה אחת של בעלי חיים שלא טופלו בזמן הטיפול היא יזמה עבור קבוצות אחרות (הבסיס) וכל החיות שעדיין נותרו בסוף תקופת המחקר (בדרך כלל 24, 48 או 96 שעות לאחר הפגיעה) על ידי חשיפה שאיפה עולה רמות בהדרגה של פחמן פחמן דו בתוך חדר סגור או שיטה חלופית כפי שהומלץ על ידי הנחיות IACUC מקומיות. ודא למוות על ידי התבוננות, ולבצע שיטה משנית של המתת חסד (כגון נקע בצוואר הרחם או פתיחת בית החזה).
  2. מניח את החיות במצב פרקדן על מחצלת הפנויה נקיה, וביסודיות להרטיב את הפרווה על החזה עם אלכוהול.
  3. בעזרת מספריים סטריליות, לחתוך דרך העור, שבבסיס שכבת השריר ואת בית החזהבמקביל עצם החזה כדי לפתוח את בית החזה. בעדינות לתפוס את הריאות עם מלקחיים סטריליות ומשוך כדי להוציא, באמצעות מספריים להפריד ביניהם מקנה הנשימה במידת הצורך. מניחים הריאות על גזה סטרילי לספוג דם עודף. אם הלב הוסר גם, לנתח אותו וזורקים.
  4. הפוך חיתוכים קטנים בתוך הריאות במספריים סטריליות לחשוף חלקי פנים ולהשתמש מלקחיים סטריליות למקום ריאות (בתוספת חתיכות שהיו קצצו בשוגג כבוי) לתוך החלק התחתון של שקית בבלנדר במעבדה. בקצרה לגלגל חפץ עגול עבה (כגון עט או סמן) על החיצוני של התיק לכתוש את הרקמה. פיפטה 1 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית לתוך השקית, למקם את השקית לתוך בלנדר מעבדה, ולהפעיל את בלנדר המעבדה במהירות גבוהה במשך 2 דקות.
  5. העברת דגימות homogenated מן השקיות המעורבבות לתוך צינורות או צלחות בעזרת פיפטה. לדלל את פי עשרה homogenate ידי aliquotting homogenate 1-חלק לתוך מלוחים 9-חלקים (כגון 100 homogenate μL לתוך 900 μL סאליןה). לדלל את ההשעיה כתוצאה פי עשרה שוב באופן דומה. המשך דילול כל השעיה כתוצאה חדשה פי עשרה גורם אחר עד 6 לפחות דילולים סדרתי נערכו מן homogenate המקורי.
  6. Aliquots בשלושה עותקים פיפטה של 20 μL כל מכל דילולים על צלחות אגר סויה trypticase השלימו עם דם כבשים (ס pneumoniae, ק pneumoniae, פ aeruginosa או baumannii א) או על צלחות אגר שוקולד (אינפלואנזה ח). דגירה לילה בשעה 37 ° C עם או בלי CO 2. (ראה איור 1E עבור דוגמא צלחת נגזרים מהם.)
  7. ספירת מושבות בכל אחד מהשלושה המשכפל בדילול הראשון שמכיל מספר "ספיר" (כלומר, לא יותר מדי מושבות לספור סביר). חשב את הערך הממוצע של שלוש משכפל. קבע את CFU לכל הריאות על ידי הכפלת השווי הממוצע ב -50 (לחשבון עבור ציפוי 20 μL של 1 מ"ל הכוללhomogenate) ופקטורינג של גורם לדילול הסופי מן homogenate המקורי שבו מושבות נספרו.

Representative Results

הכלים הנדרשים, נטייה של החיה, ועומק של אינטובציה מוצגים באיור 1. מוצגת גם היא דוגמא מייצגת של מושבות גדלו על צלחת אגרה לאחר דילול סדרתי ציפוי בשלושה עותקים של מדגם homogenate ריאות. גידול ניטל חיידקים של מספר ביומן 10 CFU מעל למתגי בסיס הוא ציין בדרך כלל בתוך ריאות נגועות עבור מבודד החיידקים ביותר, אפילו בגיל 96 שעות שלאחר זיהום, ולהבדלים בין בעלי החיים נמוך (איור 2). לקבלת אינפלואנזה ח כמה, ייתכנו צמיחה נמוכה; עם זאת, הזיהום לא צריך להתחיל-נחישות עצמית בתוך פרק זמן 48 או 96 שעות (איור 2 ב). מודל דלקת ריאות זה יכול לשמש במהלך אופטימיזציה של סדרה כימית להוביל לתמוך SAR, כפי שמוצג באיור 3 עבור תרכובות נציג שתי סדרות שונות 16, 17. הוא מספק עקבי, לשחזור נפגשהוד להערכת PK / PD בחיות immunocompetent ושימש לקבוע כי אזור נקי מסמים מתחת לעקומה ריכוז-אמת דרך ריכוז מעכבות מינימום (fAUC / MIC) בקורלציה עם היעילות של deformylase פוליפפטיד רומן (PDF) מעכב נגד ס pneumoniae וח 'אינפלואנזה (איור 4). בנוסף, מטרות fAUC / MIC עבור קיפאון ו 1-log 10 הפחתה CFU מפיקוח הבסיס נקבעו על פני 11 ס pneumoniae ו -5 מבודד אינפלואנזה ח '(טבלה 1) 18. צימוד מודל זיהום זה עם מערכת אספקת סמים לשחזר פרופילי pharmacokinetic אדם בחולדות יוצרת כלי רב עצמה להערכת משטרי מינון אדם לפני מחקרים קליניים. דוגמא לכך מסוכמת בטבלה 2, אשר מוכיחה כי ניסוח מורחב-הפצה של אמוקסיצילין-clavulanate היה יעיל יותר משטר מינון קיים עבור אורגניזמים עם Elevaטד MIC ערכים 19.

איור 1
איור 1: אינטובציה intratracheal הניתוחית. כלי מוצגים עבור intubating חולדה (א) והעכבר (B). לאחר בהרדמה, החיה צריכה להיות מוצבת כפי שמוצגת C, עם הראש ימינה והזנב שמאלה אם היחיד ביצוע הטכניקה הוא ימני. מניחים את האצבע שמאלה בעדינות על הגרון לעזור למשש את טבעות קנה הנשימה עבור אישור של מיקום הצינורית הנכון. הבידוד צריך להיות ממוקם עמוק לתוך הריאה השמאלית, כפי שמוצג בתצוגת הגחון של ריאה חולדה (D). מושבות גדלו על אגר לאחר דילול סדרתי ציפוי של מדגם אמורות להופיע דומות לזה מוצג E. איור 1D, כל הזכויות שמורות © גיל סמית [בחיות מעבדה, כרך 25 (1991), ג 'סמית,שיטה בלתי כירורגי פשוטה של החדרת intrabronchial להקמת זיהומים בדרכי נשימה בחולדה, דפים 46 - 49] 14. הודפס מחדש באישור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: דוגמאות מייצגות של התפתחות חיידקים בתוך הריאות של חיות נגועות. ממוצע ± נתוני CFU סטיית תקן N = 5 חיות / קבוצה מוצג עבור בידודים שונים של S. pneumoniae (א), אינפלואנזה ח (ב), פ 'aeruginosa (C), ק pneumoniae (ד) ו baumannii א (E). הבר הראשון של כל זוג (אפור בהיר) הוא bacte הבסיסנטל ריאל על זיהום 1 או 2 שעות לאחר, ואילו הבר השני הוא שליטה הצמיחה של סוף המחקר על זיהום 48 שעות שלאחר (אפור כהה) או 96 שעות לאחר ההדבקה (שחור). אין שיטות צנזורה נתונים יושמו; וכך, תוצאות אלה כוללים נתונים מכל 5 חיות לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: הערכת היעילות של סדרה כימית שונה במהלך אופטימיזציה יצוקה. מודלים זיהום ריאות באמצעות הטכניקות המתוארות נוצלו כדי לחקור מערכות יחסים-פעילות המבנה כחלק מתוכנית topoisomerase abacterial סוג IIA. תרכובות הבטיח 7 ו -1 הוערכו נגד quinolone-הרגיש (א) 16 או quinolone עמיד(ב) 17 בידודים של S. pneumoniae, בהתאמה. כל סמל מייצג CFU נקבע מהריאות של עכברוש אחד עם קווים המייצגים את הקבוצה מתכוונים וסטיית תקן. גבול תחתון של כימות (LLQ) היה 1.7 יומן 10 CFU / ריאות. תרכובות נשקלו (56 או 112 מ"ג של מולקולה הורה חופשי טהור), מומס 9 מ"ל של מים סטריליים, בדילול 3 מ"ל לתוך 3 מ"ל מים (1: 1) ומנוהל על ידי gavage הפה של 1 מ"ל / 125 גרם עכברוש פעמיים ביום ( 6 - זה מזה 7 שעות) עבור 2 ימים, החל מ שלאחר זיהום h 1. שולטת Nontreated (NTC) נדגמו על זיהום 1 שעות שלאחר לטובת עקרונות הבסיס או שטופלו מליחים שנדגמו בסוף המחקר (48 שעות) עבור פקדי צמיחה. איור 3 א נדפס מן ביו & מרפא כימיה מכתבים, כרך 21, TJ מיילס ואח, cyclohexyl-ואימידים רומן כמו antibacterials חזק מיקוד טופואיזומראז סוג IIA בקטריאלי, עמודים 7483 -. 7488, כל הזכויות שמורות (2011) 16, באישור Elsevier.איור 3B נדפס מן ביו & מרפא כימיה מכתבים, כרך 26, TJ מיילס ואח, טריציקלים רומן (למשל GSK945237) מעכבי חזק כמו של IIA טופואיזומראז סוג בקטריאלי, עמודים 2464 -. 2469, כל הזכויות שמורות (2016) 17, באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: PK / PD אפיון אינהיביטור PDF רומן. מודלי Emax נוצרו באמצעות מנה החל נתונים יעילים ב עכברים הנגועים בריא עם בידודים של S. pneumoniae (א) או H. אינפלואנזה (B) כדי לקבוע מטרות PK / PD עבור מעכב PDF רומן 18. מעגלילייצג את הנטל חיידקי ממוצע מקבוצה 4-5 עכברים / שטופלו במינון של המתחם משתנה. ניתוחים בוצעו כדי לתאם יעיל עם AUC ללא סמים 24 שעות (עיגולים פתוחים) או AUC / MIC (עיגולים מלאים). הודפס מחדש באישור, זכויות יוצרים © האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה, [סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה, נפח 60, 2016, עמודים 180 - 189] 18. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עִמָדוֹן 1-log 10 הפחתה
אורגניזם MIC
(מיקרוגרם / מ"ל)
R 2 עבור
fi קו
t (%)
fAUC fAUC / MIC fAUC fAUC / MIC מקס הרג
(log 10 הפחתה)
ס pneumoniae
10127 0.25 99.9 2.0 8.1 3.6 14.4 2.8
1316009S 0.25 96.1 6.5 26.0 15.1 60.3 1.8
ATCC10813 0.5 100 8.4 16.9 22.2 44.5 1.2
1307007S 1 95.8 16.1 16.1 20.1 20.1 2.7
ATCC6303 1 99.8 19.8 19.8 24.8 24.8 2.8
1629 2 100 15.8 7.9 21.2 10.6 2.4
298,443 2 99.9 26.5 13.2 31.0 15.5 2.3
336,808 2 86 8.2 4.2 19.0 9.5 2.6
338,860 2 99.5 2.9 1.5 6.7 3.4 2.8
& #160; 340,449 2 94.6 8.0 4.0 14.9 7.4 2.1
L11259 2 100 7.1 3.5 9.0 4.5 2.0
ממוצע ± SD NA NA 11.0 ± 7.5 11.0 ± 7.9 17.0 ± 8.2 19.5 ± 17.8 2.3 ± 0.5
חֲצִיוֹן NA NA 8.2 8.1 19.0 14.4 2.4
H. אינפלואנזה
1998-100-126H 1 99.7 7.3 7.3 13.4 13.4 2.9
503-008H 1 99.8 7.1 7.1 13.9 13.9 2.7
08003H 2 99.9 14.5 7.2 16.7 8.3 2.7
H128 2 96.6 15.3 7.6 26.0 13.0 2.7
19001H 4 91.9 14.8 3.7 37.3 9.3 3.0
ממוצע ± SD NA NA 11.8 ± 4.2 6.6 ± 1.6 21.5 ± 10.2 11.6 ± 2.6 2.8 ± 0.1
חֲצִיוֹן NA NA 14.5 7.2 16.7 13.0 2.7
NA, אינו ישים.

טבלה 1: PK / PD יעדים אינהיביטור PDF Novel נגד ס pneumoniae וח אינפלואנזה מבודד. AUC חינם-סמים AUC / מטרות MIC עבור קיפאון וירידה 1-log 10 CFU מתחילת המחקר נקבעו 11 ס pneumoniae ו -5 H. אינפלואנזה ב עכברים נגועים ב הריאה שטופלו מתחם 18. את DATשמש לעזור מינוני אדם בחרו עבור פיתוח קליני. טבלה זו הותאם והודפס מחדש באישור, זכויות יוצרים © האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה, [סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה, נפח 60, 2016, עמודים 180 - 189] 18.

<td> 875/125 tid מ"ג (יחס 7: 1)
טיפול קבוצה מתכוון להיכנס 10 ס pneumoniae (CFU / ריאה) ב ± SD עבור זן (AMX / CA MIC):
05010S
(2 מיקרוגרם / מ"ל)
ג 16001S
(4 מיקרוגרם / מ"ל)
16001S
(4 מיקרוגרם / מ"ל)
30005S
(4 מיקרוגרם / מ"ל)
20009S
(4 מיקרוגרם / מ"ל)
05003S
(8 מיקרוגרם / מ"ל)
404,053
(8 מיקרוגרם / מ"ל)
47003S
(8 מיקרוגרם / מ"ל)
לִשְׁלוֹט 7.3 ± 0.4 7.0 ± 0.8 5.7 ± 1.2 7.1 ± 0.7 7.1 ± 0.4 6.4 ± 0.6 6.8 ± 0.4 6.0 ± 0.3
AMX / CA
2,000 / 125 הצעת מ"ג (16 יחס: 1) ≤ 1.7 ** 2.8 ± 1.2 ** 2.2 ± 0.8 ** 2.3 ± 0.9 ** 2.5 ± 0.9 ** 2.0 ± 0.9 ** 3.8 ± 1.4 ** 1.8 ± 0.2 **
1,000 / 125 tid מ"ג (יחס 8: 1) NT NT 2.8 ± 0.5 ** 2.7 ± 1.3 ** 3.3 ± 0.9 ** 4.9 ± 0.5 ** 6.6 ± 1.3 4.7 ± 0.7 **
NT NT 3.0 ± 1.3 * 2.1 ± 0.7 ** 3.2 ± 0.4 ** 5.2 ± 0.9 * 6.4 ± 0.6 4.9 ± 0.4 **
875/125 הצעה מ"ג (יחס 7: 1) NT NT 4.5 ± 1.2 * 5.6 ± 1.3 * 5.2 ± 0.7 ** 6.3 ± 0.7 6.4 ± 0.7 5.5 ± 0.4
500/125 tid מ"ג (יחס 4: 1) 3.1 ± 1.3 ** 4.5 ± 0.9 ** NT NT NT NT NT NT
Azithromycin, 1,000 / 500 מ"ג od NT NT NT 5.8 ± 2.0 7.1 ± 0.9 3.1 ± 1.0 ** 6.6 ± 0.4 6.07; 0.6
Levofloxacin, 500 מ"ג od NT NT 4.2 ± 0.8 * 5.7 ± 0.8 * 4.9 ± 0.8 ** 3.0 ± 1.3 ** 3.5 ± 0.2 ** 3.9 ± 0.8 **
ד טיפול הקבוצה Mean להיכנס 10 אינפלואנזה ח (CFU / ריאה) ± SD עבור זן:
H128
(β-lactamase חיובי)
צ'סטרפילד
(β-lactamase שלילי, אמפיצילין עמיד)
לִשְׁלוֹט 6.4 ± 0.6 6.7 ± 0.6
AMX / CA
2,000 / 125 הצעת מ"ג (16 יחס: 1) 2.0 ± 0.7 ** 3.1 ± 0.9 **
1,000 / 125 tid מ"ג (יחס 8: 1) 2.1 ± 1.0 ** 3.6 ± 1.1 **
875/125 tid מ"ג (יחס 7: 1) 2.8 ± 1.3 ** 3.8 ± 1.3 **
875/125 הצעה מ"ג (יחס 7: 1) 2.0 ± 0.8 ** 5.1 ± 1.1 **
Azithromycin, 1,000 / 500 מ"ג od 3.2 ± 1.7 * 5.8 ± 1.1
Levofloxacin, 500 מ"ג od ≤ 1.7 ** ≤ 1.7 **
AMX / CA, אמוקסיצילין-clavulanate; הצעה, פעמיים ביום; tid., שלוש פעמים ביום; od, פעם ביום.
ב גבול הגילוי היה <1.7; *, באופן משמעותי שונה מהשלט (P ≤ 0.05); **, שונה באופן מהותי מן הביקורת (P ≤ 0.01); NT, לא נבדק.
ג זני 16001S נבדק בשני ניסויים נפרדים.
ד-clavulanate אמוקסיצילין 500/125 מ"ג (4: 1) שלוש פעמים ביום לא נבדק נגד זני H. אינפלואנזה.

טבלה 2: יעילות של פרופילי חשיפת פלזמת אדם מחדש עבור אמוקסיצילין / clavulanate השונה משטר מינון. נתונים שנוצרו בעכברים עם מערכת חיסון תקין הנגועים בריא עם בידודים של S. pneumoniae או H. אינפלואנזה באמצעות מודל זה הוכיח כי ניסוח משופר של-clavulanate אמוקסיצילין (2מ"ג, 000/125, פעמים ביום) היה יעיל יותר מאשר משטר מינון סטנדרטי נגד מבודד עם גבוהות הרגישות במבחנת 19. טבלה זו הותאם והודפס מחדש באישור, זכויות יוצרים © האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה, [סוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה, נפח 49, 2005, עמודים 908 - 915] 19.

Discussion

להצלחה אופטימלית בשעתוק מודל זיהום זה, ההצעות הנוספות הבאות צריכות להיחשב. ארסיות של בידודים חדשים יכולה להיות מוגברת על ידי passaging 2 - 3 פעמים ב vivo לפני הניצול במחקר. מניות קפוא חיידקים צריכות תמיד להיות מוכנות מהמקור עיקרי in vivo מקור -derived עם קטעים מעטים ככל האפשר מן המקור, ו refreezing או שימוש חוזר של מניות מופשרות הוא מיואש. שימוש מבודדים קליני האחרון התאושש מחול עם דלקת ריאות, ו / או הכנת תרבויות בצמיחה בשלב יומן יכול גם לעזור לשפר את הקמת הזיהום. דילול פי חמישה לתוך אגר (למשל 2 השעיה מלוחה מיליליטר הוסיפה 8 אגרו מיליליטר) יכול לשמש במקום עשרה לקפל להגדיל את הבידוד חיידקי, ואת נפח הבידוד יכול להיות מותאם על פי הגודל של החיה (למשל 200 μL / בעלי חיים בדרך כלל מחוסן לתוך 250 חולדות גרם). לפני הוספת השעית החיידקים המלוחה לתוךאגר (כלומר שלב 2.3), צפיפות החיידקים ניתן לחזות או מוערך על ידי בדיקה ויזואלית, סטנדרטים מקפרלנד או מדידות צפיפות אופטיות. זה עוזר להכיר את מאפייני צמיחה במבחנה לכל לבודד לפני ביצוע בניסויי vivo. עקביות בצמיחה וטיפול מאפשרת הערכה המדויקת ביותר של צפיפות חיידקים לכל לבודד נתון. שיטות מיקרוביולוגית תקן שונות מאלה שתוארו, כגון תקשורת אלטרנטיבית ורקמות homogenizers, עשויות לשמש מתאים להכנת inocula ואת ספירת חיידקי רקמות נגועות.

מומלץ מאוד להכין או להמיס את אגר יום לפני הניסוי ולאחסן אותו לילה באמבט מים נפרד להגדיר עד 50 מעלות צלזיוס. זה יפשט את התהליך ולעזור להישמר מפני אגר להיות חם מדי בזמן הזיהום. טמפרטורה של 41 - 42 מעלות צלזיוס משיגה איזון טוב בין maintaiנינג אגר במצב נוזלי מבלי להיות חם מדי להישרדות חיידקים לטווח קצר. כחלופה ניתן אגר מזין, אגר אצילי שימש בהצלחה בניסויים מסוימים. צינור אחד הבידוד אגר הוא בדרך כלל מספיק עבור ניסוי כולו (והוא מומלץ), אבל צינורות מרובים יכולים להיות מוכנים להדביק מספר רב של בעלי חיים (למשל יותר מ -60) או כאשר התהליך הדבקה לוקח יותר 30 - 45 דק 'אם צינורות בידוד דרושים מספר, מוסיף את השעית חיידקים המלוחה על צינור אחד של אגר כפי שהוא נדרש. הפעולה זו מפחיתה את הסיכון כי הישרדות חיידקים ו / או כושר תושפע בחשיפה ממושכת טמפרטורה גבוהה לפני החיסון. יצוין כי צינורות בידוד מרובים באמצעות עשויים גם לדרוש הליכים אקראיים בעלי חיים נוספים. במידת האפשר, להדביק את כל החיות מאותו הכנה הבידוד. מומלץ להתאים את גודל ניסויים לרמה הנוכחית של מיומנות עם technique.

מדען מיומן יכול לצנרר לחסן חיה בתוך פחות מ -30 שניות לחסן עד 5 - 6 חיות לכל אצווה (כלומר עם מזרק אחד מלא של בידוד אגר). לאלו לימוד הטכניקה, המהירות חשובה כמו אגרתי תתחיל לחזק; עם זאת, מיקום מדויק של הבידוד חשוב יותר. להתחיל עם 1 או 2 חיות לכל תצווה, ולהגדיל את הטכניקה הופכת יותר מוכרת. החיות להמשיך לנשום במהלך אינטובציה; וכך, חלון הזמן עבור חיסון תלוי כמה מהר את החיה מתאוששת מן isoflurane, אשר צריך להיות כ 2 - 3 דקות. בעלי חיים המעוררים בתהליך ניתנים מחדש מורדמים ניסו בשנית, אבל זה לא מומלץ לעשות זאת שוב ושוב. חיסון מוצלח על הניסיון הראשון צפוי כמעט 100% של בעלי חיים פעם מושגת מיומנת. הערה שזה קל יותר ללמוד את הטכניקה באמצעות החולדות ראשונות; עכברים הם יותר עדין קטן מדיls נוטה יותר סתימה עם אגר הקרושה אם לא מניפולציות במהירות. מזרקים טרום התחממות, צינורות מלוחים כמו גם שמירה על מכשיר אינטובציה על משטח חם (לא חם), כגון כרית חימום על הגדרה נמוכה, יכול לעזור למנוע התמצקות של אגר. כאשר לומדים את הטכניקה, זה גם מועיל לתרגל מיקום נכון של הבידוד באמצעות צבע כהה (כגון מתילן כחול מרוכז) במקום השעית החיידקים אגרו. בצע את ההליך כמתואר, אבל להרדימו מיד לאחר חיסון של צבע (שאינו מאפשר את החיה להתאושש בין הרדמה המתת חסד). לנתח כדי לקבוע היכן לצבוע הושם, ולהתאים טכניקה בהתאם.

המדד העיקרי במודל זה הוא CFU מריאות נגועות. הישרדות היא לא אינדיקטור טוב של נטל בקטריאלי אינו נקודת הסיום מומלץ. עבור מחקרי יעילות, ה- N הציע הוא 5 - 6 חיות לכל קבוצה כמו זה predicteד כדי לאתר ≥1 יומן 10 הבדלים CFU בין קבוצות עם כוח% 90 לפחות. ניתן בעקבות בעלי חיים יכולים להידבק בקבוצות כך חבריהם לכלוב להישאר ביחד, או תהליך אקראי אמיתי. שימו לב שאם קבוצות מוקצות על ידי כלוב, הקבוצות צריכות להיות נגועות ב רצף אקראי עם פקדי צמיחת סוף המחקר הנגועים אחרון (כדי לאשר הישרדות חיידקים / כושר לא היה מושפע משך הזמן החשוף טמפרטורה גבוהה באמבט מים). אין שיטות צנזורת נתונים צריכות להיות הכרחיות, ואף אחד המומלצים למעט סילוק המיידי של כל חיה כי כבר ברור mis-מחוסן בתחילת המחקר (לפני תחילת כל טיפול). בעלי חיים מומתים לפני תום המחקר צריכים להיות שנדגמו ותוצאות נכללות בנתונים להגדיר אלא סיבה טובה הדרה זוהתה באופן פרוספקטיבי (כלומר אירוע שאינו קשור זיהום או טיפול). שריד התרופה עלולה AFFect כמה דוגמאות והוא מהווה שיקול חשוב בכל דגמי זיהום in vivo. אם תרכובת ניתנת לעתים קרובות, בסמוך למועד של המתת חסד או יש זמן מחצית חיים ארוך, זה יכול להיות נוכח homogenate רקמות בריכוז גבוה מספיק כדי להמשיך להרוג חיידקים vivo לשעבר במהלך תהליך ספירה בקטריאלי (דילול ציפוי של הדגימות או על הצלחות אגרו במהלך דגירת הלילה). כדי למנוע זאת, פחם פעיל ו / או תוסף אשר מפרק את המולקולה הפעילה מבלי לפגוע תאי חיידקיים ניתן להוסיף המדגם לפני המגון. שיטות אחרות כוללות centrifuging הדגימות כדי להסיר את רוב המתחם הפעיל (שאמור להישאר supernatant) והעסיקו דילול שונה ציפוי מזימות כדי לדלל את המתחם הפעיל מספיק לריכוז שאינו מעכב.

כפי שמעידה דוגמאות שניתן לראות בתרשים 2, מודל זה בהצלחה induces דלקות ריאות במכרסמים עם מגוון רחב של אורגניזמים כולל אלה שאינם גדלים גם במודלים אחרים (אינפלואנזה H. למשל). זיהומים אלה הם עקביים לשחזור, להקטין את הסבירות כי ניסויים יהיו צורך לחזור בשל כשל מודל ו / או ביצועים ירודים עם לבודד נתון. למרות החיות הן עם מערכת חיסון תקינות, הם אינם מסוגלים לפתור את הזיהום במהירות, אם בכלל. זה מאפשר גמישות רבה יותר אורך המחקר, כפי מבודד רבים לשמור על זיהום קיימא דרך לפחות 96 שעות ללא צורך בזריקות חוזרות ונשנות לשמור נויטרופניה. היתרון הפוטנציאלי של הלימוד יעיל אנטיבקטריאלי בחיות immunocompetent כבר ציין בעבר 20, 21, ויש ראיות לכך, עבור תרכובות מסוימות (למשל oxazolidinones), נתוני מכרסמים שאינם נויטרופני יכולים יותר לחזות במדויק במטרות חשיפה אנושיות בהשוואה לאלו נויטרופני שניתנה 5. השירות רב תכליתי של tהוא מודל מודגם איורים 3 ו -4 ובלוחות 1 ו 2. מחקרים אלה הם חלק מאוסף גדול של נתונים שהתפרסמו פורסם שנוצרה עם המודל הזה כדי לתמוך במאמצים אופטימיזציה להוביל 16, 17, 22-24, להשוואה והאישור של מינון אדם מוצע משטר 19, 25-29 ו לאפיון PK / PD 18, 30-32 .While המודל הזה הוא בתחילה מורכב יותר לנהל בהשוואה לשיטת משאיפת אף, ישנם יתרונות רבים כפי שתואר לעיל. בעזרת תרגול שימוש שיגרתי, הטכניקות צריכות להיות פשוטות לביצוע.

ראוי לציין בחלק מהמחקרים כי הנטל חיידקי בתחילת המחקר היה נמוך מזה ממוקד בדרך כלל במודלים זיהום ריאה אחרות. הדבר נובע במידה רבה על הדילול הנדרש לתוך אגרתי ואת נפח האתגר הקטן, במיוחד אצל עכברים. עם זאת, ראוי גם לצייןהתפתחות חיידקים כי נתפסה בכל המקרים גם כאשר הנטל הראשוני היה נמוך יחסית. את עומס חיידקי בסיס היעד הוא 6 עד 6.5 יומן 10 ריאות CFU / (6.8 עד 7.3 יומן 10 CFU / g של רקמה בעכברי סמך משקל ריאות ממוצעות) אשר תואמת את הצפיפויות מוערכות בבני אדם עם דלקת ריאות חמורות 33. נטל בסיסי גבוה יותר ניתן להשיג על ידי התמקדות יותר את הבידוד חיידקי או על ידי וכתוצאה מכך התעכבה תחילת הממשל המתחם כדי לאפשר התפתחות חיידקים נוספים; עם זאת, להגדיל את העומס אתגר יותר מדי יכול להוביל למחלות קשות וחריף באופן חריג (כלומר מוות בתוך פחות מ -24 שעות) כי הוא עקשן לכל הטיפולים אנטיבקטריאלי קשר הרגישות. למרות הבידוד מושם בתחילה מועדף לתוך הריאה השמאלית של החיה, הזיהום מתפשט בדרך כלל ברחבי בשתי הריאות. מחלת ריאות מתקדמת, הפצת החיידקים לאיברים אחרים, ותחלואה סופית היא לעתים קרובות observאד עם ס pneumoniae, ק pneumoniae ו פ aeruginosa. מעניין, זיהומים עם אינפלואנזה ח ו baumannii א הם בדרך כלל יותר מאופקים, ורק לעתים רחוקות לגרום למוות בבית inocula החיידקים שנקבע.

תוצאות יעילות המתקבלות במודל זה יש בקורלציה גם עם פרופילים רגישים במבחנה כמו גם מטרות PD PK / מוגדרות. צמצום הוצאה לנפש ניטלת חיידקים הם נצפו באופן שיגרתי עבור מבודד הנחשב רגיש הסוכן נבדק, בעוד אלה תערוכה העמידה הנחשב ללא שינוי או התפתחות חיידקים מעל הבסיס 16, 17, 19, 24-29. בניסויים שנערכו בחיות מעבדה הערכת שני quinolones וכן macrolide באמצעות מודל זה 32 הראו כי היעד PK / PD הנדרשים 1-log 10 הפחתת ס pneumoniae בהשוואה לנקודת ההתחלה בקורלציה עם יעד שנקבע עכברים נויטרופני, וחשוב יותר, עם מטרות קליניות pneum חיידקי נרכש בקהילה6 onia, 7, 34, 35. Gepotidacin, אנטיביוטיקה המנגנון החדשני, נוסתה נגד מספר ס pneumoniae ונזקק יעד דומה PK / PD הפחתה 1-log 10 במודל דלקת ריאות זה 31 כפי שדרשה הפחתה 1-log 10 במודל הירך נויטרופני 36 כאשר חדירת ריאות נלקחה בחשבון (נתונים על קובץ). באופן דומה, PK / המטרות PD שנקבעו עכברי GSK2251052 נגד פ aeruginosa תאמו עבור קיפאון, 1- ו -2-log 10 הפחתות CFU בין מודל ריאה זה 30 ואת מודל זיהום נויטרופני ירך כאשר חדירת ריאות נחשבות 37, 38 . מתאם עם מודל דלקת ריאות נויטרופני באמצעות חיסון אף היה עני; עם זאת, GSK2251052 לא לייצר יותר מאשר תגובה סטטית שלימוד 38. זה ניתן לייחס בידוד החיידקים הגבוה, אשר היה 8 יומן 10 CFU / עכבר לעומת 6 יומן 37 ו intratracheal 30 דגמים. אוסף של נתונים כגון זה הוא קריטי עבור בהשוואות, שכן היא מאפשרת השוואה ישירה עם מודלים קיימים קורלציה עם נתונים קליניים על מנת להעריך את יכולת הניבוי של התרגום. עוד שימוש נרחב של מודל דלקת ריאות אינטובציה intratracheal יספק נתונים נוספים על אלו סוגים של ניתוחים.

ישנן מספר מגבלות של מודל דלקת ריאות עם מערכת חיסון תקינה זו. ראשית, הוא לא מתאים היטב כדי להעריך הופעתה של התנגדות ספונטנית בגלל בידוד החיידקים הגבוה הנדרש בדרך כלל לתוצאות מחקרים כאלה חמורים מדי זיהום. בעקבות ניסיונות להשיג ניטל חיידקים של יומן 7 או 8 10 CFU בתחילת המחקר, תחלואה מהירה נצפתה (כלומר בעלי חיים הופכים הגוססת בתוך פחות מ -24 שעות) למרות שטיפה היסודית של inocula כדי לסלק רעלים קיימים (נתונים על קובץ). זהייתכן שתוכל להתגבר על בעיה זו באמצעות מכרסמים גדולים. חולדות, במיוחד חולדות כבדות (> 250 גרם), מופיעות לסבול יותר inocula הגבוה לעומת עכברים עשויים להיות מתאים עבור סוגים אלה של מחקרים. מגבלה שנייה היא כי השימוש של אגר כמו משפר-זיהום עלול למנוע שימוש במודל להערכה של מארחת מסוימת: אינטראקציות הפתוגן. הוא האמין כי אגר מספק נקודה מוגנת מוקדים עד הזיהום הוא לקבוע באופן מלא בתוך הריאה. אפשר לספק את הבידוד מלוח ולא אגרתי כדי לעזור להתגבר על בעיה זו; עם זאת, יש לציין כי זו תייצר זיהום רק עם בידודים כמה. שלישית, קיימת עקומת למידה תלולה נדרש להיות בקיאים הטכניקה. ההליך יכול להיות עדין, במיוחד אצל עכברים. יקל בטעות למקום צינורית המתכת לתוך הוושט, ו בכוח מופרז יכול להוביל ניקוב או הוושט או קנה הנשימה. מיקום זהיר של הבידוד הוא גםנדרשים או או לא חיות לשחזר או לא להיות נגועות כראוי. עם זאת, עם סבלנות והתמדה, אפשר להיות מאוד מיומן לבצע את הטכניקה במהירות, בצורה חלקה ומדויק.

על ידי ביטול הדרישה עבור נויטרופניה, הגדלת האיתנות שחזור, מאפשר לחוקרים ללמוד יותר פתוגנים ומבודד, שיפור הגמישות של תכנון הניסוי ומתן זיהום מאתגר לאפיין פרמקודינמיקה עבור דלקת ריאות, מודל דלקת ריאות עם מערכת חיסון תקינה זה מוסיף ערך משמעותי לגילוי האנטיביוטיקה קהילה. שימוש מוגבר של מודל זה על ידי חוקרים נוספים יעזור לספק את בהשוואות דרושים לכך שהוא יוכל להשיג הסכמה רחבה יותר ולהמשיך לספק מידע תומך פרשנות ראויה.

Disclosures

המחברים כל משולמים לעובדי GlaxoSmithKline תרופות עצמו מניות בחברה.

