Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Translationele controle is in opkomst als een even belangrijke stap om gentranscriptieregulatie in genexpressie, vooral in perioden van cellulaire stress 1. Een brandpunt van de vertaling controle is op de snelheidsbeperkende stap van initiatie, waar de eerste stappen van de eiwitsynthese betrekking hebben op de binding van de eukaryote initiatie factor 4E (eIF4E) naar de 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 'cap van mRNA 2 . eIF4E maakt deel uit van een trimere complex genaamd eIF4F dat eIF4A, een RNA-helicase en eIF4G, een steiger eiwit nodig is voor de indienstneming van andere vertaling factoren en de 40S ribosoom 3 bevat. Onder normale fysiologische omstandigheden, de meeste mRNA vertaald door een cap-afhankelijk mechanisme, maar onder perioden van cellulaire stress ongeveer 10% van humane mRNAs bevatten 5 'UTR die cap-onafhankelijke translatie waardoor inwijding 1,4. Cap-afhankelijke vertaling is van oudsher synoniemlende met eIF4F echter, stress-specifieke variaties van eIF4F hebben een trending topic 5-8 geworden.

Verschillende cellulaire stress veroorzaken eIF4E activiteit die moet worden onderdrukt via de zoogdieren doelwit van rapamycine complex 1 (mTORC1). Dit kinase minder wordt onder stress, wat resulteert in de verhoogde activiteit van een van de doelstellingen, de 4E-bindend eiwit (4E-BP). Niet-gefosforyleerde 4E-BP bindt aan en blokkeert eIF4E zijn vermogen tot interactie met eIF4G waardoor de onderdrukking van cap-afhankelijke translatie 9,10. Interessant is dat een homoloog van genoemd eIF4E eIF4E2 (of 4EHP) een veel lagere affiniteit voor 4E-BP 11, waardoor het mogelijk stress gemedieerde repressie onttrekken. Inderdaad, aanvankelijk gekarakteriseerd als een repressor van translatie vanwege het gebrek aan interactie met eIF4G 12, eIF4E2 initieert de translatie van mRNAs die honderden RNA hypoxieresponselementen elementen in de 3 'UTR bevatten in hypoxische spanning 6,13. Deze activering is bereikt door interactie met eIF4G3, RNA bindend eiwit motief 4, en de hypoxia induceerbare factor (HIF) 2α een hypoxische eIF4F complex of eIF4F H 6,13 vormt. Als een repressor onder normale omstandigheden, eIF4E2 bindt met GIGYF2 en ZNF598 14. Deze complexen werden gedeeltelijk geïdentificeerd door middel van agarose-gekoppelde m 7 GTP affiniteitsharsen. Dit klassieke methode 15 is standaard op het gebied van vertaling en is de beste en meest gebruikte techniek om-cap bindende complexen te isoleren in pull-down en in vitro bindingstesten 16-19. Als de cap-afhankelijke translatie machinerie is in opkomst als flexibel en aanpasbaar met inter-wisselende delen 6-8,13, deze methode is een krachtig instrument om nieuwe-cap-bindende eiwitten die betrokken zijn bij de reactie op stress snel kan identificeren. Bovendien verschillen in eIF4F kan grote gevolgen hebben als een aantal eukaryote modelsystemen blijken een eIF4E2 homoloog voor stressreacties zoals gebruikenals A. thaliana 20, S. Pombe 21, D. melanogaster 22 en 23 C. elegans.

Er zijn aanwijzingen dat variaties in eIF4F niet strikt kan beperkt stresssituaties, maar worden in normale fysiologie 24. De zuurstoftoevoer naar weefsels (at capillair uiteinden) of binnen weefsels (gemeten met micro-elektroden) varieert van 2-6% in de hersenen 25, 3-12% in de longen 26, 3,5-6% in de darm 27, 4% in de lever 28, 7-12% in de nier 29, 4% in de spieren 30 en 6-7% in het beenmerg 31. Cellen en mitochondriën bevatten minder dan 1,3% zuurstof 32. Deze waarden zijn veel dichter bij hypoxie dan de omgevingslucht wanneer cellen worden routinematig gekweekt. Dit suggereert dat wat eerder werd gezien als hypoxie-specifieke cellulaire processen betrokken in een fysiologische omgeving zijn. Interessant, eIF4F en eIF4F H 24. Lage zuurstof rijdt ook een goede ontwikkeling van de foetus 33 en cellen hebben in het algemeen een hogere proliferatie tarieven, langere levensduur, minder DNA-schade en minder algemene stressreacties in physioxia 34. Daarom eIF4F H is waarschijnlijk een belangrijke factor in de expressie van geselecteerde genen onder fysiologische omstandigheden.

Hier bieden we een protocol om kweekcellen in vaste fysiologische zuurstofarme omstandigheden of in een dynamisch fluctuerende bereik dat waarschijnlijk meer representatief is voor het weefsel micro-omgevingen. Een voordeel van deze methode is dat de cellen worden gelyseerd in de hypoxie werkstation. Het is vaak niet duidelijk hoe de overgang van hypoxische celkweek cellysis wordt uitgevoerd in andere protocollen. De cellen worden vaak eerst verwijderd uit een klein hypoxie incubator wordenvoorgrond lysis, maar deze blootstelling aan zuurstof kunnen beïnvloeden biochemische pathways de cellulaire reactie op zuurstof snel (één of twee min) 35. Bepaalde-cap-bindende eiwitten nodig interacties met een tweede base of kan de m 7 GTP, daarom enkele cap interactors kan worden gemist in het zuiveringsproces te hydrolyseren. -Agarose gebonden enzymatisch resistente cap analoga kunnen worden gesubstitueerd in dit protocol. Het verkennen van de activiteit en de samenstelling van eIF4F H en andere variaties van eIF4F door middel van de hier beschreven methode zal licht werpen op de ingewikkelde genexpressie machines dat cellen gebruiken tijdens fysiologische omstandigheden of stressreacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereidingen voor Cultuur van de Cel

  1. Schaf commercieel beschikbare voorraden van menselijke cellen.
    LET OP: Dit protocol maakt gebruik van HCT 116 colorectaal carcinoom en primaire menselijke nier proximale tubulaire epitheelcellen (HRPTEC).
  2. Voeg 500 ml medium voor kweek van HCT116: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / hoge glucose-medium aangevuld met 7,5% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S).
  3. Voeg 500 ml medium voor kweek van HRPTEC: Epitheliale celmedium aangevuld met 5% FBS, 1% epitheelcel groei supplement, en 1% P / S.
  4. Bereid 500 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2PO 4. PH instellen op 7,4 en steriliseren in de autoclaaf gedurende 40 minuten bij 121 ° C.

2. Opening van celkweek

  1. zuig het medium van een 80-90% confluent gerecht zorgvuldig zonder storende thij cellen.
  2. Aliquot 3-5 ml 1x PBS per cultuur schotel, schud elke kolf voor het bekleden van het oppervlak van de schaal, en zorgvuldig zuig het 1x PBS. Herhaal dit voor een tweede 1x PBS wassen.
  3. Aliquot 3 ml 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in elke kweekschaal en schud gelijkmatig bekleden van de cellen met trypsine-EDTA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min.
  4. Breng de losgemaakte cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 4000 xg gedurende 90 sec.
  5. Hersuspenderen celpellet in 1 ml compleet DMEM.
  6. Aantal cellen met een hemocytometer. Berekenen hoeveel pyrogeenvrij en polystyreen 100 mm celcultuurschalen moeten een initiële zaaidichtheid van ongeveer 2.500-5.000 cellen per cm2 bereiken.
  7. Pre-warm compleet celkweekmedium in stappen 1.2 of 1.3 in een 37 ° C waterbad gedurende 30-45 min.
  8. Ontsmet het medium fles en mobiele flacon met 70% ethanol. Vanaf dit punt naar voren allesoperaties moet aseptisch worden uitgevoerd.
  9. Aliquot 6 ml volledig DMEM in maar 100 mm celcultuurschalen nodig om het gehele volume van bevroren cellen gebruiken in de in stap 2,6 genoemde zaaidichtheid.
  10. Breng de volume celsuspensie berekend in stap 2.6 voor elk van de 100 mm kweekschalen. Schud elke plaat handmatig om de cellen gelijkmatig te verdelen over het oppervlak van de plaat.
  11. Plaats de geënte 100 mm celkweek schaal in de incubator bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Een cel in staat om ten minste 24 uur incuberen voordat de volgende stappen.

3. Subkweken

  1. Bekijk elke celkweekschaal onder een microscoop om het percentage cellen confluentie (% cellen die het gebied van de schotel) te bepalen. Cellen terug in de incubator en voorverwarmen compleet medium en 1x PBS. Ga verder met de volgende stap als de cellen 80-100% confluent.
  2. zuig het verbruikte medium zorgvuldig zonder verstoring van decellen in elke kweekschaal.
  3. Aliquot 3-5 ml 1x PBS per cultuur schotel, schud elke kolf voor het bekleden van het oppervlak van de schaal, en zorgvuldig zuig het 1x PBS. Herhaal dit voor een tweede 1x PBS wassen.
  4. Aliquot 3 ml van 0,05% trypsine-EDTA in elke cultuur gerecht en schud gelijkmatig de vacht van de cellen met trypsine-EDTA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min.
  5. Tijdens deze incubatie aliquot 10 ml van compleet medium in zoveel kweekschalen moeten celdichtheid van 2.500-5.000 cellen per cm2 verkregen.
  6. Wanneer de cellen losgemaakt van de plaat snel voeg 3 ml 1x gedefinieerd trypsineremmer en voorzichtig zwenken de schaal gedurende 1 minuut om te verzekeren dat alle trypsine-EDTA werd geneutraliseerd.
  7. Breng de vrijstaande cellen in een steriele 15 ml centrifugebuis en zet apart. Voeg 3 ml 1x PBS om de schotel om eventuele resterende cellen te verzamelen, en geven dat dezelfde 15 ml centrifugebuis.
  8. Pellet de cellen door centrifugeren 150 xggedurende 5 min.
  9. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml compleet medium.
  10. Aantal cellen met een hemocytometer en zaden 150 mm kweekschalen met 15 ml compleet medium tot een celdichtheid van 2.500-5.000 cellen per cm2 verkregen. Gebruik twee 150 mm per-cap bindingstest.
    OPMERKING: Zuurstof diffusie cellen door vloeibare media is afhankelijk van het volume 36. Het wordt aanbevolen het volume van de media vergelijkbaar bij experimenten houden of hechtende cellen of cellen in suspensie gebruikt. Media kunnen vooraf geconditioneerd (geïncubeerd in het werkstation voor 24 uur zoals in Discussie) deze variabiliteit in diffusie te voorkomen.
  11. Plaats de geënte-kweekschalen in de incubator bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Laat cellen om ten minste 24 uur broeden alvorens tot de volgende stappen.

4. Physioxic Exposure

  1. Toon de cellen onder de microscoop. voor best resultaten zorgen dat cellen 70-80% confluent een 24 uur blootstelling, 50-60% confluente een 48 uur blootstelling en 40-50% confluent een 72 uur blootstelling.
  2. Plaats de cellen in een hypoxie werkstation voor de gewenste (24, 48, of 72 uur, afhankelijk van het experiment).
  3. Stel het werkstation naar de juiste physioxia.
    Opmerking: Zo zou een 3% O2 instelling vergezeld van 5% CO2 en 92% N2.
    LET OP: Als zuurstof fluctuaties binnen een dynamisch bereik gewenst zijn over een bepaalde tijdlijn, het programma van de planning in het instrument of handmatig de instellingen van zuurstof op de gewenste tijdstippen aan te passen.
  4. Stel de vochtigheid 60%. Het werkstation sfeer is erg droog toch, en de media zullen merkbaar verdampt tijdens lange experimenten (> 48 uur). Houd een media-reservaat in een celkweek kolf binnen het werkstation (zodat de media wordt in evenwicht gebracht met het werkstation atmosfeer) aan de media te vullen in de celkweek dishes.
    LET OP: Elke oplossing die interageren met de cellen voorafgaand aan lysis (zoals PBS en trypsine-EDTA) moet vooraf gedurende 24 uur voor gebruik binnen de hypoxie werkstation zodat de opgeloste zuurstof in evenwicht met de zuurstof in de lucht 36.
  5. Houd cellen in het werkstation tot lysis.

5. Voorbereiden Buffers voor Cap-bindende Assay

  1. Bereid 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS).
    1. In 800 ml dH 2 O, los 8,76 g NaCl en 6,05 g Tris Base.
    2. Breng de oplossing tot een uiteindelijke pH van 7,4 onder toepassing van 1 M HCl.
    3. Breng het uiteindelijke volume tot 1 L met behulp van dH 2 O.
  2. Bereid niet-denaturerende lysisbuffer. Bereid lysis buffer op de dag van de cap-bindingstest. Voeg extra lysisbuffer naar de lege agarose kralen en de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10-gekoppelde bolletjes (stap 7,9 en 7,13) was.
    1. In 7 ml dH 2 O, voeg 160 ul 5 M NaCll, 160 ui 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 ui 200 mM NaF, 40 pl 1 M MgCl2 en 40 pl 1 mM natriumorthovanadaat.
    2. Voeg 40 ul van Igepal de 7 ml oplossing. Snijd de punt van de pipet om halen Igepal aangezien het zeer viskeus.
    3. Meng door op en neer pipetteren of vortex de oplossing 7 ml totdat alle Igepal is opgelost.
    4. Verhoog het eindvolume van de oplossing tot 8 ml en op ijs bewaren.
  3. Bereid 4x natriumdodecylsulfaat (SDS) -PAGE Sample Buffer.
    1. In een bekerglas combineren 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml glycerol en 8 ml dithiothreïtol (DTT).
    2. Voeg 3,2 g SDS en 0,16 g broomfenolblauw. Sta poeder volledig opgelost door mengen met een magnetische roerstaaf.
    3. Aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.

6. Cel Lysis

  1. Bereid niet-denaturerende lysisbuffer en blijf op ijs de dag van the cap-bindingstest.
  2. Voorverwarmen 1x PBS en trypsine in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
  3. Aliquot 980 ul lysis buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis per-cap bindingstest uitgevoerd.
  4. Voeg 10 ul van 4- (2-aminoethyl) benzeensulfonylfluoride-hydrochloride en 10 pl 100x proteaseremmer cocktail aan het 980 pi lysisbuffer. Houd op het ijs.
  5. Gooi de media uit elke 150 mm schotel in een afvalcontainer in de hypoxie werkstation.
  6. Was de cellen met 3-4 ml warm 1x PBS en alle vloeistof verwijderen.
  7. Voeg 1 ml warm 0,05% trypsine-EDTA bij elke schaal en laat zitten gedurende 2 minuten of totdat de cellen niet meer gehecht aan de plaat.
  8. Met behulp van een pipet de cellen van een bord met een 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhalen als nodig, zodat elke plaat van cellen in een afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuis.
  9. Centrifugeer de 1,5 ml microcentrifuge buizen bij 6000 xg gedurende 90 sec to pellet van de cellen.
  10. Zuig het trypsine met een pipet zonder de pellet te verstoren. Indien de pellet wordt verstoord, opnieuw gecentrifugeerd 1,5 ml microcentrifugebuis bij 6000 xg gedurende 90 sec.
  11. Was de cellen met warme 1x PBS door voorzichtig pipetteren 200 ul PBS in de buis boven de pellet. Re-centrifuge wanneer de pellet wordt verstoord.
  12. Zuig het PBS zonder de pellet te verstoren.
  13. Pipetteer 500 ul van 1 ml lysisbuffer bereide oplossing op de eerste cellulaire pellet. Resuspendeer de pellet volledig door en neer te pipetteren.
  14. Combineer de geresuspendeerde cellen met de tweede cel pellet en resuspendeer de tweede pellet door en neer te pipetteren. Herhaal dit totdat alle pellets werden samengevoegd en geresuspendeerd voor elk monster.
  15. Combineer het lysaat met de resterende 500 ul lysis buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  16. Verwijder monsters van de hypoxie werkstation.
    OPMERKING: Na het toevoegen lysisbuffer, eenll daaropvolgende stappen worden uitgevoerd in de lucht als hypoxie werkstation is ingesteld op 37 ° C en de volgende stappen worden uitgevoerd koud (4 ° C of op ijs).
  17. Lyseren de cellen met behulp zacht schudden door rotatie van de monsters bij 4 ° C gedurende 1,5-2 uur.
  18. Centrifugeer de gelyseerde cellen bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om celresten te verwijderen.
  19. Breng het lysaat naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en gooi de pellet.
  20. Reserveren een deel (5-10%) van het supernatant te gebruiken als een totaal cellysaat ingangscontrole toekomstige western blot analyse.

7.-Cap bindingstest

  1. Voor elk monster, overdracht 50 ul van de blanco agarose kraal controle slurry en 50 pl van het γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10-gebonden kralen suspensie 1,5 ml microcentrifugebuizen scheiden. Gebruik een schaar om de punt van de pipet verwijderen om de inning van de kraal slurry te vergemakkelijken.
  2. Pellet de korrels by centrifugeren van de suspensie bij 500 xg gedurende 30 sec.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 500 pl TBS.
  4. Herhaal stap 7.2 en 7.3. Pellet de korrels bij 500 xg gedurende 30 seconden en de bovenstaande vloeistof.
  5. Breng de supernatant dat het lysaat van stap 6,19 naar 1,5 ml microcentrifugebuis met de blanco agarose korrels.
    OPMERKING: De lege agarose korrels fungeren als een pre-clearing stap eiwitten van het lysaat dat niet-specifieke interactie met de parel te verwijderen.
  6. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C onder zacht schudden.
  7. Pellet de lege agarose korrels door centrifugeren bij 500 g gedurende 30 sec.
  8. Breng de lysaat aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml dat de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10 gekoppelde korrels.
  9. Was de lege agarose korrels door resuspenderen de kralen in 500 ul lysisbuffer, pelletiseren de kralen door centrifugeren bij 500 g gedurende 30 sec en gooi de Supernatant. Herhaal dit vier keer voor een totaal van vijf wassingen.
  10. Resuspendeer de blanco agarose korrels in 1 x SDS-PAGE monsterbuffer en kook de kralen voor 90 seconden bij 95 ° C. Bewaar bij -20 ° C voor toekomstig western blot analyse zien of het gewenste eiwit bindt niet-specifiek aan de korrel.
  11. Incubeer het lysaat met γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose C10-gebonden kralen onder zacht schudden gedurende 1 uur bij 4 ° C-cap-bindende eiwitten te vangen.
  12. Pellet de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10 gekoppelde korrels door centrifugeren bij 500 g gedurende 30 sec. Verwijder het supernatant.
  13. Was de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10 verbonden kralen door het herhalen van stap 7.9.
  14. Resuspendeer de kralen in 600 pi lysisbuffer.
  15. GTP aan een eindconcentratie van 1 mM.
  16. Incubeer de γ-aminofenyl-m 7 GTP-agarose parels gekoppeld C10 + 1 mM GTP onder zacht schudden gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opmerking: dezezal distantiëren eiwitten die niet-specifiek interactie met m 7 GTP (dat wil zeggen, ook interactie met niet-gemethyleerd GTP).
  17. Pellet de γ-aminofenyl-m 7 GTP agarose-C10 gekoppelde korrels door centrifugeren bij 500 g gedurende 30 sec.
  18. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 200 ul van 4x SDS-PAGE monsterbuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% broomfenol blauw en 10% glycerol). Bewaar het GTP controlemonster bij -20 ° C voor toekomstig western blot analyse 37. Was de kralen door het herhalen van stap 7.9.
  19. Resuspendeer de kralen in 1 x SDS-PAGE monsterbuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% broomfenol blauw en 10% glycerol), en kookt bij 95 ° C gedurende 90 sec. Bewaar de m 7 GTP-gebonden fractie bij -20 ° C voor toekomstig western blot analyse 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse van Cap-bindend vermogen in reactie op Oxygen van eIF4E en eIF4E2 in een m 7 GTP Affinity Column

Figuren 1 en 2 geven western blots typische m 7 GTP affiniteitszuivering van twee zware cap-bindende eiwitten in reactie op zuurstof fluctuaties in twee menselijke cellijnen: primaire humane renale proximale tubulaire epitheelcellen (HRPTEC) in F igure 1 en colorectaal carcinoom ( HCT116) in figuur 2. Cellen worden gehandhaafd op de aangegeven zuurstofbeschikbaarheid voor 24 uur zodat de opgeloste zuurstof in de vloeibare media is geëquilibreerd met de lucht in de hypoxie werkstation. De ingang baan (IN) vertegenwoordigt 10% van het totaal cellysaat vóór de m 7 GTP-gekoppelde agarose parels worden toegevoegd aan cap-bindende eiwitten te vangen. Deze ingang rijstrook wordt gebruikt als basis om de verrijking te metenvan een doeleiwit in de m 7 GTP pulldown. De GTP lane is het eluaat uit de m 7 GTP kralen die elueren waren met 1 mM GTP. Deze stap maakt de detectie van eiwitten die ook niet-gemethyleerd GTP herkennen. De cap-bindende eiwitten eIF4E en eIF4E2 herkennen m 7 GTP specifiek, maar hun homoloog eIF4E3 (hier niet getoond) bindt ook aan niet-gemethyleerd GTP. Het vermogen van eIF4E en eIF4E2 het 5 'mRNA kapconstructie (m 7 GTP) binden kan worden gemeten door de intensiteit van de banden in de m 7 GTP kolom ten opzichte van de intensiteit van de ingang baan (totaal beschikbare pool).

Deze kwantificering kan worden uitgevoerd door het meten van de pixel intensiteit van de eiwitbanden drie biologische repliceert met beeldanalyse software zoals ImageJ. De resultaten worden uitgedrukt als relatieve middel dichtheidseenheden (RDU) ± standaardfout van het gemiddelde. Onbewerkte waarden voorafgaand aan normalisatievan zowel experimentele en controle monsters werden vergeleken door t-test ongepaarde tweezijdige Student's. P <0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Deze representatief experiment toont aan dat de twee cellijnen verschillende reeksen van zuurstof voor hun eIF4E en eIF4E2 gebruik. Figuur 1 blijkt dat HRPTEC alleen eIF4E bindt sterk aan m 7 GTP 8% O 2 (figuur 1A), die zowel eIF4E en eIF4E2 significant geassocieerd met m 7 GTP 3-5% O 2 (Figuur 1B - C), en dat alleen eIF4E2 bindt sterk aan m 7 GTP 1% O 2 (figuur 1D). In figuur 2, in HCT116 cellen, de zuurstof-afhankelijke gebruik van deze-cap-bindende eiwitten is anders: alleen eIF4E bindt aanzienlijk m 7 GTP bij 12% O 2 (Figuur 2A), zowel cap-bindende eiwitten significant bindt aan m 7 GTP in de 5-8% O 2 range(Figuur 2B - C), en slechts eIF4E2 bindt aanzienlijk m 7 GTP 3% O 2 (Figuur 2D). De afwezigheid van elutie uit de m 7 GTP kolom met GTP blijkt dat eIF4E en eIF4E2 zijn specifiek voor m 7 GTP en niet herkennen niet-gemethyleerd GTP. De staafdiagrammen vertegenwoordigen kwantificering van de drie biologische herhalingen met behulp van ImageJ. Onze resultaten tonen aan dat twee grote-cap-bindende eiwitten, eIF4E en eIF4E2 verschillen in hun vermogen om de mRNA m 7 GTP kapconstructie in een zuurstof-afhankelijke wijze binden.

Op basis van eerdere literatuur die deze twee eiwitten inleiding van de vertaling van unieke klassen van mRNA kan deze verschuiving in-cap bindingsactiviteit leiden tot verschillende Proteoomwijde gegenereerd te passen aan veranderingen in de beschikbaarheid van zuurstof. Deze techniek kan worden gebruikt om nieuwe translatie initiatie factoren die interageren met de 5 'mRNA cap karakteriseren(of met-cap-bindende eiwitten) door middel van een gerichte western blot aanpak of een brede benadering, zoals massaspectrometrie analyse van een m 7 GTP eluaat.

Figuur 1
Figuur 1: eIF4E en eIF4E2 activiteiten elkaar overlappen tijdens physioxia in HRPTEC 3-5% O 2. Capture assays gebruiken m 7 GTP kralen in humane renale proximale tubulaire epitheel cel (HRPTEC) lysaten blootgesteld aan (A) 8%, (B) 5%, (c) 3% of (D) 1% O 2 gedurende 24 uur. GTP, GTP wassen om specificiteit voor m 7 GTP te meten; m 7 GTP, eiwitten gebonden aan m 7 GTP kralen na GTP wassen. Representatieve Western blots worden weergegeven en de gegevens van ten minste drie onafhankelijke experimenten werden gekwantificeerd door ImageJ en uitgedrukt als relatieve dichtheid eenheden (RDU) ten opzichte van 10% ingang (IN) van totaal cellysaat. * P <0,05 (ongepaarde tweezijdige t-toets) beschouwd als een significante verandering bij vergelijking van de verrijking van eIF4E of eIF4E2 in de kap gebonden fractie (m 7 GTP) aan de IN. Data, gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van drie onafhankelijke experimenten. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. en Uniacke, J. Menselijke cellen gekweekt onder fysiologische zuurstof gebruiken twee-cap-bindende eiwitten te onderscheiden mRNAs te werven voor de vertaling. 2016; 291 (20): 24 10.772-82. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. eIF4E en eIF4E2 activiteiten elkaar overlappen tijdens physioxia in HCT116 5-8% O 2. Capture assays gebruiken m 7 GTP kralen in HCT116 humane colorectaal carcinoom lysaten blootgesteld aan (A) 12%, (B) 8%, (C) 5% of (D) 3% O 2 gedurende 24 uur. GTP, GTP wassen om specificiteit voor m 7 GTP te meten; m 7 GTP, eiwitten gebonden aan m 7 GTP kralen na GTP wassen. Representatieve Western blots worden weergegeven en de gegevens van ten minste drie onafhankelijke experimenten werden gekwantificeerd door ImageJ en uitgedrukt als relatieve dichtheid eenheden (RDU) ten opzichte van 10% ingang (IN) van totaal cellysaat. * P <0,05 (ongepaarde tweezijdige t-toets) beschouwd als een significante verandering bij vergelijking van de verrijking van eIF4E of eIF4E2 in de kap gebonden fractie (m 7 GTP) aan de IN. Data, gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van drie onafhankelijke experimenten. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. en Uniacke, J. Menselijke cellen gekweekt onder fysiologische zuurstof gebruiken twee-cap-bindende eiwitten te onderscheiden mRNAs te werven voor de vertaling. 2016; 291 (20): 24 10.772-82. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De analyse van cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan fysiologische zuurstofarme omstandigheden kunnen zorgen voor de identificatie van nieuwe zuurstof gereguleerde translatie initiatie factoren. De affiniteit van deze factoren de 5 'cap van mRNA of andere cap geassocieerde eiwitten kunnen worden gemeten door de kracht van hun associatie met m 7 GTP-gekoppelde agarose parels. Een nadeel van deze techniek is dat het meet de dop bindende eiwitten potentieel van post-lysis, maar het wordt uitgevoerd onder niet-denaturerende omstandigheden die eiwit-eiwit interacties en post-translationele modificaties (PTM) handhaven. Verschillende eiwit-eiwit interacties mediëren de binding van de familie eIF4E aan de 5 'cap. Het 4E-BP bindt en onderdrukt eIF4E door het blokkeren van de interactie met eIF4G en het voorkomen van de rekrutering van de 43S pre-initiatie complex 38. De eIF4E / 4E-BP complex gebonden blijft aan het 5 'mRNA cap, blokkeert elke initiatie van die transcript en kunnenworden gebruikt als marker voor eIF4E remming in m 7 GTP affiniteitskolommen. Omgekeerd kan de interactie van eIF4E met eIF4G op m 7 GTP kolommen een marker voor actieve translatie-initiatie zijn. PTMs zijn een andere werkwijze om de activiteit van translatie initiatie factoren reguleren. Zo kan fosforylatie van eIF4E door Mnk1 zijn affiniteit vergroten van het 5 'mRNA cap 39. Het eiwit modifier gecodeerd door de interferon-geïnduceerde Gene 15 (ISG15) is een PTM dat de cap-bindende activiteit van eIF4E2 in respons op interferon inductie via pathogeeninfectie 40 toeneemt. De ISG15 gen bevat een hypoxieresponselement in zijn promotor suggereren dat dit systeem eIF4E2 kan regelen bij weinig zuurstof. Zeer weinig bekend over hoe PTMs de activiteit van-cap-bindende eiwitten in fysiologisch relevante zuurstofarme omstandigheden kunnen veranderen. Deze techniek, gevolgd door massaspectrometrie analyse kunnen onthullen nieuwe zuurstof gereguleerd en fysiologisch relevante PTMs thbij bemiddelen de activiteit van translatie-initiatie factoren.

Een alternatieve methode voor de weergave met m 7 GTP cap analoog zou zijn om een bekende cap bindend eiwit zoals eIF4E of eIF4G immunoprecipitatie en uitvoeren massaspectrometrie geassocieerde eiwitten te identificeren. Een beperking van deze strategie is dat-cap-bindende eiwitten hebben vaak alternatieve cellulaire rollen, zoals in spanning korrels 41 of cap-onafhankelijke translatie 1,4. Daarom zal het gebruik m 7 GTP cap analogen is de beste, meest betrouwbare methode om cap-bindende eiwitten te isoleren, in het bijzonder bij het onderzoek van nieuwe cap-geassocieerde eiwitten. Een beperking van het gebruik van een m 7 GTP cap analoog is dat sommige-cap-bindende eiwitten zoals de scavenger decapping enzym DCPS niet alleen interactie met de m 7 GTP mRNA cap, maar ook eisen dat de tweede basis voor het binden van 42. Bovendien decapping enzymen in het algemeen, zoals Dcp1 / Dcp2 complex kan hydrolyze m 7 GTP en effectief verminderen van hars capaciteit. Daarom kunnen sommige cap-bindende eiwitten verloren in deze analyse. Om deze waarschuwingen te omzeilen, kan enzymatisch resistent mRNA cap-analogen worden gebruikt. Twee niet-hydrolyseerbare analogen cap, mononucleotide m 7 GpCH2pp of dinucleotide m 7 GpCH2ppA is aangetoond DCP, Dcp1 en Dcp2 43 vangen. Deze mRNA cap-analogen zijn niet commercieel beschikbaar, maar moet chemisch gesynthetiseerd worden. Een andere beperking van dit protocol is dat alleen cap-bindende eiwitten of eiwitten interactie met-cap-bindende eiwitten via 'meeliften' wordt vastgelegd. Terwijl cap-afhankelijke translatie initiatie is de belangrijkste vorm van initiatie, cap-onafhankelijke mechanismen zijn vooral dominant tijdens de voorwaarden van cellulaire stress 1. In de context van deze techniek en opkomende trends op het gebied van translatie initiatie 6-8,24 identificeren nieuwe stressgeïnduceerde factoren participate in cap-afhankelijke initiatie is een veelbelovend gebied van onderzoek.

Een andere factor om te overwegen in dit protocol is zuurstof in de media. Het kweken van cellen in een vloeibaar medium een ​​barrière tussen de cellen en de atmosfeer. Het is aangetoond dat vloeibare media kan tot 24 uur in evenwicht komen met de atmosferische gassamenstelling 36. Daarom moeten cellen worden gekweekt gedurende 24 uur in de gewenste zuurstofbeschikbaarheid voorafgaand aan lysis of de media kunnen worden voorgeconditioneerd indien korter incubaties nodig. Pre-conditionering omvat het handhaven van de media in het werkstation hypoxie ten minste 24 uur in een steriele kolf dat gasuitwisseling mogelijk maakt. Elke zuurstofrijk oplossing geïntroduceerd in de cellen in de hypoxie werkplek snel kunnen veranderen cellulaire signaalwegen, zoals de cap-afhankelijke translatie-initiatie dat wordt in dit protocol wordt onderzocht. Vanwege de gevoeligheid van de zuurstof sensor trajecten in cellen, elke oplossing dieinteractie met cellen voorafgaand aan lysis zoals PBS en trypsine-EDTA moet vooraf worden gedurende ten minste 24 uur. Lysis en post-lysis wasbuffers moet koud worden gebruikt en dus niet voorgeconditioneerd in de 37 ° C hypoxie werkstation. Terwijl sommige zuurstofafhankelijk wijzigingen proteïnen actieve post-lysis kan zijn, worden de koude buffers vereist om enzymatische activiteiten en "shuffling" van eiwit-eiwit of eiwit-RNA-complexen die kunnen leiden tot artefacten te minimaliseren. Een wijziging van dit protocol om strengheid te verhogen kan zijn voor een pre-conditie lysis en post-lysis wash buffers gedurende 24 uur en vervolgens incubeer ze op ijs in het werkstation voor gebruik. Media en buffers dienen niet in de hypoxie werkstation bewaard gedurende meer dan drie dagen omdat deze oplossing door verdamping wordt geconcentreerd. Voor studies langere termijn (> 3 dagen), het aanvankelijke bedrag van cellen gezaaid moet zorgvuldig worden overwogen. Als cellen delen en het oppervlak van de schotel wordt druk,andere belastingen zoals de media verzuring kan invloed hebben op de activiteit van-cap-bindende eiwitten. Op de laatste dag van het experiment moeten de cellen een confluentie van 80-90% hebben.

Er zijn vier kritische stappen in dit protocol: het handhaven van de cellen in de hypoxia werkstation tot lysis, de hoeveelheid gebruikte cellen, wassen van de parels en de niet-gemethyleerd GTP control. 1) Er zijn verschillende methoden om cellen bij weinig zuurstof te handhaven. De meeste van deze zijn kleine kamers die alleen celcultuur gerechten kan houden, maar elke manipulatie of cellyse moet buiten de kamers in de lucht worden uitgevoerd. Onderdelen van de zuurstof sensor zoals hypoxie induceerbare factoren worden geactiveerd of geïnactiveerd in een kwestie van een of twee minuten 35. Daarom, zoals eerder vermeld, de cellen te lyseren in een hypoxia werkstation is kritisch voor de activiteit van de kap bindende eiwitten is geassocieerd met de respectievelijke beschikbaarheid zuurstoftoevoer. 2) Het aantal cellenIn dit protocol (twee 150 mm gerechten) suggereerde is voldoende voor een sterke m 7 GTP interactors zoals het gezin of leden van de eIF4F complex (eIF4A en eIF4G) eIF4E. Meer cellen ten minste vijf 150 mm schalen, konden worden om eiwitten met voorbijgaande interacties of die alleen verbinden met m 7 GTP mRNA dop van eIF4F detecteren. 3) wassen van de bolletjes na te incuberen met het cellysaat kan worden uitgevoerd in een streng en minder strenge wijze. Het protocol hier gepresenteerde een belastende optie waarbij lysis buffer wordt gebruikt om de parels vijfmaal wassen. Als eiwitten met een zwakkere interacties cap-bindende eiwitten van belang zijn, kan men minder wasbeurten uit te voeren en te gebruiken Tris-gebufferde zoutoplossing in plaats van lysisbuffer. 4) Het is belangrijk om vooraf duidelijk het cellysaat met ongeconjugeerde agarose eiwitten die niet-specifieke interactie met de hiel verwijderen sommige cap-bindende eiwitten kan geen onderscheid maken tussen de ware mRNA cap-structuur, gemethyleerd GTP (m7 GTP) en niet-gemethyleerd GTP. Een dergelijk eiwit is het eIF4E homoloog eIF4E3 44. Elueren van de kralen met GTP zal een eiwit dat ook enkelvoudige niet-gemethyleerd GTP, die van belang kunnen zijn te verwijderen. De biologische relevantie van eiwitten die zowel m 7 GTP herkennen en GTP is nog niet volledig worden toegelicht. Dit blijkt duidelijk uit het aantal publicaties betreffende eIF4E3 (een bona fide-cap bindend eiwit met een geconserveerd cap-bindende domein) ten opzichte van de eIF4E en eIF4E2 eiwitten, die herken m 7 GTP uit niet-gemethyleerd GTP.

Deze techniek, zoals gepresenteerd, kan worden uitgevoerd als een gerichte aanpak van m 7 GTP interactors van belang vast te stellen of een brede aanpak van het analyseren van de m 7 GTP eluaat via massaspectrometrie. Verschillende andere technieken kunnen physioxic blootstelling (protocol 4) volgen naar-cap-bindende activiteit te analyseren, zoals subcellulaire fractionering, immunofluorescentie, co-immunoprecipitatie, eennd polysoom analyse. Translationele controle is in opkomst als een gelijke bijdrage aan genexpressie als transcriptie. Met behulp van deze techniek om de activiteit en samenstelling van de-dop bindende complexen te onderzoeken zal licht werpen op hoe cap-afhankelijke translatie initiatie wordt geregeld in reactie op lage zuurstofconcentraties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351, (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14, (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266, (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433, (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564, (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273, (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486, (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32, (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23, (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129, (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21, (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282, (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1, (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273, (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29, (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121, (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25, (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43, (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57, (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92, (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87, (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571, (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99, (1), 394 (2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321, (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15, (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26, (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14, (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18, (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21, (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14, (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18, (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271, (11), 2189-2203 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics