Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l'oxygène

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Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

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Abstract

Introduction

Contrôle translationnelle émerge comme une étape tout aussi important de la régulation transcriptionnelle de l'expression génique, en particulier pendant les périodes de stress cellulaire 1. Un point central de contrôle de la traduction est à l'étape de limitation de vitesse d'initiation où les premières étapes de la synthèse des protéines impliquent la liaison de la facteur d'initiation eucaryote 4E (eIF4E) à la 7-méthylguanosine (m 7 GTP) coiffe 5 'des ARNm 2 . eIF4E fait partie d'un complexe trimère nommé eIF4F qui comprend eIF4A, un ARN hélicase et eIF4G, une protéine d'échafaudage nécessaire pour le recrutement d'autres facteurs de traduction et les 40S ribosome 3. Dans des conditions physiologiques normales, la grande majorité des ARNm sont traduits par un mécanisme de cap-dépendante, mais sous des périodes de stress cellulaire environ 10% des ARNm humains contiennent 5 'UTR qui pourraient permettre la traduction cap-indépendante intiation 1,4. Traduction de Cap-dépendante a été synonyme historiquementous avec eIF4F, cependant, des variations spécifiques au stress de eIF4F sont devenus un sujet tendance 5-8.

Diverses contraintes cellulaires provoquent l'activité eIF4E à être réprimée par la cible mammalienne de la rapamycine complexe 1 (mTORC1). Cette kinase devient douteux sous contrainte, ce qui se traduit par l'augmentation de l'activité de l'un de ses objectifs, la protéine 4E-liaison (4E-BP). Non-phosphorylée 4E-BP se lie à eIF4E et bloque sa capacité à interagir avec eIF4G provoquant la répression de la traduction cap-dépendante 9,10. Fait intéressant, un homologue de eIF4E nommé eIF4E2 (ou 4EHP) a une affinité beaucoup plus faible pour les 4E-BP 11, peut - être ce qui lui permet d'échapper au stress médiée par la répression. En effet, tout d' abord caractérisé comme répresseur de la traduction en raison de son manque d'interaction avec eIF4G 12, eIF4E2 initie la traduction de centaines d'ARNm qui contiennent des éléments de réponse à l'hypoxie d'ARN dans les 3 'UTR lors d'un stress hypoxique 6,13. Cette i d'activations obtenus par des interactions avec eIF4G3, l' ARN de liaison aux protéines motif 4 et le facteur inductible par l'hypoxie (HIF) , 2α pour constituer un complexe eIF4F hypoxique ou eIF4F H 6,13. En tant que répresseur dans des conditions normales, eIF4E2 se lie avec GIGYF2 et 14 ZNF598. Ces complexes ont été, en partie, identifiés par m 7 résines GTP d'affinité Agarose liés. Cette méthode classique 15 est standard dans le domaine de la traduction et les dosages meilleur et le plus couramment utilisé la technique pour isoler les complexes de plafonnement contraignant pull down et in vitro de liaison 16-19. Comme le mécanisme de traduction cap-dépendante est en train de devenir flexible et adaptable avec des parties inter-changer 6-8,13, cette méthode est un outil puissant pour identifier rapidement de nouvelles protéines cap de liaison impliqués dans la réponse au stress. Par ailleurs, les variations de eIF4F pourraient avoir de vastes répercussions que plusieurs systèmes modèles eucaryotes semblent utiliser un homologue eIF4E2 pour les réponses de stress tellescomme A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, et C. elegans 23.

Les preuves suggèrent que les variations de eIF4F peuvent ne pas être strictement limitées aux conditions de stress, mais être impliqués dans la physiologie normale 24. L'apport d'oxygène aux tissus (au niveau des extrémités des capillaires) ou dans les tissus (mesurée par microélectrodes) varie de 2 à 6% dans le cerveau 25, 3-12% dans les poumons 26, 3,5-6% dans l'intestin 27, 4% le foie 28, 7-12% dans le rein 29, 4% dans le muscle 30, et 6-7% dans la moelle osseuse 31. Les cellules et les mitochondries contiennent moins de 1,3% d' oxygène 32. Ces valeurs sont beaucoup plus proches de l'hypoxie que l'air ambiant où les cellules sont cultivées en routine. Cela donne à penser que ce qui était auparavant considéré comme des processus cellulaires spécifiques à l'hypoxie peuvent être pertinents dans un contexte physiologique. Il est intéressant de eIF4F et eIF4F H 24. Le manque d' oxygène entraîne également le développement du fœtus 33 et les cellules ont généralement des taux plus élevés de prolifération, plus la durée de vie, moins de dommages de l' ADN et moins les réactions de stress général dans physioxia 34. Par conséquent, eIF4F H est probablement un facteur clé dans l'expression de certains gènes dans des conditions physiologiques.

Ici, nous fournissons un protocole aux cellules de culture dans des conditions d'oxygène physiologiques fixes ou dans une gamme fluctuant dynamique qui est probablement plus représentatif de microenvironnements tissulaires. Un avantage de cette méthode est que les cellules sont lysées à l'intérieur du poste de travail de l'hypoxie. Il est pas souvent clairement comment la transition de la culture de cellules hypoxiques à la lyse cellulaire est effectuée dans d'autres protocoles. Les cellules sont souvent d'abord retirés d'un petit incubateur d'hypoxie êtreavant la lyse, mais cette exposition à l' oxygène pourrait affecter les voies biochimiques comme la réponse cellulaire à l' oxygène est rapide (une ou deux minutes) 35. Certaines protéines cap de liaison exigent des interactions avec une seconde base ou peuvent hydrolyser le m 7 GTP, donc certains interacteurs cap peuvent manquer dans le processus de purification. Agarose liée aux analogues de cap enzymatiquement résistant peut être substitué dans ce protocole. Exploration de l'activité et la composition des eIF4F H et d' autres variations de eIF4F par la méthode décrite ici va faire la lumière sur les gènes machineries d'expression complexes que les cellules utilisent dans des conditions physiologiques ou des réactions de stress.

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Protocol

1. Préparatifs pour la culture cellulaire

  1. Achetez des stocks disponibles dans le commerce de cellules humaines.
    NOTE: Ce protocole utilise le carcinome HCT116 colorectal et des cellules primaires humaines rénaux proximaux tubulaires épithéliales (de HRPTEC).
  2. Faire 500 ml de milieu pour la culture de cellules HCT116: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / moyenne élevée en glucose supplémenté avec 7,5% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S).
  3. Faire 500 ml de milieu de culture de HRPTEC: milieu cellulaire épithéliale supplémenté avec 5% de FBS, supplément de croissance de cellules épithéliales de 1%, et 1% P / S.
  4. Préparer 500 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS): NaCl 140 mM, KCl 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM de KH 2 PO 4. Ajuster le pH à 7,4 et stériliser par autoclavage pendant 40 min à 121 ° C.

2. Ouverture de la cellule en culture

  1. Aspirer soigneusement le moyen d'un plat de confluentes 80-90% sans déranger til cellules.
  2. Aliquotes 3-5 ml de PBS 1x par boîte de culture, roche doucement chaque flacon pour recouvrir la surface du plat, et soigneusement Aspirer le PBS 1x. Répétez l'opération pour un second lavage 1x PBS.
  3. Aliquoter 3 ml de 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans chaque boîte de culture et balancer doucement pour bien enrober les cellules avec de la trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 2-3 min.
  4. Transférer les cellules détachées dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifuger à 4000 g pendant 90 secondes.
  5. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de DMEM complet.
  6. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Calculez combien non pyrogènes et de polystyrène 100 mm culture cellulaire plats sont nécessaires pour obtenir une densité d'ensemencement initiale d'environ 2,500-5,000 cellules par cm 2.
  7. milieu complet Préchauffer culture cellulaire fait dans les étapes 1.2 ou 1.3 dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30-45 min.
  8. Décontaminer la bouteille moyenne et flacon de cellules avec 70% d'éthanol. De ce point avant toutles opérations doivent être effectuées de manière aseptique.
  9. Aliquote 6 ml de DMEM complet en autant de boîtes de culture cellulaire de 100 mm requis pour utiliser la totalité du volume de cellules congelées à l'intérieur de la densité d'ensemencement mentionnée à l'étape 2.6.
  10. Transférer le volume de la suspension cellulaire calculée à l'étape 2.6 à chacune des boîtes de culture de 100 mm. Rock chaque plaque à la main pour répartir uniformément les cellules au-dessus de la surface de la plaque.
  11. Placer la boîte de 100 mm ensemencé de culture de cellules dans l'incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Laisser les cellules incuber au moins 24 heures avant les prochaines étapes.

3. Repiquage

  1. Afficher chaque boîte de culture de cellules sous un microscope pour déterminer le pourcentage de confluence cellulaire (% de cellules couvrant la zone de la cuvette). cellules à l'incubateur et milieu de pré-chaud complet et 1x PBS Retour. Passez à l'étape suivante si les cellules sont 80-100% confluentes.
  2. Aspirer soigneusement le milieu usé sans perturber lecellules dans chaque boîte de culture.
  3. Aliquotes 3-5 ml de PBS 1x par boîte de culture, roche doucement chaque flacon pour recouvrir la surface du plat, et soigneusement Aspirer le PBS 1x. Répétez l'opération pour un second lavage 1x PBS.
  4. Aliquoter 3 ml de 0,05% de trypsine-EDTA dans chaque boîte de culture et balancer doucement pour bien enrober les cellules avec de la trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 2-3 min.
  5. Au cours de cette incubation, la fraction aliquote de 10 ml de milieu complet en autant de boîtes de culture sont nécessaires pour obtenir une densité cellulaire de 2,500-5,000 cellules par cm 2.
  6. Lorsque les cellules ont détaché de la plaque, ajouter rapidement 3 ml d'inhibiteur de trypsine 1x défini et agiter doucement le plat pendant 1 min pour assurer que tous les trypsine-EDTA a été neutralisé.
  7. Transférer les cellules individuelles dans un 15 ml tube de centrifugation stérile et mettre de côté. Ajouter 3 ml de 1 x PBS à la boîte pour recueillir toutes les cellules restantes, et que le transfert à la même 15 ml tube de centrifugation.
  8. Sédimenter les cellules par centrifugation à 150 x gpendant 5 min.
  9. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de milieu complet.
  10. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et épépiner des boîtes de culture de 150 mm contenant 15 ml de milieu complet pour obtenir une densité cellulaire de 2,500-5,000 cellules par cm 2. Utilisez deux 150 mm pour chaque test de plafonnement contraignant.
    REMARQUE: la diffusion d'oxygène vers les cellules par l' intermédiaire des milieux liquides dépendent du volume 36. Il est recommandé de maintenir le volume des médias compatibles entre les expériences si les cellules adhérentes ou des cellules en suspension sont utilisés. Les médias peuvent être pré-conditionnés (incubé dans le poste de travail pendant 24 heures comme indiqué dans la discussion) afin d'éviter ces variabilités de diffusion.
  11. Placez les plats ensemencées-culture dans l'incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 de 5%. Laisser les cellules incuber au moins 24 heures avant de procéder aux étapes suivantes.

4. Physioxic exposition

  1. Afficher les cellules au microscope. Pour best les résultats, veiller à ce que les cellules sont 70-80% confluentes pour une exposition de 24 heures, 50-60% confluentes pour une exposition de 48 heures, et 40-50% confluentes pour une exposition de 72 h.
  2. Placer les cellules dans une station de travail à l'hypoxie pendant le temps désiré (24, 48 ou 72 heures en fonction de l'expérience).
  3. Réglez le poste de travail à l'physioxia approprié.
    NOTE: Par exemple, un réglage de 3% O 2 serait accompagnée de 5% de CO 2 et 92% de N 2.
    NOTE: Si les fluctuations d'oxygène dans une plage dynamique sont souhaités sur un calendrier précis, le programme du calendrier dans l'instrument ou d'ajuster manuellement les réglages d'oxygène aux intervalles souhaités.
  4. Régler le taux d'humidité de 60%. L'atmosphère du poste de travail est très sec néanmoins, et les médias sera sensiblement s'évaporer pendant de longues expériences (> 48 h). Gardez une réserve de médias dans un flacon de culture cellulaire à l'intérieur du poste de travail (de sorte que le support est équilibré avec l'atmosphère du poste de travail) pour reconstituer les médias dans le dis de culture cellulaireil est.
    REMARQUE: Toute solution qui va interagir avec les cellules avant la lyse (tel que du PBS et trypsine-EDTA) doivent être conditionnées pendant 24 h avant d'être utilisé dans le poste de travail hypoxie de sorte que l'oxygène dissous équilibre avec l'oxygène de l' air 36.
  5. Gardez les cellules dans le poste de travail jusqu'à ce que la lyse.

5. Tampons Préparation pour Assay Cap-contraignant

  1. Préparer 1x Tris-solution saline tamponnée (TBS).
    1. Dans 800 ml de dH 2 O, dissoudre 8,76 g de NaCl et 6,05 g de Tris base.
    2. Amener la solution à un pH final de 7,4 avec 1 M de HCl.
    3. Amener le volume final à 1 L en utilisant dH 2 O.
  2. Préparer un tampon de lyse non dénaturante. Préparer un tampon de lyse le jour du test de plafonnement contraignant. Faire un tampon de lyse supplémentaire pour laver les billes d'agarose vierges et le GTP agarose γ-aminophényl-m 7 billes C10 liées (étapes 7.9 et 7.13).
    1. Dans 7 ml de dH 2 O, ajouter 160 pi 5 M NaCll, NaF 160 mM , 1 ul de Tris-HCl pH 7,4, 40 ul de 200, 40 pi de 1 M de MgCl2, et orthovanadate de sodium , 40 ul de 1 mM.
    2. Ajouter 40 ul de la solution d'Igepal à 7 ml. Coupez la pointe de la pipette pour aider à récupérer Igepal car il est extrêmement visqueux.
    3. Mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas, ou vortex, la solution de 7 ml jusqu'à ce que tous les Igepal a été dissous.
    4. Relevez le volume final de la solution à 8 ml et garder sur la glace.
  3. Préparer 4x dodécylsulfate de sodium (SDS) -PAGE Sample Buffer.
    1. Dans un bécher, mélanger 16 ml de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8, 12,64 ml de glycerol, et 8 ml de dithiothréitol (DTT).
    2. Ajouter 3,2 g de SDS et 0,16 g de bleu de bromophénol. Laisser la poudre à dissoudre entièrement par mélange avec un barreau d'agitation magnétique.
    3. Aliquoter dans 1,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C.

6. Lyse cellulaire

  1. Préparer un tampon de lyse non dénaturant et garder sur la glace le jour de the cap-essai de liaison.
  2. Préchauffer PBS 1x et de la trypsine dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min.
  3. Aliquoter 980 pi de tampon de lyse dans un tube de 1,5 ml pour chaque test de plafonnement de liaison étant effectuées.
  4. Ajouter 10 ul d'acide 4- (2-aminoéthyl) le chlorhydrate de fluorure de benzènesulfonyle et 10 ul d'inhibiteur de protéase de cocktail 100x 980 ul de tampon de lyse. Gardez sur la glace.
  5. Jeter les médias de chaque plat de 150 mm dans un conteneur de déchets à l'intérieur du poste de travail de l'hypoxie.
  6. Laver les cellules avec 3-4 ml d'eau tiède 1x PBS et jeter tout le liquide.
  7. Ajouter 1 ml de chaud 0,05% de trypsine-EDTA à chaque plat et laisser reposer pendant 2 minutes ou jusqu'à ce que les cellules ne sont plus respectées à la plaque.
  8. En utilisant une pipette, transférer les cellules d'une plaque à un tube de 1,5 ml. Répéter au besoin pour que chaque plaque de cellules est transféré dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse séparé.
  9. Centrifuger les tubes de 1,5 ml de microcentrifugation à 6000 xg pendant 90 sec to sédimenter les cellules.
  10. Aspirer la trypsine en utilisant une pipette sans perturber le culot. Si le culot est perturbé, re-centrifugeuse tube de microcentrifugation de 1,5 ml à 6000 xg pendant 90 sec.
  11. Laver les cellules avec du PBS chaud 1x par pipetage 200 pi de PBS dans le tube juste au-dessus du culot. Re-centrifugeuse si le culot est perturbé.
  12. Aspirer le PBS sans perturber le culot.
  13. Introduire à la pipette 500 ul de la solution de 1 ml a préparé du tampon de lyse sur la première pastille cellulaire. Remettre en suspension le culot entièrement par pipetage vers le haut et vers le bas.
  14. Combiner les cellules remises en suspension avec le deuxième culot cellulaire et remettre en suspension le culot seconde par pipetage vers le haut et vers le bas. Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les granulés ont été combinés et remis en suspension pour chaque échantillon.
  15. Combinez le lysat avec les 500 ul restants de tampon de lyse dans un tube de 1,5 ml.
  16. Retirer les échantillons du poste de travail de l'hypoxie.
    Remarque: après l'addition du tampon de lyse, d'unoutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans l'air ambiant du poste de travail est réglé à une hypoxie 37 ° C et les étapes suivantes doivent être effectuées à froid (4 ° C ou sur de la glace).
  17. Lyser les cellules en utilisant une agitation douce en faisant tourner les échantillons à 4 ° C pendant 1,5 à 2 heures.
  18. Centrifuger les cellules lysées à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
  19. Transférer le lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et jeter le culot.
  20. Sous réserve d'une partie (5-10%) du produit surnageant à utiliser comme toute une commande d'entrée de lysat cellulaire pour une future analyse Western Blot.

7. Cap contraignant Assay

  1. Pour chaque échantillon, transférer 50 pl de suspension de l'ébauche d' agarose de commande de bourrelet et 50 ul de la suspension de billes γ-aminophényl-m- 7 GTP d' agarose-C10 lié à séparer 1,5 ml microtubes. Utilisez des ciseaux pour enlever la pointe de la pipette pour faciliter la collecte de la suspension de billes.
  2. Pellet les perles by centrifuger la suspension à 500 g pendant 30 secondes.
  3. Retirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension les billes dans 500 pi de TBS.
  4. Répétez les étapes 7.2 et 7.3. Pellet les perles à 500 xg pendant 30 sec et retirer le surnageant.
  5. Transférer le surnageant contenant le lysat de l'étape 6.19 au tube de 1,5 ml contenant les billes blanches d'agarose.
    REMARQUE: Les billes d'agarose vides agissent comme une étape de pré-compensation pour éliminer les protéines du lysat, qui interagissent de manière non spécifique avec le bourrelet.
  6. Incuber pendant 10 min à 4 ° C sous agitation douce.
  7. Sédimenter les billes vides d'agarose par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes.
  8. Transférer le lysat au tube de 1,5 ml contenant les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 liées.
  9. Laver les billes d'agarose vides en remettant en suspension les billes dans 500 pl de tampon de lyse, pastillage les billes par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes, et à rejeter le supernatante. Répétez cette opération quatre fois pour un total de cinq lavages.
  10. Resuspendre les billes d'agarose vierges dans un tampon d'échantillon 1x SDS-PAGE, et faire bouillir les billes pendant 90 secondes à 95 ° C. Conserver à -20 ° C pour une analyse future Western blot pour observer si la protéine d'intérêt se lie non spécifiquement à la perle.
  11. Incuber le lysat avec les perles γ-aminophényl-m 7 GTP agarose C10 liés avec agitation douce pendant 1 heure à 4 ° C pour capturer protéines cap contraignant.
  12. Sédimenter les γ-amino-phényl-7 m GTP des billes d' agarose-C10 lié par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes. Jeter le surnageant.
  13. Laver les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 lié par étape 7.9 répéter.
  14. Remettre en suspension les billes dans 600 pl de tampon de lyse.
  15. Ajouter GTP à une concentration finale de 1 mM.
  16. Incuber les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 liées + 1 mM GTP avec agitation douce pendant 1 heure à 4 ° C. Note: Cettese dissocier des protéines qui interagissent de manière non spécifique avec m 7 GTP (ie, également interagir avec GTP non méthylé).
  17. Sédimenter les γ-amino-phényl-7 m GTP des billes d' agarose-C10 lié par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes.
  18. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 200 pi de 4x tampon échantillon SDS-PAGE (50 mM de Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% de SDS, 0,1% de bleu de bromophénol, et 10% de glycérol). Conserver l'échantillon de contrôle de GTP à -20 ° C pour une future analyse western blot 37. Laver les billes par étape 7.9 répéter.
  19. Resuspendre les billes dans 1 x tampon échantillon SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% de SDS, 0,1% de bleu de bromophénol et 10% de glycerol) et faire bouillir à 95 ° C pendant 90 secondes. Rangez la m fraction 7 GTP à -20 ° C pour une future analyse western blot 37.

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Representative Results

Analyse de capacité Cap-contraignant en réponse à l' oxygène de eIF4E et eIF4E2 dans un m 7 GTP Affinity Colonne

Les figures 1 et 2 représentent western blots de type m 7 GTP purification par affinité de deux protéines majeures de plafonnement contraignant en réponse aux fluctuations de l' oxygène dans les deux lignées de cellules humaines: cellules primaires humaines rénaux proximaux tubulaires épithéliales (de HRPTEC) dans F igure 1 et carcinome colorectal ( HCT116) sur la figure 2. Les cellules sont maintenues à la disponibilité de l'oxygène indiquée pendant 24 heures pour s'assurer que l'oxygène dissous dans le milieu liquide est équilibré avec l'air dans le poste de travail hypoxie. La voie d'entrée (IN) représente 10% de l'ensemble du lysat cellulaire avant la m 7 billes d' agarose GTP-liés sont ajoutés à capturer protéines cap contraignant. Cette voie d'entrée est utilisé comme référence pour mesurer l'enrichissementd'une protéine cible dans le menu déroulant GTP 7 m. La voie GTP est l'éluat de la m 7 GTP perles qui ont été élués avec 1 mM de GTP. Cette étape permet la détection des protéines qui reconnaissent également GTP non méthylé. Les protéines cap liaison eIF4E et eIF4E2 reconnaissent m 7 GTP spécifiquement, mais leur homologue eIF4E3 (non représenté ici) se lie également à GTP non méthylé. La capacité de eIF4E et eIF4E2 de lier la structure de coiffe 5 'de l' ARNm (m 7 GTP) peut être mesurée en comparant l'intensité de leurs bandes dans la m 7 colonne de GTP par rapport à l'intensité dans la voie d'entrée (pool total disponible).

Cette quantification peut être réalisée en mesurant l'intensité des pixels des bandes de protéines pour trois répétitions biologique avec un logiciel d'analyse d'image, tels que ImageJ. Les résultats sont exprimés en tant que moyens relatifs des unités de densité (RDU) ± erreur type de la moyenne. Les valeurs brutes avant la normalisationà partir d'échantillons à la fois expérimentaux et témoins ont été comparées par le test t de apparié à deux queues étudiants. P <0,05 était considérée comme statistiquement significative. Cette expérience représentative montre que les deux lignées cellulaires ont différentes gammes d'oxygène pour leur utilisation eIF4E et eIF4E2. La figure 1 montre que , en ne HRPTEC eIF4E se lie fortement à 7 m GTP à 8% d' O 2 (figure 1A), et que les deux eIF4E eIF4E2 sont significativement associés à 7 m GTP 3-5% O 2 (figure 1B - C), et que seul eIF4E2 se lie fortement à m 7 GTP à 1% O 2 (figure 1D). Sur la figure 2, dans les cellules HCT116, l'utilisation de l' oxygène dépend de ces protéines cap de liaison est différente: ne eIF4E se lie de manière significative à m 7 GTP à 12% de O 2 (figure 2A), les deux protéines cap de liaison se lient de manière significative à m 7 GTP dans la gamme 5-8% O 2(Figure 2B - C) et ne se lie sensiblement à eIF4E2 m GTP 7 à 3% de O 2 (figure 2D). L'absence d'élution de la colonne m GTP GTP avec 7 montre que eIF4E et eIF4E2 sont spécifiques à 7 m GTP et ne reconnaissent pas GTP non méthylé. Les graphiques à barres représentent la quantification de trois répétitions biologiques utilisant ImageJ. Nos résultats démontrent que deux protéines majeures de capitalisation de liaison, eIF4E et eIF4E2, diffèrent dans leur capacité à lier l'ARNm m structure de coiffe 7 GTP d'une manière dépendant de l' oxygène.

Sur la base de la littérature précédente que ces deux protéines déclenchent la traduction des classes uniques d'ARNm, ce changement dans l'activité de plafonnement contraignant pourrait entraîner différents protéomes générés pour s'adapter aux changements dans la disponibilité de l'oxygène. Cette technique peut être utilisée pour caractériser de nouveaux facteurs d'initiation de traduction qui interagissent avec le «plafond de 5 ARNm(ou avec des protéines de liaison à capuchon) à travers une approche western blot ciblée ou une approche large tels que la masse analyse par spectrométrie d'un GTP éluat m 7.

Figure 1
Figure 1: eIF4E et eIF4E2 activités se chevauchent pendant physioxia en HRPTEC 3-5% O 2. Essais de capture à l' aide de m 7 GTP perles dans la cellule proximale rénale humaine tubulaire épithéliale (HRPTEC) lysats exposés à (A) 8%, (B) 5%, (C) 3% ou (D) 1% O 2 pendant 24 heures. GTP, lavage de GTP pour mesurer la spécificité pour m 7 GTP; m 7 GTP, protéines liées à m 7 perles de GTP après lavage de GTP. Western blots représentatifs sont représentés et les données provenant d'au moins trois expériences indépendantes ont été quantifiés par ImageJ et exprimés en unités relatives de la densité (RDU) par rapport à 10% entrée (IN) de lysat de cellules entières. * P <0,05 (apparié test t de Student bilatéral) a été considéré comme un changement important lorsque l'on compare l'enrichissement de eIF4E ou eIF4E2 dans la fraction cap-bound (m 7 GTP) à l'IN. Données, moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) de trois expériences indépendantes. Cette recherche a été initialement publié dans le Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. et Uniacke, cellules J. humaines cultivées sous oxygène physiologique utilisent deux protéines cap contraignant pour recruter des ARNm distincts pour la traduction. 2016; 291 (20): 10772-82 24. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. eIF4E et les activités eIF4E2 se chevauchent pendant physioxia à 5-8 HCT116% O 2. Des dosages de capture à l' aide GTP 7 m billes dans HCT116 colorectal humain lysats de carcinome exposés à (A) 12%, (B) 8%, (C) 5% ou (D) 3% d' O 2 pendant 24 heures. GTP, lavage de GTP pour mesurer la spécificité pour m 7 GTP; m 7 GTP, protéines liées à m 7 perles de GTP après lavage de GTP. Western blots représentatifs sont représentés et les données provenant d'au moins trois expériences indépendantes ont été quantifiés par ImageJ et exprimés en unités de densité relative (RDU) par rapport à 10% entrée (IN) de lysat de cellules entières. * P <0,05 (apparié test t de Student bilatéral) a été considéré comme un changement important lorsque l'on compare l'enrichissement de eIF4E ou eIF4E2 dans la fraction cap-bound (m 7 GTP) à l'IN. Données, moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) de trois expériences indépendantes. Cette recherche a été initialement publié dans le Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. et Uniacke, cellules J. humaines cultivées sous oxygène physiologique utilisent deux protéines cap contraignant pour recruter des ARNm distincts pour la traduction. 2016; 291 (20): 10772-82 24. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'analyse des protéines cap de liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques d'oxygène peut permettre l'identification de nouveaux facteurs initiation de la traduction de l'oxygène réglementé. L'affinité de ces facteurs pour le coiffe 5 'd'ARNm ou d' autres protéines cap-associé peut être mesurée par la force de leur association à m 7 GTP lié perles Agarose. Une limitation de cette technique est qu'elle mesure le potentiel de la coiffe liaison des protéines de post-lyse, mais elle est réalisée dans des conditions non dénaturantes qui maintiennent les interactions protéine-protéine et les modifications post-traductionnelles (PTM). De nombreuses interactions protéine-protéine médient la liaison de la famille eIF4E de coiffe 5 '. Le 4E-BP lie et refoule eIF4E en bloquant son interaction avec eIF4G et la prévention du recrutement des 43S pré-initiation complexes 38. Le complexe eIF4E / 4E-BP reste lié à la coiffe en 5 'de l'ARNm, bloquant toute initiation de cette transcription, et peutêtre utilisé comme un marqueur pour l' inhibition de la protéine eIF4E en m 7 colonnes d'affinité GTP. A l' inverse, l'interaction de eIF4E avec eIF4G sur m 7 colonnes GTP pourrait être un marqueur pour l' initiation de traduction active. PTM sont une autre méthode pour réguler l'activité des facteurs d'initiation de traduction. Par exemple, la phosphorylation de eIF4E par Mnk1 peut augmenter son affinité pour l' ARNm de la coiffe 5 '39. Le modificateur de la protéine codée par le gène interferon Stimulée 15 (ISG15) est une PTM qui augmente l'activité de liaison du capuchon de eIF4E2 en réponse à l' induction d' interféron par 40 infection par un pathogène. Le gène ISG15 contient un élément de réponse à l'hypoxie dans son promoteur, ce qui suggère que ce système pourrait réguler eIF4E2 à faible teneur en oxygène. On sait très peu sur la façon dont PTM peuvent modifier l'activité des protéines cap de liaison dans des conditions physiologiquement pertinentes de l'oxygène. Cette technique suivie d'une analyse par spectrométrie de masse peut révéler de nouvelles PTM en oxygène régulée et physiologiquement pertinents eà la médiation de l'activité des facteurs d'initiation de traduction.

Une méthode alternative pour la capture d'une capsule m 7 GTP analogue serait à immunoprécipiter une protéine de liaison à capuchon connu , tel que eIF4E ou eIF4G et effectuer une spectrométrie de masse pour identifier des protéines associées. Une limitation de cette stratégie est que les protéines cap de liaison ont souvent des rôles cellulaires alternatifs tels que le stress au sein de granules 41 ou dans la traduction cap-indépendante 1,4. Par conséquent, l' utilisation de m 7 analogues de capitalisation de GTP est la meilleure méthode, la plus fiable pour isoler les protéines de chapeau de liaison, en particulier lors d' enquêtes sur de nouvelles protéines cap-associé. Une limitation de l' utilisation d' un m 7 cap GTP analogique est que certaines protéines cap de liaison tels que le piégeur décapsulage enzyme DCPS non seulement interagir avec le m 7 GTP ARNm bouchon, mais nécessitent également la deuxième base pour la liaison 42. En outre, les enzymes de désamorçage en général, tels que le complexe DCP1 / DCP2, peuvent hydrolyze m 7 GTP et de réduire efficacement la capacité de résine. Par conséquent, certaines protéines cap de liaison peuvent être perdus dans cette analyse. Pour contourner ces réserves, enzymatiquement résistantes analogues de capitalisation d'ARNm peuvent être utilisés. Deux analogues de capitalisation non hydrolysables, mononucléotide m 7 GpCH2pp ou dinucléotide m 7 GpCH2ppA ont été montré pour capturer DCPS, DCP1 et DCP2 43. Ces analogues de capitalisation d'ARNm ne sont pas disponibles dans le commerce, mais doivent être synthétisés chimiquement de novo. Une autre limitation de ce protocole est que seul bouchon de liaison des protéines ou des protéines interagissant avec des protéines de cap de liaison via "ferroutage" seront capturés. Alors cap-dépendante initiation de la traduction est la principale forme d'initiation, les mécanismes de capitalisation indépendants sont particulièrement répandues dans des conditions de stress cellulaire 1. Cependant, dans le contexte de cette technique et les nouvelles tendances dans le domaine de l' initiation de traduction 6-8,24, l' identification de nouveaux facteurs induits par le stress que participate dans l'initiation cap-dépendante est un domaine de recherche prometteur.

Un autre facteur à considérer dans ce protocole est de l'oxygène dans les médias. Cultiver des cellules dans un milieu liquide constitue une barrière entre les cellules et l'atmosphère. Il a été montré que les milieux liquides peuvent prendre jusqu'à 24 heures pour équilibrer la composition de gaz atmosphérique 36. Par conséquent, les cellules doivent être cultivées pendant 24 heures dans la disponibilité de l'oxygène souhaitée avant la lyse, ou les médias peuvent être pré-conditionnés si incubations plus courtes sont nécessaires. Pré-conditionnement consiste à maintenir le support dans le poste de travail de l'hypoxie pendant au moins 24 heures dans un flacon de culture stérile qui permet l'échange de gaz. Toute solution oxygéné introduit dans les cellules à l'intérieur du poste de travail de l'hypoxie pourrait rapidement modifier les voies de signalisation cellulaires tels que l'initiation de la traduction dépendante de la coiffe qui est en cours d'examen dans ce protocole. En raison de la sensibilité des voies de l'oxygène dans les cellules de détection, toute solution qui serainteragir avec les cellules avant de lyse telles que PBS et de la trypsine-EDTA doivent également être pré-conditionnés pendant au moins 24 heures. Lysis et de lavage post-lyse des tampons doivent être utilisés à froid et ne sont donc pas pré-conditionnés dans le 37 ° C hypoxie poste de travail. Bien que certaines modifications dépendant de l'oxygène aux protéines pourraient être post-lyse actif, les tampons froids sont nécessaires pour réduire au minimum les activités enzymatiques et «brassage» de complexes protéine-protéine ou protéine-ARN qui pourraient conduire à des artefacts. Une modification de ce protocole pour augmenter la rigueur peut être pré-état lyse et de lavage post-lyse des tampons pendant 24 heures, puis les incuber sur de la glace dans le poste de travail avant de l'utiliser. Les médias et les tampons ne doivent pas être conservés dans le poste de travail de l'hypoxie pendant plus de trois jours parce que ces solutions se concentreront en raison de l'évaporation de l'eau. Pour études à long terme (> 3 jours), la quantité initiale de cellules ensemencées doit être examinée avec soin. Comme les cellules se divisent et la surface du plat devient encombré,d'autres contraintes telles que l'acidification des médias pourraient affecter l'activité des protéines cap contraignant. Le dernier jour de l'expérience, les cellules doivent avoir une confluence de 80-90%.

Il y a quatre étapes critiques dans ce protocole: le maintien des cellules dans le poste de travail de l'hypoxie jusqu'à la lyse, la quantité de cellules utilisées, lavage des billes, et le contrôle non-méthylé GTP. 1) Il existe plusieurs méthodes pour maintenir les cellules à faible teneur en oxygène. La plupart d'entre eux comprennent de petites chambres qui peuvent contenir seulement des boîtes de culture cellulaire, mais toute manipulation ou la lyse cellulaire doit être effectuée en dehors des chambres dans l'air ambiant. Composants de la machinerie de l' oxygène de détection , tels que les facteurs inductibles par hypoxie sont activés ou désactivés en l'espace de une ou deux minutes 35. Par conséquent, comme mentionné précédemment, la lyse des cellules dans une station de travail d'hypoxie est essentielle pour assurer l'activité des protéines cap de liaison est associée à la disponibilité de l'oxygène respectif. 2) Le nombre de cellulessuggéré dans ce protocole (deux 150 plats mm) est suffisant pour une forte m 7 GTP interacteurs tels que la famille eIF4E ou membres du eIF4F complexe (eIF4A et eIF4G). Plus de cellules, au moins cinq 150 plats mm, pourraient être nécessaires pour détecter les protéines avec des interactions transitoires ou que seulement associé avec le m 7 GTP ARNm bouchon par eIF4F. 3) le lavage des billes après leur incubation avec le lysat cellulaire peut être réalisée de façon stricte et moins rigoureuse. Le protocole présenté ici offre une option stricte lorsque le tampon de lyse est utilisée pour laver les perles à cinq reprises. Si les protéines avec des interactions plus faibles au cap des protéines de liaison sont d'intérêt, on peut effectuer moins de lavages et d'utiliser une solution saline tamponnée au Tris à la place du tampon de lyse. 4) Il est important d'effectuer une pré-effacer le lysat cellulaire avec non conjugué agarose pour éliminer les protéines qui interagissent de manière non spécifique avec la perle, certaines protéines cap de liaison ne peut pas différencier entre la structure de coiffe de l'ARNm vrai, GTP méthylé (m7 GTP), et GTP non méthylé. L' une de ces protéines est la protéine eIF4E homologue eIF4E3 44. L'élution des perles avec GTP délogera toute protéine qui reconnaît également le GTP non méthylé, ce qui pourrait être d'intérêt. La pertinence biologique des protéines qui reconnaissent à la fois m 7 GTP et GTP n'a pas encore été totalement élucidé. Ceci est souligné par les quelques publications impliquant eIF4E3 ( ce qui est une bonne protéine bona bouchon de liaison avec un capuchon domaine de liaison conservé) par rapport aux protéines eIF4E et eIF4E2, qui ne reconnaissent m 7 GTP de GTP non méthylé.

Cette technique, tel que présenté, peut être réalisée comme une approche ciblée pour identifier m 7 interacteurs GTP d'intérêt ou une approche globale en analysant le GTP éluat m 7 via la spectrométrie de masse. Plusieurs autres techniques peuvent suivre l'exposition physioxic (protocole 4) pour analyser l'activité de plafonnement contraignant telles que le fractionnement subcellulaire, immunofluorescence, co-immunoprécipitation, unnd analyse de polysomes. contrôle translationnelle est en train de devenir un contributeur égal à l'expression du gène comme la transcription. En utilisant cette technique pour étudier l'activité et la composition des complexes de plafonnement contraignant va faire la lumière sur la façon cap-dépendante initiation de la traduction est régulée en réponse à faible teneur en oxygène.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

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