Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre

Immunology and Infection
 

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Hoover, J. L., Lewandowski, T. F., Mininger, C. L., Singley, C. M., Sucoloski, S., Rittenhouse, S. A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii. J. Vis. Exp. (119), e55068, doi:10.3791/55068 (2017).

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Abstract

Efficacité des traitements antibactériens candidats doit être démontrée dans des modèles animaux d'infection dans le cadre du processus de découverte et de développement, de préférence dans des modèles qui imitent l'indication clinique prévue. Procédé pour induire des infections pulmonaires solides chez des rats et des souris immunocompétentes est décrit qui permet l'évaluation des traitements dans un modèle de pneumonie grave causée par S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae ou Acinetobacter baumannii. Les animaux sont anesthésiés et un inoculum à base de gélose est déposée dans le poumon profond par intubation intra-trachéale non chirurgicale. L'infection résulte est cohérente, reproductible et stable pendant au moins 48 heures et jusqu'à 96 heures pour la plupart des isolats. Des études avec des antibactériens commercialisés ont démontré une bonne corrélation entre l' efficacité in vivo et in vitro de la sensibilité, et la concordance entre pharmacocinétiques / pharmacodynamiques cibles déterminéesdans ce modèle et les cibles cliniquement acceptées a été observée. Bien qu'il y ait un investissement initial de temps lors de l'apprentissage de la technique, elle peut être effectuée rapidement et efficacement une fois la compétence est atteint. Les avantages du modèle comprennent l'élimination de l'exigence neutropénique, une robustesse accrue et la reproductibilité, la capacité à étudier plusieurs agents pathogènes et isole, une meilleure flexibilité dans la conception de l'étude et de l'établissement d'une infection difficile dans un hôte immunocompétent.

Introduction

L'évaluation de l'efficacité des médicaments candidats potentiels dans les modèles animaux d'infection est une composante essentielle du processus de découverte de médicaments antibactériens. Les études in vivo d'efficacité fournissent des données importantes pour toute la durée des efforts de découverte, de élucidant les relations structure-activité (SAR) et l' optimisation de série chimique de plomb à travers la détermination de pharmacocinétique-pharmacodynamique (PK / PD) caractéristiques des composés et de soutenir la sélection de dose pour la prise de décision développement clinique et l'approbation réglementaire. De nombreux modèles d'infection d'animaux sont décrites dans la littérature pour ces fins. L' un des modèles les plus courants et les plus utilisées est l'infection de la cuisse de la souris neutropénique, qui a été lancée par Aigle 1, 2 et plus tard étendu par Vogelman et Craig 3, 4. Ce modèle a été inestimable pour soutenir la détermination des seuils de sensibilité bactérienne et pour fournir des cibles PK / PD pour guider le dosage humain. Il y a beaucoup examenples où la capacité prédictive de ce modèle a été prouvé 7/4. Cependant, l'un des inconvénients du modèle d'infection de la cuisse est le manque de pertinence directe pour les infections pulmonaires. Il y a maintenant une plus grande importance sur l'adéquation entre le site de l'infection dans des modèles animaux sur le site de l'infection chez l'homme; et, par conséquent, pour étudier des composés pour le traitement de la pneumonie, il est idéal d'utiliser un modèle d'infection pulmonaire chez l'animal.

Plusieurs méthodes pour induire des infections pulmonaires chez les animaux de laboratoire ont été décrits et utilisés pour des études d'efficacité anti - bactériens , y compris par voie intranasale par inhalation, par la voie d' aspiration de l' oropharynx, l' exposition à l' aérosol et l' inoculation intra - trachéale chirurgicale 8. Dans de nombreux cas, les animaux (en particulier les souris) doivent d'abord être rendues neutropéniques afin de parvenir à une infection pulmonaire robuste. Malgré cet état sévèrement immunodéprimé, le nombre d'agents pathogènes et de souches bactériennes qui produisent des infections viables chez les rongeurs estlimité. Par exemple, il peut être difficile d'établir avec succès Haemophilus influenzae ou Acinetobacter baumannii dans les modèles de pneumonie 9, 10 et même plus virulent des agents pathogènes tels que Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae, peut poser des problèmes 11-13.

En 1991, Smith a décrit un modèle d'infection pulmonaire chez les rats sevrés immunocompétents où l' infection a été créée en instillant des bactéries directement dans les poumons par une méthode intratrachéale nonsurgical simple intubation 14. Berry et al. plus tard modifié la méthode pour infecter des souris 15. En utilisant un inoculum à base de gélose, cette technique d'inoculation provoque des infections pulmonaires solides chez les rats et les souris immunocompétentes avec S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa et Acinetobacter baumannii. Il se prête à un large éventail d'isolats, y compris ceux abritant diverses résistles déterminants de la ance et ceux qui ne produisent pas une infection viable par l'intermédiaire d'autres voies d'inoculation. Il permet également l'efficacité à déterminer chez les animaux immunocompétents, une condition qui est plus pertinent que le modèle de la souris neutropénique traditionnelle pour les populations de patients qui ne sont pas sévèrement immunodéprimés. La cohérence et la fiabilité de ce modèle à travers de multiples agents pathogènes et les isolats rend bien adapté pour les études d'efficacité antibactérienne.

Protocol

S. pneumoniae

Toutes les procédures sont conformes aux protocoles approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité GSK institutionnel (IACUC), et respectent ou dépassent les normes de l'Association américaine pour l'accréditation des laboratoires de protection des animaux (AAALAC), le ministère de la Santé et humain États-Unis services et toutes les lois de protection des animaux locaux et fédéraux.

NOTE: Sauf indication contraire, toutes les procédures doivent être effectuées en utilisant une technique aseptique.

1. Culture bactérienne isolements

  1. Préparer 3 à 6 boîtes de gélose avec S. pneumoniae ou Haemophilus influenzae, comme un bouillon de culture ne fournit généralement pas assez de matière pour l' inoculation.
    1. Retirer un stock culture congelée de stockage à -80 ° C, dégeler complètement, et strie jusqu'à 100 pi par plaque sur gélose trypticase soja additionné de sang de mouton (S. pneumoniae) ou sur gélose chocolat (H. influenzae) en utilisant des techniques microbiologiques classiques. Incuber une nuit à 37 ° C , avec ou sans 5% de CO 2.
  2. Préparer des cultures en bouillon avec K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii.
    1. Retirer un stock culture congelée de stockage à -80 ° C, dégeler complètement, et aliquote de 100 ul du stock en ml infusion 50 cerveau-coeur (BHI). Incuber une nuit à 37 ° C avec agitation douce (environ 120 rpm).
    2. [Facultatif] Si une culture en phase logarithmique est souhaitée, aliquote de 1 ml de la culture de la nuit résultant en ml de bouillon 50 BHI frais. Incuber pendant 3 heures à 37 ° C avec agitation douce (environ 120 rpm).

2. Préparer Saline bactériennes Suspensions

  1. Pour toutes les étapes de préparation de la suspension (2.1 à 2.3), utiliser une solution saline stérile à une température entre l'air ambiant et 37 ° C. Récolte de croissance durant la nuit de S. pneumoniae ou H. influenzae à partir des plaques d' agar par des colonies de raclageà partir de la surface à l'aide d'une boucle stérile. Transférer le matériel récolté dans 5 ml de solution saline stérile jusqu'à une suspension trouble, opaque est obtenu et doucement vortex jusqu'à homogénéité.
  2. Centrifugeuse 50 ml de K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii cultures de bouillon finale destinés à l' inoculation (par exemple la nuit ou log cultures de phase) pendant 5 min à 4500 x g. Retirer le surnageant avec une pipette et défausse. Remettre en suspension le culot dans au moins 5 ml de solution saline stérile et vortexer doucement pour obtenir une suspension homogène.
  3. Si nécessaire, diluer la suspension outre l' utilisation d'une solution saline stérile pour obtenir une masse volumique comprise dans l'intervalle de 8 à 9 log 10 unités formant des colonies (UFC) / ml. Retirer une aliquote pour la détermination de CFU / mL. En série diluer et plaque l'aliquote comme décrit dans les sections 7.5 et 7.6.

3. Préparation de l'inoculum à base d'agar

  1. Préparer une petite bouteille (environ 50 ml) de gélose nutritive according aux instructions du fabricant, ou faire fondre une bouteille de gélose nutritive solide qui a été préalablement préparée et stockée. Laisser refroidir à environ 50 ° C.
  2. Transporter l'agar liquide et tous les outils et équipements nécessaires pour le processus d'infection à la zone de procédure où les animaux seront infectés. Maintenir un petit bain d'eau réglé à 42 ° C dans la région.
  3. Laisser l'agar pour atteindre une température d'environ 50 ° C, puis aliquote 9 ml dans un tube stérile de taille appropriée pour entrer dans le bain d'eau. Laissez ce tube dans le bain d'eau jusqu'à ce que l'agar équilibrant à environ 42 ° C. Assurez-vous que l'eau est à une profondeur qui couvrira la surface de la gélose dans son conteneur, mais pas toucher le bouchon ou le couvercle.
  4. Ajouter 1 ml de la suspension bactérienne une solution saline provenant de l'étape 2.3 dans le tube contenant 9 ml de gélose dans le bain d'eau. Scellez le tube, inverser plusieurs fois pour mélanger, et le retourner à l'eau du bain.

4.nesthetize, intuber et ensemencer Animaux

NOTE: agent pathogène spécifique de rats (SPF) immunocompétents mâles Sprague-Dawley pesant 100 - 120 g ou mâles CD-1 souris pesant 20 à 25 g sont recommandés. Fournir tous les animaux avec de la nourriture et de l' eau ad libitum et les loger socialement sur des copeaux de bois ou d' autres litière absorbante avec des cycles standards de lumière-obscurité de 12 h.

  1. Avant de procéder à des expériences, d'obtenir et de stériliser un tube de la taille appropriée canule métallique et de polyéthylène pour les espèces animales. Obtenir stériles 1 ml seringues jetables et jetables aiguilles de calibre 25 stériles.
    Attention: Toujours disposer de ces seringues et aiguilles dans un récipient pour objets tranchants.
    1. Pour les rats, l'achat ou la fabrication d'une canule métallique qui est d'environ 12 cm de longueur, a une ID de 0,9 à 1,0 mm et de diamètre extérieur de 1,0 - 1,2 mm, et est plié à un angle de 45 ° environ à une extrémité. Couper une longueur de 11 à 12 pouces de tuyaux en polyéthylène avec un ID de 0,4 mm et 0,8 mm OD. (Faire référence à
    2. Pour les souris, acheter un tube # 20 l'alimentation des animaux. Retirer le ballon de l'extrémité du tube en le saisissant avec des pinces et en tirant fortement, puis pliez doucement l'extrémité à un angle de 45 ° environ. Couper une longueur de 11 à 12 pouces de tuyaux en polyéthylène avec un ID de 0,28 mm et 0,61 mm OD. Également acheter et stériliser un verre 100 pi seringue micro-injection et une aiguille micro-injection de métal de calibre 30. (Reportez - vous à la figure 1B).
    3. Placer la canule en métal dans un verre, d'un tube à bouchon à vis et l'autoclave par des procédés standards pour stériliser. Faire tremper et stocker coupé longueurs du tube en polyéthylène dans un bécher contenant de l'alcool couvert.
  2. Préparer la surface de travail et le dispositif d'intubation.
    1. Placez un tapis jetable propre sur la surface de travail, à proximité du bain d'eau. Transférer la canule métallique, dans son tube de stockage de verre à cette surface. Retirez le bouchon du tube de stockage et faites glisser la "poignée" fin de la Cannula à l'extrémité ouverte du tube.
    2. En utilisant des pinces stériles, retirer une longueur de tube en polyéthylène du bêcher et insérez-le à travers l'intérieur de la canule métallique stérile, en vous assurant qu'il se déplace librement. Ajuster une aiguille stérile à usage unique de calibre 25 (pour les rats) ou de l'aiguille métallique de calibre 30 stérilisation d'une seringue en verre de micro-injection (pour les souris) sur l'extrémité libre du tube de polyéthylène en faisant glisser les aiguilles de plusieurs mm à l'intérieur du tube. (Reportez - vous à la figure 1A pour le rat et la figure 1B pour les souris).
    3. Marks Place de guidage à la fois sur la canule métallique et d'un tube de polyethylene pour indiquer la profondeur d'insertion dans l'animal en suivant la procédure décrite ci-dessous d'intubation sur un seul animal euthanasié. Ouvrez la cavité thoracique pour l'observation, puis placez la canule métallique correctement et de faire avancer le tube de polyéthylène de manière appropriée (comme décrit dans la section 4.7). L'utilisation d'un marqueur indélébile, la marque canule métallique où elle rencontre la bouche de l'animal et le polyun tube d'éthylène où elle rejoint la partie supérieure de la canule métallique pour faciliter la mise en place correcte chez les animaux restants.
  3. À l'intérieur d'une hotte (ou à l'aide d'un système de balayage approprié) anesthésier jusqu'à 6 animaux à la fois dans une enceinte fermée alimentée en ≤5% d'isoflurane dans 1,5 L / min d'oxygène jusqu'à ce que le réflexe nauséeux est inhibée (environ 1 min).
    NOTE: Avant de procéder à des expériences, établir le temps de la dose et de l' exposition sans danger pour l' isoflurane dans les conditions spécifiques utilisées (par exemple la taille / type de chambre et la taille / espèce / souche animale) pour prévenir l' exposition létale par inadvertance.
  4. Remplir une seringue de 1 ml jetable stérile (pour les rats) avec une solution saline stérile en plaçant la pointe stérile dans la solution saline et en tirant sur le piston. Remplir la seringue en verre micro-injection stérile (pour les souris) comme décrit ci-dessous. Fixer la seringue à l'aiguille emmanchée sur le tube de polyéthylène, et rincer la totalité du volume de solution saline à travers le tube jusqu'à ce que la seringuee est vidé.
    1. Pour remplir la seringue micro-injection (pour les souris), enlever complètement le piston de métal et de l'aiguille (monté sur le tube de polyéthylène) de la seringue et régler à la fois de côté.
    2. Remplir un jetable 1 ml seringue stérile avec une solution saline stérile (comme décrit ci-dessus) et fixer une aiguille 25 gauge jetable stérile. Insérer l'aiguille dans la partie supérieure de la seringue, la micro-injection (où le plongeur métallique est inséré) et appuyer sur le piston de la seringue jetable jusqu'à ce qu'il remplisse la seringue micro-injection avec du sérum physiologique.
    3. Jeter la seringue et une aiguille jetables qui ont été utilisées pour remplir la seringue micro-injection dans un récipient pour objets tranchants. Ré-attacher l'aiguille de micro-injection de métal (monté sur le tube de polyéthylène) à la pointe de la seringue de micro-injection et réinsérer le piston en métal, une pression jusqu'à ce que la totalité du volume de solution saline a été rincé à travers la seringue et le tube.
  5. Remplir la seringue avec l'inoculum à base d'agar-vientm le récipient dans le bain d'eau, et l' agar de rinçage à travers le tube jusqu'à ce que le tube est amorcé (par exemple , complètement remplis de l'agar - agar).
    1. Pour les rats, retirer l'aiguille de calibre 25 (monté sur le tube de polyéthylène) de la seringue jetable. Jeter la seringue utilisée dans un récipient pour objets tranchants. Remplissez un nouveau, jetable 1 ml seringue stérile avec l'inoculum agar-base du récipient dans le bain d'eau en plaçant la pointe stérile dans l'inoculum et en tirant sur le piston. Ré-attacher l'aiguille (emmanché sur le tube de polyéthylène) et d'agar de rinçage à travers le tube en appuyant sur le poussoir jusqu'à ce que le tube est complètement remplie avec de l'agar.
    2. Pour les souris, retirer l'aiguille métallique micro-injection (monté sur le tube en polyéthylène) et le piston de métal à partir de la seringue micro-injection et mettre de côté. En utilisant une seringue de 1 ml à usage unique stérile et une aiguille de calibre 25 jetables stériles, remplir la seringue de micro-injection avec l'inoculum à base de gélose à partir du récipient dans labain d'eau en utilisant la procédure de remplissage décrite dans la section 4.4. Re-fixer l'aiguille micro-injection de métal (monté sur le tube de polyéthylène), insérez le piston métallique, et l'agar affleurant à travers le tube jusqu'à ce que le tube est complètement rempli avec de l'agar.
  6. Retirer un animal de la chambre d'anesthésie. Placer l'animal dans une position couchée sur le tapis jetable avec la tête vers la droite et de la queue vers la gauche comme représenté sur la figure 1C.
  7. En utilisant le dispositif d'intubation (ie la canule métallique muni d' un tube de polyéthylène), intuber l'animal et insérer la canule dans le grand lobe du poumon gauche (voir la figure 1D).
    1. Insérer l'extrémité libre de la canule métallique dans la bouche de l'animal. Tourner la canule, de sorte que l'extrémité libre est inclinée vers le haut et avancer doucement dans la trachée, en contournant soigneusement les structures laryngées avec un léger mouvement de torsion. Confirmer l'introduction dans la trachée, par opposition à laœsophage en faisant glisser doucement la canule légèrement vers l' avant et à l' arrière à plusieurs reprises tout en palpant les anneaux trachéaux avec l'index gauche , comme le montre la figure 1C.
    2. Lorsque la canule atteint la bifurcation où la trachée se divise en bronches gauche et à droite, faire un léger mouvement de torsion vers le côté gauche de l'animal pour assurer que la canule est insérée dans la bronche gauche. Avancez la canule métallique jusqu'à la fin est à mi-chemin des trois quarts vers le bas le poumon gauche, en utilisant le repère précédemment placé pour confirmer que la profondeur appropriée a été atteinte.
    3. Avec la canule métallique en place, faire avancer le polyéthylène tube plusieurs mm. Utilisez le repère précédemment mis sur le tube pour assurer qu'elle est suffisamment avancé que loin pour sortir de l'extrémité de la canule métallique et pas perforer le poumon.
  8. Avec les deux canules en place, utiliser la seringue attachée à instiller 100 pi (pour les rats) ou 20 pi (pour les souris) du Suspe agarnsion profondément dans le grand lobe du poumon gauche (voir la figure 1D). Retirez plusieurs mm du tube en polyéthylène, puis retirez délicatement le dispositif d'intubation intact. Réglez-le dans le tube de stockage de verre, et de déplacer l'animal dans une nouvelle cage pour récupérer.
  9. Continuer anesthésier, intubation et inoculer les animaux restants.
    1. Entre lots d'animaux anesthésiés, retirer l'aiguille (monté sur le tube) de la seringue. Pour les rats, jeter la seringue jetable utilisée dans un récipient pour objets tranchants et remplir une nouvelle seringue jetable, stérile de l'inoculum dans le bain d'eau. Pour les souris, remplir à nouveau la même seringue en verre de micro-injection de l'inoculum dans le bain d'eau en utilisant la technique de remplissage décrite dans la section 4.4.
    2. Si l'agar commence à épaissir dans le dispositif d'intubation, rincer tout agar restant dans le tube. Retirez l'aiguille de la seringue (en laissant l'aiguille monté sur le tube de polyéthylène). Suivez les procédures décritesdans la section 4.4 pour rincer au chaud, une solution saline stérile à travers le dispositif d'intubation, répétant que nécessaire pour complètement clair tout blocage. Videz tous saline de la seringue et de préparer à nouveau l'inoculum agar comme décrit à la section 4.5.
    3. Calculer l'inoculum bactérien final par animal , selon la CFU déterminée à partir de la suspension saline (voir section 2.3), le facteur de dilution finale de la suspension saline dans la gélose (par exemple dix fois), et le volume instillé dans les animaux (par exemple 100 pi pour rats ou 20 ul pour les souris).

5. Évaluer les animaux pour Mis-inoculation potentiel ou autres événements indésirables

  1. Observer attentivement tous les animaux pendant l'intubation, l'instillation de l'agar-agar et la récupération de l'anesthésie pour évaluer le potentiel d'une mauvaise inoculation. euthanasier Immédiatement (selon les directives du IACUC locales) tout animal qui saigne, présente une respiration anormale (comme la respiration laborieuse ou haletant), ne bouge pasnormalement au sujet de la cage, ou ne semble pas aux yeux brillants et en bonne santé lors de la récupération de l'anesthésie.
  2. Si la cessation spontanée de la respiration se produit (généralement lorsque l'inoculum est pas placé assez profond et bloque les voies respiratoires), confirmer la mort par l'observation et effectuer une méthode secondaire de l'euthanasie (telle que la dislocation cervicale ou thoracotomie).
  3. Réduire la longueur des animaux de temps sont exposés à l'isoflurane, l'anesthésie est seulement nécessaire pendant plusieurs minutes pour effectuer la procédure. Si anesthésiques injectables sont utilisés, assurer que les animaux sont sous observation jusqu'à pleinement éveillé. Placez les animaux, en particulier des souris, dans un environnement réchauffé pour la récupération lors de l'utilisation des anesthésiques injectables.
  4. Observez les animaux au moins deux fois par jour pendant la période d'étude pour les signes de maladie respiratoire suivants: respiration prononcée, horripilation, une activité réduite et la température corporelle réduite. euthanasier Immédiatement (selon les directives du IACUC locales) tout animal qui est moribond, experiences respiration laborieuse ou de détresse respiratoire, a une température corporelle sensiblement réduite lors de la manipulation, est incapable ou refuse de se déplacer, ou ne peut pas atteindre la nourriture et de l'eau.

6. Traitements Administrer test

  1. Préparer et administrer des traitements d'essai selon la conception de l'étude prévue. Commencez l'administration de traitements à 1 ou 2 h infection post (ou retarder le traitement plus si une charge bactérienne initiale plus élevée est souhaitée). Des détails spécifiques pour la préparation et l'administration des traitements d'essai ne peut être donné qu'elle dépend de l'objectif de l'étude ainsi que les propriétés de chaque traitement individuel. (Reportez - vous à la figure 3 , par exemple.)
  2. Mettez de côté un groupe de infectées, les animaux non traités servent de témoins de référence. Énumérer la charge bactérienne dans les poumons de ces animaux au moment où le traitement est initié pour les autres groupes, suivant les procédures décrites dans la section 7.
  3. Pour les analyses PK / PD, évaluerle profil pharmacocinétique du traitement (s) est administré dans le sang et / ou les tissus des animaux infectés. Des procédures spécifiques pour les études pharmacocinétiques sont en dehors du champ d'application de cet article.

7. Énumérer les bactéries viables des Poumons

  1. Euthanasier un groupe d'animaux non traités au moment du traitement est initié pour les autres groupes (de base) et tous les animaux restants à la fin de la période d'étude (généralement 24, 48 ou 96 h après l'infection) par l'exposition par inhalation à l'augmentation progressive des niveaux de carbone dioxyde dans une chambre fermée ou une autre méthode recommandée par les directives IACUC locales. Vérifier la mort par l'observation, et d'effectuer une méthode secondaire de l'euthanasie (telle que la dislocation cervicale ou thoracotomie).
  2. Placez les animaux dans une position couchée sur une natte jetable propre, et bien mouiller la fourrure sur la poitrine avec de l'alcool.
  3. Avec des ciseaux stériles, couper à travers la peau, sous-jacente couche musculaire et ribcageparallèlement au sternum pour ouvrir la cavité thoracique. Saisir doucement les poumons avec des pinces stériles et tirez pour enlever, à l'aide des ciseaux pour les séparer de la trachée, si nécessaire. Placez les poumons sur une gaze stérile pour absorber l'excès de sang. Si le cœur a également été supprimée, disséquer loin et jeter.
  4. Faire de petites cisailles dans les poumons avec des ciseaux stériles pour exposer les sections intérieures et utiliser des pinces stériles pour placer les poumons (plus toutes les pièces qui ont été par inadvertance Snipped off) dans le fond d'un sac laboratoire de mélangeur. Brièvement rouler un objet rond épais (comme un stylo ou un marqueur) sur l'extérieur du sac pour écraser le tissu. Pipette 1 ml de solution saline stérile dans le sac, placer le sac dans un mélangeur de laboratoire, et exécuter le mélangeur de laboratoire à grande vitesse pendant 2 min.
  5. Transférer les échantillons homogénéisé des sacs mélangés dans des tubes ou des plaques à l'aide d'une pipette. Diluer le broyat dix fois par aliquotage 1 partie homogénat en 9-pièces saline (comme 100 ul homogénat dans 900 ul saline). Diluer la suspension résultante par dix fois de nouveau d'une manière similaire. Continuer diluer chaque nouvelle suspension obtenue par un autre facteur de dix fois au moins jusqu'à 6 dilutions en série ont été préparés à partir de l'homogénat d'origine.
  6. Aliquotes Pipette triples de 20 ul chacune de toutes les dilutions sur des plaques de gélose de soja trypticase additionné de sang de mouton (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii) ou sur des plaques de gélose chocolat (H. influenzae). Incuber une nuit à 37 ° C avec ou sans CO 2. (Voir la figure 1E pour un exemple d'une plaque résultante).
  7. Compter les colonies dans chacune des trois répétitions lors de la première dilution qui contient un certain nombre "dénombrable" (c. -à- pas trop de colonies à compter raisonnablement). Calculer la valeur moyenne des trois répétitions. Déterminer l'UFC par les poumons en multipliant la valeur moyenne de 50 (pour tenir compte de placage 20 pl du total 1 mlhomogénat) et la prise en facteur de dilution finale de l'homogénat initial auquel les colonies ont été comptées.

Representative Results

Les outils requis, l' orientation de l'animal, et la profondeur de l' intubation sont représentés sur la figure 1. Est également représenté un exemple représentatif des colonies se développant sur une plaque de gélose après dilution en série et trois boîtes de Petri d'un échantillon d'homogénat pulmonaire. Une augmentation de la charge bactérienne de plusieurs log 10 UFC au- dessus des contrôles de base est généralement observée dans les poumons infectés pour la plupart des isolats bactériens, même après l'infection de 96 h, et la variabilité entre les animaux est faible (Figure 2). Pour certains H. influenzae, il peut y avoir peu de croissance; Toutefois, l'infection ne doit pas commencer à auto-détermination dans un laps de temps de 48 ou de 96 h (figure 2B). Ce modèle d'infection pulmonaire peut être utilisé lors de l' optimisation des séries chimiques conduisent à soutenir RS, comme représenté sur la figure 3 pour des composés représentatifs de deux séries différentes 16, 17. Il fournit un uniforme, reproductible rencontréhod pour évaluer PK / PD chez les animaux immunocompétents et a été utilisé pour déterminer que la zone de médicament libre sous la courbe concentration-temps sur la concentration minimale inhibitrice (Fauc / MIC) en corrélation avec l' efficacité d'un nouveau déformylase polypeptide (PDF) inhibiteur contre S. pneumoniae et H. influenzae (figure 4). En outre, les Fauc / cibles MIC pour la stase et un 1-log 10 UFC réduction des contrôles de base ont été déterminés dans 11 S. pneumoniae et 5 isolats de H. influenzae (tableau 1) 18. Coupler ce modèle d'infection par un système de délivrance de médicament pour recréer les profils pharmacocinétiques chez des rats humains crée un outil puissant pour évaluer les schémas posologiques humains avant les études cliniques. Un exemple de ceci est résumé dans le tableau 2, qui montre qu'une formulation à libération prolongée de l' amoxicilline-clavulanate était plus efficace que les régimes de dose existants pour les organismes avec elevavaleurs ted MIC 19.

Figure 1
Figure 1: Nonsurgical Intratrachéal intubation. Les outils sont présentés pour intuber le rat (A) et la souris (B). Une fois anesthésié, l'animal doit être positionné comme indiqué dans C, avec la tête vers la droite et la queue vers la gauche si la personne effectuant la technique est droitier. Placez l'index gauche doucement sur la gorge pour aider à palper les anneaux trachéaux pour la confirmation du placement de canule correcte. L'inoculum doit être placé profondément dans le poumon gauche, comme le montre la vue ventrale d'un poumon de rat (D). Les colonies en croissance sur gélose après dilution en série et le placage d'un échantillon doit ressembler à celle représentée sur E. Figure 1D, Copyright © Gill Smith [les animaux de laboratoire, Volume 25 (1991), G. Smith, Améthode non-chirurgicale simple instillation intrabronchique pour l'établissement d'infections respiratoires chez le rat, pages 46 - 49] 14. Reproduit avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Exemples représentatifs de la croissance bactérienne dans les poumons des animaux infectés. Moyenne ± écart type de données standard CFU de N = 5 animaux / groupe est représenté par différents isolats de S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) et A. baumannii (E). La première barre de chaque paire (gris clair) est le bacte de basefardeau rial après l'infection 1 ou 2 h, tandis que la deuxième barre est le contrôle de la croissance de la fin de l'étude à 48 h infection post (gris foncé) ou après l'infection 96 h (noir). Aucune méthode de censure de données ont été appliquées; Ainsi, ces résultats comprennent des données de tous les 5 animaux par groupe. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Évaluation de l'efficacité des diverses séries chimiques lors de l' optimisation de plomb. modèles d'infection pulmonaire en utilisant les techniques décrites ont été utilisées pour explorer les relations structure-activité dans le cadre du programme de type abactérienne IIA topoisomérase. Des composés prometteurs 7 et 1 ont été évalués contre quinolone-sensibles (A) 16 ou résistants aux quinolones(B) 17 isolats de S. pneumoniae, respectivement. Chaque symbole représente CFU déterminé à partir des poumons d'un rat avec des lignes représentant la moyenne du groupe et l'écart-type. Limite inférieure de quantification (LIQ) était de 1,7 log 10 UFC / poumons. Les composés ont été pesés (56 ou 112 mg de molécule mère libre pure), dissous dans 9 ml d'eau stérile, on dilue 3 ml en ml d'eau 3 (1: 1) et administré par gavage par voie orale de 1 ml / 125 g de rat, deux fois par jour ( 6 - 7 h d'intervalle) pendant 2 jours, à partir de l'infection post 1 h. témoins non traités (NTC) ont été prélevés après l'infection 1 h à la ligne de base ou traités avec du sérum physiologique et échantillonnés à la fin de l'étude (48 h) pour le contrôle de la croissance. Figure 3A réimprimé de Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, cyclohexyl-amides nouveaux comme antibactériens puissants type de ciblage bactérienne IIA topoisomérases, Pages 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, avec la permission de Elsevier.Figure 3B réimprimé de Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, tricycliques nouveaux (par exemple GSK945237) comme de puissants inhibiteurs de type bactérien IIA topoisomérases, Pages 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, avec la permission de Elsevier. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: PK / PD Caractérisation d'un inhibiteur de PDF Novel. Modèles Emax ont été créés en utilisant la dose allant des données d'efficacité chez des souris immunocompétentes infectées dans le poumon avec des isolats de S. pneumoniae (A) ou H. influenzae (B) pour déterminer les cibles / PD PK pour un nouvel inhibiteur de PDF 18. Cerclesreprésenter la charge bactérienne moyenne de 4 à 5 souris / groupe traité avec des doses variables du composé. Les analyses ont été effectuées pour établir une corrélation entre l'efficacité avec médicament libre 24 h AUC (cercles ouverts) ou AUC / MIC (cercles pleins). Reproduit avec la permission, Copyright © American Society for Microbiology, [ les agents antimicrobiens et la chimiothérapie, le volume 60, 2016, pages 180 - 189] 18. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Stase 1-log 10 de réduction
Organisme MIC
(pg / ml)
R 2 représente
ligne fi
t (%)
Fauc Fauc / MIC Fauc Fauc / MIC tuer Max
(log 10 réduction)
S. pneumoniae
10127 0,25 99,9 2.0 8.1 3.6 14.4 2.8
1316009S 0,25 96,1 6.5 26,0 15.1 60,3 1.8
ATCC10813 0,5 100 8.4 16,9 22.2 44,5 1.2
1307007S 1 95,8 16.1 16.1 20.1 20.1 2.7
ATCC6303 1 99,8 19,8 19,8 24.8 24.8 2.8
1629 2 100 15.8 7.9 21.2 10.6 2.4
298443 2 99,9 26,5 13.2 31,0 15.5 2.3
336808 2 86 8.2 4.2 19,0 9.5 2.6
338860 2 99,5 2.9 1.5 6.7 3.4 2.8
& #160; 340449 2 94,6 8.0 4.0 14.9 7.4 2.1
L11259 2 100 7.1 3.5 9.0 4.5 2.0
Moyenne ± SD SO a N / A 11,0 ± 7,5 11,0 ± 7,9 17,0 ± 8,2 19,5 ± 17,8 2,3 ± 0,5
Médian N / A N / A 8.2 8.1 19,0 14.4 2.4
H. influenzae
1998-100-126H 1 99,7 7.3 7.3 13.4 13.4 2.9
503-008H 1 99,8 7.1 7.1 13.9 13.9 2.7
08003H 2 99,9 14.5 7.2 16.7 8.3 2.7
H128 2 96,6 15.3 7.6 26,0 13,0 2.7
19001H 4 91,9 14.8 3.7 37,3 9.3 3.0
Moyenne ± SD N / A N / A 11,8 ± 4,2 6.6 ± 1.6 21,5 ± 10.2 11,6 ± 2,6 2,8 ± 0,1
Médian N / A N / A 14.5 7.2 16.7 13,0 2.7
un NA, non applicable.

Tableau 1: PK Cibles / PD pour un Inhibiteur PDF Novel contre S. pneumoniae et H. influenzae isolements. AUC libre-médicament et ASC / cibles MIC pour la stase et à 1 log 10 UFC réduction de base ont été déterminées pour 11 S. pneumoniae et H. influenzae 5 chez les souris immunocompétentes infectées dans le poumon et traités avec le composé 18. La data été utilisé pour aider les doses humaines sélectionner pour le développement clinique. Ce tableau a été adapté et réimprimé avec la permission, Copyright © American Society for Microbiology, [ les agents antimicrobiens et la chimiothérapie, le volume 60, 2016, pages 180 - 189] 18.

<td> 875/125 mg tid (rapport 7: 1)
Groupe de traitement d' un Logarithmique moyen 10 S. pneumoniae (CFU / poumon) b ± SD pour la souche (AMX / CA MIC):
05010S
(2 pg / ml)
16001S c
(4 ug / ml)
16001S
(4 ug / ml)
30005S
(4 ug / ml)
20009S
(4 ug / ml)
05003S
(8 pg / ml)
404053
(8 pg / ml)
47003S
(8 pg / ml)
Contrôle 7,3 ± 0,4 7,0 ± 0,8 5,7 ± 1,2 7,1 ± 0,7 7,1 ± 0,4 6,4 ± 0,6 6,8 ± 0,4 6,0 ± 0,3
AMX / CA
2000/125 mg bid (rapport 16: 1) ≤ 1,7 ** 2,8 ± 1,2 ** 2,2 ± 0,8 ** 2,3 ± 0,9 ** 2,5 ± 0,9 ** 2,0 ± 0,9 ** 3,8 ± 1,4 ** 1,8 ± 0,2 **
1000/125 mg tid (rapport 8: 1) NT NT 2,8 ± 0,5 ** 2,7 ± 1,3 ** 3,3 ± 0,9 ** 4,9 ± 0,5 ** 6,6 ± 1,3 4,7 ± 0,7 **
NT NT 3,0 ± 1,3 * 2,1 ± 0,7 ** 3,2 ± 0,4 ** 5,2 ± 0,9 * 6,4 ± 0,6 4,9 ± 0,4 **
875/125 mg bid (rapport 7: 1) NT NT 4,5 ± 1,2 * 5,6 ± 1,3 * 5,2 ± 0,7 ** 6,3 ± 0,7 6,4 ± 0,7 5,5 ± 0,4
500/125 mg tid (rapport 4: 1) 3,1 ± 1,3 ** 4,5 ± 0,9 ** NT NT NT NT NT NT
Azithromycine, 1000/500 mg od NT NT NT 5,8 ± 2,0 7,1 ± 0,9 3,1 ± 1,0 ** 6,6 ± 0,4 6.07; 0,6
Lévofloxacine, 500 mg od NT NT 4,2 ± 0,8 * 5,7 ± 0,8 * 4,9 ± 0,8 ** 3,0 ± 1,3 ** 3,5 ± 0,2 ** 3,9 ± 0,8 **
Groupe de traitement d Moyenne log 10 H. influenzae (CFU / poumon) ± écart - type pour la souche:
H128
(β-lactamase positive)
Chesterfield
(β-lactamase négatif, résistant
à l' ampicilline)
Contrôle 6,4 ± 0,6 6,7 ± 0,6
AMX / CA
2000/125 mg bid (rapport 16: 1) 2,0 ± 0,7 ** 3,1 ± 0,9 **
1000/125 mg tid (rapport 8: 1) 2,1 ± 1,0 ** 3,6 ± 1,1 **
875/125 mg tid (rapport 7: 1) 2,8 ± 1,3 ** 3,8 ± 1,3 **
875/125 mg bid (rapport 7: 1) 2,0 ± 0,8 ** 5,1 ± 1,1 **
Azithromycine, 1000/500 mg od 3,2 ± 1,7 * 5,8 ± 1,1
Lévofloxacine, 500 mg od ≤ 1,7 ** ≤ 1,7 **
un AMX / CA, amoxicilline-acide clavulanique; offre, deux fois par jour; tid., trois fois par jour; od, une fois par jour.
b La limite de détection était <1,7; * Significativement différent du témoin (P ≤ 0,05); ** Significativement différent du témoin (P ≤ 0,01); NT, non testé.
La souche c 16001S a été testée dans deux expériences distinctes.
d amoxicilline-clavulanate 500/125 mg (4: 1) trois fois par jour n'a pas été testé contre les souches de H. influenzae.

Tableau 2: Efficacité des profils d'exposition Recreated plasma humain pour différents Amoxicilline / Clavulanate schémas posologiques. Les données générées chez les rats immunocompétents infectés dans le poumon avec des isolats de S. pneumoniae ou H. influenzae en utilisant ce modèle ont démontré qu'une formulation améliorée de l' amoxicilline-acide clavulanique (2000/125 mg deux fois par jour) était plus efficace que les schémas posologiques standards contre les isolats avec élévation de la sensibilité in vitro 19. Ce tableau a été adapté et réimprimé avec la permission, Copyright © American Society for Microbiology, [ les agents antimicrobiens et la chimiothérapie, le volume 49, 2005, pages 908 - 915] 19.

Discussion

Pour une réussite optimale dans la reproduction de ce modèle d'infection, les suggestions suivantes devraient être envisagées. Virulence des nouveaux isolats peut être améliorée par passage 2 - 3 fois in vivo avant l'utilisation dans une étude. Souches bactériennes congelées doivent toujours être préparés à partir d' une source primaire -derived in vivo avec le moins de passages que possible de l'original, et regel ou réutilisation de stock décongelé est découragé. En utilisant des isolats cliniques récents récupéré des patients atteints de pneumonie, et / ou la préparation des cultures en phase de croissance log peut également aider à améliorer la mise en place de l'infection. Une dilution de cinq fois dans la gélose (par exemple 2 ml de solution saline suspension ajoutée à 8 ml de gélose) peut être utilisé au lieu de dix fois pour augmenter l'inoculum bactérien, et le volume de l' inoculum peut être ajustée en fonction de la taille de l'animal (par exemple 200 pi / animal est habituellement inoculés dans 250 g de rats). Avant l'addition de la suspension bactérienne dans la solution saléeagar - agar ( par exemple à l' étape 2.3), la densité bactérienne peut être prévue ou estimée par une inspection visuelle, des normes MacFarland ou des mesures de densité optique. Il est utile de se familiariser avec les caractéristiques in vitro de croissance pour chaque isolat avant de procéder à des expériences in vivo. La cohérence de la croissance et de la manipulation permet l'estimation la plus précise de la densité bactérienne pour tout isolat donné. des procédés microbiologiques classiques qui diffèrent de ceux décrits, tels que les médias et les homogénéisateurs de tissus de remplacement, peuvent être utilisés le cas échéant pour la préparation des inoculums et la numération des bactéries dans les tissus infectés.

Il est fortement recommandé de préparer ou de faire fondre la gélose le jour avant l'expérience et le stocker pendant une nuit dans un bain d'eau séparé réglé à 50 ° C. Cela simplifiera le processus et aider à se prémunir contre l'agar étant trop chaud au moment de l'infection. Une température de 41 - 42 ° C permet d'obtenir un bon équilibre entre entretenir cetning la gélose à l'état liquide sans être trop chaud pour la survie des bactéries à court terme. Comme une alternative possible à la gélose nutritive, la gélose noble a été utilisé avec succès dans certaines expériences. Un tube d'agar inoculum est généralement suffisant pour une expérience entière (et recommandé), mais plusieurs tubes peut être préparé pour infecter un grand nombre d'animaux (par exemple , plus de 60) ou lorsque le processus infectant prend plus de 30 - 45 min Si tubes d'inoculum multiples sont nécessaires, ajouter la suspension bactérienne saline à chaque tube d'agar comme il est nécessaire. Cela réduit le risque que la survie des bactéries et / ou remise en forme seront affectés par une exposition prolongée à une température élevée avant l'inoculation. Il convient de noter que l'utilisation de plusieurs tubes d'inoculum peuvent également nécessiter des procédures de randomisation des animaux supplémentaires. Chaque fois que possible, d'infecter tous les animaux de la même préparation de l'inoculum. Il est recommandé d'adapter la taille des expériences au niveau actuel de compétence avec le technique.

Un scientifique qualifié peut intuber et inoculer un animal en moins de 30 s et ensemencer jusqu'à 5 - 6 animaux par lot (ie avec une seringue pleine d'inoculum agar). Pour ceux apprentissage de la technique, la vitesse est importante que la gélose commencera à se solidifier; cependant, un positionnement précis de l'inoculum est plus important. Commencez avec 1 ou 2 animaux par lot, et augmentera à mesure que la technique devient plus familier. Les animaux continuent à respirer pendant l'intubation; Ainsi, la fenêtre de temps pour l'inoculation dépend de la rapidité avec laquelle l'animal récupère de l'isoflurane, qui doit être d'environ 2-3 min. Les animaux qui se réveillent au cours du processus peuvent être ré-anesthésiés et ont tenté une deuxième fois, mais il est déconseillé de le faire à plusieurs reprises. inoculation réussie au premier essai est prévu dans presque 100% des animaux une fois la compétence est atteint. A noter qu'il est plus facile d'apprendre la technique en utilisant des rats en premier lieu; les souris sont plus délicates et les plus petits aussils sont plus sujettes à un blocage avec de l'agar solidifié sinon manipulé rapidement. seringues pré-réchauffement, tubes et salins ainsi que du maintien du dispositif d'intubation sur une surface tiède (pas chaude), comme un coussin chauffant à basse température, peuvent aider à prévenir la solidification de l'agar-agar. Lors de l'apprentissage de la technique, il est également utile de mettre en pratique le positionnement correct de l'inoculum à l'aide d'un colorant de couleur foncée (par exemple, on concentre le bleu de méthylène), au lieu de la suspension bactérienne dans la gélose. Effectuer la procédure comme décrit, mais euthanasier l'animal immédiatement après l'inoculation du colorant (ne permettant pas l'animal de récupérer entre l'anesthésie et l'euthanasie). Disséquer pour déterminer où le colorant a été placé, et ajuster la technique en conséquence.

Le critère principal de ce modèle est CFU des poumons infectés. La survie est pas un bon indicateur de la charge bactérienne et ne constitue pas un critère recommandé. Pour les études d'efficacité, a suggéré le N est 5 - 6 animaux par groupe comme cela est predicted ≥1 pour détecter les différences de log 10 UFC entre les groupes d'au moins 90% de la puissance. Les animaux peuvent être infectés dans des groupes tels que les compagnons de cage restent ensemble, ou un véritable processus de randomisation peuvent être suivies. Notez que si les groupes sont affectés par cage, les groupes devraient être infectés dans un ordre aléatoire avec des contrôles de croissance de fin d'étude infectées dernière (pour confirmer que la survie bactérienne / remise en forme n'a pas été affectée par la durée de l'exposition à une température élevée dans le bain d'eau). Aucune méthode de censure de données devrait être nécessaire, et aucun sont recommandés à l'exception de la suppression immédiate de tout animal qui a été évidemment mis-inoculés au début de l'étude (avant le début de tout traitement). Les animaux qui sont euthanasiés avant la fin de l'étude devraient être échantillonnés et les résultats inclus dans l'ensemble , sauf si une raison valable d'exclusion a été identifiée de façon prospective les données (ie un événement sans rapport avec l'infection ou le traitement). report de la drogue peut affect quelques échantillons et est une considération importante pour tous les modèles in vivo d'infection. Si un composé est donnée fréquemment, à proximité du moment de l' euthanasie ou a une longue demi-vie, il peut être présent dans l'homogénat de tissu à une concentration suffisamment élevée pour continuer de tuer les bactéries ex vivo au cours du processus de dénombrement des bactéries (dilution et plaquage les échantillons ou sur les plaques d'agar pendant une nuit d'incubation). Pour éviter cela, le charbon actif et / ou un additif qui dégrade la molécule active sans léser les cellules bactériennes peuvent être ajoutés à l'échantillon avant l'homogénéisation. D'autres procédés comprennent la centrifugation des échantillons pour éliminer la majorité du composé actif (qui doit rester dans le surnageant) et en utilisant une dilution différente et le placage des systèmes pour diluer suffisamment du composé actif à une concentration non inhibitrice.

Comme en témoignent les exemples de la figure 2, ce modèle avec succès induces infections pulmonaires chez les rongeurs avec un large éventail d'organismes , y compris ceux qui ne poussent pas bien dans d' autres modèles (par exemple H. influenzae). Ces infections sont cohérentes et reproductibles, ce qui réduit la probabilité que les expériences devront être répétées en raison de l'échec du modèle et / ou de mauvaises performances avec un isolat donné. Bien que les animaux sont immunocompétent, ils sont incapables de résoudre rapidement l'infection, le cas échéant. Cela permet une plus grande souplesse dans la durée de l'étude, car de nombreux isolats de maintenir une infection par viable au moins 96 heures sans la nécessité d'injections répétées pour maintenir une neutropénie. L'avantage potentiel d'étudier l' efficacité antibactérienne chez les animaux immunocompétents a été noté précédemment 20, 21, et il est évident que, pour certains composés (par exemple oxazolidinones), les données de rongeurs non neutropéniques peuvent prédire plus précisément les objectifs de l' exposition humaine par rapport à ceux neutropénique rendu 5. L'utilitaire polyvalent de til modèle est démontré dans les figures 3 et 4 et les tableaux 1 et 2. Ces études font partie d'une grande collection de données publiées et non publiées qui a été généré avec ce modèle pour soutenir les efforts d'optimisation de plomb 16, 17, 22-24, à titre de comparaison et la confirmation de la proposition de dosage humain schémas 19, 25-29 et PK / PD caractérisation 18, 30-32 .While ce modèle est d' abord plus complexe à réaliser par rapport à la méthode intranasale par inhalation, il existe de nombreux avantages tels que décrits ci - dessus. Avec la pratique et l'utilisation de routine, les techniques devraient être simples à effectuer.

On peut noter dans certaines études que la charge bactérienne à l'inclusion était inférieure à celle généralement ciblée dans d'autres modèles d'infection pulmonaire. Cela est dû en grande partie à la dilution requise dans de la gélose et le petit volume de défi, en particulier chez la souris. Toutefois, il convient également de noterque la croissance bactérienne a été observée dans tous les cas, même lorsque la charge initiale était relativement faible. La charge bactérienne initiale de la cible est de 6 à 6,5 log 10 UFC / poumons (6,8 à 7,3 log 10 UFC / g de tissu chez des souris sur la base du poids des poumons en moyenne) ce qui correspond à des densités estimées chez les patients humains atteints de pneumonie sévère 33. Une charge initiale plus élevée peut être obtenue en concentrant davantage l'inoculum bactérien ou retarder le début de l'administration du composé pour permettre la croissance bactérienne supplémentaire; Cependant, l' augmentation de la charge de défi trop peut conduire à une maladie anormalement sévère et aiguë (c. -à mort en moins de 24 h) qui est réfractaire à tous les traitements antibactériens , indépendamment de la sensibilité. Bien que l'inoculum est d'abord placé de préférence dans le poumon gauche de l'animal, l'infection se propage généralement dans les deux poumons. maladie progressive du poumon, de la diffusion des bactéries à d'autres organes, et la morbidité éventuelle est souvent observed avec S. pneumoniae, K. pneumoniae et P. aeruginosa. Fait intéressant, les infections à H. influenzae et A. baumannii sont généralement plus contenu et conduisent rarement à la mort à l'inoculum bactérien prescrit.

Les résultats d'efficacité obtenus à partir de ce modèle ont une bonne corrélation avec les profils de sensibilité in vitro ainsi que des cibles / PD PK définies. La réduction de la charge bactérienne sont régulièrement observés pour les isolats considérés comme sensibles à l'agent testé, tandis que ceux qui présentent résistant considéré aucun changement ou la croissance bactérienne au-dessus de la ligne de base 16, 17, 19, 24-29. Des études chez le rat évaluant deux quinolones et d' un macrolide à l' aide de ce modèle ont montré que 32 la cible PK / PD requise pour un 1-log 10 de réduction de S. pneumoniae par rapport au niveau de référence en corrélation avec la cible déterminée chez des souris neutropéniques et, plus important encore , avec cibles cliniques pour pneum bactérienne d'origine communautaireonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un nouveau mécanisme antibiotique, a été testé contre plusieurs S. pneumoniae et nécessitait une cible PK / PD similaire pour un 1-log 10 diminution de ce modèle d'infection pulmonaire 31 comme celle requise pour un 1-log 10 de réduction dans le modèle de la cuisse neutropénique 36 lorsque la pénétration du poumon a été pris en compte (données sur fichier). De même, les / cibles PD PK déterminées chez la souris pour GSK2251052 contre P. aeruginosa étaient compatibles pour la stase, 1 et 2 log 10 réductions de CFU entre ce modèle de poumon 30 et le modèle d'infection de la cuisse neutropénique lorsque la pénétration du poumon a été considéré comme 37, 38 . La corrélation avec un modèle d'infection pulmonaire neutropénique utilisant l'inoculation intranasale était pauvre; cependant, GSK2251052 n'a pas produit plus d'une réponse statique dans cette étude 38. Cela peut être attribuable à l'inoculum bactérien plus élevé, ce qui était de 8 log 10 UFC / souris par rapport à 6 log 37 et intratrachéale 30 modèles. La collecte de données telles que ce qui est essentiel pour l'analyse comparative, car il permet une comparaison directe avec des modèles et corrélation avec les données cliniques existantes pour évaluer la capacité prédictive translationnelle. Une utilisation plus répandue du poumon modèle d'infection intubation trachéale fournira des données supplémentaires pour ces types d'analyses.

Il existe plusieurs limites de ce modèle de pneumonie immunocompétent. Tout d'abord, il est pas bien adapté à l'évaluation émergence de résistance spontanée parce que l'inoculum bactérien élevé généralement requis pour des résultats d'études en trop sévère une infection. Après les tentatives pour atteindre la charge bactérienne de 7 ou 8 log 10 UFC au départ, la morbidité rapide a été observée ( à savoir les animaux deviennent moribonds en moins de 24 h) malgré un lavage complet de l'inoculum pour éliminer les toxines pré-existantes (données sur fichier). Ilpeut être possible de surmonter ce problème en utilisant de plus grands rongeurs. Les rats, les rats particulièrement lourdes (> 250 g), semblent mieux tolérer inoculums plus élevé par rapport aux souris et peuvent être adaptés à ce type d'étude. Une deuxième limitation est que l'utilisation de l'agar comme une infection-activateur peut empêcher l'utilisation du modèle pour l'évaluation de certains hôte: interactions pathogènes. On croit que l'agar fournit un point focal protégé jusqu'à l'infection est pleinement établie dans le poumon. Il est possible de livrer l'inoculum dans une solution saline plutôt que de l'agar pour aider à surmonter ce problème; cependant, il convient de noter que cela ne provoque une infection avec des isolats. Troisièmement, il y a une courbe d'apprentissage abrupte nécessaire pour devenir compétent dans la technique. La procédure peut être délicate, en particulier chez les souris. Il est facile de placer à tort la canule métallique dans l'œsophage, et une force excessive peut conduire à la perforation soit l'œsophage ou la trachée. le placement minutieux de l'inoculum est égalementnécessaires ou les animaux peuvent soit ne pas récupérer ou non être infectées de manière adéquate. Cependant, avec patience et persévérance, on peut devenir très compétent et effectuer la technique rapidement, en douceur et avec précision.

En supprimant l'exigence de la neutropénie, l'augmentation de la robustesse et de la reproductibilité, permettant aux enquêteurs d'étudier plusieurs agents pathogènes et les isolats, l'amélioration de la flexibilité de la conception expérimentale et en fournissant une infection difficile à caractériser la pharmacodynamie pour une pneumonie, ce modèle d'infection pulmonaire immunocompétent ajoute une valeur importante à la découverte des antibiotiques Communauté. L'utilisation accrue de ce modèle par les enquêteurs supplémentaires aidera à fournir l'étalonnage nécessaire pour lui permettre de faire accepter plus largement répandue et continuer à fournir des informations de soutien pour une interprétation appropriée.

Disclosures

Les auteurs sont tous payés les employés de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals et actions propres d'actions au sein de l'entreprise.

Acknowledgments

JH souhaite remercier mentor, ami et ancien directeur Valerie Berry pour la première nous enseigne ce modèle; et Gary Woodnutt, qui nous a appris les bases de et a inspiré notre engagement dans le domaine des antibactérienne PK / PD. Tous les auteurs tiennent à remercier David Payne pour son soutien et l'appréciation de notre science. Nous tenons à remercier notre ancien dans collègues de microbiologie in vivo qui ont contribué à l'ensemble des données générées en utilisant ces méthodes, en particulier Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni page et Nerissa Simon. Enfin, nos remerciements vont à nos collègues in vitro de microbiologie pour leur aide, en particulier pour fournir toutes les CMI , nous demandons (Lynn McCloskey, Josh Ouest et Sharon Min); et pour notre équipe de microbiologie clinique qui fournit des conseils d'experts et de soutien (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman et Deborah Butler).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood Becton Dickinson and Company 4321261
Chocolate II Agar Becton Dickinson and Company 4321267
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified Becton Dickinson and Company 299070
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol Becton Dickinson and Company 297808 storage media for frozen stock
Inoculating loop Nunc 251586
0.9% Sodium Chloride, USP Baxter Healthcare Corporation NDC 0338-0048-04
Difco Nutrient Agar Becton Dickinson and Company 213000
30 mL free standing centrifuge tube with cap EverGreen Scientific 222-3530-G80
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Falcon, a Corning Brand 352070
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm Falcon, a Corning Brand 352059
Guide Tool Intek Services Ltd GT01 custom-made metal cannula for rats
90' Portex tubing SAI POR-080-100 plastic cannula for rats
1 mL TB syringe slip tip Becton Dickinson and Company 309659
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 Becton Dickinson and Company 305122
Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 Popper and Sons, Inc 7903 used to create metal cannula for mice
Intramedic polyethylene tubing Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company 427401 plastic cannula for mouse 
75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 Hamilton 87930 HPLC glass injection syringe
Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner Corning 9825-25 to autoclave/store metal cannulae
70% isopropyl alcohol Vi-Jon (Swan) NDC 0869-0810-43
Isoflurane, USP Piramal Healthcare NDC 66794-013-10
Stomacher  Seward Stomacher80
Stomacher 80 classic bags Seward BA6040
Assay plate, 96 well, round bottom Costar, Corning Inc 3795 optional, for serial diluting
Blood Omni Plates Hardy #A127 optional, rectangular blood plates

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