A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen

Immunology and Infection
 

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Hoover, J. L., Lewandowski, T. F., Mininger, C. L., Singley, C. M., Sucoloski, S., Rittenhouse, S. A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii. J. Vis. Exp. (119), e55068, doi:10.3791/55068 (2017).

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Abstract

Wirksamkeit von Kandidatenantibakterielle Behandlungen müssen in Tiermodellen der Infektion als Teil der Entdeckung und Entwicklung von Verfahren, vorzugsweise in Modellen gezeigt werden, die die beabsichtigte klinische Indikation nachahmen. Ein Verfahren zum Induzieren robust Lungeninfektionen bei immunkompetenten Ratten und Mäusen beschrieben , die durch S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae oder A. baumannii zur Bewertung von Behandlungen in einem Modell der schweren Lungenentzündung verursacht werden können. Die Tiere werden betäubt und ein Agar-basierten Impfstoff wird tief in die Lunge über nicht-chirurgische intratracheale Intubation hinterlegt. Die sich ergebende Infektion ist konsistent reproduzierbar und stabil für mindestens 48 h und bis zu 96 h für die meisten Isolate. Studien mit vermarktet Antibakterika haben eine gute Korrelation zwischen in vivo - Wirksamkeit unter Beweis gestellt und in - vitro - Empfindlichkeit und Übereinstimmung zwischen Pharmakokinetik / Pharmakodynamik Ziele bestimmtin diesem Modell und klinisch akzeptierten Ziele beobachtet. Obwohl es eine anfängliche Zeitaufwand, wenn die Technik Lernen, kann es schnell und effizient durchgeführt werden, sobald Eignungs erreicht wird. Die Vorteile des Modells gehören Beseitigung der neutropenische Anforderung, erhöhte Robustheit und Reproduzierbarkeit, die Fähigkeit, mehr Krankheitserreger und isoliert, eine verbesserte Flexibilität in Studiendesign und Einrichtung einer herausfordernden Infektion in einem immunkompetenten Wirts zu studieren.

Introduction

Die Bewertung der Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten in Tiermodellen der Infektion ist ein wichtiger Bestandteil des antibakteriellen Wirkstoff-Forschung. In vivo liefern Wirksamkeitsstudien wichtige Daten für die Entscheidungsfindung über die Spanne der Entdeckung Bemühungen, aus Aufklären Struktur-Aktivitäts - Beziehungen (SAR) und Blei chemischen Serie durch pharmakokinetische-pharmakodynamische Bestimmung Optimierung (PK / PD) Eigenschaften von Verbindungen und die Wahl der Dosis Unterstützung für klinische Entwicklung und Zulassung. Zahlreiche Tierinfektionsmodellen sind für diese Zwecke in der Literatur beschrieben. Eines der am häufigsten und am weitesten verbreiteten Modelle ist die neutropenischen Maus Oberschenkelinfektion, die von Eagle 1, 2 und später erweitert durch Vogelman und Craig 3, 4 Pionierarbeit geleistet wurde. Dieses Modell wurde für die Unterstützung Bestimmung der bakteriellen Anfälligkeit Grenzwerte und für die Bereitstellung von PK / PD-Ziele von unschätzbarem Wert menschlichen Dosierung zu führen. Es gibt viele Prüfungples , wo die Vorhersagefähigkeit dieses Modells hat 4-7 bewährt. Allerdings ist einer der Nachteile des Oberschenkels Infektionsmodell ist das Fehlen von direkter Bedeutung für Lungeninfektionen. Es gibt jetzt eine stärkere Betonung der Ort der Infektion in Tiermodellen an den Ort der Infektion beim Menschen entspricht; und somit zu untersuchen Verbindungen zur Behandlung von Lungenentzündung, ist es ideal, eine Lungeninfektionsmodell in Tieren zu verwenden.

Mehrere Verfahren zur Lungeninfektionen bei Labortieren induziert wurden für die antibakterielle Wirksamkeit Studien einschließlich intranasale Inhalation, Aspiration über den Mund - Rachen - Route, Aerosolexposition und chirurgische intratracheale Inokulation 8 beschrieben und verwendet. In vielen Fällen müssen die Tiere (vor allem Mäuse) erste neutropenische gemacht werden, um eine stabile Lungeninfektion zu erreichen. Trotz dieser stark immungeschwächten Zustand, die Anzahl der bakteriellen Pathogenen und Stämme, die tragfähige Infektionen bei Nagern zu produzieren istbegrenzt. Zum Beispiel kann es schwierig sein , erfolgreich Haemophilus influenzae oder Acinetobacter baumannii in Pneumonie Modellen 9, 10, und noch mehr virulenten Pathogenen wie Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella pneumoniae, kann pose 11-13 Herausforderungen zu etablieren.

Im Jahr 1991 beschrieb Smith ein Modell Lungeninfektion bei Immun entwöhnten Ratten , bei denen eine Infektion durch Einträufeln Bakterien direkt in die Lunge über eine einfache nicht - chirurgischen intratracheale Intubation Verfahren 14 hergestellt wurde. Berry et al. später geändert , um die Verfahren für Mäuse 15 zu infizieren. Unter Verwendung eines Agar-basierten Impfstoff, diese Impfung Technik induziert robuste Lungeninfektionen in immunokompetente Ratten und Mäuse mit S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii. Es ist offen für ein breites Spektrum von Isolaten, einschließlich der Beherbergung verschiedene widerance Determinanten und solche, die nicht über eine tragfähige Infektion durch andere Impfung Wege produzieren. Es ermöglicht auch die Wirksamkeit bei immunokompetente Tieren bestimmt werden, eine Bedingung, die für Patientengruppen relevanter ist als die traditionellen neutropenische Mausmodell ist, das nicht stark immungeschwächten sind. Die Konsistenz und Zuverlässigkeit dieses Modells auf mehrere Krankheitserreger und Isolate macht es für antibakterielle Wirksamkeit Studien gut geeignet.

Protocol

S. pneumoniae

Alle Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Protokollen von der GSK Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt, und erfüllen oder übertreffen die Standards der American Association für die Akkreditierung von Labortierpflege (AAALAC), den Vereinigten Staaten Department of Health and Human überschreiten Dienstleistungen und alle lokalen und bundesstaatlichen Tierschutzgesetze.

HINWEIS: Wenn nicht anders angegeben, sollen alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Kultur Bakterienisolaten

  1. Vorbereitung 3 bis 6 Agarplatten mit S. pneumoniae oder H. influenzae, wie Bouillonkultur im allgemeinen nicht genug Material für die Inokulation liefert.
    1. Entfernen einer gefrorenen Stammkultur von Lagerung bei -80 ° C, vollständig auftauen und Streifen bis zu 100 & mgr; l pro Platte auf Agar tryptischen Soja ergänzt mit Schafsblut (S. pneumoniae) oder auf Schokoladen - Agar (H. influenzae) unter Verwendung von Standard - Techniken mikrobiologische. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren , mit oder ohne 5% CO 2.
  2. Bereiten Sie Brühekulturen mit K. pneumoniae, P. aeruginosa oder A. baumannii.
    1. Entfernen einer gefrorenen Stammkultur von Lagerung bei -80 ° C, vollständig auftauen und aliquoten 100 ul der Lager in 50 ml Hirn-Herz-Infusion (BHI) Brühe. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (ca. 120 Upm).
    2. [Optional] Wenn eine Protokollphasenkultur gewünscht wird, aliquoten 1 ml aus der resultierenden Kultur über Nacht in 50 ml frisch BHI-Brühe. Inkubieren für 3 h bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (ca. 120 Upm).

2. Bereiten Sie Saline Bakteriensuspensionen

  1. Für alle Aufhängungsvorbereitungsschritte (2.1 bis 2.3) nutzen steriler Kochsalzlösung bei einer Temperatur zwischen der Umgebungsluft und 37 ° C. Ernte über Nacht Wachstum von S. pneumoniae oder H. influenzae von den Agarplatten Kolonien durch Abkratzenvon der Oberfläche mit einer sterilen Schleife. Übertragen Sie das Erntegut in 5 ml steriler Kochsalzlösung, bis eine trübe wird undurchsichtigen Suspension erhalten und sanft Wirbel bis zur Homogenität.
  2. Zentrifuge 50 ml der K. pneumoniae, P. aeruginosa oder A. baumannii letzte Bouillonkulturen für die Impfung bestimmt sind (zB über Nacht oder Phasen Kulturen log) für 5 min bei 4500 x g. Entfernen Überstand mit einer Pipette und entsorgen. Resuspendieren des Pellets in mindestens 5 ml steriler Kochsalzlösung und sanft Wirbel um eine homogene Suspension zu erhalten.
  3. Falls erforderlich, verdünnt die Suspension weiter steriler Kochsalzlösung mit einer Dichte im Bereich von 8 bis 9 log 10 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml zu erhalten. Entfernen eines Aliquots zur Bestimmung der KBE / ml. Abwechselnd verdünnen und die aliquoten Platte wie in den Abschnitten 7.5 und 7.6 beschrieben.

3. Bereiten Sie die Agar-basierte Inokulum

  1. Bereiten Sie eine kleine Flasche (ca. 50 ml) Nähragar according den Anweisungen des Herstellers oder schmelzen, um eine Flasche von festen Nähragar, die zuvor hergestellt und gelagert wurde. Lassen Sie es auf ca. 50 ° C abkühlen.
  2. Transport des flüssigen Agar und alle erforderlichen Werkzeuge und Geräte für den Infektionsprozess zu dem Verfahren Bereich, in dem die Tiere infiziert sein. Pflegen Sie ein kleines Wasserbad bei 42 ° C im Bereich eingestellt.
  3. Erlauben es dem Agar mit einer Temperatur von etwa 50 ° C zu erreichen, und dann Aliquot 9 ml in ein steriles Röhrchen geeigneter Größe zu passen in das Wasserbad. Lassen Sie dieses Rohr im Wasserbad, bis der Agar auf ca. 42 ° C ins Gleichgewicht. Stellen Sie sicher, das Wasser in einer Tiefe, die die Oberfläche des Agar in seinem Behälter zu decken, aber nicht die Kappe oder Deckel berühren.
  4. 1 ml der Bakteriensuspension saline aus Schritt 2.3 in das Röhrchen, das 9 ml Agar in dem Wasserbad. Das Röhrchen, kehren mehrmals zu mischen, und wieder in das Wasserbad.

4.nesthetize, Intubate und Inoculate Tiere

HINWEIS: Spezifische pathogenfreie (SPF) immunokompetente männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 120 g oder männliche CD-1-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 25 g empfohlen. Stellen Sie alle Tiere mit Futter und Wasser ad libitum und beherbergen sie sozial auf Holzspäne oder andere saugfähige Streu mit Standard - 12 h Hell-Dunkel - Zyklen.

  1. Vor alle Versuche durchführen, erhalten und eine Metallkanüle und Polyethylenschlauch in der entsprechenden Größe für die Tierarten zu sterilisieren. Erhalten sterile 1 ml Einwegspritzen und sterile Einmal 25-Gauge-Nadeln.
    Achtung: Entsorgen Sie diese Spritzen und Nadeln in einem dafür vorgesehenen Behälter.
    1. Für Ratten, kaufen oder eine Metallkanüle herzustellen, die ungefähr 12 cm lang, hat einen ID von 0,9 bis 1,0 mm und Außendurchmesser von 1,0-1,2 mm, und ist auf einen ungefähren Winkel von 45 ° an einem Ende gebogen. Geschnitten, um eine 11- bis 12-Zoll-Länge von Polyethylenschlauch mit einem ID von 0,4 mm und Außendurchmesser 0,8 mm. (Beziehen auf
    2. ein # 20 Tierfutterrohr für Mäuse, erwerben. Entfernen Sie den Ball aus dem Ende des Rohrs, indem sie es mit einer Zange greifen und ziehen stark an, und dann biegen Sie das Ende zu einem ungefähren Winkel von 45 °. Geschnitten, um eine 11- bis 12-Zoll-Länge von Polyethylenschlauch mit einem ID von 0,28 mm und 0,61 mm OD. Auch Kauf und ein Glas 100 ul Mikroinjektionsspritze und eine 30-Gauge-Metall-Mikroinjektionsnadel sterilisieren. (Siehe auf 1B.)
    3. Legen Sie die Metallkanüle in einem Glas, mit Schraubverschluss Rohr und Autoklaven durch Standardverfahren zu sterilisieren. Weichen und speichern Schnittlängen des Polyethylenschlauch in einem abgedeckten Becherglas mit Alkohol.
  2. Bereiten Sie die Arbeitsfläche und Intubation Gerät.
    1. Setzen Sie eine saubere Einweg-Matte auf die Arbeitsfläche, in der Nähe des Wasserbades. Übertragen Sie die Metallkanüle, in dessen Glasspeicherrohr, auf diese Oberfläche. Entfernen Sie die Kappe von der Speicherrohr und schieben Sie den "Griff" Ende des Cannula zum offenen Ende des Rohres.
    2. Mit einer sterilen Pinzette, entfernen Sie eine Länge von Polyethylenschlauch aus dem Becher und setzen Sie sie durch das Innere des sterilen Metallkanüle ein, dass sie sich frei bewegt. Fit eine sterile Einweg 25-gauge Nadel (bei Ratten) bzw. das sterilisierte 30-gauge Metallnadel eines Glasmikroinjektionsspritze (für Mäuse) auf das freie Ende des Schlauchs aus Polyethylen durch die Nadel mehrere mm in das Rohr geschoben wird. (Siehe 1A für Ratten und 1B für Mäuse Abbildung).
    3. Platz Führungsmarkierungen sowohl auf der Metallkanüle und Polyethylenschlauch, um anzuzeigen, Eintauchtiefe in das Tier durch die Intubation Verfahren folgende unten beschrieben auf einem einzigen eingeschläfert Tier. Öffnen Sie die Brusthöhle zur Beobachtung, dann legen Sie die Metallkanüle richtig und rückt den Polyethylenschlauch in geeigneter Weise (wie in Abschnitt 4.7 beschrieben). einen unauslöschlichen Stift verwenden, werden die Metallkanüle markieren, wo sie den Mund des Tieres und dem Poly trifftEthylen Schlauch, wo es die Oberseite der Metallkanüle trifft in verbleibenden Tiere die richtige Platzierung zu unterstützen.
  3. Innerhalb einer Abzugshaube (oder eine entsprechende Spülsystem verwendet wird), betäuben zu einem Zeitpunkt, in einer geschlossenen Kammer zu 6 Tieren bis geliefert mit ≤5% Isofluran in 1,5 l / min Sauerstoff, bis der Würgereflex gehemmt wird (ca. 1 min).
    HINWEIS: Vor alle Versuche durchführen, stellen Sie die sichere Dosis und Belichtungszeit für Isofluran unter den spezifischen Bedingungen verwendet werden (zB Größe / Art der Kammer und Größe / Art / Stamm von Tier) unbeabsichtigte tödliche Exposition zu verhindern.
  4. Füllen Sie eine sterile Einweg-1-ml-Spritze (für Ratten) mit steriler Kochsalzlösung durch die sterile Spitze in die Salz platzieren und wieder auf den Kolben zu ziehen. Füllen Sie das sterile Glasmikroinjektionsspritze (für Mäuse), wie unten beschrieben. Bringen Sie die Spritze mit der Nadel auf die Polyethylenschlauch angebracht, und spülen Sie das gesamte Volumen Kochsalzlösung durch den Schlauch bis zum syringe entleert.
    1. Um die Mikroinjektionsspritze füllen (für Mäuse), vollständig zu entfernen Sie die Metallkolben und Nadel (auf den Polyethylenschlauch montiert) aus der Spritze und setzen Sie beide beiseite.
    2. Füllen Sie eine sterile Einweg-1-ml-Spritze mit steriler Kochsalzlösung (wie oben beschrieben) und befestigen Sie eine sterile Einweg-25-Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel in die Oberseite der Mikroinjektionsspritze (wo das Metall Kolben eingefügt wird), und drücken Sie den Kolben der Einwegspritze, bis sie die Mikroinjektionsspritze mit Kochsalzlösung gefüllt.
    3. Entsorgen Sie die Einwegspritze und Nadel, die verwendet wurden, die Mikroinjektionsspritze in einen Behälter für spitze Gegenstände zu füllen. Befestigen Sie wieder das Metall Mikroinjektionsnadel (montiert auf den Polyethylenschlauch) an die Spitze der Mikro-Injektionsspritze und wieder einsetzen Metall Kolben, deprimierend, bis das gesamte Volumen Kochsalzlösung wurde durch die Spritze und Schlauch gespült worden.
  5. Füllen Sie die Spritze mit dem Agar-basierten Impfstoff herm die Behälter im Wasserbad und bündig Agar durch den Schlauch , gerade bis der Schlauch (mit dem Agar zB vollständig gefüllt) grundiert wird.
    1. Für Ratten, entfernen Sie die 25-Gauge-Nadel (auf den Polyethylenschlauch montiert) von der Einwegspritze. Entsorgen Sie die Spritze in einem Behälter für spitze Gegenstände. Füllen Sie eine neue, sterile Einweg-1-ml-Spritze mit dem Agar-basierten Inokulum aus dem Behälter in dem Wasserbad durch die sterile Spitze in das Inokulum platzieren und wieder auf den Kolben zu ziehen. Wieder anbringen Nadel (auf den Polyethylenschlauch montiert) und bündig Agar durch den Schlauch durch Drücken des Kolbens nur bis Schlauch vollständig mit Agar gefüllt ist.
    2. Bei Mäusen, entfernen Sie die Metallmikroinjektionsnadel (auf den Polyethylenschlauch montiert) und Metall Kolben aus der Mikro-Injektionsspritze und beiseite stellen. Unter Verwendung eines sterilen Einweg-1-ml-Spritze und sterile Einweg 25-gauge Nadel, füllen Sie den Mikroinjektionsspritze mit dem Agar-basierten Inokulum aus dem Behälter in derWasserbad den Füllvorgang in Abschnitt 4.4 beschrieben ist. Befestigen Sie wieder das Metall Mikroinjektionsnadel (auf den Polyethylenschlauch montiert), legen Sie die Metall Kolben und bündig Agar durch den Schlauch nur bis Schlauch vollständig mit Agar gefüllt ist.
  6. Entfernen Sie ein Tier aus der Narkose Kammer. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf dem Wegwerfmatte mit dem Kopf nach rechts und Schwanz nach links , wie in Figur 1C gezeigt.
  7. Verwendung der Intubationsvorrichtung (dh die Metallkanüle mit Polyethylenschlauch vorhanden), um das Tier intubiert und die Kanüle in die große Lappen der linken Lunge einfügen (siehe Figur 1D).
    1. Stecken Sie das freie Ende der Metallkanüle in dem Maul des Tieres. Drehen Sie die Kanüle so dass das freie Ende nach oben abgewinkelt ist und sie sanft in die Trachea vorrücken, sorgfältig die Larynx-Strukturen mit einer leichten Drehbewegung zu umgehen. Bestätigen Einführen in die Trachea zu den gegenüberliegendenSpeiseröhre , indem Sie vorsichtig die Kanüle leicht nach vorn und zurück mehrmals Gleiten während die Trachealringe mit dem linken Zeigefinger palpating wie in 1C gezeigt.
    2. Wenn die Kanüle die Gabelung erreicht, wo die Luftröhre in die linke und rechte Bronchien aufspaltet, stellen eine leichte Drehbewegung in Richtung auf die linke Seite des Tieres zu gewährleisten, dass die Kanüle in dem linken Bronchus eingeführt wird. Schieben Sie die Metallkanüle bis zum Ende ist halb bis drei Viertel der auf der linken Lunge, mit der zuvor platzierten Führungsmarkierung, um zu bestätigen, dass die entsprechende Tiefe erreicht ist.
    3. Mit der Metallkanüle an Ort und Stelle, vorab die Polyethylenschlauch mehrere mm. Verwenden Sie die zuvor platzierten Führungsmarkierung auf dem Schlauch nur so weit fortgeschritten ist genug, um sicherzustellen, dass es das Ende der Metallkanüle zu verlassen und nicht die Lunge durchstoßen.
  8. Mit beiden Kanülen an Ort und Stelle, verwenden Sie die beiliegende Spritze 100 & mgr; l (für Ratten) oder 20 & mgr; l zu vermitteln (für Mäuse) des Agar suspension tief in den großen Lappen der linken Lunge (siehe Figur 1D). Ziehen Sie mehrere mm des Polyethylenschlauch, und dann vorsichtig die intakte Intubation Gerät entfernen. Setzen Sie ihn zurück in die Glasspeicherrohr, und das Tier in einem frischen Käfig bewegen sich zu erholen.
  9. Weiter anesthetizing, Intubation und Inokulieren der übrigen Tiere.
    1. Zwischen Chargen von betäubten Tieren, entfernen Sie die Nadel (auf den Schlauch montiert) aus der Spritze. Bei Ratten, entsorgen Sie die verwendeten Einwegspritze in einem dafür vorgesehenen Behälter und füllen Sie eine neue, sterile Einmalspritze aus dem Inokulum im Wasserbad. Bei Mäusen, füllen Sie das gleiche Glasmikroinjektionsspritze aus dem Inokulum im Wasserbad die Füllung Technik in Abschnitt 4.4 beschrieben ist.
    2. Wenn der Agar in der Intubation Gerät beginnt zu verdicken, spülen Sie alle verbleibenden Agar durch den Schlauch. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze (Verlassen der Nadel auf die Polyethylenschlauch montiert). Folgen Sie den Anweisungen beschriebenin Abschnitt 4.4 zu warm, steriler Kochsalzlösung durch die Intubation Gerät spülen, wie erforderlich sind, um ganz klar jede Blockade zu wiederholen. Leeren Sie alle Kochsalzlösung aus der Spritze und bereiten wieder den Agar Inokulum, wie in Abschnitt 4.5 beschrieben.
    3. Berechnen Sie die endgültige Bakterieninokulum pro Tier die CFU mit aus der Salz Suspension bestimmt (siehe Abschnitt 2.3), die endgültige Verdünnungsfaktor der Salzsuspension in Agar (zB das Zehnfache), und das Volumen in den Tieren geträufelt (zB 100 & mgr; l für Ratten oder 20 & mgr; l für Mäuse).

5. Beurteilen Sie Tiere für potentielle Mis-Impfung oder andere unerwünschte Ereignisse

  1. Beachten Sie sorgfältig alle Tiere während der Intubation, Einträufeln des Agar und aus der Narkose für mögliche Fehl Impfung zu bewerten. Ab sofort einschläfern (nach den örtlichen IACUC Richtlinien) jedes Tier, das blutet, zeigt abnormale Atmung (wie Atemnot oder Keuchen), bewegt sich nichtnormalerweise über den Käfig, oder mit leuchtenden Augen und gesund nicht aus der Narkose bei der Wiederherstellung auftreten.
  2. Wenn spontane Atemstillstand auftritt (in der Regel, wenn der Impfstoff nicht tief genug gesetzt und blockiert die Atemwege), der Tod durch die Beobachtung bestätigen und eine sekundäre Methode der Euthanasie (wie Genickbruch oder Thorakotomie) durchführen.
  3. Minimiert die Zeitdauer, Tiere ausgesetzt sind, Isofluran Anästhesie als nur einige Minuten erforderlich ist, das Verfahren durchzuführen. Wenn injizierbare Anästhetika verwendet werden, sicherzustellen, dass die Tiere bis zum vollständigen Aufwachen unter Beobachtung stehen. Legen Sie Tiere, insbesondere Mäuse, in einer wärmten Umgebung für Erholung, wenn injizierbare Anästhetika verwenden.
  4. Beobachten Sie Tiere mindestens zweimal täglich während der Studiendauer für die folgenden Anzeichen einer Erkrankung der Atemwege: ausgeprägte Atmung, Piloerektion, verminderte Aktivität und verringerte Körpertemperatur. Ab sofort einschläfern (entsprechend den örtlichen Richtlinien IACUC) jedes Tier, das moribund ist, experiences erschwerte Atmung oder Atemnot, eine deutlich reduzierte Körpertemperatur bei der Handhabung hat, ist nicht in der Lage oder nicht willens, Nahrung und Wasser zu bewegen oder nicht erreichen kann.

6. administrieren Test-Behandlungen

  1. Vorbereiten und verwalten Testbehandlungen nach geplanten Studiendesign. Beginnen Verabreichung von Behandlungen bei 1 oder 2 h nach der Infektion (oder zu verzögern Behandlung weiter, wenn eine höhere Basis bakterielle Belastung gewünscht wird). Konkrete Angaben zur Zubereitung und Verabreichung von Testanwendungen kann nicht gegeben werden, da es auf das Ziel der Studie sowie die Eigenschaften jeder einzelnen Behandlung abhängig ist. (Siehe 3 als Beispiel auf Fig.)
  2. Nehmen Sie sich eine Gruppe von infizierten, unbehandelten Tieren als Basis Kontrollen zu dienen. Aufzählen die bakterielle Belastung in den Lungen der Tiere zum Zeitpunkt der Behandlung für die anderen Gruppen initiiert, nach den beschriebenen Verfahren in Abschnitt 7.
  3. Für PK / PD-Analysen bewertendas pharmakokinetische Profil der verabreichten Behandlung (en) im Blut und / oder Geweben der infizierten Tiere. Spezifische Verfahren für pharmakokinetische Studien sind nicht in den Anwendungsbereich dieses Artikels.

7. Aufzählen lebenden Bakterien aus der Lunge

  1. Euthanize eine Gruppe von unbehandelten Tieren zum Zeitpunkt der Behandlung für die anderen Gruppen (Baseline) und den restlichen Tiere am Ende des Untersuchungszeitraums eingeleitet wird (in der Regel 24, 48 oder 96 Stunden nach der Infektion) durch Inhalation allmählich Mengen an Kohlenstoff steigen dioxid innerhalb einer geschlossenen Kammer oder einem alternativen Verfahren, wie von den lokalen IACUC Richtlinien empfohlen. Stellen Sie sicher, Tod durch Beobachtung, und führen Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie (wie Genickbruch oder Thorakotomie).
  2. Legen Sie die Tiere in Rückenlage auf einer sauberen Einweg-Matte und nass gründlich das Fell über die Brust mit Alkohol.
  3. Mit einer sterilen Schere, schneiden durch die Haut, zugrunde liegende Muskelschicht und ribcagemit dem Brustbein parallel zu der Brusthöhle zu öffnen. Fassen Sie die Lunge mit einer sterilen Pinzette und ziehen Sie die Schere zu entfernen, indem sie aus der Luftröhre bei Bedarf zu trennen. Legen Lungen auf steriler Gaze überschüssiges Blut zu absorbieren. Wenn das Herz wurde ebenfalls entfernt, sezieren sie weg und entsorgen.
  4. Machen Sie kleine Schnitzel in der Lunge mit einer sterilen Schere Innere Abschnitte zu entlarven und sterile Pinzette zu platzieren Lungen (plus alle Stücke, die versehentlich snipped ausgeschaltet wurden) in den Boden eines Labormischer Tasche. Kurz rollen einen dicken runden Gegenstand (wie ein Stift oder Marker) über die Außenseite des Beutels um das Gewebe zu zerdrücken. Pipette 1 ml steriler Kochsalzlösung in den Beutel, legen Sie den Beutel in einem Labormischer, und die Labormischer mit hoher Geschwindigkeit für 2 min laufen.
  5. Übertragen Sie die homogenisiert Proben aus den gemischten Beutel in Röhren oder Platten mit einer Pipette. Verdünnen Sie das Homogenat zehnfach durch Aliquotierung 1-K-Homogenat in 9-Teile Kochsalzlösung (wie zum Beispiel 100 & mgr; l Homogenat in 900 & mgr; l saline). Verdünne die resultierende Suspension durch zehnfach wieder in einer ähnlichen Weise. Weiter jede neue resultierende Suspension durch einen anderen Zehnfache Faktor verdünnt, bis mindestens sechs Reihenverdünnungen wurden aus dem ursprünglichen Homogenats hergestellt.
  6. Pipette dreifacher Ausfertigung Aliquots von 20 & mgr; l jeweils von allen Verdünnungen auf Trypticase - Soja - Agar - Platten , ergänzt mit Schafsblut (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa oder A. baumannii) oder auf Schokolade - Agar - Platten (H. influenzae). Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit oder ohne CO 2. (Siehe Abbildung 1E für ein Beispiel eines resultierenden Platte.)
  7. Zählen der Kolonien in jeder der drei Replikaten auf der ersten Verdünnung , die eine "zählbar" Nummer enthält (dh nicht zu viele Kolonien zu maßen zählen). Berechnen Sie den Durchschnittswert der drei Wiederholungen. Bestimmen Sie die KBE pro Lunge durch den Mittelwert von 50 multipliziert wird (zur Berücksichtigung von Plattierung 20 ul der insgesamt 1 mlHomogenat) und Factoring in der letzten Verdünnungsfaktor aus dem ursprünglichen Homogenats bei dem die Kolonien wurden gezählt.

Representative Results

Die Werkzeuge erforderlich, die Ausrichtung des Tieres, und die Tiefe der Intubation sind in Abbildung 1 dargestellt. ist auch ein repräsentatives Beispiel der Kolonien auf eine Agar-Platte nach serieller Verdünnung und dreifach Plattieren einer Lungenhomogenat Probe gezeigt. Eine Erhöhung der bakteriellen Belastung von mehreren log 10 CFU über dem Ausgangswert steuert , ist typischerweise in infizierten Lunge für die meisten bakteriellen Isolate, auch bei 96 h nach der Infektion beobachtet, und die Variabilität zwischen den Tieren niedrig ist (Abbildung 2). Für einige H. influenzae, kann es wenig Wachstum; Allerdings beginnen die Infektion sollte nicht selbst beheben innerhalb eines 48 oder 96 h Zeitperiode (2B). Diese Lungeninfektionsmodell kann bei der Optimierung von Blei chemischen Serie verwendet werden SAR zu unterstützen, wie 16 in Figur 3 für repräsentative Verbindungen von zwei unterschiedlichen Serien gezeigt, 17. Es bietet eine konsistente und reproduzierbare erfüllthod für PK / PD in immunokompetente Tiere Bewertung und verwendet wurde , dass der freie Arzneimittel Fläche unter der Konzentrations-Zeit - Kurve über die minimale Hemmkonzentration (fAUC / MIC) mit Wirksamkeit eines neuartigen Polypeptid Deformylase (PDF) Inhibitor gegen S. pneumoniae korreliert , um zu bestimmen und H. influenzae (Abbildung 4). Zusätzlich von der fAUC / MIC Ziele für Stase und eine 1-log Reduktion in CFU 10 Baseline - Kontrollen in 11 S. pneumoniae und H. influenzae 5 Isolaten (Tabelle 1) 18 bestimmt. Die Kopplung dieser Infektionsmodell mit einem Arzneimittelabgabesystem menschlichen pharmakokinetischen Profile in Ratten neu schafft ein leistungsfähiges Werkzeug für die menschliche Dosierungsschemata vor der klinischen Studien zu bewerten. Ein Beispiel hierfür ist in Tabelle 2 zusammengefasst , die zeigt , dass eine Extended-Release - Formulierung von Amoxicillin-Clavulanat effektiver als bestehende Dosierungsschemata für Organismen mit eleva warted MIC - Werte 19.

Abbildung 1
Abbildung 1: Nonsurgical Intratracheale Intubation. Die Werkzeuge werden für Intubation die Ratte (A) und der Maus (B) gezeigt. Einmal betäubt, sollte das Tier positioniert werden , wie in C gezeigt, mit dem Kopf nach rechts und Schwanz nach links , wenn die Person , die Technik der Durchführung ist Rechtshänder. Stellen Sie den linken Zeigefinger sanft auf den Hals zu helfen, die Trachealringe zur Bestätigung der korrekten Kanülenplatzierung abtasten. Das Inokulum sollte tief in die linke Lunge platziert werden, wie in der ventralen Ansicht eines Rattenlunge (D) gezeigt ist . Die Kolonien wachsen auf Agar nach Reihenverdünnung und Plattierung einer Probe sollte gezeigt , dass in E ähnlich erscheinen. 1D Copyright © Gill Smith [Labortiere, Band 25 (1991), G. Smith, Aeinfache , nicht-chirurgische Methode der intrabronchiale Instillation für die Einrichtung von Atemwegsinfektionen bei der Ratte, Seiten 46-49] 14. Abdruck mit freundlicher Genehmigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Repräsentative Beispiele für Bakterienwachstum in den Lungen infizierter Tiere. Mittelwert ± Standardabweichung CFU Daten von N = 5 Tiere / Gruppe wird für verschiedene Isolate von S. pneumoniae (A) gezeigt, H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) und A. baumannii (E). Der erste Balken jedes Paares (hellgrau) ist das Basis bacterial Belastung bei 1 oder 2 h nach der Infektion, während die zweite Bar ist der End-of-Studie Wachstumskontrolle erfolgt nach 48 Stunden nach der Infektion (dunkelgrau) oder 96 h nach der Infektion (schwarz). Keine Daten Zensierung Methoden angewendet wurden; Somit sind diese Ergebnisse von Daten aus allen 5 Tieren pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Die Wirksamkeit von verschiedenen chemischen Serie während der Leitstrukturoptimierung auswerten. Lung Infektion Modelle, die beschriebenen Techniken wurden verwendet, um Struktur-Aktivitäts-Beziehungen im Rahmen der abacterial Typ IIA Topoisomerase-Programm zu erkunden. Viel versprechende Verbindungen 7 und 1 wurden gegen ausgewertet quinolone anfälligen (A) 16 oder Chinolon-resistente(B) 17 Isolate von S. pneumoniae sind. Jedes Symbol steht für CFU aus der Lunge von einer Ratte bestimmt mit Linien, die die Gruppe Mittelwert und Standardabweichung. Untere Grenze (LLQ) betrug 1,7 log 10 KBE / Lunge. Verbindungen wurden gewogen (56 oder 112 mg reines Molekül frei parent), in 9 ml sterilem Wasser gelöst, verdünnt 3 mL in 3 mL Wasser (1: 1) und durch orale Gabe von 1 ml / 125 g Ratte zweimal täglich verabreicht ( 6 - 7 h auseinander) für 2 Tage, beginnend bei 1 h nach der Infektion. Nicht-behandelten Kontrollen (NTC) wurden bei 1 h nach der Infektion für die Basislinie abgetastet oder mit Kochsalzlösung behandelt, und am Ende der Studie (48 h) zum Wachstumskontrollen abgetastet. 3A nachgedruckt von Bioorganische & Medicinal Chemistry Letters, Band 21, TJ Miles et al, Roman cyclohexyl-Amide als potente antibakterielle Mittel Targeting bakterielle Typ IIA topoisomerases, Seiten 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, mit Genehmigung von Elsevier.3B nachgedruckt von Bioorganische & Medicinal Chemistry Letters, Band 26, TJ Miles et al, Roman tricyclics (zB GSK945237) als potente Inhibitoren von bakteriellen Typ IIA topoisomerases, Seiten 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, mit Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: PK / PD - Charakterisierung eines neuen PDF - Inhibitor. Emax - Modelle wurden unter Verwendung erstellt Wirksamkeitsdaten in immunkompetenten Mäusen Dosis im Bereich in der Lunge infiziert mit Isolaten von S. pneumoniae (A) oder H. influenzae (B) PK / PD Ziele für einen neuen PDF - Inhibitor 18 zu bestimmen. Kreisestellen die mittlere bakterielle Belastung von 4 bis 5 Mäuse / Gruppe mit unterschiedlichen Dosen der Verbindung behandelt. Die Analysen wurden durchgeführt, um korrelieren Wirksamkeit mit frei Medikament 24 h AUC (offene Kreise) oder AUC / MIC (gefüllte Kreise). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung, Copyright © Amerikanischen Gesellschaft für Mikrobiologie, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Band 60, 2016, Seiten 180-189] 18. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Stase 1-log 10 Reduzierung
Organismus MIC
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R 2 für
Linie fi
t (%)
fAUC fAUC / MIC fAUC fAUC / MIC Max Tötung
(log 10 Reduktion)
S. pneumoniae
10127 0,25 99,9 2.0 8.1 3.6 14.4 2.8
1316009S 0,25 96,1 6.5 26.0 15.1 60.3 1.8
ATCC10813 0,5 100 8.4 16.9 22.2 44.5 1.2
1307007S 1 95,8 16.1 16.1 20.1 20.1 2.7
ATCC6303 1 99,8 19.8 19.8 24.8 24.8 2.8
1629 2 100 15.8 7.9 21.2 10.6 2.4
298443 2 99,9 26.5 13.2 31.0 15.5 2.3
336808 2 86 8.2 4.2 19.0 9.5 2.6
338860 2 99.5 2.9 1.5 6.7 3.4 2.8
& #160; 340449 2 94,6 8.0 4.0 14.9 7.4 2.1
L11259 2 100 7.1 3.5 9.0 4.5 2.0
Mittelwert ± SD NA ein N / A 11,0 ± 7,5 11,0 ± 7,9 17,0 ± 8,2 19,5 ± 17,8 2,3 ± 0,5
Median N / A N / A 8.2 8.1 19.0 14.4 2.4
H. influenzae
1998-100-126H 1 99,7 7.3 7.3 13.4 13.4 2.9
503-008H 1 99,8 7.1 7.1 13.9 13.9 2.7
08003H 2 99,9 14.5 7.2 16.7 8.3 2.7
H128 2 96,6 15.3 7.6 26.0 13.0 2.7
19001H 4 91.9 14.8 3.7 37.3 9.3 3.0
Mittelwert ± SD N / A N / A 11,8 ± 4,2 6,6 ± 1,6 21,5 ± 10,2 11,6 ± 2,6 2,8 ± 0,1
Median N / A N / A 14.5 7.2 16.7 13.0 2.7
ein NA, nicht anwendbar.

Tabelle 1: PK / PD - Targets zur Herstellung eines neuen PDF - Inhibitor gegen S. pneumoniae und H. influenzae - Isolaten. Frei Arzneimittel AUC und die AUC / MIC Ziele für Stase und eine 1-log 10 Reduktion der CFU von der Basislinie wurden für 11 S. pneumoniae bestimmt und 5 H. influenzae in immunokompetente Mäusen in der Lunge infiziert und mit Verbindung 18 behandelt. Die data wurde verwendet, wählen Sie die menschliche Dosen für die klinische Entwicklung zu helfen. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung, Copyright © Amerikanischen Gesellschaft für Mikrobiologie angepasst und neu aufgelegt, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Band 60, 2016, Seiten 180-189] 18.

<td> 875/125 mg tid (Verhältnis 7: 1)
Behandlungsgruppe ein Mittlere log 10 S. pneumoniae (KBE / Lunge) b ± SD für Stamm (AMX / CA MIC):
05010S
(2 ug / ml)
16001S c
(4 ug / ml)
16001S
(4 ug / ml)
30005S
(4 ug / ml)
20009S
(4 ug / ml)
05003S
(8 & mgr; g / mL)
404053
(8 & mgr; g / mL)
47003S
(8 & mgr; g / mL)
Steuern 7,3 ± 0,4 7,0 ± 0,8 5,7 ± 1,2 7,1 ± 0,7 7,1 ± 0,4 6,4 ± 0,6 6,8 ± 0,4 6,0 ± 0,3
AMX / CA
2.000 / 125 mg zweimal täglich (Verhältnis 16: 1) ≤ 1,7 ** 2,8 ± 1,2 ** 2,2 ± 0,8 ** 2,3 ± 0,9 ** 2,5 ± 0,9 ** 2,0 ± 0,9 ** 3,8 ± 1,4 ** 1,8 ± 0,2 **
1.000 / 125 mg tid (Verhältnis 8: 1) NT NT 2,8 ± 0,5 ** 2,7 ± 1,3 ** 3,3 ± 0,9 ** 4,9 ± 0,5 ** 6,6 ± 1,3 4,7 ± 0,7 **
NT NT 3,0 ± 1,3 * 2,1 ± 0,7 ** 3,2 ± 0,4 ** 5,2 ± 0,9 * 6,4 ± 0,6 4,9 ± 0,4 **
875/125 mg zweimal täglich (Verhältnis 7: 1) NT NT 4,5 ± 1,2 * 5,6 ± 1,3 * 5,2 ± 0,7 ** 6,3 ± 0,7 6,4 ± 0,7 5,5 ± 0,4
500/125 mg tid (Verhältnis 4: 1) 3,1 ± 1,3 ** 4,5 ± 0,9 ** NT NT NT NT NT NT
Azithromycin, 1000/500 mg od NT NT NT 5,8 ± 2,0 7,1 ± 0,9 3,1 ± 1,0 ** 6,6 ± 0,4 6.07; 0,6
Levofloxacin, 500 mg od NT NT 4,2 ± 0,8 * 5,7 ± 0,8 * 4,9 ± 0,8 ** 3,0 ± 1,3 ** 3,5 ± 0,2 ** 3,9 ± 0,8 **
Behandlungsgruppe d Die mittlere log 10 H. influenzae (KBE / Lunge) ± SD für Stamm:
H128
(β-Lactamase
- positiv)
Chesterfieldsofa
(β-Lactamase
- negativ, Ampicillin - resistente)
Steuern 6,4 ± 0,6 6,7 ± 0,6
AMX / CA
2.000 / 125 mg zweimal täglich (Verhältnis 16: 1) 2,0 ± 0,7 ** 3,1 ± 0,9 **
1.000 / 125 mg tid (Verhältnis 8: 1) 2,1 ± 1,0 ** 3,6 ± 1,1 **
875/125 mg tid (Verhältnis 7: 1) 2,8 ± 1,3 ** 3,8 ± 1,3 **
875/125 mg zweimal täglich (Verhältnis 7: 1) 2,0 ± 0,8 ** 5,1 ± 1,1 **
Azithromycin, 1000/500 mg od 3,2 ± 1,7 * 5,8 ± 1,1
Levofloxacin, 500 mg od ≤ 1,7 ** ≤ 1,7 **
ein AMX / CA, Amoxicillin-Clavulanat; Gebot, zweimal täglich; tid., dreimal pro Tag; od, einmal pro Tag.
b Die Nachweisgrenze lag bei <1,7; * Signifikant verschieden von der Kontrolle (P ≤ 0,05); ** Signifikant verschieden von der Kontrolle (P ≤ 0,01); NT, nicht getestet.
C - Stamm 16001S wurde in zwei getrennten Experimenten getestet.
d Amoxicillin-Clavulanat 500/125 mg (4: 1) dreimal am Tag nicht gegen die H. influenzae - Stämmen getestet.

Tabelle 2: Wirksamkeit von Recreated Humanplasma Belichtungsprofile für unterschiedliche Amoxicillin / Clavulanate Dosierungen. Erzeugten Daten in immunokompetente Ratten in der Lunge infiziert mit Isolaten von S. pneumoniae oder H. influenzae dieses Modell gezeigt , dass eine verbesserte Formulierung von Amoxicillin-Clavulanat (2000/125 mg zweimal täglich) war wirksamer als Standard - Dosierungen gegenüber Isolaten mit erhöhten Empfindlichkeit in vitro 19. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung, Copyright © Amerikanischen Gesellschaft für Mikrobiologie angepasst und neu aufgelegt, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Band 49, 2005, Seiten 908-915] 19.

Discussion

Für einen optimalen Erfolg in diesem Infektionsmodell reproduzieren, sollten die folgenden zusätzlichen Vorschläge berücksichtigt werden. 3 mal in vivo vor der Verwendung in einer Studie - Virulenz neuer Isolate können durch Passagierung 2 verbessert werden. Gefrorene Bakterien Bestände sollten immer von einem primären in vivo abgeleitetes Quelle mit möglichst wenigen Passagen wie möglich von der ursprünglichen hergestellt werden und erneutes Gefrieren oder Wiederverwendung von aufgetauten Lager wird abgeraten. kürzlich durchgeführten klinischen Isolaten von Patienten mit Lungenentzündung erholt Verwendung und / oder Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase der Vorbereitung können auch Etablierung der Infektion zu verbessern. Eine fünffache Verdünnung in den Agar (zB 2 mL Kochsalzsuspension zugesetzt 8 ml Agar) kann anstelle von verwendet werden zehnfach das bakterielle Inokulum zu erhöhen und das Inokulum Volumen eingestellt werden kann , von der Größe des Tieres basiert (beispiels 200 & mgr; l / Tier wird in der Regel in 250 g Ratten geimpft). Bevor die Salzbakteriensuspension in die zum HinzufügenAgar ( das heißt bei dem Schritt 2.3) kann die Bakteriendichte durch visuelle Inspektion vorausgesagt oder geschätzt werden, MacFarland Standard oder Messungen der optischen Dichte. Es ist hilfreich , vertraut zu werden mit den in - vitro - Wachstumseigenschaften für jede der Durchführung in vivo - Experimenten vor isolieren. Konsistenz in Wachstum und Handhabung ermöglicht, die genaueste Abschätzung der Bakteriendichte für jeden gegebenen isolieren. Standard mikrobiologische Verfahren, die von denen beschrieben wird, wie beispielsweise alternative Medien und Gewebe Homogenisatoren unterscheiden, können geeignet verwendet werden zur Herstellung von Inokula und Bakterien aus infizierten Geweben aufzählt.

Es wird dringend vor dem Experiment der Agar den Tag vorzubereiten oder zu schmelzen empfohlen und speichern Sie es über Nacht in einem separaten Wasserbad auf 50 ° C eingestellt. Dies wird den Prozess vereinfachen und Schutz gegen die Agar zum Zeitpunkt der Infektion zu heiß. Eine Temperatur von 41 bis 42 ° C erreicht, eine gute Balance zwischen der Wartung desning der Agar in flüssigem Zustand ohne kurzfristige Überleben der Bakterien für zu heiß. Als mögliche Alternative zu Nähragar wurde noble Agar wurde in einigen Versuchen erfolgreich eingesetzt. Ein Rohr aus Agar Inokulum in der Regel ausreichend für eine gesamte Experiment (und empfohlen wird), sondern mehrere Rohre können zum Infizieren einer großen Anzahl von Tieren hergestellt werden (beispielsweise mehr als 60) , oder wenn das infizierende Vorgang dauert länger als 30 - 45 min Wenn mehrere Inokulum Rohre erforderlich sind, fügen die Salzbakteriensuspension in jedes Röhrchen Agar, wie es benötigt wird. Dies reduziert das Risiko, dass bakterielle Überleben und / oder Eignung wird durch verlängerte Exposition gegenüber einer erhöhten Temperatur vor der Inokulation berührt. Es sollte beachtet werden, dass die Verwendung mehrerer Inokulum Rohre auch zusätzliche Randomisierung Tierverfahren erfordern. Wann immer möglich, infizieren alle Tiere aus dem gleichen Inokulumzubereitung. Es wird empfohlen, die Größe der Experimente auf dem aktuellen Stand der Kenntnisse im Umgang mit dem te zuzuschneidenchnique.

Ein erfahrener Wissenschaftler kann ein Tier in weniger als 30 s intubieren und impfen und impfen bis 5 - 6 Tiere pro Charge (dh mit einer Spritze voller Agar Inokulum). Für diejenigen, die Technik zu lernen, ist die Geschwindigkeit wichtig wie die Agar beginnt zu verfestigen; jedoch eine genaue Platzierung des Inokulums ist wichtiger. Beginnen Sie mit 1 oder 2 Tiere pro Charge, und erhöhen so die Technik vertrauter wird. Die Tiere auch weiterhin während der Intubation zu atmen; Somit hängt die Zeitfenster für die Inokulation ab, wie schnell sich das Tier erholt sich von Isofluran, die etwa 2 sein sollte - 3 min. Tiere, die während des Prozesses erwecken können wieder narkotisiert und ein zweites Mal versucht, aber es wird nicht empfohlen, so wiederholt zu tun. Erfolgreiche Impfung beim ersten Versuch wird in fast 100% der Tiere zu erwarten, wenn Fähigkeits erreicht wird. Beachten Sie, dass es einfacher ist, die Technik unter Verwendung von Ratten zu erlernen zuerst; Mäuse sind empfindlicher und je kleiner zuls sind anfälliger mit verfestigten Agar zur Verstopfung, wenn nicht schnell manipuliert. Vorwärmen Spritzen, Schläuche und Kochsalzlösung sowie die Intubation Gerät an einem warmen (nicht heißen) Oberfläche, wie ein Heizkissen auf niedriger Einstellung zu halten, helfen Verfestigung des Agar verhindern kann. Wenn die Technik lernen, ist es auch hilfreich, die richtige Platzierung des Inokulums zu praktizieren unter Verwendung eines dunkel gefärbten Farbstoff (wie konzentrierte Methylenblau) anstelle der Bakteriensuspension in Agar. Führen Sie das Verfahren wie beschrieben, aber einschläfern das Tier unmittelbar nach der Inokulation des Farbstoffs (nicht erlaubt, das Tier zwischen Anästhesie und Euthanasie zu erholen). Sezieren, um zu bestimmen, wo der Farbstoff angeordnet ist, und entsprechend anpassen Technik.

Der primäre Endpunkt in diesem Modell ist CFU aus infizierten Lunge. Überleben ist kein guter Indikator für die bakterielle Belastung und ist keine empfohlene Endpunkt. Für Wirksamkeitsstudien ist die vorgeschlagene N 5 - 6 Tiere pro Gruppe, wie dies predicte istd ≥1 log 10 CFU Unterschiede zwischen den Gruppen mit mindestens 90% Leistung zu erfassen. Tiere können in Gruppen angesteckt werden, so dass Käfiggenossen zusammen bleiben, oder eine wahre Randomisierung Prozess verfolgt werden kann. Beachten Sie, dass, wenn Gruppen von Käfig zugeordnet sind, sollten die Gruppen mit den am Ende der Studie Wachstumskontrollen in einer zufälligen Sequenz infiziert werden zuletzt infiziert (um die bakterielle Überlebens bestätigen / Fitness wurde nicht durch die Länge der Zeit einer erhöhten Temperatur ausgesetzt betroffen im Wasserbad). Keine Daten censoring Methoden sollten notwendig sein, und keine sind, mit Ausnahme der unmittelbaren Entfernung von jedem Tier zu empfehlen, die offensichtlich falsch inokuliert zu Beginn der Studie (vor der Einleitung irgendwelcher Behandlungen) gewesen ist. Tiere , die vor dem Ende der Studie eingeschläfert werden sollte , es sei denn für den Ausschluss eines triftigen Grundes im Datensatz abgetastet und die Ergebnisse einbezogen werden prospektiv identifiziert (dh ein Ereignis in keinem Zusammenhang mit der Infektion oder Behandlung). Drug Verschleppung kann affeinige Proben ect und ist eine wichtige Überlegung für alle in vivo Infektionsmodellen. Wenn eine Verbindung häufig gegeben ist, in der Nähe der Zeit der Euthanasie oder hat eine lange Halbwertszeit, kann es bei einer ausreichend hohen Konzentration im Gewebe Homogenat vorhanden sein , um weiterhin Bakterien ex vivo während der bakteriellen Enumerationsprozess (Verdünnung und Plattierung des Tötens die Proben oder auf den Agarplatten während der Inkubation über Nacht). Um dem vorzubeugen, Aktivkohle und / oder ein Additiv, das das aktive Molekül abbaut, ohne die Bakterienzellen schädigen können vor der Homogenisierung zu der Probe gegeben werden. Andere Verfahren umfassen die Proben Zentrifugieren der Mehrheit der aktiven Verbindung zu entfernen (die im Überstand bleiben soll) und unterschiedliche Verdünnungs Verwendung und Plattieren Schemata ausreichend den Wirkstoff in eine nicht-inhibitorische Konzentration verdünnen.

Wie in Abbildung 2, dieses Modell durch die i gezeigten Beispielen belegt erfolgreichnduces Lungeninfektionen bei Nagetieren mit einem breiten Spektrum von Organismen einschließlich derer, die in anderen Modellen (zB H. influenzae) nicht gut wachsen. Diese Infektionen sind konsistent und reproduzierbar, was die Wahrscheinlichkeit reduziert wird, die Experimente benötigen aufgrund der Modellversagen wiederholt werden und / oder eine schlechte Leistung mit einem gegebenen Isolat. Obwohl die Tiere immunokompetenten sind, sind sie nicht in der Lage, die Infektion zu schnell zu lösen, wenn überhaupt. Dies ermöglicht eine größere Flexibilität bei der Studie der Länge, wie viele Isolate eine tragfähige Infektion durch mindestens 96 h, ohne die Notwendigkeit halten für wiederholte Injektionen Neutropenie zu halten. Der potenzielle Nutzen des Studierens antibakterieller Wirksamkeit bei Immun Tieren wurde 20 zuvor angemerkt, 21, und es gibt Hinweise , dass für einige Verbindungen (zB oxazolidinones), Daten aus nicht neutropenischen Nagetiere genauer die Exposition des Menschen Ziele vorhersagen kann , verglichen mit denen gemacht neutropenische 5. Der Mehrzweck-Verwendbarkeit von ter Modell ist in den Figuren gezeigt , 3 und 4 und den Tabellen 1 und 2. Diese Studien sind Teil einer großen Sammlung von veröffentlichten und nicht veröffentlichten Daten , die mit diesem Modell generiert wurde , um Lead - Optimierung Anstrengungen 16, 17, 22-24, zum Vergleich unterstützen und die Bestätigung der vorgeschlagenen menschlichen Dosierungsschemata 19, 25-29 und für PK / PD - Charakterisierung 18, 30-32 .Während dieses Modell zunächst komplexer ist , mit der intranasalen Inhalation Methode zur Durchführung verglichen, gibt es viele Vorteile , wie oben beschrieben. Mit etwas Übung und Routine zu verwenden, sollten die Techniken unkompliziert geworden auszuführen.

Es kann in einigen Studien festgestellt werden, dass die bakterielle Belastung zu Beginn der Studie, dass niedriger war als in der Regel in anderen Lungeninfektionsmodellen gezielt. Dies ist zum großen Teil auf die gewünschte Verdünnung in Agar und das kleine Volumen Herausforderung, insbesondere bei Mäusen. Es sollte jedoch auch beachtet werden,dass das Bakterienwachstum wurde in allen Fällen gesehen, selbst wenn die anfängliche Belastung relativ gering war. Die Zielbasisbakterienbelastung ist 6 bis 6,5 log 10 KBE / Lunge (6,8 bis 7,3 log 10 KBE / g Gewebe bei Mäusen nach durchschnittlichen Lungengewichte) , die in menschlichen Patienten mit einer schweren Lungenentzündung 33 geschätzt Dichten entspricht. Eine höhere Basislast kann durch weitere Konzentration der Bakterieninokulum oder durch Verzögerung der Beginn der Verabreichung der Verbindung zu ermöglichen, zusätzliche Bakterienwachstum erreicht werden kann; aber zu viel der Herausforderung zunehmender Belastung kann zu abnorm schwere und akute Erkrankung führen (dh Tod in weniger als 24 h), die für alle antibakterieller Therapien refraktär ist unabhängig von der Anfälligkeit. Obwohl das Inokulum anfangs vorzugsweise in die linke Lunge des Tieres gelegt wird, breitet sich die Infektion im Allgemeinen überall in beiden Lungen. Progressives Lungenerkrankung, die Verbreitung der Bakterien auf andere Organe und eventuelle Morbidität ist oft observed mit S. pneumoniae, K. pneumoniae und P. aeruginosa. Von Interesse sind Infektionen mit H. influenzae und A. baumannii in der Regel mehr enthalten und nur selten in der vorgeschriebenen bakteriellen Inokula zum Tod führen.

Die Ergebnisse zur Wirksamkeit von diesem Modell erhalten haben , gut korreliert mit in - vitro - Empfindlichkeit Profile sowie definierte PK / PD - Ziele. Kürzungen bei der bakteriellen Belastung sind für die Isolate als anfällig für den Agenten getestet, während die als resistent zeigen keine Veränderung oder Bakterienwachstum über dem Ausgangswert 16, 17, 19, 24-29 routinemäßig beobachtet. Studien an Ratten Auswertung zwei Chinolone und ein Makrolid dieses Modell 32 haben gezeigt , dass die PK / PD - Ziel für eine 10 Reduktion der S. pneumoniae Vergleich zum Ausgangswert mit dem in neutropenischen Mäusen bestimmt Ziel korreliert log 1-erforderlich und, was noch wichtiger ist , mit klinische Ziele für die Gemeinschaft erworbenen bakteriellen pneumonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, ein neuartiger Mechanismus Antibiotikum, wurde gegen mehrere S. pneumoniae getestet und eine ähnliche PK / PD - Ziel , die für eine 1-log 10 Reduktion in diesem Modell Lungeninfektion 31 , wie es für ein Modell 1-log 10 Reduzierung der neutropenische Oberschenkel erforderlich 36 , wenn Lungenpenetration wurde berücksichtigt ( die Daten - Datei) übernommen. In ähnlicher Weise waren die PK / PD - Ziele bestimmt in Mäusen für GSK2251052 gegen P. aeruginosa konsistent für Stase, 1- und 2-log 10 Reduktion der CFU zwischen diesem Lungenmodell 30 und dem neutropenische Oberschenkel - Infektionsmodell bei Lungen Penetration 37 betrachtet wurde, 38 . Die Korrelation mit einer Neutropenie-Modell Lungeninfektion unter Verwendung von intranasalen Impfung war schlecht; jedoch GSK2251052 nicht produzieren mehr als eine statische Reaktion in dieser Studie 38. Dies kann auf die höhere bakterielle Inokulum zurückzuführen sein, die 8 log 10 KBE / Maus war im Vergleich mit 6 log 37 und intratracheale Intubation 30 Modelle. Sammlung von Daten, wie dies ist kritisch für Benchmark, da es einen direkten Vergleich mit bestehenden Modellen und Korrelation mit klinischen Daten erlaubt die translatorische Vorhersagefähigkeit zu bewerten. Mehr weit verbreitete Verwendung des Modells Lungeninfektion intratracheale Intubation wird für diese Art von Analysen zusätzlicher Daten.

Es gibt einige Einschränkungen dieser immunokompetente Pneumonie-Modell. Erstens ist es nicht gut geeignet Entstehung von spontanen Resistenz gegen die Bewertung, da die hohe allgemein bakterielle Inokulum für solche Studien führt zu streng einer Infektion erforderlich. Nach Versuchen, bakterielle Belastungen von 7 oder 8 log 10 CFU zu Beginn der Studie zu erreichen, hat eine schnelle Morbidität beobachtet (dh Tiere , immer moribund in weniger als 24 h) trotz sorgfältigem Waschen der Inokula vorbestehenden Toxine (Daten - Datei) zu entfernen. Eskann möglich sein, dieses Problem zu überwinden, indem sie größere Nagetiere verwenden. Ratten, besonders schwerer Ratten (> 250 g), scheinen besser höher Inokula zu tolerieren als mit Mäusen verglichen, und kann für diese Art von Untersuchungen geeignet sein. Eine zweite Einschränkung ist, dass die Verwendung von Agar als infektions Enhancer ausschließen kann das Modell zur Bewertung bestimmter Host mit: Pathogen-Interaktionen. Es wird angenommen, daß der Agar ein geschütztes Brennpunkt liefert, bis Infektion vollständig innerhalb der Lunge festgestellt wird. Es ist möglich, den Impfstoff in Kochsalzlösung statt Agar liefern zu helfen, dieses Problem zu überwinden; jedoch ist zu beachten, dass dies nur eine Infektion mit einigen Isolaten produziert. Drittens gibt es eine steile Lernkurve in der Technik vertraut zu machen erforderlich. Das Verfahren kann empfindlich, vor allem bei Mäusen sein. Es ist leicht, die Metallkanüle in die Speiseröhre fälschlicherweise zu platzieren, und eine übermäßige Kraft auf Einstich entweder der Speiseröhre oder der Luftröhre führen. Eine sorgfältige Platzierung des Inokulums ist aucherforderlich oder Tiere können entweder nicht erholen oder nicht ausreichend angesteckt werden. Doch mit Geduld und Ausdauer kann man sehr beherrschen und die Technik schnell durchführen, flüssig und präzise.

Durch das Entfernen der Anforderung für Neutropenie, zunehmende Robustheit und Reproduzierbarkeit, so dass die Ermittler mehr Krankheitserreger und Isolate zu untersuchen, die Flexibilität der experimentellen Design zu verbessern und eine anspruchsvolle Infektion Pharmakodynamik für eine Lungenentzündung zu charakterisieren, diese immunokompetente Modell Lungeninfektion fügt einen wesentlichen Wert auf die Antibiotika-Entdeckung Gemeinschaft. Die verstärkte Nutzung dieses Modells durch zusätzliche Ermittler wird dazu beitragen, die notwendige Benchmarking sorgen dafür breitere Akzeptanz zu gewinnen und weiterhin unterstützende Informationen für eine angemessene Interpretation bieten.

Disclosures

Die Autoren sind alle Mitarbeiter von Glaxosmithkline Pharmaceuticals und eigene Aktien des Unternehmens innerhalb des Unternehmens bezahlt.

Acknowledgments

JH möchte seiner Anerkennung und danken Mentor, Freund und ehemaliger Manager Valerie Berry für uns zuerst dieses Modell unterrichten; und Gary Woodnutt, der uns die Grundlagen gelehrt und inspiriert unser Engagement auf dem Gebiet der antibakteriellen PK / PD. Alle Autoren wünschen David Payne für seine Unterstützung und Anerkennung für unsere Wissenschaft zu danken. Wir möchten , dass unsere früheren In - vivo - Mikrobiologie Kollegen zu erkennen , die auf den Körper von Daten beigetragen , diese Verfahren erzeugt mit, vor allem Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Seite und Nerissa Simon. Schließlich danken wir unseren in vitro Mikrobiologie Kollegen für ihre Unterstützung, insbesondere für die Bereitstellung aller MHK wir (Lynn McCloskey, Josh Westen und Sharon Min) verlangen; und für unsere klinischen Mikrobiologie-Team, die kompetente Beratung und Unterstützung (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman und Deborah Butler) zur Verfügung stellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood Becton Dickinson and Company 4321261
Chocolate II Agar Becton Dickinson and Company 4321267
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified Becton Dickinson and Company 299070
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol Becton Dickinson and Company 297808 storage media for frozen stock
Inoculating loop Nunc 251586
0.9% Sodium Chloride, USP Baxter Healthcare Corporation NDC 0338-0048-04
Difco Nutrient Agar Becton Dickinson and Company 213000
30 mL free standing centrifuge tube with cap EverGreen Scientific 222-3530-G80
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Falcon, a Corning Brand 352070
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm Falcon, a Corning Brand 352059
Guide Tool Intek Services Ltd GT01 custom-made metal cannula for rats
90' Portex tubing SAI POR-080-100 plastic cannula for rats
1 mL TB syringe slip tip Becton Dickinson and Company 309659
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 Becton Dickinson and Company 305122
Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 Popper and Sons, Inc 7903 used to create metal cannula for mice
Intramedic polyethylene tubing Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company 427401 plastic cannula for mouse 
75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 Hamilton 87930 HPLC glass injection syringe
Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner Corning 9825-25 to autoclave/store metal cannulae
70% isopropyl alcohol Vi-Jon (Swan) NDC 0869-0810-43
Isoflurane, USP Piramal Healthcare NDC 66794-013-10
Stomacher  Seward Stomacher80
Stomacher 80 classic bags Seward BA6040
Assay plate, 96 well, round bottom Costar, Corning Inc 3795 optional, for serial diluting
Blood Omni Plates Hardy #A127 optional, rectangular blood plates

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References

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