Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

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Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

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Abstract

Introduction

Controle de translação está a emergir como um passo igualmente importante para a regulação da transcrição na expressão do gene, especialmente durante períodos de estresse celular 1. Um ponto focal de controlo de tradução é para o passo limitante da velocidade de início em que os primeiros passos da síntese de proteínas envolve a ligação do factor eucariótico de iniciação 4E (eIF4E) para o 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 'tampão de mRNAs 2 . eIF4E é parte de um complexo trimérico chamado eIF4F que inclui elF4A, uma helicase de ARN, e eIF4G, uma proteína andaime necessário para o recrutamento de outros factores de tradução e os ribossomas 40S 3. Sob condições fisiológicas normais, a grande maioria dos mRNAs são traduzidas por um mecanismo dependente da tampa, mas sob períodos de stress celular, aproximadamente 10% de mRNAs humanos contêm 5 'UTRs que podem permitir a tradução independente de cap iniciação 1,4. tradução dependente de Cap tem sido historicamente sinônimoous com eIF4F, no entanto, variações específicas de estresse dos eIF4F tornaram-se um trending topic 5-8.

Várias tensões celulares causar actividade eIF4E a ser reprimido através do alvo de mamífero do complexo rapamicina 1 (mTORC1). Esta quinase torna-se prejudicada sob estresse, o que resulta no aumento da atividade de um dos seus alvos, proteína do 4E de ligação (4E-BP). Não fosforilada 4E-BP liga-se a eIF4E e bloqueia a sua capacidade de interagir com eIF4G fazendo com que a repressão da tradução dependente de tampão 9,10. Curiosamente, um homólogo de eIF4E chamado eIF4E2 (ou 4EHP) tem uma afinidade muito menor para 4E-BP 11, permitindo que ele talvez para evadir a repressão mediada por stress. Com efeito, caracterizada inicialmente como um repressor da tradução devido à sua falta de interacção com eIF4G 12, eIF4E2 inicia a tradução de centenas de ARNm que contêm elementos de resposta a hipoxia de ARN na sua UTR 3 'durante o stress hipóxico 6,13. Este i activaçãos alcançado através de interações com ligação eIF4G3, RNA motivo de proteína 4 e 2α o fator inducible hipoxia (HIF) para constituir um complexo eIF4F hipóxica ou eIF4F H 6,13. Como um repressor em condições normais, se liga com eIF4E2 GIGYF2 e ZNF598 14. Estes complexos foram, em parte, identificados através de m 7 resinas GTP de afinidade de agarose ligadas. Este método clássico 15 é padrão na área de tradução e é os ensaios de melhor e mais comumente utilizado técnica para isolar complexos de ligação de PAC em puxar para baixo e in vitro de ligação 16-19. À medida que a maquinaria de tradução dependente de tampão está a emergir como flexível e adaptável com partes inter- mudando 6-8,13, este método é uma ferramenta poderosa para identificar rapidamente novas proteínas de ligação ao tampão envolvidas na resposta ao stress. Além disso, as variações na eIF4F poderia ter implicações amplas como vários sistemas modelo eucarióticos parecem usar um homólogo eIF4E2 para as respostas ao estresse taiscomo A. thaliana 20, S. Pombe 21, 22 de D. melanogaster e C. elegans 23.

As evidências sugerem que variações no eIF4F pode não ser estritamente limitado a condições de estresse, mas estar envolvidos na fisiologia normal 24. O fornecimento de oxigénio para os tecidos (em extremidades capilares) ou dentro dos tecidos (medida através de microeléctrodos) varia de 2-6% no cérebro 25, 3-12% nos pulmões 26, 3,5-6% no intestino 27, 4% em o fígado 28, 7-12% no rim 29, 4% no músculo 30, e 6-7% na medula óssea 31. Células e mitocôndrias contêm menos de 1,3% de oxigênio 32. Estes valores são muito mais próximos à hipoxia do que a do ar ambiente, quando as células são cultivadas por rotina. Isto sugere que o que foram previamente pensado como processos celulares específicas de hipóxia pode ser relevante em um ambiente fisiológico. Curiosamente, eIF4F e H eIF4F 24. Baixo oxigênio também impulsiona o desenvolvimento fetal adequado 33 e células geralmente têm taxas mais elevadas de proliferação, a expectativa de vida mais longos, menos danos ao DNA e menos respostas de estresse geral em physioxia 34. Portanto, é provável H eIF4F um factor-chave na expressão de genes selecionados em condições fisiológicas.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para células de cultura em condições de oxigénio fisiológicas fixos ou em um intervalo de flutuação dinâmica que é provável mais representativo do microambiente do tecido. Uma vantagem deste método é que as células são lisadas dentro da estação de trabalho hipóxia. Não é claro como muitas vezes a transição a partir da cultura de células hipóxicas à lise das células é realizada em outros protocolos. As células são muitas vezes removidos em primeiro lugar a partir de uma pequena incubadora ser hipoxiatona lise, mas esta exposição ao oxigénio poderia afectar vias bioquímicas como a resposta celular ao oxigénio é rápido (uma ou duas min) 35. Certas proteínas de ligação PAC necessitem de interações com uma segunda base ou pode hidrolisar o GTP m 7, portanto, alguns interagentes cap podem ser desperdiçada no processo de purificação. Agarose ligada aos análogos cap resistentes enzimaticamente pode ser substituído neste protocolo. Explorando a atividade e composição do eIF4F H e outras variações de eIF4F através do método descrito aqui vai lançar luz sobre os mecanismos de expressão genética intrincados que as células utilizam durante as condições fisiológicas ou respostas ao estresse.

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Protocol

1. Preparativos para Cultura de Células

  1. Comprar ações disponíveis no mercado de células humanas.
    NOTA: Este protocolo utiliza carcinoma colorectal HCT116 e células primárias humanas renais proximais tubulares epiteliais (HRPTEC).
  2. Adicione 500 ml de meio de cultura de HCT116: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), meio de glucose / alta suplementado com 7,5% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S).
  3. Adicione 500 ml de meio de cultura de HRPTEC: meio de células epiteliais suplementado com FBS a 5%, suplemento de crescimento de células epiteliais de 1%, e 1% de P / S.
  4. Preparar 500 ml de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS): NaCl 140 mM, KCl a 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM de KH 2 PO 4. Ajustar o pH para 7,4 e esterilizar em autoclave durante 40 min a 121 ° C.

2. Início de cultura de células

  1. Aspirar cuidadosamente o meio de um prato confluentes 80-90% sem perturbar tele células.
  2. Alíquotas 3-5 ml de 1x PBS por placa de cultura, agite levemente cada frasco para revestir a área da superfície do prato, e cuidadosamente aspirar o PBS 1x. Repita o procedimento para uma segunda lavagem 1x PBS.
  3. Aliquota de 3 ml de ácido etilenodiaminotetra-tripsina a 0,05% (EDTA) em cada placa de cultura e agitar suavemente para revestir uniformemente as células com tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2-3 min.
  4. Transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 4000 xg durante 90 seg.
  5. Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de DMEM completo.
  6. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Calcula quantos não pirogénica e 100 milímetros de poliestireno celular de cultura de pratos são necessárias para alcançar uma densidade de sementeira inicial de cerca de 2.500-5.000 células por cm2.
  7. meio completo pré-quente de cultura celular feito em etapas 1.2 ou 1.3 em um 37 ° C banho de água por 30-45 min.
  8. Descontaminar a garrafa médio e frasco de células com etanol 70%. Deste ponto em diante tudooperações devem ser realizadas de forma asséptica.
  9. Aliquota 6 ml de DMEM completo em tantas placas de cultura de células de 100 mm é necessária para utilizar todo o volume de células congeladas dentro da densidade de sementeira mencionada no passo 2.6.
  10. Transferir o volume de suspensão de células no passo 2.6 calculada para cada um dos pratos de cultura de 100 mm. Rocha cada placa manualmente para distribuir uniformemente as células sobre a superfície da placa.
  11. Colocar a placa de cultura de célula de 100 milímetros semeado na incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Permitir que as células a incubar, pelo menos, 24 h antes de os passos seguintes.

3. Subcultura

  1. Ver cada prato de cultura de células sob um microscópio para determinar a percentagem de confluência celular (% de células que cobrem a área do prato). Retorno células para a incubadora e meio completo pré-quente e 1x PBS. Vá para a próxima etapa se as células são 80-100% confluentes.
  2. Aspirar cuidadosamente o meio passou sem perturbar oAs células em cada placa de cultura.
  3. Alíquotas 3-5 ml de 1x PBS por placa de cultura, agite levemente cada frasco para revestir a área da superfície do prato, e cuidadosamente aspirar o PBS 1x. Repita o procedimento para uma segunda lavagem 1x PBS.
  4. Alíquota de 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA em cada placa de cultura e agite levemente para uniformemente revestir as células com tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2-3 min.
  5. Durante esta incubação, uma alíquota de 10 ml de meio completo em tantas placas de cultura são necessários para obter a densidade celular de 2.500-5.000 células por cm2.
  6. Quando as células terem separado da placa, adicionar rapidamente 3 ml de inibidor de tripsina 1x definido e agitar suavemente o prato durante 1 minuto para assegurar que toda a tripsina-EDTA foi neutralizado.
  7. Transferência das células isoladas em um 15 ml tubo de centrífuga estéril e reserve. Adicionar 3 ml de 1x PBS para o prato para recolher quaisquer células restantes, e transferir o mesmo que para 15 ml tubo de centrífuga.
  8. Agregar as células por centrifugação a 150 xgdurante 5 min.
  9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de meio completo.
  10. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e semear placas de cultura de 150 mm contendo 15 ml de meio completo para se obter uma densidade celular de 2.500-5.000 células por cm2. Use duas 150 mm para cada ensaio de ligação cap.
    NOTA: Oxygen difusão de células através de meios líquidos é dependente do volume 36. Recomenda-se para manter o volume do meio consistente entre as experiências se as células aderentes ou células em suspensão são utilizados. Os meios podem ser pré-condicionado (incubados na estação de trabalho, durante 24 h, como discutido em Discussão) para evitar estas variabilidades em difusão.
  11. Colocar os pratos de cultura semeado na incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Permitir que as células a incubar pelo menos 24 horas antes de prosseguir para as próximas etapas.

4. A exposição Physioxic

  1. Ver as células ao microscópio. para besresultados t, assegurar que as células são 70-80% confluentes para uma exposição de 24 horas, 50-60% confluentes para uma exposição de 48 horas, e 40-50% confluentes para uma exposição de 72 horas.
  2. Colocar as células em hipoxia uma estação de trabalho durante o tempo desejado (24, 48, ou 72 horas, dependendo da experiência).
  3. Defina a estação de trabalho para o physioxia apropriado.
    NOTA: Por exemplo, uma configuração de 3% de O2 seria acompanhado por 5% de CO 2 e 92% de N2.
    NOTA: Se as flutuações de oxigênio dentro de um intervalo dinâmico são desejados ao longo de um cronograma específico, o programa da agenda para o instrumento ou ajustar manualmente as configurações de oxigênio nos intervalos desejados.
  4. Ajuste a umidade para 60%. A atmosfera da estação de trabalho é muito seco, no entanto, e meios de comunicação visivelmente evaporar durante experimentos longos (> 48 h). Manter uma reserva de mídia em uma garrafa de cultura de célula dentro da estação de trabalho (de modo que a mídia está equilibrada com a atmosfera estação de trabalho) para repor os meios de comunicação no dis cultura de célulashes.
    NOTA: Qualquer solução que vai interagir com as células antes da lise (tal como PBS e tripsina-EDTA) deve ser pré-condicionadas durante 24 horas antes da utilização dentro da estação de trabalho de hipoxia de modo que o oxigénio dissolvido se equilibra com o oxigénio atmosférico 36.
  5. Manter as células no interior da estação de trabalho até a lise.

5. Amortecedores preparando para Ensaio Cap-obrigatório

  1. Prepare 1x Tris salina (TBS).
    1. Em 800 mL de dH2O, dissolve-se 8,76 g de NaCl e 6,05 g de Tris Base.
    2. Levar a solução a um pH final de 7,4 utilizando HCl 1 M.
    3. Levar o volume final de 1 L utilizando dH2O
  2. Preparar tampão de lise não desnaturante. Preparar tampão de lise no dia do ensaio de ligação a tampa. Adicione tampão de lise adicional para lavar as pérolas de agarose em branco e o γ-aminofenil-m 7 GTP agarose C10-ligados (passos 7.9 e 7.13).
    1. Em 7 ml de dH 2 O, adicionar 160 ul de 5 M NaCl, 160 ul de 1 M de Tris-HCl pH 7,4, 40 ul de 200 mM de NaF, 40 ul de 1 M de MgCl2, e ortovanadato de sódio 1 mM 40 ul.
    2. Adicionar 40 ul de Igepal-se à solução 7 ml. Cortar a ponta da pipeta para ajudar a recuperar o Igepal, uma vez que é extremamente viscoso.
    3. Misturar por pipetagem para cima e para baixo, ou de vórtice, a solução 7 ml até todo o Igepal foi dissolvido.
    4. Aumentar o volume final da solução de 8 ml e manter em gelo.
  3. Prepare tampão de 4x Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) -Page Sample.
    1. Numa proveta, combinar 16 ml de 1 M de Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml de glicerol, e 8 ml de ditiotreitol (DTT).
    2. Adicionar 3,2 g de SDS e 0,16 g de azul de bromofenol. Permitir que o pó se dissolver completamente, misturando com uma barra de agitação magnética.
    3. Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.

6. Lise Celular

  1. Preparar tampão de lise não desnaturante e manter em gelo do dia do the ensaio de ligação cap-.
  2. Pré-aquecido PBS 1x tripsina e num banho de água a 37 ° C durante 30 min.
  3. Alíquotas de 980 ul de tampão de lise para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada teste de ligação de tampa a ser realizada.
  4. Adicionar 10 ul de 4- (2-aminoetil) benzenossulfonilo cloridrato de fluoreto e 10 ul de mistura de inibidores de protease 100X aos 980 ul de tampão de lise. Manter em gelo.
  5. Descarte a mídia a partir de cada prato 150 mm de um recipiente de resíduos dentro da estação de trabalho hipóxia.
  6. Lavar as células com 3-4 ml de PBS morno 1x e descartar todo o líquido.
  7. Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina quente-EDTA a cada placa e deixar repousar durante 2 minutos ou até que as células não estão aderidas à chapa.
  8. Usando uma pipeta, transferir as células de uma placa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita conforme necessário de modo a que cada placa de células é transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado.
  9. Centrifugar os tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 6.000 xg durante 90 seg tO sedimentar as células.
  10. Aspirar a tripsina usando uma pipeta, sem perturbar o sedimento. Se o sedimento é perturbado, re-centrifugar o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 6000 xg durante 90 seg.
  11. Lavam-se as células com PBS morno 1x pipetando suavemente 200 ul de PBS para dentro do tubo imediatamente acima do sedimento. Re-se o sedimento de centrifugação é perturbado.
  12. Aspirar o PBS sem perturbar o sedimento.
  13. Pipetar 500 ul de 1 ml dos preparados solução tampão de lise sobre o primeiro sedimento celular. Ressuspender o sedimento inteiramente por pipetagem cima e para baixo.
  14. Combine as células ressuspensas com o segundo agregado de células e ressuspender o pellet segunda pipetando cima e para baixo. Repetir este processo até que todos os peletes foram combinadas e ressuspensas para cada amostra.
  15. Combinar o lisado com os restantes 500 ul de tampão de lise em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  16. Retirar amostras a partir da estação de trabalho hipóxia.
    NOTA: Depois de adicionar tampão de lise, all passos subsequentes devem ser realizadas no ar ambiente como a estação de trabalho hipoxia é definido como 37 ° C e os passos seguintes são para ser realizada a frio (4 ° C ou sobre gelo).
  17. Lisar as células, utilizando agitação suave através da rotação das amostras a 4 ° C durante 1,5-2 h.
  18. Centrifugar as células lisadas a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C para remover os restos celulares.
  19. Transferir o lisado para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL e rejeitar o sedimento.
  20. Reservar uma parte (5-10%) do sobrenadante a ser usado como um controle de entrada de lisado de células inteiras para futura análise Western Blot.

7. Ensaio de ligação Cap

  1. Para cada amostra, transferir 50 ul da suspensão de esferas de agarose de controlo em branco e 50 ul da suspensão do grânulo γ-aminofenil-m 7 GTP de agarose-C10 ligado para separar 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Utilize uma tesoura para remover a ponta da pipeta para facilitar a recolha da pasta de grânulo.
  2. Sedimentar as contas bY centrifugação da suspensão a 500 xg durante 30 seg.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente as pérolas em 500 ul de TBS.
  4. Repita os passos 7.2 e 7.3. Sedimentar as pérolas a 500 xg durante 30 seg e remover o sobrenadante.
  5. Transferir o sobrenadante contendo o lisado proveniente de passo de 6,19 para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo as contas de agarose em branco.
    NOTA: As esferas de agarose em branco actuar como um passo de pré-limpeza para remover as proteínas a partir do lisado que não interagem especificamente com o grânulo.
  6. Incubar durante 10 min a 4 ° C com agitação suave.
  7. Sedimentar as pérolas de agarose em branco por centrifugação a 500 xg durante 30 seg.
  8. Transferir o lisado para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo os γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10.
  9. Lavam-se as pérolas de agarose em branco por ressuspensão das pérolas em 500 ul de tampão de lise, sedimentando os grânulos por centrifugação a 500 xg durante 30 seg, e descartando o Supernatant. Repetir este quatro vezes para um total de cinco lavagens.
  10. Ressuspender as esferas de agarose em tampão de amostra em branco 1x SDS-PAGE, e os grânulos ferver durante 90 segundos a 95 ° C. Armazenar a -20 ° C para futura análise de Western blot para observar se a proteína de interesse se liga não especificamente à esfera.
  11. Incubar o lisado com os grânulos γ-aminofenil-m 7 GTP de agarose-C10 com ligações com agitação suave durante 1 hora a 4 ° C para capturar as proteínas de ligação ao tampão.
  12. Agregar as γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10 por centrifugação a 500 xg durante 30 seg. Descartar o sobrenadante.
  13. Lavar as γ-aminofenil-m 7 GTP esferas de agarose ligadas-C10, repetindo o passo 7.9.
  14. Ressuspender as pérolas em 600 ul de tampão de lise.
  15. Adicionar GTP a uma concentração final de 1 mM.
  16. Incubar as γ-aminofenil-m 7 GTP esferas de agarose ligadas-C10 + GTP 1 mM, com agitação suave durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Esteirá dissociar as proteínas que não interactuam especificamente com M 7 GTP (isto é, também interagir com GTP não-metilada).
  17. Agregar as γ-aminofenil-m 7 GTP agarose contas ligadas a C10 por centrifugação a 500 xg durante 30 seg.
  18. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 200 ul de tampão de amostra 4x de SDS-PAGE (Tris 50 mM-HCl, DTT 100 mM, SDS a 2%, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%). Armazenar a amostra de controlo de GTP a -20 ° C para futura análise de Western blot 37. Lave as contas repetindo o passo 7.9.
  19. Ressuspender as esferas em 1x tampão de amostra de SDS-PAGE (Tris 50 mM-HCl, DTT 100 mM, SDS a 2%, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%), e ferver a 95 ° C durante 90 seg. Armazenar a fracção m-7 GTP ligado a -20 ° C para futura análise de Western blot 37.

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Representative Results

Análise da Capacidade Cap-obrigatório em resposta a Oxygen de eIF4E e eIF4E2 em uma m 7 GTP de afinidade de coluna

As Figuras 1 e 2 representam Western blot de m 7 GTP purificação por afinidade típica de duas importantes proteínas de ligação do tampão em resposta a flutuações de oxigênio em duas linhas de células humanas: células primárias humanas renais proximais tubulares epiteliais (HRPTEC) em igura 1 e colorectal carcinoma F ( HCT116) na Figura 2. As células são mantidas na disponibilidade de oxigénio indicada durante 24 horas para assegurar que o oxigénio dissolvido no meio líquido foi equilibrada com o ar no interior da estação de trabalho hipóxia. A pista de entrada (IN), representa 10% de todo o ligado celular antes do m 7 esferas de agarose ligadas a GTP-são adicionados para capturar as proteínas de ligação ao tampão. Esta pista de entrada é usado como uma base para medir o enriquecimentode uma proteína alvo na m GTP 7 suspenso. A pista de GTP é o produto de eluição a partir dos 7 m GTP grânulos que foram eluir com GTP 1 mM. Este passo permite a detecção de proteínas que também reconhecem GTP não-metilada. As proteínas de ligação ao tampão eIF4E e eIF4E2 reconhecer m 7 GTP especificamente, mas o seu homólogo eIF4E3 (não mostrado) também se liga ao GTP não-metilada. A capacidade de eIF4E eIF4E2 e de se ligar a estrutura cap 5 'de mRNA (m GTP 7) pode ser medido por comparação da intensidade das suas bandas na coluna 7 m GTP em relação à intensidade na pista de entrada (total do conjunto disponível).

Esta quantificação pode ser realizada por medição da intensidade de pixel das bandas de proteína por três repetições biológica com um software de análise de imagem, tais como ImageJ. Os resultados são expressos como médias relativas de unidades de densidade (RDU) ± erro padrão da média. valores brutos antes da normalizaçãoa partir de amostras experimentais e de controlo foram comparados pelo teste t não emparelhado de duas caudas de Student. P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Esta experiência representativa que mostra as duas linhas de células possuem diferentes gamas de oxigénio para a sua utilização e eIF4E2 eIF4E. A Figura 1 mostra que, em HRPTEC única eIF4E liga-se fortemente a 7 m de GTP a 8% de O2 (Figura 1A), que tanto a eIF4E e eIF4E2 estão significativamente associados com 7 m GTP 3-5% de O 2 (Figura 1B - C), e que só eIF4E2 liga-se fortemente a 7 m de GTP a 1% de O 2 (Figura 1D). Na Figura 2, em células HCT116, o uso dependente de oxigénio destas proteínas de ligação de PAC é diferente: somente eIF4E se liga significativamente a m 7 GTP a 12% de O 2 (Figura 2A), ambas as proteínas de ligação de tampão liga significativamente a m 7 GTP na gama de 5-8% de O2(Figura 2B - C), e apenas eIF4E2 se liga de forma significativa a 7 m de GTP a 3% de O2 (Figura 2D). A ausência de eluição a partir da coluna de GTP m 7 com GTP mostra que eIF4E eIF4E2 e são específicos para M 7 GTP e não reconhecem GTP não-metilada. Os gráficos de barras representam a quantificação de três réplicas biológicos utilizando ImageJ. Os nossos resultados demonstram que duas principais proteínas de ligação ao tampão, e eIF4E2 eIF4E, diferem na sua capacidade para se ligarem a ARNm m estrutura tampa 7 GTP de uma forma dependente de oxigénio.

Com base na literatura anterior que essas duas proteínas iniciar a tradução das classes únicas de mRNAs, esta mudança na actividade de ligação a tampa pode resultar em diferentes proteomas gerados para se adaptar às mudanças na disponibilidade de oxigênio. Esta técnica pode ser usada para caracterizar factores de iniciação de tradução novos que interagem com o "tampão 5 ARNm(ou com proteínas de ligação cap) através de uma abordagem western blot alvo ou uma abordagem ampla, como análise de espectrometria de massa de um m 7 GTP eluato.

figura 1
Figura 1: eIF4E e eIF4E2 actividades sobrepõem durante physioxia em HRPTEC 3-5% de O2. Ensaios de captura, utilizando m 7 GTP grânulos na célula renal proximal tubular epitelial humana (HRPTEC) lisados expostos a (a) 8%, (B) 5%, (C) ou 3% (D) 1% de O 2 durante 24 h. GTP, lavagem de GTP para medir especificidade para m 7 GTP; m 7 GTP, proteínas ligadas à m 7 contas GTP após lavagem GTP. Western blots representativos são mostrados e os dados de pelo menos três experiências independentes foram quantificados por ImageJ e expressa como unidades de densidade relativa (DRL) em relação a 10% de entrada (IN) de lisado de células inteiras. * P <0,05 (bicaudal teste t de Student desemparelhado) foi considerada uma mudança significativa quando se comparam o enriquecimento de eIF4E ou eIF4E2 na fracção ligada à tampa (7 m GTP) para a EM. Os dados, média ± erro padrão da média (SEM) de três experiências independentes. Esta pesquisa foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. e Uniacke, as células J. humanas cultivadas sob oxigénio fisiológica utilizar duas proteínas de ligação do tampão de recrutar mRNAs distintos para a tradução. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. eIF4E e actividades eIF4E2 sobrepõem durante physioxia em HCT116 5-8% De O 2. Ensaios de captura, utilizando m 7 GTP grânulos em HCT116 de carcinoma colorrectal humano lisados expostos a (a) 12%, (B), 8%, (C) a 5% ou (D) 3% O 2 durante 24 h. GTP, lavagem de GTP para medir especificidade para m 7 GTP; m 7 GTP, proteínas ligadas à m 7 contas GTP após lavagem GTP. Western blots representativos são mostrados e os dados de pelo menos três experiências independentes foram quantificados por ImageJ e expressa como unidades relativas de densidade (RDU) em relação a 10% de entrada (IN) de lisado de células inteiras. * P <0,05 (bicaudal teste t de Student desemparelhado) foi considerada uma mudança significativa quando se comparam o enriquecimento de eIF4E ou eIF4E2 na fracção ligada à tampa (7 m GTP) para a EM. Os dados, média ± erro padrão da média (SEM) de três experiências independentes. Esta pesquisa foi originalmente publicado no Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. e Uniacke, as células J. humanas cultivadas sob oxigénio fisiológica utilizar duas proteínas de ligação do tampão de recrutar mRNAs distintos para a tradução. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A análise de proteínas de ligação de PAC em células humanas expostas a condições fisiológicas de oxigénio pode permitir a identificação de novos factores de iniciação de tradução regulada de oxigénio. A afinidade destes factores para a tampa 5 'do mRNA ou de outras proteínas associadas a tampa pode ser medida pela força da sua associação a 7 m-GTP ligados esferas de agarose. Uma limitação desta técnica é que ele mede o potencial de ligação a tampa de proteínas pós-lise, mas é realizada sob condições não desnaturantes que mantêm as interacções proteína-proteína e modificações pós-traducionais (PTMs). Várias interacções proteína-proteína de mediar a ligação da família eIF4E a tampa 5 '. A 4E-BP liga-se e reprime eIF4E bloqueando a sua interacção com eIF4G e prevenir o recrutamento dos 43S pré-iniciação complexos 38. O complexo eIF4E / 4E-BP permanece ligada ao 'cap 5 mRNA, bloqueando qualquer iniciação de transcrição que, e podeser utilizada como um marcador para a inibição eIF4E em 7 m colunas de GTP de afinidade. Por outro lado, a interacção de eIF4E com eIF4G em 7 m colunas de GTP pode ser um marcador para a iniciação da tradução activo. PTMs são outro método para regular a actividade dos factores de iniciação de tradução. Por exemplo, a fosforilação de eIF4E por Mnk1 pode aumentar a sua afinidade para o mRNA 5 'cap 39. O modificador de proteína codificada pelo gene interferão Estimulada 15 (ISG15) é um PTM que aumenta a actividade de ligação ao tampão de eIF4E2 em resposta a indução do interferão por meio de uma infecção patogénica 40. O gene ISG15 contém um elemento de resposta à hipóxia em seu promotor sugerindo que este sistema poderia regular eIF4E2 em baixa de oxigênio. Muito pouco se sabe sobre como PTMs podem alterar a atividade das proteínas de ligação do tampão durante condições de oxigênio fisiologicamente relevantes. Esta técnica seguida de análise de espectrometria de massa poderia revelar novos regulados por oxigênio e fisiologicamente relevantes PTMs tha mediar a actividade de factores de iniciação da tradução.

Um método alternativo para a captura com um M 7 GTP tampão análogo seria para imunoprecipitar uma proteína de ligação conhecido, tal como tampão eIF4E ou eIF4G e realizar a espectrometria de massa para identificar proteínas associadas. Uma limitação desta estratégia é que as proteínas de ligação cap muitas vezes têm funções celulares alternativos, como dentro de estresse grânulos 41 ou em independente de cap tradução 1,4. Assim, a utilização m 7 análogos cap GTP é o melhor método, mais confiável para isolar proteínas de ligação cap, especialmente quando a investigar novas proteínas associadas capitalização. A limitação da utilização de um m 7 cap GTP analógico é que algumas proteínas de ligação da PAC, como o limpador decapping enzima DCPS não só interagir com o m 7 cap mRNA GTP, mas também exigem a segunda base para a ligação 42. Além disso, decapping enzimas em geral, tais como o complexo DCP1 / DCP2, pode HYDRolyze m 7 GTP e efetivamente reduzir a capacidade de resina. Portanto, algumas proteínas de ligação ao cap podem ser perdido nesta análise. Para ignorar estas advertências, resistentes enzimaticamente análogos cap mRNA pode ser utilizado. Dois análogos não-hidrolizáveis tampão, mononucleótido M 7 GpCH2pp ou dinucleótido m 7 GpCH2ppA foram mostrados para capturar DCPS, DCP1, e DCP2 43. Estes análogos de tampão de ARNm não estão disponíveis comercialmente, mas deve ser quimicamente sintetizados de novo. Outra limitação deste protocolo é que apenas proteínas ou proteínas que interagem com proteínas de ligação cap via "verticalização" de ligação a tampa será capturada. Enquanto dependente da tampa de iniciação da tradução é a principal forma de iniciação, mecanismos independentes de capitalização são especialmente prevalente durante condições de estresse celular 1. No entanto, no contexto desta técnica e tendências emergentes no campo da iniciação da tradução 6-8,24, identificando fatores novos induzida pelo stress que participate na iniciação dependente da tampa é uma área promissora de pesquisa.

Outro fator a considerar neste protocolo é o oxigênio na mídia. A cultura de células em um meio líquido proporciona uma barreira entre as células e a atmosfera. Demonstrou-se que o meio líquido pode levar até 24 horas para equilibrar com a composição de gás atmosférico 36. Portanto, as células devem ser criadas em cultura durante 24 horas na disponibilidade de oxigénio desejada antes da lise, ou os meios podem ser pré-condicionado, se são necessários incubações curtas. Pré-condicionamento envolve a manutenção dos meios de comunicação no local de trabalho hipóxia por pelo menos 24 horas num frasco de cultura estéril que permite a troca gasosa. Qualquer solução oxigenada introduzida para as células dentro da estação de trabalho hipóxia pode rapidamente alterar vias de sinalização celular, como a iniciação da tradução dependente da tampa que está sendo examinada neste protocolo. Devido à sensibilidade das vias de sensor de oxigénio nas células, qualquer solução que iráinteragir com as células antes da lise, tais como PBS e tripsina-EDTA deve também ser pré-condicionadas durante pelo menos 24 h. Lise e lavagem pós-lise buffers deve ser usado frio e são, portanto, não pré-condicionado no C de estação de trabalho hipóxia 37 °. Enquanto algumas modificações dependentes do oxigénio para as proteínas poderia ser activa pós-lise, os tampões frias são necessárias para minimizar as actividades enzimáticas e "embaralhar" complexos de proteína-proteína ou proteína-ARN que poderiam levar a artefactos. Uma modificação para este protocolo para aumentar o rigor pode ser a pré-condição de lise e lavagem pós-lise buffers, durante 24 horas e depois incubar-los no gelo dentro da estação de trabalho antes do uso. Meios e tampões não devem ser mantidos na estação de trabalho hipoxia durante mais de três dias, porque essas soluções irão concentrar-se devido à evaporação da água. Para os estudos de longo prazo (> 3 dias), a quantidade inicial de células semeadas devem ser cuidadosamente considerados. Como as células se dividem e a área da superfície do prato torna-se aglomerado,outros estresses como a acidificação da mídia pode afetar a atividade das proteínas de ligação cap. No último dia da experiência, as células devem ter uma confluência de 80-90%.

Existem quatro etapas críticas no âmbito deste protocolo: manter as células em hipoxia a estação de trabalho até a lise, a quantidade de células utilizadas, lavagem das pérolas, e o controlo não metilado GTP. 1) Existem vários métodos para manter as células em baixa de oxigênio. A maioria destas incluem pequenas câmaras, que pode conter apenas os pratos de cultura de células, mas qualquer manipulação ou a lise de células deve ser realizada fora das câmaras no ar ambiente. Componentes da maquinaria de sensor de oxigénio, tais como os factores de hipóxia indutível são activados ou inactivado em questão de um ou dois minutos e 35. Por isso, como mencionado anteriormente, lisando as células em uma estação de trabalho hipoxia é crítica para garantir a actividade das proteínas de ligação de PAC é associado com a respectiva disponibilidade de oxigénio. 2) O número de célulassugerida neste protocolo (dois 150 pratos mm) é adequado para a forte m 7 GTP interagentes como a família eIF4E ou membros da eIF4F complexo (eIF4A e eIF4G). Mais células, pelo menos cinco pratos de 150 mm, podem ser necessários para detectar proteínas com interações transitórios ou que só associado com a m 7 cap mRNA GTP através eIF4F. 3) lavagem das pérolas após a sua incubação com o lisado celular pode ser realizada de um modo rigoroso e menos rigorosas. O protocolo aqui apresentado oferece uma opção rigorosas onde tampão de lise é usado para lavar as pérolas de cinco vezes. Se as proteínas com interações mais fracas para cap-vinculativo proteínas são de interesse, pode-se realizar menos lavagens e utilizar solução tampão salina Tris em vez de lise. 4) Embora seja importante para pré-limpar o ligado celular não conjugada com agarose para remover as proteínas que não interagem especificamente com o grânulo, algumas proteínas de ligação a tampa não pode diferenciar entre a verdadeira estrutura de cobertura do mRNA, GTP metilado (m7 GTP), e GTP não-metilada. Uma dessas proteínas é o homólogo de eIF4E eIF4E3 44. Eluindo com os grânulos de GTP irá desalojar qualquer proteína que também reconhece GTP não-metilada, que podem ser de interesse. A importância biológica de proteínas que reconhecem tanto GTP m 7 e GTP ainda não foi completamente elucidado. Isto é enfatizado pelas poucas publicações envolvendo eIF4E3 (que é uma proteína de ligação a tampa bona fide com um domínio de ligação ao tampão conservadas) relativamente às proteínas eIF4E e eIF4E2, que reconhecem m 7 GTP de GTP não-metilada.

Esta técnica, tal como apresentado, pode ser realizada como uma abordagem orientada para identificar m 7 interagentes GTP de interesse ou como uma abordagem ampla, analisando o m 7 GTP eluato através de espectrometria de massa. Várias outras técnicas pode seguir a exposição physioxic (protocolo 4) para analisar a atividade de ligação a tampa, como fracionamento subcelular, imunofluorescência, co-imunoprecipitação, umanálise polysome nd. controle de translação está a emergir como um colaborador igual a expressão do gene como a transcrição. Utilizando esta técnica para investigar a atividade e composição dos complexos de ligação cap vai lançar luz sobre como a iniciação da tradução dependente da tampa é regulada em resposta a baixos níveis de oxigênio.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

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