Acknowledgments

JH מבקש להכיר ולהודות מנטור, חבר ומנהל לשעבר ואלרי ברי עבור הראשון מלמד אותנו מודל זה; וגארי Woodnutt, שלימד אותנו את היסודות של השראה מחויבותנו בתחום PK / PD אנטיבקטריאלי. כל המחברים מבקשים להודות דוד פיין לתמיכה והערכתו המדע שלנו. ברצוננו להכיר לשעבר שלנו עמיתים מיקרוביולוגיה vivo שתרמו הגוף של נתונים שנוצרו באמצעות שיטות אלה, במיוחד פיט DeMarsh, רוב שטראוב, רוני פייג 'Nerissa סיימון. לבסוף, תודתנו ללכת העמיתים מיקרוביולוגיה במבחנה שלנו על עזר, במיוחד עבור מתן כל המיקרופונים אנו מבקשים (לין McCloskey, ג'וש המערבי ושרון מינ '); ועבור צוות מיקרוביולוגיה קלינית שלנו אשר מספק ייעוץ ותמיכה מומחה (לינדה מילר, ניקול Scangarella-עומאן ודבורה באטלר).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood Becton Dickinson and Company 4321261
Chocolate II Agar Becton Dickinson and Company 4321267
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified Becton Dickinson and Company 299070
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol Becton Dickinson and Company 297808 storage media for frozen stock
Inoculating loop Nunc 251586
0.9% Sodium Chloride, USP Baxter Healthcare Corporation NDC 0338-0048-04
Difco Nutrient Agar Becton Dickinson and Company 213000
30 mL free standing centrifuge tube with cap EverGreen Scientific 222-3530-G80
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Falcon, a Corning Brand 352070
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm Falcon, a Corning Brand 352059
Guide Tool Intek Services Ltd GT01 custom-made metal cannula for rats
90' Portex tubing SAI POR-080-100 plastic cannula for rats
1 mL TB syringe slip tip Becton Dickinson and Company 309659
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 Becton Dickinson and Company 305122
Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 Popper and Sons, Inc 7903 used to create metal cannula for mice
Intramedic polyethylene tubing Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company 427401 plastic cannula for mouse 
75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 Hamilton 87930 HPLC glass injection syringe
Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner Corning 9825-25 to autoclave/store metal cannulae
70% isopropyl alcohol Vi-Jon (Swan) NDC 0869-0810-43
Isoflurane, USP Piramal Healthcare NDC 66794-013-10
Stomacher  Seward Stomacher80
Stomacher 80 classic bags Seward BA6040
Assay plate, 96 well, round bottom Costar, Corning Inc 3795 optional, for serial diluting
Blood Omni Plates Hardy #A127 optional, rectangular blood plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy. N Engl J Med. 248, (12), 481-488 (1953).
  2. Eagle, H., Fleischman, R., Musselman, A. D. The bactericidal action of penicillin in vivo: the participation of the host, and the slow recovery of the surviving organisms. Ann Intern Med. 33, (3), 544-571 (1950).
  3. Vogelman, B., et al. Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model. J Infect Dis. 158, (4), 831-847 (1988).
  4. Craig, W. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men. Clin Infect Dis. 26, (1), 1-12 (1998).
  5. Ambrose, P. G., et al. Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore. Clin Infect Dis. 44, (1), 79-86 (2007).
  6. Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. Clinical pharmacodynamics of quinolones. Infect Dis Clin North Am. 17, (3), 529-543 (2003).
  7. Andes, D. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections. Curr Opin Inf Dis. 14, (2), 165-172 (2001).
  8. Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294, (3), L387-L398 (2008).
  9. Antibiotics in laboratory medicine, 5th edition. Chapter 15: Evaluation of antimicrobials in experimental animal infections. Lorian, V. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2005).
  10. McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37, (2), 130-155 (2013).
  11. Nuermberger, E. Murine models of pneumococcal pneumonia and their applicability to the study of tissue-directed antimicrobials. Pharmacotherapy. 25, (12 Pt 2), 134S-139S (2005).
  12. Mehrad, B., Standiford, T. J. Use of animal models in the study of inflammatory mediators of pneumonia. ILAR J. 40, (4), 167-174 (1999).
  13. De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS ONE. 9, (9), (2014).
  14. Smith, G. A simple non-surgical method of intrabronchial instillation for the establishment of respiratory infections in the rat. Lab Anim. 25, (1), 46-49 (1991).
  15. Berry, V., Ferreira-Cornwell, M. C., Singley, C., Woodnutt, G. Development of experimental murine infections caused by H. influenzae and H. parainfluenzae. Clin Microbiol Infect. 7, (S1), 322 (2001).
  16. Miles, T. J., et al. Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 21, (24), 7483-7488 (2011).
  17. Miles, T. J., et al. Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 26, (10), 2464-2469 (2016).
  18. Hoover, J., et al. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection. Antimicrob Agents Chemother. 60, (1), 180-189 (2016).
  19. Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother. 49, (3), 908-915 (2005).
  20. Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, (5), 475-487 (2009).
  21. Drusano, G. L., Fregeau, C., Liu, W., Brown, D. L., Louie, A. Impact of burden on granulocyte clearance of bacteria in a mouse thigh infection model. Antimicrob Agents Chemother. 54, (10), 4368-4372 (2010).
  22. Miles, T. J., et al. Novel hydroxyl tricyclics (e.g. GSK966587) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 23, (19), 5437-5441 (2013).
  23. Hunt, E. Pleuromutilin antibiotics. Drugs Future. 25, (11), 1163-1168 (2000).
  24. Jin, Q., et al. Novel LpxC inhibitors with broad-spectrum gram-negative activity. Proceedings of the 44th National Organic Chemistry Symposium.. College Park, MD, Abstract T-31 (2015).
  25. Singley, C., Page, R., Hoover, J., Elefante, P., DeMarsh, P. Efficacy of a LRS inhibitor GSK2251052 against Enterobacteriaceae isolates using a computer-controlled infusion system to recreate human PK profiles in rats. Clin Microbiol Infect. 17, (S4), S429-S430 (2011).
  26. Berry, V., et al. Comparative in vivo activity of gemifloxacin in a rat model of respiratory tract infection. J Antimicrob Chemother. 45, (S1), 79-85 (2000).
  27. Tsuji, M., et al. S-649266, a Novel Siderophore Cephalosporin: Efficacy against Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 or KPC in rat lung infection model with recreated humanized exposure profile of 2 gram dose with 1 hour and 3 hours infusion. Open Forum Infect Dis. 1, (S1), S106-S107 (2014).
  28. Tsuji, M., et al. Use of Iron Depleted Mueller Hinton Broth (IDMHB) for microdilution testing of S-649266, a novel siderophore cephalosporin. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdam, Netherlands, Abstract P0808 (2016).
  29. Singley, C., Hoover, J., DeMarsh, P. J., Elefante, P., Zalacain, M. Efficacy of PDF Inhibitor GSK1322322 Against Abscess Infections Caused by MRSA Using a Computer-Controlled Infusion System to Recreate Human PK Profiles in Rats. Proceedings of the 60th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA, Abstract F1-2114 (2010).
  30. Hoover, J., Mininger, C., Rittenhouse, S. GSK2251052, a novel LeuRS inhibitor, is effective against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in a mouse pneumonia model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, Abstract B-1308 (2012).
  31. Hoover, J., Mininger, C., Novick, S., Rittenhouse, S. Efficacy of GSK2140944 against Streptococcus pneumoniae in a non-neutropenic mouse lung infection model. Proceedings of the 53rd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Denver, CO, Abstract A-014 (2013).
  32. Hoover, J. L., et al. Selection of a lung infection model to predict efficacy in community-acquired pneumonia (CAP) caused by S. pneumoniae (SP). Proceedings of the 47th Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, Illinois, Abstract A-17 (2007).
  33. Drusano, G. L., et al. Saturability of granulocyte kill of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia. Antimicrob Agents Chemother. 55, (6), 2693-2695 (2011).
  34. Peric, M., Browne, F. A., Jacobs, M. R., Applebaum, P. C. Activity of nine oral agents against gram-positive and gram-negative bacteria encountered in community-acquired infections: use of pharmacokinetic/pharmacodynamic breakpoints in the comparative assessment of beta-lactam and macrolide antimicrobial agents. Clin Ther. 25, (1), 169-177 (2003).
  35. Calbo, E., Garau, J. Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of community-acquired respiratory tract infections. Respiration. 72, (6), 561-571 (2005).
  36. Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2140944 against Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 54th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC, Abstract A-680 (2014).
  37. Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, Abstract A-1270 (2012).
  38. Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, Abstract A-1271 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics