Analyse av Cap-bindende proteiner i humane celler eksponert for Fysiologiske oksygenforholdene

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Translasjonell kontroll fremstår som en like viktig skritt for å transcriptional regulering i genuttrykk, særlig i perioder med cellulært stress en. Et samlingspunkt oversettelse kontroll er på hastighetsbegrensende trinn i initiering hvor de første trinnene av proteinsyntese involverer binding av eukaryote initiering faktor 4E (eIF4E) til 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 'cap av mRNA 2 . eIF4E er en del av en trimere kompleks kalt eIF4F som inkluderer eIF4A, en RNA helicase, og eIF4G, et stillas protein nødvendig for rekruttering av andre oversettelses faktorer og 40S ribosom tre. Under normale fysiologiske forhold, er det store flertallet av mRNA oversettes ved hjelp av en hette-avhengig mekanisme, men under perioder av cellulært stress omtrent 10% av humane mRNA inneholde 5 'UTR som kan tillate cap-uavhengig oversettelses intiation 1,4. Cap-avhengige oversettelsen har vært historisk synonymOUS med eIF4F, men stress-spesifikke variasjoner av eIF4F har blitt en trending topic 5-8.

Ulike cellulære påkjenninger føre eIF4E aktivitet for å bli undertrykt via mammalian target of rapamycin kompleks 1 (mTORC1). Denne kinase blir svekket under stress, noe som resulterer i økt aktivitet av ett av sine mål, 4E-bindende protein (4E-BP). Non-fosforylert 4E-BP binder seg til eIF4E og blokkerer dens evne til å samhandle med eIF4G forårsaker undertrykkelse av cap-avhengige oversettelse 9,10. Interessant, en homolog av eIF4E heter eIF4E2 (eller 4EHP) har en mye lavere affinitet for 4E-BP 11, kanskje slik at det å unngå belastning-mediert represjon. Faktisk, først karakterisert som en repressor av oversettelse på grunn av sin mangel på interaksjon med eIF4G 12, initierer eIF4E2 oversettelsen av hundrevis av mRNA som inneholder RNA hypoksi responselementer i sin 3 'UTR under hypoksiske stresset 6,13. Denne aktiveringen is oppnås gjennom interaksjoner med eIF4G3, RNA-bindende protein motiv 4, og den hypoksi induserbar faktor (HIF) 2α for å utgjøre en hypoksisk eIF4F kompleks, eller eIF4F H 6,13. Som en repressor under normale forhold, binder eIF4E2 med GIGYF2 og ZNF598 14. Disse kompleksene ble delvis identifisert ved agarose-koblede m 7 GTP affinitet harpikser. Denne klassiske metoden 15 er standard innen oversettelse og er de beste og mest brukte teknikk for å isolere cap-bindende komplekser i trekke ned og in vitro bindingsanalyser 16-19. Etter hvert som hetten avhengige oversettelse maskineri fremstår som fleksibel og tilpasningsdyktig med innbyrdes skiftende deler 6-8,13, er denne metoden et kraftig verktøy for raskt å identifisere nye cap-bindende proteiner som er involvert i den stressrespons. Videre variasjoner i eIF4F kunne ha bred betydning som flere eukaryote modellsystemer synes å bruke en eIF4E2 homolog for stressresponser slikesom A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, og C. elegans 23.

Tyder på at variasjoner i eIF4F ikke kan være strengt begrenset til stress forhold, men være involvert i normal fysiologi 24. Oksygentilførselen til vevene (ved kapillær ender) eller i vev (målt via mikroelektroder) varierer fra 2-6% i hjernen 25, 3-12% i lungene 26, 3,5-6% i tarmen 27, 4% i leveren 28, 7-12% i nyrene 29, 4% i muskel 30, og 6-7% i benmargen 31. Celler og mitokondrier inneholder mindre enn 1,3% oksygen 32. Disse verdiene er mye nærmere hypoksi enn den omgivende luft, hvor cellene rutinemessig dyrket. Dette tyder på at det tidligere var tenkt som hypoksi-spesifikke cellulære prosesser kan være relevant i en fysiologisk innstilling. Interessant, eIF4F og eIF4F H 24. Lavt oksygen driver også riktig fosterutvikling 33 og celler generelt har høyere spredning priser, lengre levetid, mindre DNA skader og mindre generell stressresponser i physioxia 34. Derfor er eIF4F H sannsynligvis en viktig faktor i ekspresjon av utvalgte gener under fysiologiske betingelser.

Her gir vi en protokoll for å dyrke celler i anleggs fysiologiske oksygenforholdene eller i et dynamisk varierende utvalg som sannsynligvis mer representativt for vev microenvironments. En fordel med denne metoden er at cellene blir lysert i hypoksi arbeidsstasjonen. Det er ikke ofte klart hvordan overgangen fra hypoksisk cellekultur til cellelysering blir utført i andre protokoller. Celler blir ofte først fjernes fra en liten hypoksi inkubator bliforgrunnen lyse, men dette eksponering for oksygen kan påvirke biokjemiske reaksjonsveier som den cellulære responsen til oksygen er rask (ett eller to min) 35. Visse cap-bindende proteiner krever samhandling med andre base eller kan hydrolysere m 7 GTP, derfor noen cap interactors kan være savnet i renseprosessen. Agarose-bundet til enzymatisk resistente cap analoger kan være substituert i denne protokollen. Utforsking av aktivitet og sammensetning av eIF4F H og andre varianter av eIF4F gjennom metoden beskrevet her vil belyse intrikate genuttrykk machineries at celler benytter under fysiologiske forhold eller stressresponser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelser for Cell Culture

  1. Kjøp kommersielt tilgjengelige aksjer på menneskeceller.
    MERK: Denne protokollen benytter HCT116 tykktarmskreft og primære humane nyre proksimale tubulære epitelceller (HRPTEC).
  2. Gjør 500 ml medium for kultur av HCT116: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) / høy glukose-medium supplert med 7,5% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S).
  3. Gjør 500 ml medium for kultur av HRPTEC: epithelial cell medium supplementert med 5% FBS, 1% epitelial cellevekst supplement, og 1% P / S.
  4. Fremstille 500 ml 1x fosfatbuffret saltoppløsning (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na-HPO 2 til 4, 15 mM KH 2PO 4. Juster pH til 7,4 og sterilisere ved autoklavering i 40 minutter ved 121 ° C.

2. Innføring av celledyrking

  1. aspirer nøye mediet fra en 80-90% konfluent fatet uten å forstyrre than celler.
  2. Delmengde 3-5 ml 1x PBS pr kultur fatet, forsiktig rocke hver kolbe å belegge overflaten av fatet, og nøye aspirer 1x PBS. Gjenta for andre 1x PBS vask.
  3. Alikvoter 3 ml 0,05% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) til hver kulturskål og rist for å belegge jevnt cellene med trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 ° C i 2-3 min.
  4. Overfør de frigjorte celler til et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 4000 xg i 90 sek.
  5. Resuspender cellepelleten i 1 ml komplett DMEM.
  6. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Beregne hvor mange ikke-pyrogent og polystyren 100 mm cellekultur retter er nødvendig for å oppnå en initial poding tetthet på omtrent 2,500-5,000 celler pr cm2.
  7. Forvarm fullstendig cellekulturmedium laget i trinn 1.2 eller 1.3 i et 37 ° C vannbad i 30-45 min.
  8. Dekontaminere mediet flasken og celle hetteglass med 70% etanol. Fra dette punktet fremover alleoperasjoner skal utføres aseptisk.
  9. Alikvoter 6 ml komplett DMEM til flest 100 mm cellekulturskåler som kreves for å bruke hele volumet av frosne celler i seeding tetthet som er nevnt i trinn 2,6.
  10. Overfør volumet av cellesuspensjon beregnet i trinn 2.6 til hvert av de 100 mm kulturskåler. Rist hver plate manuelt å fordele cellene over overflaten av platen.
  11. Plasser seeded 100 mm cellekulturskål i inkubator ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. Tillat celler til å ruge på minst 24 timer før de neste trinnene.

3. subdyrking

  1. Se hver cellekulturskål under et mikroskop for å bestemme prosentandelen av cellesammenflytning (% celler som dekker området av fatet). Returner cellene til inkubatoren og pre-varm komplett medium og 1x PBS. Fortsett til neste trinn hvis cellene er 80-100% konfluent.
  2. aspirer forsiktig brukt medium uten å forstyrreceller i hver kultur tallerken.
  3. Delmengde 3-5 ml 1x PBS pr kultur fatet, forsiktig rocke hver kolbe å belegge overflaten av fatet, og nøye aspirer 1x PBS. Gjenta for andre 1x PBS vask.
  4. Delmengde 3 ml 0,05% trypsin-EDTA i hver kultur tallerken og forsiktig rocke til jevnt strøk cellene med trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 ° C i 2-3 min.
  5. I løpet av denne inkubasjonen alikvot 10 ml fullstendig medium til så mange kulturskåler er nødvendig for å oppnå celletetthet på 2,500-5,000 celler pr cm2.
  6. Når cellene har løsnet fra platen, raskt tilsett 3 ml 1x definert trypsininhibitor og virvle fatet i 1 min for å sikre at alt av den trypsin-EDTA er blitt nøytralisert.
  7. Overfør de frigjorte celler inn i et sterilt 15 ml sentrifugerør og satt til side. Tilsett 3 ml 1 x PBS til skålen for å samle eventuelle gjenværende celler, og overføre den til den samme 15 ml sentrifugerør.
  8. Pellet cellene ved sentrifugering 150 xgi 5 min.
  9. Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 3 ml fullstendig medium.
  10. Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og frø 150 mm kulturskåler inneholdende 15 ml fullstendig medium for å oppnå en celletetthet på 2,500-5,000 celler pr cm2. Bruk to 150 mm for hver cap-bindingsanalysen.
    MERK: Oksygen diffusjon til cellene gjennom flytende media er avhengig av volumet 36. Det anbefales å holde volumet av mediet konsekvent mellom eksperimenter om adherente celler eller celler i suspensjon anvendes. Media kan være pre-condition (inkubert i arbeidsstasjonen for 24 timer som omtalt i diskusjon) for å unngå disse variabilities i diffusjon.
  11. Plasser seeded-kultur retter i inkubator ved 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfæren. Tillat celler til å ruge på minst 24 timer før du går videre til neste trinn.

4. Physioxic Eksponering

  1. Vis cellene under mikroskopet. for besT resultater, sørge for at cellene er 70-80% konfluent for en 24 timers eksponering, 50-60% konfluent for en 48 timers eksponering, og 40-50% konfluent for en 72 timers eksponering.
  2. Plassere cellene i en hypoksi arbeidsstasjon for den ønskede tid (24, 48 eller 72 timer, avhengig av eksperimentet).
  3. Sett arbeidsstasjonen til den aktuelle physioxia.
    MERK: For eksempel vil en 3% O 2 innstillingen følges av 5% CO 2 og 92% N2.
    MERK: Hvis oksygen svingninger innenfor et dynamisk område er ønsket i løpet av en bestemt tidsplan, program planen inn i instrumentet eller manuelt justere oksygen innstillingene på de ønskede intervaller.
  4. Sett fuktighet til 60%. Arbeidsstasjonen Atmosfæren er veldig tørt likevel, og media vil merkbart fordampe under lange eksperimenter (> 48 timer). Hold en media reserve i en cellekultur kolbe innenfor arbeidsstasjonen (slik at media er i likevekt med arbeidsstasjonen atmosfæren) til å fylle mediene i cellekultur dishes.
    MERK: Enhver løsning som vil samhandle med cellene før lyse (som PBS og trypsin-EDTA) skal være pre-betinget for 24 timer før bruk innen hypoksi arbeidsstasjon slik at oppløst oksygen likevekt med atmosfærisk oksygen 36.
  5. Hold celler i arbeidsstasjonen til lyse.

5. Klar Buffere for Cap-bindingsanalysen

  1. Forbered 1x Tris-bufret saltvann (TBS).
    1. I 800 ml dH 2 O, oppløse 8,76 g NaCl og 6,05 g Tris-base.
    2. Bring løsningen til en slutt-pH på 7,4 ved anvendelse av 1 M HCI.
    3. Ta det endelige volumet til en L hjelp dH 2 O.
  2. Forbered ikke-denaturering lysis buffer. Forbered lyseringsbuffer dagen av cap-bindingsanalysen. Gjør ekstra lysis buffer for å vaske tomme agarose perler og γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10-lenkede perler (trinn 7.9 og 7.13).
    1. I 7 ml dH 2 O, tilsett 160 mL 5 M NaCll, 160 pl 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 pl 200 mM NaF, 40 pl 1 M MgCl2, og 40 pl 1 mM natriumortovanadat.
    2. Legg 40 ul Igepal til 7 ml oppløsning. Skjær tuppen av pipetten for å hjelpe hente Igepal som det er ekstremt tyktflytende.
    3. Bland ved å pipettere opp og ned, eller vortex, 7 ml oppløsning inntil alt Igepal er blitt oppløst.
    4. Heve det endelige volum av oppløsningen til 8 ml og holde på is.
  3. Forbered 4x Sodium (SDS) siders Sample Buffer.
    1. I et begerglass, kombinere 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml glyserol, og 8 ml ditiotreitol (DTT).
    2. Legg 3,2 g SDS og 0,16 g av bromfenol blått. Tillat pulver til fullstendig oppløse ved å blande med en magnetisk rørestav.
    3. Delmengde inn 1,5 ml Mikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 ° C.

6. Cell Lysis

  1. Forbered ikke-denaturerende lysis buffer og holde på is dagen the cap-bindingsanalysen.
  2. Forvarm 1 x PBS og trypsin i et 37 ° C vannbad i 30 min.
  3. Alikvote 980 ul lyseringsbuffer til et 1,5 ml mikrosentrifuge-rør for hver hette-bindingsanalysen blir utført.
  4. Tilsett 10 mL av 4- (2-aminoetyl) benzensulfonyl fluor-hydroklorid og 10 ul av 100x protease inhibitor cocktail til 980 ul lyseringsbuffer. Hold på is.
  5. Kast media fra hver 150 mm rett i en avfallsbeholder i hypoksi arbeidsstasjon.
  6. Vask cellene med 3-4 ml varm 1 x PBS og forkaste hele væsken.
  7. Tilsett 1 ml varm 0,05% trypsin-EDTA til hver tallerken og la sitte i 2 minutter eller til cellene er ikke lenger festet til platen.
  8. Ved hjelp av en pipette, overføres celler fra en plate til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Gjenta etter behov, slik at hver plate med celler overføres til et separat 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  9. Sentrifuger 1,5 ml mikrosentrifugerør ved 6000 xg i 90 sek to pellet cellene.
  10. Aspirer trypsin ved hjelp av en pipette uten å forstyrre pelleten. Dersom pelleten blir forstyrret, re-sentrifuger 1,5 ml mikrosentrifugerør ved 6000 xg i 90 sek.
  11. Vask cellene med varme 1 x PBS ved forsiktig pipettering av 200 ul av PBS inn i røret like over pellet. Re-sentrifuge hvis pelleten er forstyrret.
  12. Aspirer PBS uten å forstyrre pelleten.
  13. Pipetter 500 ul fra 1 ml lyseringsbuffer fremstilt løsningen på den første cellulære pelleten. Resuspender pelleten i sin helhet ved å pipettere opp og ned.
  14. Kombiner de resuspenderte celler med den andre celle-pellet og resuspender den andre pellet ved å pipettere opp og ned. Gjenta denne prosessen til alle pellets har blitt kombinert og suspendert for hver prøve.
  15. Kombiner lysatet med de resterende 500 ul lyseringsbuffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  16. Fjerne prøver fra hypoksi arbeidsstasjonen.
    MERK: Når du har lagt lysis buffer, enll etterfølgende trinn som skal utføres i omgivende luft som den hypoksi arbeidsstasjonen er satt til 37 ° C og de følgende trinnene blir utført kaldt (4 ° C eller på is).
  17. Lyse av cellene ved hjelp av forsiktig agitering ved å rotere prøvene ved 4 ° C i 1,5-2 timer.
  18. Sentrifuger de lyserte cellene ved 12 000 xg i 15 min ved 4 ° C for å fjerne cellerester.
  19. Overfør lysatet til en ny 1,5 ml mikrosentrifugerør og kast pellet.
  20. Reservere en del (5-10%) av supernatanten som skal brukes som en helhet cellelysat inngangsstyre for fremtidig western blot-analyse.

7. Cap-bindingsanalysen

  1. For hver prøve, overfør 50 pl av emnet agarose vulsten kontroll oppslemmingen og 50 ul av den γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10 bundne perle oppslemming for å separere 1,5 ml mikrosentrifugerør. Bruke saks for å fjerne spissen av pipetten for å lette oppsamling av vulsten oppslemmingen.
  2. Pellet perler by sentrifugering av oppslemmingen ved 500 x g i 30 sek.
  3. Fjern supernatanten forsiktig og resuspender perlene i 500 mL av TBS.
  4. Gjenta trinn 7.2 og 7.3. Pellet perlene ved 500 xg i 30 sek, og fjern supernatanten.
  5. Overfør supernatanten inneholdende lysat fra trinn 6,19 til 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende de tomme agarose perler.
    MERK: tomme agarosekuler fungere som en pre-clearing trinn for å fjerne proteiner fra lysatet at ikke-spesifikt samvirke med vulsten.
  6. Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C med forsiktig omrøring.
  7. Pellet tomme agarosekuler ved sentrifugering ved 500 x g i 30 sek.
  8. Overfør lysatet til 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10-bundne kuler.
  9. Vask den tomme agarosekuler ved resuspendering perlene i 500 ul lyseringsbuffer, pelletering av perlene ved sentrifugering ved 500 x g i 30 sek, og forkaster supernatant. Gjenta dette fire ganger for totalt fem vasker.
  10. Resuspender tomme agarosekuler i 1x SDS-PAGE-prøvebuffer, og koke perlene etter 90 sekunder ved 95 ° C. Oppbevar ved -20 ° C for fremtidig western blot-analyse for å observere hvorvidt proteinet av interesse bindes ikke-spesifikt til vulsten.
  11. Inkuber lysatet med γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10 bundne perler med forsiktig omrøring i 1 time ved 4 ° C for å fange opp cap-bindende proteiner.
  12. Pellet γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10-bundne kuler ved sentrifugering ved 500 x g i 30 sek. Kast supernatanten.
  13. Vask γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10-bundne kuler ved å gjenta trinn 7.9.
  14. Resuspender perler i 600 ul lyseringsbuffer.
  15. Legg GTP til en sluttkonsentrasjon på 1 mM.
  16. Inkuber γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10-bundne kuler + 1 mM GTP med forsiktig omrøring i 1 time ved 4 ° C. Merk: Dennevil angre proteiner som ikke er spesifikt reagerer med m 7 GTP (dvs. også samhandle med ikke-denaturert GTP).
  17. Pellet γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10-bundne kuler ved sentrifugering ved 500 x g i 30 sek.
  18. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett 200 pl 4 x SDS-PAGE-prøvebuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% bromfenolblått og 10% glycerol). Oppbevar GTP kontrollprøven ved -20 ° C for fremtidig western blot-analyse 37. Vask kulene ved å gjenta trinn 7.9.
  19. Resuspender perler i 1x SDS-PAGE-prøvebuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% bromfenolblått og 10% glycerol), og koker ved 95 ° C i 90 sek. Oppbevar m 7 GTP-bundet fraksjon ved -20 ° C for fremtidig western blot-analyse 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse av Cap-bindende evne i Response til Oxygen av eIF4E og eIF4E2 i en m 7 GTP Affinity Column

Figurene 1 og 2 representerer western blot av typiske m 7 GTP affinitetsrensing av to hoved cap-bindende proteiner som reaksjon på oksygen svingninger i to humane cellelinjer: primære humane proksimale nyretubuli epitelceller (HRPTEC) i F igur 1 og kolorektal karsinom ( HCT116) i figur 2. Celler blir opprettholdt ved den angitte oksygentilgang i 24 timer for å sikre at det oppløste oksygen i de flytende medier har likevekt med luften i arbeidsstasjonen hypoksi. Inngangs lane (IN) representerer 10% av hele cellelysatet før den m 7 GTP-bundne agarosekuler ble tilsatt for å fange opp cap-bindende proteiner. Denne inngangen kjørefelt brukes som basis for å måle berikelseav et mål protein i m 7 GTP nedtrekk. GTP kjørefelt er eluatet fra M-7 GTP perler som var eluer med 1 mM GTP. Dette trinnet gjør det mulig for påvisning av proteiner som også gjenkjenner ikke-metylert GTP. Hetten bindende proteiner eIF4E og eIF4E2 gjenkjenne m 7 GTP spesielt, men deres homolog eIF4E3 (ikke vist her) binder også til ikke-denaturert GTP. Evnen til eIF4E og eIF4E2 til å binde 5 'mRNA cap struktur (m 7 GTP) kan måles ved å sammenligne intensiteten av deres bånd i den m 7 GTP kolonne i forhold til intensiteten i inngangs kjørefelt (totalt tilgjengelig pool).

Denne kvantifisering kan utføres ved å måle pikselintensiteten av proteinbåndene i tre biologiske replikater med et bildeanalyseprogramvare som ImageJ. Resultater er uttrykt som relative hjelp av enheter tetthet (RDU) ± standard feil av gjennomsnittet. Rå verdier før normaliseringfra både eksperimentelle og kontrollprøver ble sammenlignet ved uparet to-halet t-test. P <0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Denne representative forsøk viser at de to cellelinjene har forskjellige områder av oksygen for deres eIF4E og eIF4E2 bruk. Figur 1 viser at i HRPTEC bare eIF4E binder seg sterkt til 7 m GTP ved 8% O 2 (figur 1A), at både eIF4E og eIF4E2 er signifikant assosiert med m 7 GTP fra 3-5% O 2 (figur 1 B - C), og at bare eIF4E2 binder sterkt til m 7 GTP på 1% O 2 (figur 1D). I figur 2, i HCT116-celler, er oksygenavhengig bruken av disse Cap-bindende proteiner forskjellig: bare eIF4E binder seg sterkt til m 7 GTP til 12% O 2 (figur 2A), begge cap-bindende proteiner bindes i vesentlig grad til m 7 GTP i 5-8% O 2 rekkevidde(Figur 2B - C), og bare eIF4E2 binder seg sterkt til 7 m GTP på 3% O 2 (figur 2D). Fraværet av eluering fra m 7 GTP kolonne med GTP viser at eIF4E og eIF4E2 er spesifikke for m 7 GTP og kjenner ikke ikke-denaturert GTP. De søylediagram representerer kvantifisering av tre biologiske replikater ved hjelp ImageJ. Våre resultater viser at to hoved cap-bindende proteiner, eIF4E og eIF4E2, varierer i deres evne til å binde til mRNA m 7 GTP dekselkonstruksjonen i en oksygenavhengig måte.

Basert på tidligere litteratur at disse to proteinene initiere oversettelse av unike klasser av mRNA, kan dette skiftet i cap-bindende aktivitet resultere i forskjellige proteom generert til å tilpasse seg endringer i oksygentilgangen. Denne teknikken kan brukes til å karakterisere nye translasjonsinitiering faktorer som reagerer med 5'-mRNA cap(eller med cap-bindende proteiner) gjennom en målrettet western blot tilnærming eller en bred tilnærming som massespektrometri analyse av en m 7 GTP eluat.

Figur 1
Figur 1: eIF4E og eIF4E2 aktiviteter overlapper under physioxia i HRPTEC 3-5% O 2. Capture analyser ved anvendelse av m 7 GTP-perler i human proksimale nyretubuli epitelcellelinje (HRPTEC) lysater utsatt for (A) til 8%, (B) 5%, (C) 3% eller (D) 1% O2 i 24 timer. GTP, GTP vask for å måle spesifisitet for m 7 GTP; m 7 GTP, proteiner bundet til m 7 GTP perler etter GTP vask. Representative Western-blot er vist og data fra minst tre uavhengige eksperimenter ble kvantifisert ved ImageJ og uttrykt som enheter relative tetthet (RDU) i forhold til 10% inngang (IN) i hele cellelysatet. * P <0,05 (uparet to-halet t-test) ble betraktet som en vesentlig endring når man sammenligner anriking av eIF4E eller eIF4E2 i hatten-bundne fraksjon (m 7 GTP) til IN. Data, gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) av tre uavhengige eksperimenter. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. og Uniacke, J. menneskeceller dyrket under fysiologiske oksygen utnytte to cap-bindende proteiner for å rekruttere forskjellige mRNA for oversettelse. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. eIF4E og eIF4E2 aktiviteter overlapper under physioxia i HCT116 5-8% O 2. Capture analyser ved anvendelse av m 7 GTP-perler i HCT116 human colorectal carcinoma lysater som er utsatt for (A) 12%, (b) 8%, (C) 5% eller (D) 3% O 2 i 24 timer. GTP, GTP vask for å måle spesifisitet for m 7 GTP; m 7 GTP, proteiner bundet til m 7 GTP perler etter GTP vask. Representative Western-blot er vist og data fra minst tre uavhengige eksperimenter ble kvantifisert ved ImageJ og uttrykt som relative tetthetsenheter (RDU) i forhold til 10% inngang (IN) i hele cellelysatet. * P <0,05 (uparet to-halet t-test) ble betraktet som en vesentlig endring når man sammenligner anriking av eIF4E eller eIF4E2 i hatten-bundne fraksjon (m 7 GTP) til IN. Data, gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) av tre uavhengige eksperimenter. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. og Uniacke, J. menneskeceller dyrket under fysiologiske oksygen utnytte to cap-bindende proteiner for å rekruttere forskjellige mRNA for oversettelse. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analysen av cap-bindende proteiner i humane celler utsettes for fysiologiske oksygenbetingelser kan gi rom for identifisering av nye oksygen regulert translasjonsinitiering faktorer. Affiniteten av disse faktorene for den 5 'cap av mRNA eller andre cap-assosierte proteiner kan måles ved styrken av deres tilknytning til 7 m GTP bundne agarosekuler. En påminnelse med denne teknikken er at den måler hetten bindende potensial av proteiner post-lysis, men den utføres under ikke-denaturerende betingelser som opprettholder protein-protein interaksjoner og post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs). Flere protein-protein interaksjoner medierer binding av eIF4E familien til 5 'cap. Den 4E-BP binder og undertrykker eIF4E ved å blokkere interaksjonen med eIF4G og hindre rekruttering av 43s pre-initieringskomplekset 38. Den eIF4E / 4E-BP kompleks forblir bundet til 5'-mRNA cap, blokkerer enhver initiering fra det transkript, og kanbrukes som en markør for eIF4E inhibering i m 7 GTP affinitetskolonner. Motsatt kan samspillet av eIF4E med eIF4G på m 7 GTP kolonner være en markør for aktiv oversettelse initiering. PTMs er en annen metode for å regulere aktiviteten av translasjon initiering faktorer. For eksempel kan fosforylering av eIF4E av Mnk1 øke sin affinitet for 5 'mRNA cap 39. Proteinet modifiserende middel som kodes av Interferon stimulert Gene 15 (ISG15) er en PTM som øker cap-bindingsaktivitet av eIF4E2 som respons på interferon-induksjon via patogen infeksjon 40. Den ISG15 genet inneholder en hypoksi respons element i sin promoter som tyder på at dette systemet kan regulere eIF4E2 i lav oksygen. Svært lite er kjent om hvordan PTMs kan endre aktiviteten til cap bindende proteiner i løpet av fysiologisk relevante oksygenforhold. Denne teknikken etterfulgt av massespektrometri-analyse kunne avdekke nye oksygen-regulert og fysiologisk relevante PTMs thved mediere aktiviteten av translasjons-initierings-faktorer.

En alternativ metode for å fange med en m 7 GTP cap analog vil være å immunutfelle et kjent cap-bindende protein som eIF4E eller eIF4G og utføre massespektrometri for å identifisere assosierte proteiner. En begrensning av denne strategien er at cap-bindende proteiner ofte ha alternative cellulære roller som innenfor stresset granulater 41 eller i cap-uavhengig oversettelse 1,4. Derfor benytter m 7 GTP cap analoger er den beste, mest pålitelige metoden for å isolere cap-bindende proteiner, spesielt når undersøker nye cap-assosierte proteiner. En begrensning av bruk av en m 7 GTP cap analog er at noen cap-bindende proteiner som gatefeier decapping enzymet DCPS ikke bare kommunisere med m 7 GTP mRNA cap, men også kreve at andre base for binding 42. Videre decapping enzymer generelt, slik som Dcp1 / Dcp2 komplekset, kan hydrolyze m 7 GTP og effektivt redusere harpiks kapasitet. Derfor kan enkelte cap-bindende proteiner gå tapt i denne analysen. For å omgå disse begrensningene, kan enzymatisk resistente mRNA cap analoger utnyttes. To ikke-hydrolyser cap analoger, mononukleotid m 7 GpCH2pp eller dinucleotide m 7 GpCH2ppA har vist seg å fange DCPS, Dcp1, og Dcp2 43. Disse mRNA cap analoger er ikke kommersielt tilgjengelig, men må bli kjemisk syntetisert de novo. En annen begrensning av denne protokollen er at bare cap-bindende proteiner eller proteiner i samspill med cap-bindende proteiner via "snylter" vil bli tatt til fange. Mens cap-avhengige oversettelse initiering er den viktigste formen for initiering, cap-uavhengige mekanismer er spesielt utbredt i forhold til cellulært stress en. Men i sammenheng med denne teknikken og nye trender innen oversettelse initiering 6-8,24, identifisere nye stress-indusert faktorene som participate i cap-avhengige initiering er et lovende område for forskning.

En annen faktor å vurdere i denne protokollen er oksygen i media. Dyrkning av celler i et flytende medium tilveiebringer en barriere mellom cellene og atmosfæren. Det har vist seg at flytende medier kan ta opptil 24 timer å stabilisere seg med den atmosfæriske gassammensetning 36. Derfor må cellene dyrkes i 24 timer i ønsket oksygentilgangen før lyse, eller media kan være pre-condition om kortere inkubasjoner er påkrevd. Pre-conditioning innebærer å opprettholde medie i hypoksi arbeidsstasjon i minst 24 timer i et sterilt kultur kolbe som gjør at gassutveksling. Enhver oksygenert løsning innføres i cellene i hypoksi arbeidsstasjonen kan raskt endre cellulære signalveier som hetten avhengige translasjonsinitiering som blir undersøkt i denne protokollen. På grunn av følsomheten av oksygenfølsomme baner i celler, hvilken som helst løsning som vilreagere med celler før lysering så som PBS og trypsin-EDTA, må også være pre-kondisjonert i minst 24 timer. Lysis og etterlyse vaske buffere må brukes kald og er derfor ikke forhåndsavkjølt om 37 ° C hypoksi arbeidsstasjon. Mens noen oksygenavhengig modifikasjoner av proteiner som kan være aktiv post-lysis, blir den kalde buffere som kreves for å redusere enzymatisk aktivitet og "shuffling" av protein-protein eller protein-RNA komplekser som kan føre til gjenstander. En modifikasjon til denne protokollen for å øke stringens kan være til pre-tilstand lysis og etterlyse vask buffere for 24 timer og deretter inkuber dem på isen innenfor arbeidsstasjonen før bruk. Medier og buffere bør ikke holdes i den hypoksi arbeidsstasjon for mer enn tre dager, fordi disse oppløsninger vil konsentrere seg på grunn av vannfordampning. For langtidsstudier (> 3 dager), den opprinnelige beløpet av celler seeded må vurderes nøye. Som celler deler seg og overflatearealet av fatet blir overfylt,andre påkjenninger som for eksempel media forsuring kan påvirke aktivitet av cap-bindende proteiner. På den siste dag av forsøket, bør celler har en sammenflytning på 80-90%.

Det er fire viktige trinnene i denne protokollen: opprettholde cellene i hypoksi arbeidsstasjonen inntil lyse, mengden av celler som brukes, vasking av perler, og det ikke-metylert GTP kontroll. 1) Det finnes flere metoder for å opprettholde celler i lav oksygen. De fleste av disse består av små kamre som kan inneholde bare cellekultur retter, men noen manipulering eller cellelyse må utføres utenfor kamrene i luften. Komponenter av den oksygensensor maskineri slik som hypoksi induserbar faktorene er aktivert eller inaktivert i løpet av ett eller to minutter 35. Derfor, som nevnt tidligere, å lysere cellene i en hypoksi arbeidsstasjon er avgjørende for å sikre aktiviteten av hetten-bindende proteiner er assosiert med den respektive oksygen tilgjengelighet. 2) Antall cellerforeslått i denne protokollen (to 150 mm skåler) er tilstrekkelig for sterk m 7 GTP interactors som eIF4E familie eller medlemmer av eIF4F kompleks (eIF4A og eIF4G). Flere celler, minst fem 150 mm retter, kan bli pålagt å påvise proteiner med forbigående interaksjoner eller som bare forbinder med m 7 GTP mRNA cap gjennom eIF4F. 3) vasking av perlene etter inkubering av dem med cellelysatet kan utføres i en stringent og mindre strenge måte. Protokollen presentert her har en streng alternativ der lyseringsbuffer benyttes for å vaske perlene fem ganger. Hvis proteiner med svakere interaksjoner til cap-bindende proteiner er av interesse, kan man utføre færre vasker og utnytte Tris-bufret saltvann i stedet for lysebuffer. 4) Selv om det er viktig å forhånds fjerne cellelysatet med ukonjugert agarose for å fjerne proteiner som ikke-spesifikt reagerer med vulsten, noen cap-bindende proteiner kan ikke skille mellom sanne mRNA cap struktur, metylert GTP (m7 GTP), og ikke-denaturert GTP. Et slikt protein er det eIF4E homolog eIF4E3 44. Eluere perlene med GTP vil løsne noen protein som også anerkjenner ikke-denaturert GTP, som kan være av interesse. Den biologiske betydningen av proteiner som gjenkjenner både m 7 GTP og GTP har ennå ikke helt klarlagt. Dette understrekes av de få publikasjoner som involverer eIF4E3 (som er en bona fide cap-bindende protein med en konservert cap-bindende domene) i forhold til de eIF4E og eIF4E2 proteiner, som gjenkjenner m 7 GTP fra ikke-metylert GTP.

Denne teknikken, som presenteres, kan utføres som en målrettet tilnærming til å identifisere m 7 GTP interactors av interesse eller som en bred tilnærming ved å analysere m 7 GTP eluatet via massespektrometri. Flere andre teknikker kan følge physioxic eksponering (protokoll 4) for å analysere cap-bindende aktivitet som subcellulære fraksjonering, immunfluorescens, co-immunoprecipitation, ennd polysome analyse. Translasjonell kontroll fremstår som en likeverdig bidragsyter til genekspresjon som transkripsjon. Utnytte denne teknikken for å undersøke aktiviteten og sammensetning av cap-bindende komplekser vil belyse hvordan cap-avhengige oversettelse initiering er regulert i respons til lav oksygen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351, (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14, (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266, (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433, (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564, (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273, (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486, (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32, (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23, (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129, (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21, (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282, (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1, (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273, (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29, (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121, (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25, (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43, (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57, (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92, (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87, (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571, (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99, (1), 394 (2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321, (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15, (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26, (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14, (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18, (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21, (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14, (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18, (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271, (11), 2189-2203 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics