フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ:
1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Published 2/11/2017
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Summary

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Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

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Abstract

Introduction

CFは、上皮陰イオンチャネルをコードする嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)遺伝子の変異によって引き起こされます。 CFは、全世界で約85,000人1に影響与えます 。 2,000 CFTR変異が同定されている( www.genet.sickkids.on.ca )。この多様性は、部分的に観察された疾患表現型(広範囲の説明www.CFTR2.org )2、3。 CFTR突然変異の6つのクラスは、CFTRタンパク質の発現と機能に及ぼす影響に基づいて定義されている:(I)NO合成、(II)損なわれ、人身売買、(III)、不良チャネル開閉、(IV)変更されたコンダクタンス、通常の(V)減少したレベルCFTRの機能、および(VI)損なわれ、細胞表面安定4。臨床状態と共通のCFTR突然変異がよく研究されていますが、CFTR機能と関係poorl残りますyは特に希少な「孤児」変異(の大規模なグループのために、個々のレベルで理解www.CFTR2.org )1、3。

最近では、薬物は、突然変異特異的にCFTRタンパク質を標的と開発されています。 CFTRタンパク質を標的とする2つのクラスの薬物は、現在臨床で使用され、異なる作用様式を有します。このようなVX-770などの増強、頂端局在変異CFTRのオープン確率を高め、セル5への添加時に直接作用します。このようなVX-809のような補正器は、小胞体局在ミスフォールドCFTRの人身売買を復元し、効果は6観察される前に、細胞とのプレインキュベーションを必要とします。 CFTR増強、VX-770は、同様に他の8の場合と同様に、G551D変異7、8の被験者のために登録されていますCFTRは、S1251N 9を含む、変異をゲーティング。一緒に、これらの変異は、すべてのCF科目の5パーセントによって運ばれています。他の臨床試験では、VX-770、補正VX-809と組み合わせたが、肺機能にはまだかなりの影響を制限していることが示された患者10の百分の45から50によって運ばF508del突然変異についてホモ接合性の被験者における増悪率の減少を引き起こすしています11。

CF患者の残りの50%以内の薬物応答性被験体を同定するために、従来の臨床試験では、コストと時間がかかり、非常にまれなCFTR遺伝子型を持つ個人のために実行可能ではありません。小説、費用対効果の高い、パーソナライズされた方法は、CFTR突然変異のいずれかのタイプを運ぶ個人へのCFTRモジュレーターの増加数と一致することが重要です。今までは、特定のCFTR変異を有する患者群のトライアル含めることは、hでの変異CFTR遺伝子のトランスフェクションを用いた研究によって導かれていますチャンバー5、6、12アッシングで電気生理学的研究に続いeterologous電池システム、。適切なCFの動物モデルの不足のために、CF肺の外植片の材料から誘導される空気-液体界面分化気管支上皮細胞における薬効研究は、薬物開発の13、14、15のために使用されています。しかし、肺の外植組織や侵襲的処置の限られた利用可能性はあまり一般的CFTR突然変異の分析を妨げる末期疾患のない被験者からの気管支細胞を取得し、パーソナライズされたファッションで薬物検査を防止することができます。これらの制限を克服するために、人工多能性幹細胞から誘導される大腸オルガノイド、鼻の気道細胞、および気道の細胞のような「簡単なアクセス」組織は、現在、パーソナライズされた薬物治療のために検討されています。

16、17の形で任意の胃腸器官からの培養上皮幹細胞へのプロトコルを確立しました。ヒト結腸/直腸のために、培養条件は、小分子(ニコチンアミド、A83-01と組み合わせ定義された成長因子(上皮増殖因子(EGF)、ガストリンは、Wnt-3A、Rスポンジン3(Rspo3)、及びノギン)を含みます基底膜マトリックスおよびSB202190)。これらの条件下では、単一の幹細胞または小さな組織フラグメントは、閉じた、嚢胞性に外側に向い、その基端側で高い偏上皮によって形成された3D構造を成長させます。すべての細胞型は、典型的には、それらの正常な比率と位置で表示されます。オルガノイドは、毎週の機械的破壊と再メッキにより長期間にわたって拡張することができます。それらは、遺伝的および表現型的に安定であり、長期的な拡大、バイオバンキング17を可能する、保存することができます。彼らはに適しています2Dセルライン18のために開発された全ての標準的な細胞生物学/遺伝子操作および分析技術。

我々は最近、CFTRの機能を容易にフォルスコリン誘発性腫脹(FIS)アッセイ19、20に大腸オルガノイドで測定することができることを実証しました。コレラ毒素の代わりにフォルスコリン(FSK)や、にさらされたとき、オルガノイドは急速に、それらの環状アデノシン一リン酸(cAMP)のレベルを増加させるCFTRチャンネル19の開口部に回転もたらします。健康な個体から、または残存機能に関連したCFTR変異を有する被験者からのオルガノイドは、その後オルガノイドの内腔へのイオンと水輸送の結果、分泌性下痢のin vitroでの同等物として膨潤します。 CFTR-nullの個人由来オルガノイドによって示されるように大腸オルガノイドのFIS応答は以前に、完全にCFTR依存性であることが示されました特定の薬理学的CFTR阻害剤19を使用することによりND。大きな被写体固有のデータセットは、生検を取った後、数週間以内に導出することができます。

ここでは詳細に説明FISアッセイのために、オルガノイドは、どの年齢で及び限ら不快21を得ることができる直腸生検から培養されます。オルガノイドは、簡単に再密閉し、新しいオルガノイドを形成する単一の陰窩に機械的破壊によって毎週継代します。 FISアッセイを実行するために、これらの破砕少しオルガノイドの〜30-80は、96ウェルプレート19の各ウェルに播種します。アッセイの日に、オルガノイドをカルセイン緑、それがライブイメージングを容易にする、生きた細胞内に保持される蛍光細胞透過性色素で染色します。そして、細胞内cAMPを上昇させ、それによってCFTRを活性化するFSKは、オルガノイド膨潤を促進するために添加されます。頂端CFTRに作用増強を同時にワット追加されますフォルスコリンi番目、CFTRの人身売買を復元補正器に対し、FSKの添加前に24時間を追加されます。オルガノイド膨潤は、フォルスコリン添加時の各時点での全蛍光オブジェクトの合計面積の相対的増加を計算する自動画像解析によって定量化されます。

3Dオルガノイド腫れはアッシングチャンバーで2D培養気道細胞内の既存の電気生理学的CFTRの読み出しを超える利点と欠点を提供します。主な利点は、膨潤アッセイのスループットです。細胞を培養し、培養液の単一タイプを使用してアッセイであり、経験豊富な技術者は、12の患者サンプルで週当たり約1200のデータポイントを文化毎週25オルガノイドサンプルまで定量することができますしながら。私たちは、従来のプレートあたりの重複または三重測定により、単一の実験条件を入力して、三つの独立インキュベーション時点でそのような測定を繰り返します。合計で、約300〜500秒イングルオルガノイド構造は、次に限定された技術的な変動とCFTR機能の非常に正確な測定につながる実験条件、毎に測定されています。この精度は、私たちは明らかにCFTRモジュレーターに残存機能とレスポンスの違いを定義することができ、容易に同一のCFTR突然変異19、22、23、24、25運ぶ患者間の遺伝的背景の影響をピックアップすることを可能にします。データの品質は、容易に顕微鏡画像から評価することができます。 FISは完全にCFTR依存性であるが、それはその読み出し流体輸送へのイオン輸送のカップリングによる、CFTR機能のための間接的なアウトカム指標です。これは、経上皮イオン電流26を測定アッシングチャンバーで直接CFTR機能の測定、とは対照的です。アッシングチャンバは、頂端または側底Cの選択刺激を可能にします(オルガノイドアッセイは許可されません)ompartments。側底膜を透過性にすることにより、頂端CFTR依存性アニオン分泌を選択的に27で測定することができます。

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Protocol

本明細書に記載されたヒト組織を用いたすべての実験は、大学医療センターユトレヒト(; TcBio#14から008 UMCU)で倫理委員会によって承認されました。組織収集、生成、ストレージ、およびオルガノイドの使用のためのインフォームドコンセントをウィルヘルミナ小児病院(WKZ)-UMCUで患者から得られました。

装置 消耗品 ツール
層流フード 15、50mlのコニカルチューブツァイスLSM 800 - 画像を測定するための禅2(青版)ソフトウェア
CO 2インキュベーターマイクロチューブ Microsoft Excelのプログラム
細胞培養顕微鏡(光/光学顕微鏡) 0.22μmのフィルター
遠心血清学的ピペット
ローリング・シェイカーマイクロピペットフィルターチップ
インキュベーターのため4℃の部屋または4℃の冷蔵庫クライオバイアル
CoolCell細胞凍結コンテナ
血清学的ピペッター
Micropippette(千、200及び20μlの)
Viafloリピートピペット
(ライブセル)共焦点顕微鏡
コンピューター
液体窒素タンク
マルチチャンネル(200μL)

文化1.準備試薬

  1. 基礎培地の準備
    注:基本培地(BM)は、ハムの栄養混合物F-12(AD-DF)とアドバンストダルベッコ改変イーグル培地を意味し、4-(2-hydroxyethil)-1piperazineethanesulfonic酸(HEPES)、グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシン(ペンを補っ/連鎖球菌)。
    1. 500ミリリットルのAd-DF培地ボトルでは、5〜200 mMグルタミンのミリリットル、1 M HEPESの5ミリリットル、およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液の5ミリリットル(10,000 U / mlの、万/ mlの)を追加します。
    2. 少なくとも4週間、4℃の冷蔵庫で保管してくださいBM。
  2. Wnt-3A条件培地の準備
    注:のWnt-3A条件培地が行われ、社内usinG細胞株L-のWnt-3Aを製造業者の指示に従って。
    1. Wnt-3A条件培地を収穫するために、1週間の細胞に曝露培地を収集し、浮遊細胞を除去するために、450×gで5分間スピンダウン。
    2. 0.22μmのフィルターを介してのWnt-3A条件培地を濾過し、50mlコニカルチューブに40ミリリットルのアリコートに分割します。活動の損失なしに少なくとも4ヶ月間、4℃で保管してください。
    3. ヒト胚腎臓(HEK)を使用して、TOP / FOPアッセイにウミシイタケとTOP-とFOP-ルシフェラーゼおよびTK- ウミシイタケをトランスフェクトし、測定-293細胞をWntシグナル-3A条件培地の活性を試験することによるアッセイキットを-ルシフェラーゼ製造業者の説明書。
      注:TOP-ルシフェラーゼは野生型TCF結合領域を含むレポータープラスミドです。 Wnt-3A条件培地がアクティブである場合、標準的なWntシグナル伝達が活性化されます。 β-カテニンは、ウィットを関連付けるために核に移行します時間TCF / LEF転写因子および基質を添加した場合の相対的なルシフェラーゼ活性の増加を誘導する、ルシフェラーゼレポーターの転写を活性化します。 TCFが変異している、ルシフェラーゼ遺伝子の上流領域に結合するため、FOPルシフェラーゼを陰性対照として使用します。
  3. コロンミディアム準備
    注:製造元の推奨に従って、すべての成長因子および試薬を準備し、希釈します。避け凍結融解サイクル小型のアリコートを使用してください。機能的な成長因子は、結果を得るために不可欠です。
    1. 1×B27、1.25 mMのN-アセチルシステインとBMを補完することにより、大腸培地(CM)を準備し、50 ngの/ mlののhEGF、5 nMのガストリン、10mMのニコチンアミド、300 ngの/ mlのhRspo3、100ng / mlのhNoggin、500μMA83-01 、初代細胞用抗菌10μMのSB202190、および100μg/ mlです。
    2. アリコートにCMを分割し、最大4ヶ月間-20℃でそれらを凍結。完全なコロンを準備するためにアリコートを解凍CMに50%のWnt-3A-conditoned培地を添加することにより培地(FCM)。活動の損失なしに4℃で7日間まで保存FCM。
    3. 直腸生検からオルガノイド文化の確立のために、50μg/ mlのバンコマイシン、50μg/ mlのゲンタマイシンをFCMを補完し、10μMのRho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(RhoKi)。唯一の文化の中で最初の2〜3日間、分離培地(IM)と呼ばれるこの培地を、使用してください。
  4. EDTAストック溶液の調製
    1. 0.22μmのフィルターで滅菌超純H 2 Oに、0.5Mのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pHが8を準備します。
  5. 基底膜マトリックスの操作
    1. 製造業者の推奨に従って基底膜マトリックス(BMM)を準備します。
    2. 一晩氷上で解凍BMM。
    3. 15ミリリットルコニカルチューブにボトルからBMMを転送する、使用する場合5ミリリットルピペットと15ミリリットルコニカルチューブ-20℃で予冷。
    4. 解凍後、4℃で冷蔵庫にBMMを格納し、使用前に少なくとも30〜60分間氷上でインキュベートします。
      注:最良の結果を得るためには、BMMは陰窩またはオルガノイドを埋め込む前に、寒さと適切に混合されなければなりません。

2. CF患者の生検から大腸オルガノイドの確立

注:組織収集した後、それは生理食塩水に氷上でサンプルを維持することが重要である、のCa 2+およびMg 2+(DPBS)、またはBMのないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水。生検の迅速な処理が推奨されていますが、7日間まで氷上で保存生検からオルガノイド培養を確立することが可能であることが証明されました。

  1. 生検を15 mLコニカルチューブの底に沈降し、上清を除去しましょう。
  2. 10ミリリットルピペットを用いて生検およびピペット上下10〜20倍にDPBSの10ミリリットルを追加します。
    注:ピペットは、生検をピペットする前に、BMで予め湿らせする必要があります。
  3. 生検が底に沈降し、上清を除去してみましょう。
  4. 上清が透明になるまで繰り返し、2.2と2.3 4-5回繰り返します。
  5. 生検にDBPSの10ミリリットルと200μlのEDTA(0.5 M)を加え、4℃で60から120分間、ロッキングチューブプラットフォームにチューブを配置します。
    注:インキュベーション時間は患者ごとに異なる場合があります。陰窩がリリースされている場合、DPBSは濁ります。陰窩を顕微鏡下で観察することができる場合EDTAインキュベーションを確定することができます。
  6. 陰窩が安定することを可能にします。上清を捨てます。
  7. BMの2ミリリットルを取り、新しい15ミリリットルコニカルチューブに追加します。内部はBMで覆われているように、手動でこの新しいチューブを振ります。
  8. ピペットBMで予め濡らしを使用して、生検およびピペット上下10-20回を含むチューブにDPBSの2ミリリットルを追加します。
  9. 生検が新しいに陰窩とDPBSを解決し、転送することができステップ2.7で調製したBMの2ミリリットルを含むチューブ。
  10. これ以上陰窩が放出されなくなるまで繰り返し、2.8と2.9を繰り返します。
  11. 8°Cで5分間、130×gで陰窩をスピンダウン。
  12. 一方、室温(RT)で安全キャビネットにIMを転送します。
  13. 上清を捨て、陰窩ペレットを繰り返しステップ2.11にBMの10ミリリットルを追加します。
  14. BMの1ミリリットル中にペレットを再懸濁。 5-10μLを取り、顕微鏡下で目によって陰窩の数を数えます。
  15. 8°Cで5分間、130×gで陰窩をスピンダウン。
  16. 上清を除去し、55%BMMにペレットを再懸濁(BMM V IM Vへ)。
    注:陰窩は、1μl当たり1地下室で55%BMMの対応するボリュームに再懸濁されています。十分な陰窩がない場合は、BMMの最小体積は40μlです。
  17. 播種のために、ウェルあたりピペット35μL(24ウェルプレート中)。 3-5にBMM35μlのを分割することはGROの拡散を向上させるために、別々に下がりますBMMへの要因WTH。泡を作成しないでください。
  18. BMMが固化するため、少なくとも20分間、37℃のインキュベーター内で上下逆さまにプレートを配置しておきます。
  19. ウェルあたりIMの500μlを添加して、37℃のインキュベーター中でそれを維持し、5%のCO 2。
  20. 2〜3日毎に培地を更新します。 BMMそのまま降下を残して、P1000ピペットを用いてピペッティングすることにより、古いメディアを削除します。慎重に直接ではなくBMMが低下する上、井戸の側でそれをピペットでFCMを追加します。
    注記:陰窩を単離プロトコールでリリースされていない場合は、上清を遠心分離、BMでペレットを2〜3回洗浄し、BMMでそれを再懸濁します。残りの組織を取り、カミソリと小さな断片にカット。 15ミリリットルコニカルチューブにこれらを収集し、それらを遠心分離し、同じBMMで再懸濁します。任意の上皮幹細胞が存在する場合、これらはまた、オルガノイドを生成します。

3.メンテナンスのための大腸オルガノイドの継代、凍結、およびについてskolin誘発性の膨潤アッセイ(FIS)

注:すべてのオルガノイド文化は独自の倍加時間を持っています。通常、大腸のCFオルガノイドは1拡張することができます:3-1:5回ごとに7〜10日。出芽構造が観察されている場合、それは良い兆候です。大腸正常オルガノイド( 図2D)より-大腸CFのオルガノイドは少ない嚢胞(2C 図2A)です。確立および維持のために、オルガノイドは、24ウェルプレートで培養します。凍結のため、6ウェルプレート中で、そして、FISアッセイのため、96ウェルパテインチ

  1. オルガノイドの継代
    1. それを使用する前に、少なくとも30〜60分間氷上にBMMを保管してください。
    2. それを使用する前に少なくとも1時間、室温でFCMを保管してください。
    3. サンプル名やなどの別のチューブに1 15ミリリットルコニカルチューブにラベルを付け、「洗浄しました。」
    4. 慎重BMMが低下乱すことなく、P1000ピペットを用いてウェルから培地を吸引除去します。
    5. ウェル1およびbにBMの1ミリリットルを追加します。アップreak BMMは、P1000ピペットを使用することによって低下します。サンプル名で15ミリリットルコニカルチューブにこの1ミリリットルを転送します。
    6. BMの別の1ミリリットルでよく洗浄し、同じ15ミリリットルチューブに移します。
    7. 繰り返しは、(1 15ミリリットルコニカルチューブに洗浄され、24ウェルプレートの6ウエルまで)5以上のウェルと3.1.5と3.1.6を繰り返します。
    8. BMと12ミリリットルにチューブを上に記入してください。ピペットアップおよび予め湿らせた5ミリリットルピペットを用いてダウン。
    9. 8℃で5分間、85×gでスピン。
    10. 上清を捨て、ペレットにBMの1ミリリットルを追加します。同じP1000ピペットチップを使用すると、フィルタなしP10チップを取り、ピペットアップおよび20倍のダウン。 P1000およびP10のヒントの両方を破棄します。
    11. 5ミリリットルピペットでBMの4ミリリットルを追加し、一方の側に垂直線から約70°に傾斜チューブを保持します。新しいP1000チップをプリウェットとP1000(1ミリリットル容量)と激しく2-3回混ぜます。
    12. 傾斜位置のまま10まで数え、最上層を収集慎重ワットラベルチューブにP1000ピペット、および転送4×1ミリリットルi番目の "洗浄"。
    13. 傾斜チューブ内底に沈降オルガノイドを観察し、未破砕オルガノイドと大きな塊が底に沈んでしまいます。遠心15mlを85×gで8℃で5分間チューブを「洗浄しました」。
    14. 上清を捨て、55%BMMの最終濃度にオルガノイドペレットに培地とBMMの必要量を追加します。泡( 図3B)を作成することなく、ピペッティングにより混和します。
      注:良い密度がBMM10μlに25-30オルガノイドを播種することによって達成されます。
    15. フォローは2.17から2.19までを繰り返します。
  2. 凍結のための継代
    1. 使用前に少なくとも30〜60分間氷中でBMを保管してください。使用前に少なくとも1時間、室温でFCMを保管してください。
    2. RhoKi(ステップ1.3.3)を補充したFCMを準備します。
    3. 冷蔵庫からトリプシンを取り、使用前に少なくとも30分間、室温でそのままにしておきます。
    4. 手順に従ってください3.1.5-3.1.10。
    5. 、できるだけ多くの上清を除去し、トリプシンの4ミリリットルを追加し、30秒間ボルテックス。
    6. 30秒間激しく1分間、ボルテックス、37℃の温水浴中にチューブを入れてください。
    7. チューブ内の溶液を点検してください。無傷のオルガノイドは、顕微鏡下で観察される場合、ステップ3.2.7を繰り返します。
    8. オルガノイドが破壊される場合には、トリプシンおよびピペット10倍を中和するためにBMの8ミリリットルを追加します。
    9. 8℃で450×gで3分間回転。
    10. 上清を捨て、55%BMMのソリューションに到達するためにオルガノイドに培地とBMMの必要量を追加します。泡を作成せずにピペッティングすることによって、およびミックスダウン。
      注:トリプシン処理した後、1:1の比率の凍結について、オルガノイドは1に播種する必要があります。
    11. シード〜10μlに小さな、分離液滴を生成する予熱した6ウェル組織培養プレートの1ウェル中の250μlの、。 37℃のインキュベーター内で上下逆さまにプレートを置き、残します20〜30分間凝固するBMM。
    12. 各ウェル6ウェルプレートに新鮮なFCM + RhoKiの2.5ミリリットルを加え、インキュベーター( 図3C)にプレートを転送します。
  3. FISアッセイのためのオルガノイドを継代
    注:オルガノイドの数とサイズに応じて、24ウェルプレートの4と6ウェル間を96ウェルプレートの27ウェルを播種するために十分です。
    1. ステップ3.1-3.1.13から説明されているようにオルガノイドを処理します。
    2. 50%BMMの120μlのペレットを再懸濁。
    3. 顕微鏡下で3μlのBMMドロップでオルガノイドの数(30-50)を確認してください。
    4. プレート96ウェルパテの各ウェルの中央に配置された3μlの一滴を使用してオルガノイド。
    5. BMMが固化するための15分間の37℃のインキュベーターでプレートを置き、さらなるステップは、ステップ6.1.1に記載されています。

4.凍結コロンCFオルガノイド

注:オルガンOIDは1-2日トリプシン処理し、培養後凍結しする準備ができているので、オルガノイドはまだ解凍後の生存の効率を増加させる、小さいであろう。

  1. BMの1ミリリットルを追加し、BMMは、P1000ピペットを使用してドロップし別れます。 15ミリリットルコニカルチューブに移します。
  2. 同じ15ミリリットルチューブにBMと転送の別の1ミリリットルとよく洗います。
  3. 繰り返して、すべてのウェルで4.1と4.2を繰り返します。
    注:過剰BMMを回避するためには、6ウェルプレートの3ウェルは、1つの15mlチューブにプールされています。
  4. 12冷たいBM mlのピペット上下5ミリリットルピペットでとオルガノイドを含む15mlチューブを埋めます。 5分間氷上でチューブを残します。
  5. 450×gで3分と8°Cのためにスピンして上清を除去します。
  6. 適切オルガノイドを再懸濁し、上下の媒体やピペットを凍結してオルガノイドのペレットを溶解します。
    注:凍結培地500μlがBMMの各100μlのために使用されています。
  7. 5mLのピペットを使用して、0.5mlのを転送します凍結培地に再懸濁オルガノイドは、極低温バイアルを無菌にします。
  8. 細胞凍結容器にバイアルを移し、-80℃でそれを置きます。
  9. 24時間後、液体窒素中に保存のためにバイアルを移します。

5.冷凍オルガノイドから文化の確立

注:氷の上BMMを解凍し、氷上で保管してください。 BMは、RTに到達し、解凍1クライオバイアルの手順を開始する前に、37℃に10ミリリットルのアリコートを温めましょう。

  1. まだ少し凍結材料があるまで37℃の水浴中で撹拌することによって急速にバイアルを解凍します。
  2. P1000ピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに解凍したオルガノイドを転送します。
  3. チューブの底を振とうしながら直後、ドロップによって暖かいBM降下の1ミリリットルを追加します。培地の1ミリリットルが追加されると、凍結培地を希釈するためにピペッティングすることにより、数回上下慎重に混ぜます。
  4. ゆっくりと(一滴ずつ)コニカルチューブのコンタに暖かいBMの9ミリリットルを追加オルガノイドining。数回反転します。
  5. 85 XGと8℃で3分間、細胞懸濁液をスピン。
  6. ペレットを乱すことなく、慎重に上清を捨てます。 RhoKi(ステップ1.3.3)を補充したFCMの90μlのオルガノイドを再懸濁します。そして、BMMの110μlを添加します。
  7. 小さな、分離液滴を作り、予め温めておいた24ウェルプレートの各ウェルに35μlのを追加します。
  8. 逆さまに20-30分間プレートを残して、37℃のインキュベーターにプレートを転送します。
  9. 各ウェルにRhoKiとFCMの500μlを添加して、バックインキュベーター( 図4A - 4C)にプレートを転送します。
  10. オルガノイドは、解凍から正常に回復した後は、そうBMMの各10μlを25-30オルガノイドが含まれ、よりBMMに希釈しました。オルガノイドの適切な成長を確保する-この手順では、2〜3日(4G 図4D)を解凍した後に行うことができます。

6.フォルスコリン誘発性の腫脹(FIS)と言います

注:FSK滴定は、CFTR残存機能の測定を可能にします。 CFTR変調のために、オルガノイドは、遺伝子型に応じて、指定された補正( 例えば、VX-809)および/または増強( 例えば、VX-770)にさらされています。 VX-770およびFSKは、右の測定を開始する前に追加されている間通常、VX-809は、測定前に18〜24時間を追加されます。いくつかの変調器(補正器/増強)をアッセイプレートのプラスチック表面に結合できることに注意してください。

  1. アッセイのためのメッキ
    注:VX-809ストックを20mMに等分し、-80℃で保存します。解凍すると、RTで残し、光から保護します。
    1. 3.3節で説明したようにオルガノイドを処理します。
    2. 0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0、および30μM:VX-809補正をテストする場合は、以下の濃度と三重での用量反応曲線を準備します。 FCMでの希釈液を調製します。
    3. 96ウェルプレートに、いずれかの100μを追加; FCMのそれぞれのVX-809の濃度または100μlのとFCMのリットルは、プレートをインキュベートします。
  2. アッセイを測定します
    注:FSKは10mMでありながら、VX-770銘柄は、20 mMので等分しています。両方を-80℃で保存します。解凍すると、室温でのままにし、光から保護します。
    1. カルセインとDMSOのバイアルを取り、室温で15分間おきます。
    2. 未開封の場合、カルセインを粉末として提供されているバイアルにDMSOの5.1μlを添加します。それ以外の場合は、カルセインの2.5μLを含む既に再懸濁カルセインバイアルを使用します。
    3. 1.5ミリリットルチューブ内のBMの580μlにカルセインの2.5μlを添加して、それをラベル。
    4. 各ウェルリピートピペットを使用して、この染料溶液(BM +カルセイン)の10μLを加えます。
    5. 染料が十分に混合されることを確実にするために、マルチチャンネルで一度再懸濁。
    6. 30分間37℃のインキュベーター内でプレートをインキュベートします。
    7. カルセインインキュベーションの間、FSKの準備を開始およびVX-770のソリューション、必要に応じて。
    8. 0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0、および30μM:VX-770の増強を使用している場合は、以下の濃度で三連の用量反応曲線を準備します。 FSK滴定の場合には、濃度は以下のとおりです。0、0.008、0.02、0.05、0.12、0.32、0.8、2.0、および5.0μM。 BM中の希釈液を調製します。
      注:FSK /薬物滴定溶液100μlがすでに100μLを含有する各ウェルに追加されますので、FSK、VX-770、または第二日目に添加される任意の他の薬物について、希釈液は、2×最終濃度で調製しなければなりませんFCMの。
    9. 顕微鏡室にFSKおよびVX-770のソリューション、P200ピペット、とヒントを転送します。
    10. FISアッセイを画像化するために、自動化された段階、加熱室、およびCO 2の流れを搭載したライブセルイメージング共焦点顕微鏡を使用しています。
      注:以下の手順は、特定の顕微鏡を参照してください。異なるセットアップは、メーカーの他に、次のような顕微鏡に適用されるべきです指示。
    11. プレートホルダーに、96ウェルプレートを置きます。
    12. イメージングのための共焦点設定を入力します。
      1. 37℃にライブイメージングツールをプリセットし、5%CO 2及び室は、測定前に最低30分間プレインキュベートしましょう。
      2. アレクサフルオロ-488トラックを選択し、「スマートセットアップ」オプションを使用します。
      3. ズームアウトとウェル全体をキャプチャする0.6Xに5Xレンズとスキャンエリアを設定します。
      4. バックグラウンドを超えるカルセイングリーンラベルされたオルガノイドの最適な検出を可能にするためにレーザパワーと検出器の感度を調整します。ピンホールは、130ミクロンに増加することができ、画像の平均化は、2に設定することができます。
      5. 8のビット深度と512×512のフレームサイズを設定します。
      6. 測定時間、周波数、および間隔を設定するには、時系列のオプションを使用します。
        注:定期的な測定のために推奨:10分間隔で1時間:サイクル= 7(サイクル1は、T = 0です)。減少した腫脹の測定では、orgaがノイドは、最大3時間画像化することができます。
      7. 手動で個々のウェルの位置を決定するために、タイルオプションを使用します。
    13. 測定と同じ順序に従って、対応するウェルにFSKおよび/またはVX-770の溶液100μLを加えます。よく撮像された最初のソリューションの追加を開始し、撮影オーダを続行します。
    14. 測定を開始します。
    15. 実験が終了した後、ファイルを保存します。
  3. FISアッセイデータの解析
    1. アレクサ-488トラックを介して撮像されたすべての構造を認識し、全面的オルガノイド面積の増加を計算するために識別された構造を埋める画像解析ソフトで解析ツールを使用して、FISアッセイのデータ解析のための「オルガノイド分析 "マクロを作成します。異なる時点。
    2. 画像解析プログラムで取得した画像を使用してデータファイルを開きます。
    3. オルガノイド分析のためのマクロを選択します。
    4. <李>は時点1での1つのウェル中の信号対雑音比のバランスをとり、すべてのオルガノイド構造が認識され、満たされていることを確認するために、しきい値を設定します。
      1. すべての構造はまた、時刻7で認識されている場合は少し時間点7でのバックグラウンドシグナルは、(特定の閾値は実験間で多少変更する場合があります)構造として認識されないことを保証するために、しきい値を変更見に4-6ウェルで確認してください。
    5. 千μmの2に認識されたオブジェクトの最小面積の大きさの基準を設定します。
    6. 押して開始するには、「分析」。分析は、使用するソフトウェアに応じて、約3分かかります。
    7. よく数字(表は、この順に増加するはずである)、時点、およびウェル当たりの総面積:ソフトウェアが終了すると、「テーブルを作成」​​し、次のデータを選択してください。
    8. スプレッドシートプログラムにエクスポートする.xlmとしてファイルを保存します。
    9. このプログラムでは、WEL当たりの面積の相対的増加を計算100%の時点1の領域を設定することにより、L。時点条件当たり1~7からの曲線下面積(AUC)を計算します。領域(Y値)の下限値を100%に設定されています。 FSKまたは薬物滴定(X軸)は、AUC(Y軸)に対してプロットされています。

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Representative Results

図1Aは、BMMに埋め込まれた陰窩の代表新鮮な分離を示しています。陰窩は、CF対象の大腸生検からのものです。通常、オルガノイドは、それぞれのcrypt( - C 図1A)から生成されます。 CFTRの機能不全に、大腸のCFオルガノイドのほとんどは、嚢胞性ではなく、むしろコンパクト突起とbuddings( 図2A - 2B)です。しかし、いくつかのCFは、特に高い残留機能で、文化をオルガノイド野生型オルガノイド培養( 図2D)のように、嚢胞性形状( 図2C)でいくつかのオルガノイドを持っています。

文化を拡張またはFISアッセイをシードするためにオルガノイドを継代する前に、 図3(a)に示すようオルガノイドは、複数のbuddingsで大きなサイズを有することが重要です。オルガノイドは小さく、nはなしにしている場合継代のために処理したときumerous buddingsは、オルガノイド文化が悪影響を受けます。 EGFは、Wnt-3A、およびRspo3のような本質的な成長因子の品質や活動に応じて、オルガノイドは7と12日( 図3A)との間で所望の大きさに達します。機械的破壊後、buddingsが中断し、次の継代( 図3B)で新しいオルガノイドを生成するために使用されます。凍結のためのオルガノイドを処理する場合は、 図3Cに示されるように、それらは小さなサイズにトリプシン処理されることが重要です。トリプシン処理した後、オルガノイドは、彼らが操作のストレスから回復させるために、1または2日間培養します。このステップは、一緒にオルガノイドの小さなサイズで、( 図4A)を解凍後に98%の細胞回復を保証します。

オルガノイドが解凍された場合には、高密度にそれらを持っていることが重要であるので、通常、それらが中で解凍され少量(Figure4A)。培養液中の1または2日後、およびオルガノイドは( 図4B図4Aを比較- 4C)のサイズを大きくしていることを観察した後、オルガノイドは、右の密度を提供する、BMM10μlの当たり20-30オルガノイドの割合で希釈されています大きいサイズに成長します。オルガノイドがあまりに希釈されている場合、彼らは成長を遅らせることができ、さらに分化して死ぬことができます。オルガノイドがあまりにも混雑している場合は、スペースの不足や成長因子の不足もオルガノイドの成長を遅くし、buddingsの数を減らすことができます。

限られた細胞破片を持つ実行可能な培養物からオルガノイドのメッキがオルガノイドの> 95%が十分なCFTR機能は、( - 5B 図5A)が存在することを条件とする、FSK刺激により膨潤する条件をもたらすはずです。オルガノイドはとしてgenotype-および薬物依存的に膨潤2 F508del対立遺伝子( 図5A)とオルガノイド化合物-ヘテロ接合F508delとS1251N( 図5B)のために、いくつかの残存機能に関連したCFTRゲーティング変異を有するオルガノイドの代表画像によって示されています。

腫脹を定量するために、総カルセイン・グリーン表面積を各時点のために選択し、T = 0の百分率として表されている(100%に設定し、 図6(a))。破片及び小、非膨潤性構造体は、典型的には、全表面積の5%未満です。相対的な面積の増加は、10分間の時間間隔ごとに発現され、そしてAUC(任意単位)の測定は、各条件(T = 0〜60分、100%に設定したベースライン閾値; 図6B)に対して生成されます。我々は、それが腫れの開始でいくつかのバリエーションだけでなく、高CFTR機能レベルでのFSKの30-40分を超えた曲線関係を組み込んだとしてAUCは、最も堅牢であることが判明しました。

図6C)とのインキュベーション時〜2,500-3,500 AUC単位に増加することができます。 CFTR残存機能に関連したオルガノイドは、CFTRモジュレーター(プレFSK条件の百分の200から220の表面積)の不在下で5μMFSK刺激の60分後に4500 AUC台まで達することができます。オルガノイド膨潤はおそらく「伸張」の条件の下でオルガノイド構造、基底外側イオン輸送の律速影響、およびイオンおよび流体輸送の恒常性の確立の物理的な制限のために、〜4,500 AUC単位で天井に達します。 FSKは、さらに優れた残存機能や高度に効果的に定量するために、これらの高CFTR残存機能レベルでアッセイのダイナミックレンジを拡大するために滴定することができます化合物処理( 例えば、より低いFSKの濃度で刺激したときのS1251Nのオルガノイドの膨潤にVX770の高い活性によって示されるように、 図6D)。

図1
図1:生検からCF大腸オルガノイドの確立。 (A)分離日(継代0、0日目)にBMMに埋め込まれた後の直腸生検から単離された物質の代表的な画像。指示された地下室の拡大が右下のパネルに示されています。 (B)と同じ陰窩は、培養7日目(継代0、7日目)の後に続きました。パネルAに示され、同じ陰窩の拡大が示されています。 (C)11日に分割された後の同じオルガノイド文化の代表的な画像(継代1、11日目)。スケールバー=100μmです。
159fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:異なるCFTR変異を有する被験者由来CF大腸オルガノイドの代表的な画像。 F508del / F508del(A)、F508del / R117H-7T(B)、およびF508del / S1251N(C)変異を有する被験者からのCF大腸オルガノイドの代表的な画像。 (D)野生型CFTR対象から大腸オルガノイド文化の代表的な画像。スケールバー=100μmです。これらの画像はないFSK刺激で得られました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3:保守およびアッセイのために、または凍結する処理のCF大腸オルガノイド。 (A)(B)継代または(C)の凍結のいずれかのために処理されるCF結腸オルガノイド培養物の代表的な画像を準備。次の通路に新しいオルガノイドを生成する彼らの機械的破壊、小さな断片が形成され、後(B)。 (C)トリプシン処理した後、非常に小さな、丸いオルガノイドは、凍結プロセスの間にそれらの生存率を容易に生成されます。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:冷凍オルガノイドからCF大腸オルガノイド文化を確立します。 (<強い> A - 0日目(A)で解凍CF大腸オルガノイド文化のC)代表的な画像。同一のウェルからの画像は、一(B)及び後2(C)の日に採取しました。 (D - G)のセクション5.9で説明した希釈工程の代表的な画像。オルガノイドは、解凍(解凍後3日目)から正常に回復した後、彼らは(D)を成長させるためのスペースを持っているので、それらは希釈されます。同一のウェルからの画像は、6(E)、10(F)、および解凍後の15(C)の日に採取しました。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:CFのフォルスコリン誘発性の腫脹オルガノイド。 (AB)代表F508del / F508delの画像(A)またはF508del / S1251N(B)大腸オルガノイドVX-770(3ミクロン])の非存在下または存在下でFSK(5ミクロン)による刺激の60分前または後またはVX-770 VX-809(3ミクロン)と組み合わせて用いることができます。スケールバー=200μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6:定量化フォルスコリン誘発性腫脹。 (A)F508del / S1251Nの画像解析ソフトによりオルガノイドの前に(0分)、FSK(5μM)及びVX770(3μM)による刺激の60分後オルガノイドエリア選択の代表的な画像。スケールバー=200μmです。 (B)RepresVX770(3ミクロン)および/またはVX809(3ミクロン)の非存在下または存在下でFSK(5ミクロン)刺激の60分の間にF508del / F508delまたはF508del / S1251Nのオルガノイドの相対面積増加のentative画像。 (B)(T = 60分で、ベースライン閾値= 100%)で示された条件の曲線測定下(C)領域。 (D)FSKの異なる濃度でF508del / F508delの曲線測定またはF508del / S1251Nのオルガノイド下面積。データは、単一の代表的な実験からの平均±SDを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここでは、ヒト結腸直腸オルガノイドの発生、拡大、凍結、融解のための完全なプロトコルを提供します。我々はいくつかの時間前に17人のオルガノイド培養を確立しているが、それは時々 、ハンズオントレーニングすることなく、他の研究室で技術の確立が困難であることが判明しました。私たちは、これらのプロトコルは、このような訓練を置き換えることを期待しています。

Wnt-3A条件培地は、長期オルガノイド文化の確立と維持に成功するために最も重要な試薬の1つです。低活性とのWnt-3A-conditonedの媒体にさらされたときに実際に、オルガノイド培養は「クラッシュ」かもしれません。 Wnt-3A条件培地を、社内で行われるので、活性媒質を生成する際に考慮しなければならないいくつかの側面があります。アクティブのWnt-3Aは、L細胞および疎水性の安定化のための適切な増殖シグナルを提供する高品質のウシ胎児血清(FBS)を含む培地中で産生することができますWnt-3A分子。 Wnt-3Aのアクティビティが低い( すなわち、低TOP / FOP比、以下を参照)である場合、それは通常、問題の原因となっているFBSです。

商業組換えWntが不十分働くので、私たちは、TOP / FOPのWntレポーターアッセイの陽性対照として、それを使用することはお勧めしません。 TOP /ウミシイタケおよびFOP /ウミシイタケの間の比率はそれほどのWnt-3A条件培地の良いバッチがからTOP / FOPの値に比べて、25よりも高いTOP / FOP比を与え、馴化培地のWnt活性の指標でありますネガティブコントロール:中のWnt-3A産生細胞に露出していません。組換えノギン及びRスポンジンは、ノギンによって置き換えられ、Rスポンジンの馴化培地28を 、29とすることができます。

現在のプロトコルはまた、CFTR-FISアッセイのための機能テストを記述しています。我々は最近、CFTR遺伝子型とFISとどのようにこれが公開されたCFTR genotyを反映したとの間の関係を実証しています臨床レジストリ(www.CFTR2.org)25から得られたPE-表現型との関係。このアッセイを用いて、非常にまれなCFTR変異を有する2人は、そのオルガノイドivacaftor(VX-770)25に応答した同定されました。この薬のその後の処方は、臨床試験データが存在しない場合に稀な変異を有する患者で特異的な薬物を一致させるためにFISアッセイの価値を強調し、明確な臨床反応が得られました。 FISの定量化のために必須では唯一の(通常5%未満)非膨潤オルガノイドの限られた分数で示され、最適な成長およびアッセイ条件です。非生存、非膨潤性構造体の大きな割合として膨潤の過小評価にデブリリードの高いレベルが、画像分析ソフトウェアによって認識されます。

in vitroでの FIS応答し、以前に確立されたCFTR依存のバイオマーカー(汗塩化物濃度とINTESTとの相関パーソナライズされたレベルで)inal電流測定は、我々の以前の研究19、25に容易に実証しました。これは、CFを有する対象にFISを使用して、残存機能の測定は、パーソナライズされたファッションに診断または予後マーカーとしての現在のアプローチを補完することができるという考えを支持しました。このような汗の塩化物濃度の生体内での測定およびex vivo直腸生検で腸の電流測定などのCFTR機能の他のバイオマーカーと比較FISアッセイのスループットは、技術的な変動のより良好な制御を可能にします。また、完全にCFTR依存読み出しおよびFSKの滴定正確種類の残留CFTR機能を使って、広いダイナミックレンジを提供します。

CF疾患の変調は唯一のCFTR機能以上の影響を受けている間しかし、FISアッセイは、薬効の変動に対する個々の遺伝子型の影響のみを反映しています。 DRUのためのG応答は、アッセイは、潜在的な組織応答を反映します。 インビボ 7,8または直接ex vivoで CFTR測定値32 対向するようにCFTR測定において非常に正確なものの、薬物動態におけるヒト変化は、組み込まれていません。前述したように、(遺伝的および環境的双方の)非CF改良剤はまた、インビトロの観察またはCFTRのバイオマーカーと臨床表現型2との間の切断を引き起こし、表現型に影響を与えています。さらに、セルライン33を使用して、潜在的な応答性の変異の同定は、オルガノイドの確立のための直腸生検を取得する必要があり、患者にあまり影響に関連しています。

複数のCFTR-標的とする薬剤が開発1に現在あります。臨床試験は、臨床的有効性bの正しい予測を許可しないことが予想されます単独のCFTR変異状態にASED。 FISアッセイは、機能的CFTR機能および薬物応答を測定するように、それがどの患者に最も適している薬剤を決定するための最適な方法になることがあります。 FISのアッセイはまた、登録試験に含まれる患者群の同定および新規な薬物様式の開発に有用であり得ます。前と治療中のプラズマと大腸オルガノイドの刺激はさらに、潜在的に、血液中のCFTRモジュレーターを循環パーソナライズ投与および臨床試験30における薬剤投与量の選択、31容易する機能量を定量化するのを助けることができます。最後に、FISは、CFTR機能とその機能の他の-soはるかに大きくunknown-遺伝的修飾因子との相互作用のより良い基本的な理解のために有用である可能性があります。

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Acknowledgements

この作品は、オランダCF財団(NCFS)、ZonMW(40-00812-98-14103)、ウィルヘルミナ小児病院研究基金とCZ、およびZilverenkruis / AchmeaのHIT-CFプログラムによってサポートされていました。我々はS. HEIDA・ミッシェル、M. Geerdink、KMデウィンター・ド・グルート、およびG. Berkers(小児呼吸器科、ウィルヘルミナこども病院、UMCユトレヒト)、及びRHJ Houwen(小児消化器科、ウィルヘルミナに感謝したいと思います患者に接近し、CFバイオバンクの生成のための生検を取得するための小児病院、UMCユトレヒト)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

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References

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