Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Yetişkin Drosophila beyin nöronal devreleri, yüksek beyin fonksiyonları ve karmaşık bozuklukları çalışmak için değerli bir sistemdir. Etkin bir yöntem, beyin temelli çalışmalar kolaylaştıracak küçük sinek kafasından tüm beyin dokusu incelemek için. Burada iyi korunmuş morfolojisi ile yetişkin beyinlerinde basit, tek adımlı diseksiyon protokol açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

İnsan beyni dejeneratif hastalıkların modeli yetişkin beyinlerinde nöronal devreler harita ve yüksek beyin fonksiyonlarının moleküler ve hücresel temelini incelemek için Drosophila kullanarak artan bir ilgi vardır. iyi korunmuş morfolojisi erişkin beyinlerinin bir bütün montaj hazırlığı gibi tüm beyin temelli çalışmalar için kritik, ama teknik olarak oldukça zor ve zaman alıcı olabilir. takip eden işlem aşamalarını kolaylaştırmak için vücudun geri kalan bağlı bozulmamış beyin tutarken Bu protokol, en az 10 s bir yetişkin sinek kafasının kolay öğrenmek için, tek-aşamalı bir diseksiyon yaklaşımı tarif eder. prosedür normalde daha sonra görüntüleme adımla engelleyebilir beyin ile ilişkili göz ve trakea dokuların en temizlenmesine yardımcı olur ve aynı zamanda diseksiyon forseps kalitesine daha az talep yerleştirir. Buna ek olarak, B her iki tarafına görüntüleme için önemli olan bir lamel üzerine monte edilmiş, beyin örnekleri uygun bir çevirme sağlayan basit bir yöntem tarifbenzer sinyal yoğunluğu ve kalitesi ile yağmurlar. Protokolün bir örneği olarak, biz WT yetişkin beyinlerinde dopaminerjik (DA) nöronların ilişkin bir analizi sunması (1118 w) uçar. Diseksiyon yöntemi yüksek etkinlik Drosophila büyük ölçekli yetişkin beyin temelli çalışmalar için özellikle yararlı hale getirir.

Introduction

Yaygın meyve sineği olarak bilinen model organizma Drosophila, uzun zarif genetik araçlar, kısa üreme kez değerlemeye tabi tutulmuştur ve son derece moleküler ve hücresel yollar korunmuş bulunmaktadır. Meyve sineği başarıyla temel sinyal yollarını, çok hücreli organizmaların desenlendirme mekanizmaları yanı sıra nöronal gelişimi, işlevleri altında yatan mekanizmaları ve hastalıkları 1,2 teşrih istihdam edilmiştir. Hücre etiketleme ve görüntüleme teknolojilerindeki son gelişmelerle birlikte, meyve sineği beyin, nöronal devrenin ince haritalama ve öğrenme ve hafıza ve sirkadiyen ritim 1,3 gibi yüksek beyin fonksiyonları, moleküler ve hücresel temelini diseksiyon özellikle güçlü hale geldi 4,5,6,7,8.

Drosophila sisteminin bir avantajı normal bir bileşik veya konfokal mikroskop kullanılarak beyin tüm montaj hazırlanması ve incelenmesini sağlayan nispeten küçük bir boyutudur. This özelliği dolayısıyla bütünün içinde bir çalışılan konu bütüncül bakış ve onun tam geometri hem sağlayarak, tüm beyin dokusunda bağlamında, hücresel ve hücre içi düzeyde nöronal devrenin detaylı anatomik ve fonksiyonel analiz, hatta tek bir nöronu mümkün kılar beyin. Ancak, beynin oldukça minyatür boyutu göz önüne alındığında, aynı zamanda verimli bir yetişkin sinek koruyucu dış iskelet kafa davanın dışında sağlam bir beyin dokusunu diseksiyon teknik bir meydan okuma sunuyor. Çeşitli etkili ve nispeten basit diseksiyon yöntemleri genellikle dikkatli içerir ve adım adım kafa durumda kaldırılmasını ve gözler dahil ilişkili dokuları, trakea ve yağ 9, 10. Bunlar mikrocerrahi diseksiyon yöntemlerinin doğru beyin, hangi detaylı bir şekilde tarif edilmiştir genellikle kolayca zarar görebilir ince iyi hizalanmış ipuçları forseps dayanarak, diseksiyon forseps kalitesi oldukça sıkı talepleri yerleştirin. Dahası, disseke beyinler genellikle separat vardırvücudun geri kalan ed, beyinleri nedeniyle kolayca, küçük boyutları ve işlem tampon maddesi içinde şeffaflığının daha sonra boyanması ve yıkama işlemleri sırasında kaybolabilir. Burada, gövde bağlı disseke beyinleri tutan yetişkin beyinlerinde için, nispeten basit ve kolay öğrenilebilen bir adım diseksiyon protokol açıklar. Diseksiyon işlemi genellikle kolay gibi göz ve trakea gibi beyin ilişkili dokuların en uzak temizler ve kaliteli diseksiyonu forseps ihtiyacını azaltır.

floresan bileşik mikroskop veya konfokal mikroskop altında beyin görüntüleme, ayrıca, uzak floresan ışık kaynağından beynin yan nedeniyle genellikle tüm montaj beyin kalınlığı zayıf bir sinyal ve daha az net görüntüler üretir. Burada, biz de benzer sinyal intensi ile beynin her iki tarafın uygun görüntüleme sağlayan, beyin numunelerinin kolay saygısız sağlayan basit bir montaj yöntemi açıklarty ve kalite.

Bir kanıtı-of-concept yetişkin beyin incelemek için bu yöntemin uygulanması için, biz daha 1118 sinekler w beyinlerinde DA nöronların varlığını incelendiğinde; genellikle transgenik sinekler ve birçok Drosophila çalışmalarında vahşi tipli denetimi oluşturmak için ebeveyn hattı olarak kullanılan bir genotip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Beyin Diseksiyon ve Immunofluorescent Boyama için kullanılır 1. Çözümler

  1. Yetişkin yapay serebral spinal sıvı içinde beyinleri sinek teşrih (CSF): 119 mM NaCl, 26.2 mM NaHCO 3, 2.5 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO 4, 1.3 mM MgCl2, 10 mM glükoz. Kullanmadan önce, gaz% 5 CO 2/95 10% O 2 ile aCSF - 2.5 mM CaCl2 ile 15 dakika ve başak. 0.22 um'lik bir membran filtresinden süzülerek ACSF çözüm sterilize edin.
    Not: Mağaza aCSF 4 ° C'de bakteri bulaşmasını önlemek için. parçalara beyinleri nihai görüntü kalitesi iki diseksiyon çözeltilerinin etkileri ayrıntılı karşılaştırmalar yapılmamıştır, ancak Fly beyinleri Ayrıca, fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisinde kesildi edilebilir.
  2. Normalde bölünüp -20 ° C'de saklanır sabitleyici çözelti olarak 1 x PBS içinde hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA) kullanın.
    Caution: PFA toksik ve korozif ve dikkatle ele alınmalıdır.
  3. parçalara beyinleri immünofloresan boyama sırasında, beyinlerinden son yıkama aşamasından sonra PFA durulama 1x PBS kullanın. 10x PBS stok solüsyonu 1x PBS hazırlayın (1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na 2 HPO 4, ve 18 mM KH 2 PO 4).
  4. parçalara beyinleri immünofloresan boyama esnasında sonraki tüm yıkama adımları için 1x PBS (1 x PBT)% 0.3 Tween-20 kullanımı.

Yetişkin Fly Başkanları 2. Mikrocerrahi Diseksiyon

Not: diseksiyon işlemi, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

  1. CO 2 ile yetişkin sinekler uyutmak. 5 s - Forseps kullanarak, bir sinek pick up ve kısaca 3% 70 etanol içinde batırarak kendi manikür Dewax. Bu aCSF veya 1X PBS diseksiyon çözeltisi batırılır zaman hiçbir kabarcıklar sinek manikür uymasını sağlar.
  2. Altındaeller tarafından bloke olmayacak bir açıda bir ışık kaynağı ile diseksiyon mikroskobu, sinek (1.2x büyütme) net bir görüş elde etmek objektif lens ayarlayın. Hayvan hareketsiz ve Şekil 1A gösterildiği gibi karın, yukarı bakacak şekilde soğuk diseksiyon çözüm içine sinek batırmak için dominant olmayan el ile forseps kullanabilir.
  3. 160 forseps tutmak - anında karın üzerine küçük bir kuvvet uygularken, diseksiyon levhasına göre 170 ° bir açı (Şekil 1A oklar olarak gösterilmiştir). Bu adım sinek hareketsiz ve 15 geriye doğru başını hareket ettirmek için zorlar - 25 ° yukarı burnumun uzatırken. Bu süreçte, manikür yumuşak ve saydam bölge, burnumun altında, belirgin hale gelmelidir. Büyütme artırmak ve bu bölgede üzerine odak düzlemi ayarlayın.
    Not: çok sıkı forseps tutmayın, ama yeterince yerine sadece firma stabilize etmekSinek. Çok fazla kuvvet iç organlar solüsyon içine yırtılmasına neden olur.
  4. tutma elden basınç bırakıldığında forseps açık bahar böylece, forseps ipuçları hafif dirençli kuvvet üretecek olan ipuçları kapalı böylece diseksiyon forseps, basın baskın elinizi kullanın. Şekil 1B gösterildiği gibi, sinek tutan forseps dik forseps yerleştirin.
    1. Pierce Şekil 1B kırmızı okla gösterildiği gibi burnumun altında manikür yumuşak ve saydam bölgeye diseksiyon forseps kapalı ipuçları. Çok derinden beyni değecek forseps nüfuz önemlidir. Doğru beyin görünür hale gelmelidir. dominant olmayan el ile sinek istikrarlı bir şekilde tutun.
  5. Çabuk ama sürekli t kendi kuvveti ile diseksiyon forseps ipuçları bırakın ve koparmak için bu sürümden ivme güveniyorO Exoskeleton sinek kafasını çevreleyen. Görünür hale gelmelidir uygun sağlam bir beyin (hemen Şekil 1C alt forsepsi ucu yukarıda beyaz doku) (Şekil 1C gösterilen dışa kırmızı oklar olarak gösterilmiştir) yayımlanan forcep ipuçları ivme rehberlik etmek için bir hayali çizgiyi takip edin. Bu hafifçe Exoskeleton kaldırmak ve beyin beyin ilişkili göz ve trakea en olacaktır. Doğru zamanlama ve kuvvet dış iskelet araştırmacının deneyimine bağlı olacaktır açmak için başvurdu.
    Not: Bu Diseksiyon sırasında en kritik adımdır. Açık beyin bırakarak vücudun geri kalanına bağlı kalırken Exoskeleton kaldırmak için açılış forseps ivme oluşturulan doğal kuvvet güvenmek önemlidir.
  6. dikkatle, beyaz elyaf yapıları gibi görünen trakea olarak kalan aksesuar dokuları, kaldırmak için baskın el forseps kullanın remaining beyin bağlı. çekin veya uygun beyin zarar vermemek için dikkatli olun.

Brain 3. Immunofluorescent Boyama

  1. 60 dakika - 40% 4 PFA yaklaşık 1 mL ilişkili gövdeleri olan parçalara beyin örnekleri saptamak.
    Not: Bu ve sonraki adımlar için düzgün çözelti örnekleri karıştırmak için bir nutator örnekleri ile tüpler veya plakalar tutun.
  2. 3 kez aşağı çözümü yukarı pipetleme 1x 1 mL PBS ile durulayın. uzak beynini aspire için dikkatli olun.
  3. 5 dakika her biri için 1x PBT ile 5 kez yıkayın. inkübasyon sırasında nutator örnekleri tutun.
  4. 4 ° C'de / uygun seyreltme O'da primer antikorlar ile N inkübe edin.
  5. Ertesi gün, birincil antikorlar kaldırmak ve 1x PBT numuneleri 5 kez yıkayın. Her yıkama arasında 1x PBT çözeltisi içinde 10 dakika - 5 için örnek bırakın. inkübasyon sırasında nutator örnekleri tutun.
  6. yıkanmış inkübeÖnerilen seyreltme ve kuluçkalama süresi ile uygun bir ikincil antikorlar örnekler.
  7. Her yıkama arasında 10 dakika inkübasyon ile 1x PBT numuneleri altı kez yıkayın.
    Bu aşama, spesifik olmayan bir örnek bağlanmış ikinci antikorun çıkarılması için kritiktir.
  8. 30 dakika süre ile 1x PBT çözeltisi içinde 1 mg / ml 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 10,000 seyreltme: 1 içinde inkübe edin. DAPI DNA'nın en bölgelerine bağlanır ve beynin genel morfolojisi ortaya çıkarmak için kullanılabilir bir DNA boyadır.
  9. 1x PBS ile üç kez yıkayın.
  10. Transfer diseksiyon çanak örnekler ve forseps kullanarak bir diseksiyon çanak kurumlardan beyinleri ayırın.
  11. boyama ve yıkama adımlarından sonra, ikisi arasında lamelleri içinde beyinleri montaj ve montaj slayt üstüne lamelleri yerleştirin. Beynin her iki taraf da benzer bir sinyal yoğunluğu ile görüntülenebilir böylece bu yolla, beyin numuneleri kolayca saygısız olabilir.
  12. bir montaj slayt üstüne bir 18 x 18 mm'lik bir örtücü cam yerleştirin. Bir bıçak ile bir pipet açılmasını genişletmek ve 18 x 18 mm lamel üzerine 1x PBS çözüm beyinleri aktarmak için kullanabilirsiniz.
  13. anti-solmaya montaj orta 40 uL (% 0.2 (99.5 w / v) n-propil galat - Başka 20, lamel ortasında beynini koyun ince pipet ile beyinleri etrafında sıvı kaldırmak ve sonra da eklemek beyinleri üzerinde% ACS derecesi gliserol).
    Not: orta eklenen montaj miktarı incelendiğinde beyinleri sayısına bağlıdır.
  14. dışa viskoz montaj orta yerinden hafifçe beynini yayıldı. Bu temas edinceye kadar ilk taraftan slayt düşürerek beyin üzerine ikinci bir 18 x 18 mm'lik bir örtücü cam yerleştirinMontaj kayma yüzeyi ve sonra yavaş yavaş hava kabarcıkları ile beyin temasını en aza indirmek için diğer tarafı düşürücü.
    Not: montaj orta hacmi iki lamelleri arasındaki bir ara parçası kullanmak ve beyinleri, iki lamelleri ayırmak için yeterli bir alan sağlamak için hiçbir gerek yoktur.
  15. slaytlar yerleşmek için izin verin. Bir laboratuvar doku ile makbuzları taraftan çıkıp aşırı sıvı çıkarın.
  16. taşıma sırasında montaj slayt düşmesini monte beyinleri ile lamelleri önlemek için, montaj slayt lamelleri eklemek için bant küçük bir parça kullanın.
    Not: Brain monte slaytlar hemen görüntülü veya slaytları mühür herhangi bir dolgu macunu kullanmak için bir gerek olmadan, floresan sinyalinin önemli bir kayıp olmadan en fazla bir hafta boyunca 4 ° C de muhafaza edilebilir arasındadır. lekeli beyinleri uzun vadeli korunması için, iki slip yan w kapalı olabiliri tırnak içinde lehçe ve depolanan -20 ° C derin dondurucuda, lekeli beyinleri zamanla sinyallerini kaybedebilirsiniz rağmen. Bu tavsiye edilmez.
  • görüntü beyinleri uygun bir bileşik floresan mikroskop veya konfokal mikroskop kullanın.
    1. İlk olarak, hedefe daha yakın beynin yan görüntü elde ve daha sonra dikkatlice ortasında sıkışmış örnekleri var lamelleri çevirin. Bu adım aynı beynin diğer tarafında görüntü elde kolaylaştırır.
    2. (Örnek olarak, bir dik bir bileşik floresan mikroskobu ve görüntü 20X objektif lens tüm beyin (Şekil 2'de örnekler) ve bu Eşleştirilmiş anterior medial (PAM), küme bölgesinde DA nöronlar gibi beyin görüntü küçük bölgeler, bir 40x objektif kullanarak Şekil 3'te).
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Yukarıda tarif edildiği gibi Şekil 1, yetişkin beyin diseksiyonu için ana prosedürleri gösterir 2 Şekiller ve 3 3 günlük bir WT temsilcisi görüntüler. (Genotip: 1118 w) yetişkin tirozin hidroksilaz karşı bir antikor ile costained edildi beyinleri, sinek (TH Şekil 2'de, kırmızı renkli ve Şekil 3) beyaz bir belirteç, genellikle tüm farklılaşmış nöronların seyahati hücre çekirdekleri ve Elav proteinine karşı bir antikor, bir işaretleyici etiket DNA boyası DAPI ek olarak, DA nöronlar 11 etiketlemek için kullanılan sinek birlikte beynin genel yapısını ortaya, hangi (yeşil renkli).

    1 200 Seyreltme ve sıçan anti-Elav antikoru: Şekiller 2 ve 3'te, birincil antikorlar için, Bir 1 tavşan anti-TH antikoru kullanılan 100 seyrelti, WHICH spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için% 5 normal keçi serumu ile 1 x PBT hazırlanmıştır. 1x PBT: 500 oranında seyreltilmiş sekonder antikor için, 1 Alexa Fluor 488-konjuge keçi-anti-fare antikor ile AlexaFluor596-konjuge keçi anti-tavşan antikoru kullanılır.

    beyinleri görüntü için, biz beyinde ilgi bölgenin bütün derinliği kapsayan beyin dilimleri Z-yığın görüntüleri elde etmek için bir Apotome fonksiyonu ile donatılmış dik bir bileşik floresan mikroskop kullanılır. Örneğin, tüm beyin DA nöronların genel dağılımı net bir görüntü elde etmek için, ayrı ayrı görüntü aynı beynin ön ve arka kenarları (Şekil 2), bir 20X objektif lens kullanılır. 25 mikron toplam - Beynin her iki tarafında derinliği tüm DA nöronları kapağı olabilir bu konuda 20 olduğunu görüntülenmiş. güvenilir küçük hücre boyutları ve zayıf TH si var PAM küme bölgede DA nöronlar, görselleştirmek ve ölçmek içingnals (aşağıya bakınız), bir 40X objektif lens kullanılır. PAM küme bölge (Şekil 3c) bir 3D rekonstrüksiyon optimum görüntü kalitesi sağlanmış her görüntülü dilim arasında 1 um, - Ayrıca, ticari yazılım Z-serisi elde etme fonksiyonu, biz 0.5 kesit kalınlığı seçilir. 10 mikron toplamda - bütün DA nöronları kapsayan beyinde PAM küme kalınlığı yaklaşık 8'dir. Bizim tecrübelerimize göre, Apotome fonksiyonu önemli ölçüde böyle bir bütün beyin veya PAM küme bölge gibi yüksek bir arka plan, kalın örnekleri görüntüleme gürültü sinyali azaltabilir.

    Şekil 2F-J, beynin iki taraf arasında sinyal yoğunluğu benzer bir seviye göstergesi beyin örnekleri, tutun lamelleri çevirme sonrası aynı beynin arka görünüşünü göstermektedir, oysa Şekil 2A-D, bir beynin ön görünümünü göstermektedir her üç görüntülü kanalları. DA neurons, erken atama 11 aşağıdaki farklı kümeler halinde gruplandırıldı biz PPM1, PPM2 ve beynin ön tarafında PPM3 kümeleri ve Arka Yanal Eşli isim (PPL dahil Posterior Medial (PPM) Eşleştirilmiş adı kullanmak burada rağmen beyaz şov anterior ve yüksek büyütme aynı beynin arka görünümlerinde Şekil 2E ve 2J. Şekil 2E ve 2J gösterildiği gibi) dA farklı gruplar ortaya, beynin posterior tarafında PPL1 ve pPL2 kümeleri kapsayacak şekilde beynin her iki yüzüne de nöronlar. Beyaz çizgiler beyin (Şekil 2E) yanı sıra PPL ve beyin (Şekil 2J) posterior tarafında PPM kümeleri ön tarafında belirgin PAM ve Eşleştirilmiş Ön Yanal (PAL) kümeleri vurgulamak kesik.

    Şekil 3A ve 3B, bir w 1118 sinekler DA kümelerin bazı ölçümü sonuçlarının özetleri yeniden. Biz DA nöronlar dilim tarafından dilim ve aynı zamanda 3D gelen kesin olmayan sayım en aza indirmek olmalıdır görüntüleri, yeniden sayılır. Biz 3 gün yaşlı w 1118 sinekler genel beyin başına PPM kümede 27 DA nöronların ortalama olduğunu tahmin yarımkürede başına PPL kümede 16 DA nöronlar, yarımkürede başına PAL küme (Şekil 3A) 5 DA nöronlar, ve PAM kümeleri (Şekil 3B) her 97 DA nöronlar. Şekil 3C, bu bölgedeki tüm DA nöronları kapsayan yüksek büyütme görüntüleri dilim yansıtılan PAL ve PAM kümeler halinde DA nöronları, temsili bir 3D rekonstrüksiyon olduğunu. Böyle PAL gibi diğer kümelere kıyasla, PAM kümede DA nöronlar nispeten daha küçük hücre boyutları ve zayıf TH boyama sinyalleri açıktır.

    "Src =" / files / ftp_upload / 55128 / 55128fig1.jpg "/>
    Şekil 1:. Yetişkin Drosophila Beyin için Diseksiyon Protokolü Grafik İllüstrasyon (A) Sinekler yukarı ventral tarafta konumlandırılmış ve non-dominant el kullanarak toraks tarafından tutulur. Kuvvet yavaşça aşağıya beyaz şeffaf bölgeyi açığa sinek kafası ve burnumun hafif dışa doğru uzantısı geriye eğmeyi ikna etmek için forseps (kırmızı oklar) uygulandı. Dominant elin (B) Forseps sığ bir kesi (kırmızı ok) oluştururken, burnumun altında şeffaf bölgede eklenir. Kullandığımız forseps çok ince uçlu uçları yok unutmayın. Kırmızı oklarla gösterildiği gibi (C) Forseps, kendi gücü ile dağılmayacak izin verilir. Forseps açarak oluşturulan momentum nispeten temiz Drosophila beyin açığa gözleri ve dış iskelet kaldırır. Trakea çoğu işleminde uzaklaştırılır. ( Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    şekil 2
    Şekil 2:. DA Nöronlar (20X Amaç Edinilmiş) Yetişkin Erkek Drosophila B yağmur anti-Tirozin hidroksilaz (TH) Antikor ile Açığa Bu rakam disseke yetişkin beyinlerinde temsilcisi görüntüler içeriyor, beyin bölgenin Z-yığılmış görüntüleri kullanarak yeniden bileşik floresan mikroskop ile elde edilen faiz. (AE) ön ve (FJ) aynı yetişkin beynin posterior görüşleri; (A & F) Cep çekirdekleri DAPI boyama (beyaz) ve w (C & H) nöronlar tarafından görüntülendiere pan-nöronal belirteç anti-Elav antikorlar (yeşil) etiketli; (B & G) DA nöronlar anti-TH antikorları (kırmızı) ile ortaya çıkar. (D & I) DAPI, TH ve Elav tedavisi için görüntülerin Yerleşimi. (E & J) beyaz gösterilen DA nöronları ile beyin bölgelerinin Genişletilmiş görünümü. Kesik çizgiler beynin posterior beyin ve PPL ve PPM kümelerinin anterior PAL ve PAM kümeleri vurgulayın. Ölçek çubuğu tüm panelleri 50 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    (40X Amaç Edinilmiş) 1118 sinekler w Erkek yetişkin Brain cinsinden Şekil 3. Kantitasyonu DA Nöronlar. (A ve B) DA n sayısallaştırılmasıAnti-TH boyama ile ortaya 1118 sinekler w gün 3 erkek eurons. Veri aykırı olarak minimum ve maksimum değerleri gösteren bıyık kutu araziler tarafından temsil edilir; hem de ilk (Q1) olarak, ikinci (Q2) ve üçüncü (Q3) çeyreklik. İkinci çeyrek ortalama değer olarak temsil edilir. (A) PPM {(n = 28) Min: 21, S1: 24, Ortalama: 27, Q2: 30, Max: 32}, PPL {(n = 26) Min: 10, S1: 12, Ortalama: 16, S2: 18, Max: 25}, ve PAL {(n = 24), Min: 2, S1: 4, Ortalama: 5, S2: 5, Max: 10} kümeleri; (B) PAM kümesi {(n = 20) Min: 86, S1: 94, Ortalama: 97, Q2: 97, Max: 99}. 3 d 1118 sinekler w erkek PAM ve PAL kümeleri DA nöronları gösteren (C) bir temsilci projeksiyon görüntüsü. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    İnsan beyni hastalıkları, nöronal devreleri, ve yüksek beyin fonksiyonlarını incelemek için yetişkin Drosophila beyin kullanarak artan bir ilgi ile, orta serili için özellikle önemlidir tam montaj analizleri, bozulmadan sinek beyinleri elde etmek basit ve hızlı yöntemler geliştirilmesi gerekmektedir beyin temelli ekranlar ölçek. Bizim yöntem basit ve kolay öğrenirler bir sinek kafası dışarı incelemek için bir yaklaşım (genellikle tecrübesi ile en az 10 s) iyi korunmuş morfolojisi ile büyük ölçüde ilişkili dokuların temizlendiğinden emin sağlar. disseke beyinleri hala sinek organları geri kalanına bağlı olduğundan, genellikle hızlı bir şekilde örnek tüpünün dibine çöker ve yıkama ve boyama adımları sırasında tanımak ve toplamak kolaydır. Bu anlamlı küçük fiziksel boyutları beyin örneklerini işleme önemli bir sorunu olabilir örnek kaybını en aza indirir. Bu sorun büyük ölçekli çalışmalar için özellikle önemli olabilir. Beyin kolayca vücut ayrılabilirmontaj öncesi boyama işleminin tamamlanmasından sonra.

    Diseksiyon sırasında, doğru sinek konumlandırmak sinek kafasından Exoskeleton çıkarırken doğru açıları korumak ve yavaşça her adımı gerçekleştirmek için uygun bir kuvvet uygulamak önemlidir. Forseps sinek (Şekil 1B) kesilmesini önlemek için birbirine dik yerleştirilmiş önerilir. Şekil 2'de temsili görüntüleri de gösterildiği gibi, bu protokolü kullanılarak hazırlandı beyinleri tatmin edici sonuçlar vermektedir. Bu örnekte, yetişkin beyinlerin PAM kümede DA nöronları üzerinde duruldu. Ortalama bir Drosophila beyin farklı projeksiyon desen ve fonksiyonel çıktıya 11, 12, beynin farklı bölgelerinde farklı kümelerde dağıtılır protocerebrum başına yaklaşık 280 DA nöronların toplam sahiptir. Yetişkin Drosophila beyinleri, ajanlar dahil olmak üzere DA nöron mi karakterizasyonung böyle parkin mutantlar insan hastalık genlerinin modelleri sinek, büyük ölçüde PAL odaklanmıştır, nispeten büyük hücre boyutları ve TH, etiketleme DA nöronlar 13-18 için kullanılan standart yapımcısı belirgin ifade var PPL ve PPM kümeleri.

    Bununla birlikte, uçucu beyinde DA nöronlarının çoğunluğu küme başına yaklaşık 100 da nöronlarla PAM kümeler halinde bulunurlar. Diğer DA kümeler hücrelere kıyasla, PAM küme DA nöronlar, normal olarak tirosin hidroksilaz ekspresyonu ve daha küçük hücre boyutlarına sahip daha küçük bir seviyesini gösterir. konfokal görüntüleme olmadan, bizim diseksiyon ve boyama protokolü hazırlanan örneklerde, PAM kümede DA nöronlar açıkça görülebilir ve bir bileşik floresan mikroskop kullanılarak yüksek kalitede görüntülenmiş. onun çok sayıda göz önüne alındığında, farklı genetik geçmişleri PAM kümede DA nöronlarının miktar daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilir. Biz düşündürmektedir PAM işçiliği birimleri DA nöronlarter DA biyoloji okuyan ve Parkinson hastalığı gibi DA-bağlantılı bozukluklar, modelleme için yararlı bir sistemi temsil eder.

    bizim deneyim, biz önemli ölçüde özellikle bütün yetişkin sinek beyin gibi önemli kalınlıkta örnekleri, incelerken, arka plan sinyalini azaltabilir kullanılan mikroskop Apotome fonksiyonu. konfokal mikroskop fazla ayrıntı, yüksek büyütme ve daha kaliteli görüntüler üretebilir rağmen, genellikle zaman alıcı ve maliyetlidir. Bu tür açık 3D rekonstrüksiyon ve Dekonvolüsyonun analizi için Z-yığın bölümünün dizi gerektiren yetişkin beyinlerinde kalın örneklerin çok sayıda görüntüleme için özellikle doğrudur. Bu çerçevede, Apotome fonksiyonu yeterli kalitede görüntüler üretmek için hızlı ve düşük maliyetli bir alternatif temsil (örneğin, Şekil 2 ve 3'te görüntüler).

    Beyin çalışmalarda, iki Si görüntü hücrelere çoğu zaman gereklidiraynı beynin des. Örneğin, DA nöronlar beynin ön ve arka tarafına hem de kümeler halinde mevcuttur. Bir beyin slayt üzerine monte edildikten sonra görüntülü Ancak, nedeniyle kalınlığı, uzak ışık kaynağından yan (yani, montaj slayt bakan tarafı) genellikle normal bileşik ve konfokal kullanarak zayıf sinyaller ve daha az net görüntülere yol açar mikroskoplar. İki kapak slaytlar arasında örnekleri monte edilmesi sayesinde, monte slayt ve benzer sinyal yoğunlukları aynı beynin her iki sonraki görüntüleme numunelerin uygun bir ters yuz sağlar. Şekil 2 her iki tarafından görüntüleme DA nöronların bir örnektir nispeten karşılaştırılabilir sinyal yoğunluğu ve görüntüleme kalitesini gösterdi bu yöntemi kullanarak beyinleri sinek.

    Yetişkin sinek beyinleri diseksiyon için çeşitli kolay takip yaklaşımları güzel olmuş 9, 10 tarif var. Bizim yaklaşımımız kürk can alternatif bir yöntem sağlarther yetişkin diseksiyon ve boyama işlemleri beynini sinek basitleştirmek. Daha geniş ölçekli çalışmalar tüm beyin nöron devrelerini yanı sıra moleküler ve hücresel bileşenleri haritaya yürütülen sayesinde, otomatik diseksiyon ve görüntüleme yaklaşımları yüksek verimli genetik ve ilaç ekranları gerçekleştirmek için yetişkin Drosophila beyinleri için geliştirilmiş olabilir öngörülebilir Bu klasik genetik modelinde in vivo.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Biz projeye büyük destek Sayın Enes Mehmet, Bayan Kiara Andrade, Bayan Pilar Rodriguez, Chris Kwok ve Bayan Danna Mü'min kabul.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
    PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
    NaCl Fisher Scientific S640-500
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
    Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
    Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
    Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
    D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
    Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
    EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
    Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
    Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
    Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
    Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
    Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
    Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
    Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
    DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
    Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
    Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
    Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
    Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
    Zen lite software Quote

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
    2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
    3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
    4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
    5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
    6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
    7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
    8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
    9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
    10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
    11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
    12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
    13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
    14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
    15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
    16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
    17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
    18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics