Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R., Beekman, J. M., Clevers, H. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CF נגרמת על ידי מוטציות רגולטור מוליכות הטרנסממברני סיסטיק פיברוזיס (CFTR) גן מקודד ערוץ אניון אפיתל. CF משפיע על כ 85,000 אנשים ברחבי העולם 1. למעלה מ -2,000 מוטציות CFTR זוהו ( www.genet.sickkids.on.ca ). גיוון זה מסביר חלקית קשת רחבה של פנוטיפים מחלת לב ( www.CFTR2.org ) 2, 3. שש כיתות של מוטציות CFTR מוגדרות בהתבסס על השפעתן על ביטוי חלבון CFTR ותפקוד: (I) אין סינתזה, (II) סחר פגום, (III) gating ערוץ פגום, (IV) מוליכות שינה, (V) רמות נמוכות של כלל תפקוד CFTR, ויציבות פני התא נפגם (VI) 4. למרות מוטציות CFTR המשותפות נלמדות היטב, פונקצית CFTR וקשר עם מצב קליני להישאר poorly הבין ברמת הפרט, במיוחד עבור הקבוצה הגדולה של מוטציות נדירות "יתומות" ( www.CFTR2.org ) 1, 3.

לאחרונה, תרופות פותחו למקד חלבון CFTR באופן מוטציה ספציפית. ישנן שתי קבוצות של תרופות CFTR מיקוד-חלבון נמצאות כיום בשימוש קליני יש מצבים שונים של פעולה. Potentiators, כגון VX-770, לשפר את ההסתברות הפתוחה של CFTR מוטצית apically-מקומי ולפעול ישירות על התוספת שלהם לתאים 5. מתקן, כגון VX-809, לשחזר את הסחר של CFTR misfolded הרטיקולום-מקומי endoplasmic ודורש דגירה מראש עם תאים לפני השפעת הם נצפו 6. Potentiator CFTR, VX-770, כבר נרשמו נבדקים עם המוטציה 7 G551D, 8, כמו גם במשך שמונה אחריםCFTR gating מוטציות, כולל S1251N 9; יחד, מוטציות אלה מבוצעים על ידי 5% מכלל הנבדקים CF. ניסויים קליניים אחרים הראו, כי VX-770, בשילוב עם VX-809 המתקן, הגביל השפעות משמעותיות עדיין על תפקוד ריאות ואת גורם לירידה בשיעורי החמרה בנבדקים הומוזיגוטים למוטצית F508del נישאה על ידי 45-50% מהחולים 10, 11.

ניסויים קליניים קונבנציונליים לזהות נושאי סמי תגובה בתוך 50% הנותרים של חולי CF הם יקרים זמן רב ואינם אפשריים עבור אנשים עם גנוטיפים CFTR הנדירים ביותר. רומן, חסכונית, שיטות אישית הם קריטיים כדי להתאים את מספר הגדל וההולך של מאפנני CFTR ליחידים נושאים כל סוג של מוטצית CFTR. עד עכשיו, הכללת הבדיקה של קבוצות חולות נושאת מוטציות CFTR ספציפיות כבר מונחה על ידי מחקרים באמצעות transfection גן CFTR מוטנטי h מערכות תא eterologous, ואחריו מחקרים אלקטרו Ussing תאי 5, 6, 12. בשל חוסר במודלים של בעלי חיים נאותים CF, מחקרים יעילים תרופה בתאי אפיתל סימפונות אוויר נוזלים ממשק בדיל נגזרו חומרי explant CF ריאות שמשו לפיתוח תרופות 13, 14, 15. עם זאת, הזמינות המוגבלת של רקמות explant ריאות ואת הפרוצדורות פולשניות כדי להשיג תאי סימפונות נושאים ללא מחלת סופנית להקשות על הניתוח של מוטציות CFTR נפוצות פחות ולמנוע בדיקות סמים באופן אישי. כדי להתגבר על המגבלות האלה, "גישה קלה" רקמות, כגון organoids הגס, תאים בדרכי נשימת אף, ותאי דרך נשימה שמקורם בתאי גזע מושרים, הן נבדקות כיום טיפולים תרופתיים אישית.

= "jove_content"> בעבר, הקמנו פרוטוקולים לתאי גזע אפיתל תרבות מכל איבר העיכול בצורה של 3D organoids 16, 17. עבור המעי הגס / החלחולת האנושי, תנאי התרבות לערב גורמי גדילה מוגדר (פקטור גדילה אפיתל (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), ו noggin) בשילוב עם מולקולות קטנות (Nicotinamide, A83-01, ו SB202190) במטריצה ​​קרום במרתף. בתנאים אלה, תאי גזע יחידים או שברי רקמה קטנים לגדול לתוך סגור, פיברוזיס, מבני 3D נוצרו על ידי אפיתל פערים מקוטב עם הצד הבסיסי שלה מכוון כלפי חוץ. כל סוגי התאים בדרך כלל מופיעים יחסים והעמדות הרגילים שלהם. Organoids ניתן להרחיב פני תקופות זמן ארוכות על ידי הפרעה מכאנית שבועית מחדש ציפוי. הם גנטיים ויציבים phenotypically ניתן לאחסן, המאפשרים התרחבות לטווח ארוכים ביו-בנקאי 17. הם ניתניםכל המניפולציות הגנטיות / סטנדרטי התא ביולוגי וטכניקות ניתוח שפותחו עבור שורות תאי 2D 18.

אנחנו הוכחנו לאחרונה כי פונקצית CFTR ניתן למדוד בקלות organoids המעי גס נפיחות הנגרמת forskolin (FIS) assay 19, 20. כאשר נחשף forskolin (FSK) או, לחלופין, כדי רעלן הכולרה, organoids במהירות להגדיל monophosphate אדנוזין המחזורי שלהם (cAMP) רמות, שבתורה גוררת בפתיחת ערוץ CFTR 19. Organoids מיחידים בריא, או נבדקים עם מוטציות CFTR הקשורים בתפקוד שיורית, יהיה בהמשך להתנפח כתוצאה יון ותחבורה מים לומן organoid, המקבילה במבחנה של שלשול הפרשה. תגובת FIS של organoids הגס הוצגה בעבר להיות מלא CFTR תלוי, כפי שצוינה על ידי organoids נגזר אנשי CFTR-nullND על ידי שימוש במעכבי CFTR תרופתי ספציפי 19. ערכות נתונים נושאות ספציפית גדולות יכולות להיגזר בתוך מספר שבועות לאחר נטילת ביופסיה.

עבור assay FIS תיאר בפרוטרוט כאן, organoids מתורבתים ביופסיות רקטלית שניתן להשיג בכל גיל ועם אי נוחות מוגבלת בלבד 21. Organoids הם passaged שבועי על ידי הפרעה מכנית לתוך מאורות יחיד בקלות לחתום מחדש ויוצרים organoids חדש. להרצת assay FIS, ~ 30-80 של organoids קצת שיבשו אלה הם מצופה בכל טוב של צלחת 96-גם 19. באותו יום של assay, organoids מגואלות ירוק calcein, צבע תא חדיר פלורסנט כי זה נשמר בתוך תאים חיים, בהנחיית הדמיה לחיות. לאחר מכן, FSK, אשר מעלה cAMP התאית ובכך מפעיל CFTR, מתווסף על מנת לעורר נפיחות organoid. Potentiators שפועל על CFTR הפסגה מתווסף זמנית wה- i forskolin, ואילו מתקן כי לשחזר סחר CFTR מתווספים 24 שעות לפני תוספת של FSK. נפיחות organoid היא לכמת ידי ניתוח תמונה אוטומטי המחשב את העלייה היחסית השטח הכולל של כל אובייקטי הניאון עבור כל נקודת זמן על תוספת forskolin.

3D organoid נפיחות מספק יתרונות וחסרונות על readouts CFTR אלקטרו קיימים תאים בדרכי הנשימה תרבותי 2D ב Ussing תאי. יתרון עיקרי הוא התפוקה של assay הנפיחות. הם תאים בתרבית ו assayed שימוש באמצעי אחד בלבד של מדיום התרבות, ו טכנאי מנוסה יכול תרבות עד 25 דגימות organoid על בסיס שבועי ואילו לכימותים כ -1,200 נקודות נתונים בשבוע ב -12 דגימות חולות. אנחנו כמקובל הקלידו תנאי ניסוי יחידים על ידי מדידות כפולות או בשלושה עותקים לכל צלחת וחזרו מדידות כאלה בשלוש נקודות זמן דגירה עצמאיות. בסך הכל, כ 300-500 single organoid מבנים אז נמדדים לפי תנאי הניסוי, אשר מוביל מדידות מדויקות מאוד של תפקוד CFTR עם השתנות טכנית מוגבלת. דיוק זה מאפשר לנו להגדיר הבדלים בבהירות בתפקוד שיורית בתגובה מאפננת CFTR ומאפשר לנו להרים אפקטי רקע גנטיים בקלות בין חולי נושאת מוטציות CFTR זהים 19, 22, 23, 24, 25. איכות הנתונים ניתן להעריך בקלות מתמונות מיקרוסקופ. בעוד FIS הוא CFTR תלוי באופן מלא, זה למדידת תוצאה עקיפה לתפקוד CFTR, לקריאה החוצה שלה נגרמת על ידי הצימוד של תחבורת יון לתחבורה נוזלת. זאת לעומת מדידות פונקצית CFTR ישירות בתאי Ussing, אשר מודדות זרמי transepithelial יון 26. תאי Ussing לאפשר הגירוי הנבחר של ג פסגה או basolateralompartments (שבו assay organoid אינו מאפשר); על ידי permeabilizing ממברנות basolateral, הפרשת אניון הפסגה תלויה CFTR ניתן למדוד 27 באופן סלקטיבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים תוך שימוש ברקמות אדם מתואר במסמך זה אושר על ידי ועדת האתיקה באוטרכט המרכז הרפואי האוניברסיטאי (UMCU; TcBio # 14-008). הסכמה מדעת לאיסוף רקמות, דור, אחסון, ולהשתמש של organoids התקבלה המטופלים בבית החולים וילהלמינה ילדים (WKZ) -UMCU.

צִיוּד מתכלה כלים
מכסה מנוע זרימה למינרית 15 ו -50 מ"ל צינורות חרוטי Zeiss LSM 800 - 2 זן (מהדורה הכחולה) תוכנה למדידת תמונות
CO 2 באינקובטור צינורות microfuge התוכנית של Microsoft Excel
תא מיקרוסקופ תרבות (מיקרוסקופ אופטי / אור) 0.22 מיקרומטר מסננים
סַרכֶּזֶת טפטפות סרולוגיות
רולינג שאכר טיפים מסננים Micropipette
4 ° C חדר או 4 ° C מקררים עבור חממה cryovials
Cell CoolCell הקפאה מיכל
פיפטור סרולוגיות
Micropippette (1,000, 200 ו -20 μl)
פיפטה חזור Viaflo
(תא חי) Confocal מיקרוסקופ
מַחשֵׁב
מיכל חנקן נוזלי
רב-ערוצי (200 μl)

1. ריאגנטים הכנות לקראת תרבות

"Jove_content"> הערה: כל השלבים מבוצעים בתוך ארון בטיחות ביולוגי ובעקבות הנחיות תקן לעבודה עם תרביות תאים. על מנת להקל על ההיווצרות של טיפות יפות של מטריקס קרום במרתף, לשמור על מניות מחוממות מראש של 96, 24, ו -6 היטב צלחות בחממה על 37 מעלות צלזיוס.

  1. הכנת הבסיס בינוני
    הערה: בינוני בסל (BM) מתייחסת בינוני הנשר השונה של המתקדם Dulbecco עם תערובת המזין של החם F-12 (Ad-DF) השלימה עם 4- (2-hydroxyethil) חומצת -1piperazineethanesulfonic (HEPES), גלוטמין, ו פניצילין / סטרפטומיצין (עטתי / סטרפטוקוקוס).
    1. בתוך בקבוק בינוני 500 מ"ל אד-DF, להוסיף 5 מ"ל של 200 גלוטמין מ"מ, 5 מ"ל של 1 M HEPES, ו -5 מ"ל של פתרונות עט / סטרפטוקוקוס (10,000 יח '/ מ"ל, 10,000 מיקרוגרם / מ"ל).
    2. BM לאחסן במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות לפחות.
  2. Wnt-3A ממוזג הכנה בינונית
    הערה: Wnt-3A ממוזג בינוני מתבצעת ללא צורך במיקור חוץ usinז קו L-Wnt-3A התא על פי הוראות היצרן.
    1. לקציר המדיום Wnt ממוזג-3A, לאסוף המדיום חשוף התאים למשך שבוע ומסובב אותו במשך 5 דקות ב 450 XG כדי להסיר תאים צפים.
    2. מסנן המדיום Wnt-3A ממוזג דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ומחלקים אותו ל -40 aliquots מ"ל ב 50 מ"ל צינורות חרוטי. ולאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 חודשים לפחות ללא הפסד בפעילות.
    3. בדוק את הפעילות של המדיום-3A ממוזג Wnt ב assay TOP / FOP באמצעות כליה עוברית אנושית (HEK) -293 תאים transfected עם העליונה ו-בלוציפראז FOP ו TK- Renilla ומדד עם Renilla -luciferase ערכת assay פי על פי הוראות היצרן.
      הערה: TOP-בלוציפראז הוא פלסמיד כתב המכיל wild-type TCF אזורים מחייבים. אם המדיום Wnt-3A ממוזג פעיל, איתות Wnt הקנונית מופעלת. -קטנין ביתא translocates לתוך הגרעין לשייך שנינותTCF h / גורמי שעתוק LEF ומפעיל שעתוק של כתב בלוציפראז, גרימת עלייה בפעילות בלוציפראז יחסית כאשר המצע הוא הוסיף. FOP-בלוציפראז משמש כביקורת שלילית משום TCF מחייב אזורים במעלה הזרם של הגן בלוציפראז הם מוטציה.
  3. קולון הכנה בינונית
    הערה: הכן לדלל כל גורמי גדילה ריאגנטים פי המלצות היצרנים. השתמש aliquots קטן בגודל מחזורים להימנע להקפיא להפשיר. גורמי גדילה פונקציונליים חיוניים התוצאות.
    1. הכן בינוני המעי הגס (CM) על ידי השלמת BM עם 1x B27, 1.25 מ"מ N-acetylcysteine, 50 ng / ml hEGF, 5 gastrin ננומטר, 10 מ"מ nicotinamide, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 מיקרומטר A83-01 , 10 מיקרומטר SB202190, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של מיקרוביאלית עבור תאים ראשוניים.
    2. מחלקים את CM לתוך aliquots ולהקפיא אותם ב -20 ° C עד 4 חודשים. הפשרת aliquots להכין מעי גס מלאבינוני (FCM) על ידי הוספת 50% Wnt-3A-conditoned בינוני עד CM. חנות FCM עד 7 ימים על 4 מעלות צלזיוס ללא הפסד בפעילות.
    3. להקמת תרבות organoid ביופסיות רקטלי, להשלים FCM עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ונקומיצין, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​gentamycin, ו -10 מיקרומטר rho הקשורים מעכב קינאז מפותל-סליל יוצרי חלבון סרין / תראונין (RhoKi). להשתמש בינוני, בינוני בידוד שנקרא (IM), רק עבור ימי שלוש בתרבות הראשון.
  4. הכנת פתרון במלאי EDTA
    1. כן 0.5 חומצת M ethylenediaminetetraacetic (EDTA), pH 8, ב ultrapure H 2 O, מעוקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
  5. מניפולציה של המרתף מטריקס ממברנה
    1. הכן את מטריקס קרום במרתף (BMM) על פי המלצת היצרן.
    2. הפשרת BMM לילה על קרח.
    3. בעת העברת BMM מהבקבוק עד 15 צינור חרוטי מ"ל, שימושפיפטה 5 מ"ל צינור חרוטי 15 מ"ל מקורר מראש ב -20 ° C.
    4. לאחר מופשר, לאחסן את BMM במקרר ב 4 ° C ו דגירה על קרח למשך לפחות 30-60 דקות לפני השימוש.
      הערה: על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר, BMM חייב להיות קר מעורב כראוי לפני הטבעת מאורות או organoids.

2. הקמת קולון Organoids מתוך ביופסיה בחולי ציסטיק פיברוזיס

הערה: לאחר איסוף רקמות, חשוב לשמור על המדגם על קרח מלוח, פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco ללא Ca 2 + ו Mg 2+ (DPBS), או BM. עיבוד מהיר של הביופסיות מומלץ, אבל היא הוכיחה שאפשר להקים תרבויות organoid ביופסיות מאוחסנות על קרח למשך עד 7 ימים.

  1. תנו ביופסיות להתיישב בחלק התחתון של צינור חרוטי 15 מ"ל ולהסיר את supernatant.
  2. הוסף 10 מ"ל של DPBS אל ביופסיות ו פיפטה מעלה ומטה 10-20 פעמים בעזרת פיפטה 10 מ"ל.
    הערה: פיפטה צריכה להיות מראש רטוב עם BM לפני pipetting הביופסיה.
  3. תנו ביופסיות ליישב בתחתית ולהסיר את supernatant.
  4. חזור על שלבים 2.2 ו -2.3 4-5 פעמים עד supernatant ברור.
  5. הוסף 10 מ"ל של DBPS ו -200 EDTA μl (0.5 מ ') אל ביופסיות ולמקם את הצינור על פלטפורמת מנורות נדנדה עבור 60-120 דקות ב 4 °.
    הערה: זמן דגירה עשוי להיות שונה לכל מטופל. אם מאורות משתחררים, DPBS הופך מעונן. דגירת EDTA יכולה להיות סופית כאשר מאורות ניתן להבחין תחת מיקרוסקופ.
  6. אפשר המאורות להתיישב. בטל supernatant.
  7. קח את 2 מ"ל של BM ולהוסיף אותו צינור חרוטי 15 מ"ל חדש. Shake צינור חדש זה באופן ידני בצורה כזאת כי בתוך מכוסה בע"מ.
  8. בעזרת פיפטה טרום רטוב עם BM, להוסיף 2 מיליליטר של DPBS אל הצינור המכיל ביופסיות ו פיפטה מעלה ומטה 10-20 פעמים.
  9. אפשר הביופסיות להתיישב ולהעביר את DPBS עם מאורות אל חדששפופרת המכילה את 2 מ"ל של BM כי היה מוכן בשלב 2.7.
  10. חזור על שלבים 2.8 ו -2.9 עד אין מאורות יותר משתחררים.
  11. ספין המאורות למטה ב 130 XG במשך 5 דקות ב 8 מעלות צלזיוס.
  12. בינתיים, להעביר הודעות מיידיות אל ארון בטיחות בטמפרטורת החדר (RT).
  13. בטל supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של BM לשלב גלולה וחזור הקריפטה 2.11.
  14. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של BM. קח 5-10 μl ולספור את מספר המאורות לפי עין תחת מיקרוסקופ.
  15. ספין המאורות למטה ב 130 XG במשך 5 דקות ב 8 מעלות צלזיוס.
  16. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 55% BMM (נ BMM כדי IM v).
    הערה: מאורות הם resuspended בהיקף המקביל 55% BMM 1 הקריפטה לכל μl. אם אין מספיק מאורות, ההיקף המינימאלי של BMM הוא 40 μl.
  17. עבור זריעה, פיפטה 35 μl לכל טוב (בצלחת 24 גם). מחלקים את 35 μl של BMM לתוך 3-5 טיפות בנפרד על מנת לשפר את הדיפוזיה של Growth גורם לתוך BMM. אין ליצור בועות.
  18. מניחים ולהשאיר צלחת במהופך בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות עבור BMM כדי לחזק.
  19. הוסף 500 μl של IM לכל טוב ולשמור אותו בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  20. רענן המדיום כל 2-3 ימים. הסר את המדיום הישן ידי pipetting החוצה עם טפטפת P1000, עוזב את BMM טיפות ללא פגע. בזהירות להוסיף FCM ידי pipetting אותו בצד של הבאר, לא ישירות על BMM טיפות.
    הערה: אם לא מאורות משתחררים בפרוטוקול בידוד, בצנטריפוגה supernatant, ולשטוף גלולה 2-3 פעמים עם BM, ו resuspend אותו BMM. קח את רקמת השאריות וחותכים אותו לחתיכות קטנות בעזרת סכין גילוח. אסוף אלה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה אותם, ו resuspend אותם באותה BMM. אם כל תאי גזע אפיתל נוכחים, אלו גם ליצור organoids.

3. Passaging של Organoids קולון עבור תחזוקה, כלבים, וחוץskolin הנגרמת Assay נפיחות (FIS)

הערה: כל תרבות organoid יש זמן הכפלה משלה. בדרך כלל, organoids CF הגס ניתן להרחיב 1: 3-1: 5 פעמים כל 7-10 ימים. זה סימן טוב אם מבנים ניצני הם נצפו. Organoids הגס CF הם פחות פיברוזיס (איור 2 א - 2C) מ organoids נורמלי הגס (2D איור). להקמה ותחזוקה, organoids מתורבת 24 גם צלחות; להקפאה, 6 צלחות היטב; ולמען assay FIS, ב פאטה 96-היטב.

  1. Passaging של Organoids
    1. שמור את BMM על קרח למשך לפחות 30-60 דקות לפני השימוש בו.
    2. שמור את FCM ב RT לפחות 1 שעה לפני השימוש בו.
    3. לייבל אחד 15 מ"ל חרוטי צינור עם השם מדגם צינור אחר כמו "שטף".
    4. בזהירות לשאוב את המדיום המבאר בעזרת פיפטה P1000 מבלי להפריע BMM טיפות.
    5. הוסף 1 מ"ל של BM עד 1 היטב בreak את BMM טיפות באמצעות פיפטה P1000. העבר 1 זה מ"ל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם השם מדגם.
    6. לשטוף היטב עם 1 מ"ל אחר של BM ולהעביר אותו אל הצינור 15 מ"ל אותו.
    7. חזור על שלבים 3.1.5 ו 3.1.6 עם 5 בארות יותר (עד 6 בארות של צלחת 24 גם יהיה שטף באחד 15 מ"ל צינור חרוטי).
    8. מלאו את צינור עד 12 מ"ל עם BM. פיפטה מעלה ומטה בעזרת פיפטה 5 מיליליטר מראש רטוב.
    9. ספין ב 85 XG במשך 5 דקות ב 8 מעלות צלזיוס.
    10. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של BM כדי גלולה. עם אותו קצה פיפטה P1000, תופסים קצה P10 ללא מסנן, ו פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים. בטל הן P1000 וטיפים P10.
    11. הוסף 4 מ"ל של BM עם פיפטה 5 מ"ל והחזק הצינור הטה בסביבות 70 מעלות מהאנך לצד אחד. טרום להרטיב טיפ P1000 חדש ומערבבים נמרצות 2-3 פעמים עם P1000 (נפח 1 מ"ל).
    12. לספור עד 10 תוך שמירה בעמדה מוטה, לאסוף את השכבה העליונה בזהירות wה- i פיפטה P1000, והעברת 4 x 1 מ"ל לתוך הצינור שכותרתו "שטף".
    13. שים לב organoids ליישב לתחתית בצינור המוטה; organoids undisrupted וגושי גדול ישקעו לתחתית. צנטריפוגה 15 מ"ל "שטף" צינור במשך 5 דקות ב 85 XG ו -8 מעלות צלזיוס.
    14. בטל supernatant ולהוסיף את הכמות הנדרשת של בינוניות BMM כדי גלולה organoid לריכוז סופי של 55% BMM. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה מבלי ליצור בועות (איור 3 ב).
      הערה: צפיפות טובה מושגת על ידי זריעת 25-30 organoids ב 10 μl של BMM.
    15. עקוב אחר צעדי 2.17-2.19.
  2. Passaging להקפאה
    1. שמור את BM בקרח במשך לפחות 30-60 דקות לפני השימוש. שמור את FCM ב RT לפחות 1 שעה לפני השימוש.
    2. כן FCM בתוספת RhoKi (שלב 1.3.3).
    3. קח טריפסין מהמקרר ולהשאיר אותה ב RT למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש.
    4. בצע את השלבים 3.1.5-3.1.10.
    5. להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר, להוסיף 4 מ"ל של טריפסין, ו מערבולת למשך 30 שניות.
    6. שים את הצינור באמבט מים חמים על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ו מערבולת במרץ למשך 30 שניות.
    7. בדוק את הפתרון בצינור. אם organoids השלם עדיין נראה תחת מיקרוסקופ, חזור על שלב 3.2.7.
    8. כאשר organoids הם שיבשו, להוסיף 8 מ"ל של BM לנטרל את טריפסין ו פיפטה 10 פעמים.
    9. ספין 3 דקות ב 450 XG ב 8 מעלות צלזיוס.
    10. בטל supernatant ולהוסיף את הכמות הנדרשת של בינוניות BMM אל organoids להגיע לפתרון BMM 55%. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה מבלי ליצור בועות.
      הערה: להקפאה, חייב להיות זורעים organoids ביחס של 1: 1 יחס לאחר trypsinization.
    11. זרע 250 μl בבאר יחידה של צלחת בתרבית רקמה טרום חמם 6 באר, ייצור טיפות זעירות, מופרדים של ~ 10 μl. מניח את הצלחת ההפוכה בחממה ב 37 ° C ולהשאיר אתBMM לגבש במשך 20-30 דקות.
    12. להוסיף 2.5 מ"ל של FCM טרי + RhoKi בכל צלחת 6-היטב היטב ולהעביר את הצלחת אל האינקובטור (איור 3 ג).
  3. Passaging Organoids עבור assay FIS
    הערה: בהתאם למספר והגודל של organoids, בין 4 ל 6 בארות של צלחת 24 גם הם מספיק עבור זריעת 27 בארות של צלחת 96-היטב.
    1. לעבד את organoids כמתואר מצעדים 3.1-3.1.13.
    2. Resuspend גלולה ב 120 μl של 50% BMM.
    3. אשר את מספר organoids (30-50) בטיפת 3 μl BMM תחת מיקרוסקופ.
    4. פלייט organoids שימוש טיפה אחת של 3 μl ממוקם באמצע של כל טוב של פטה 96-היטב.
    5. מניח את הצלחת בחממת 37 ° C במשך 15 דקות עבור BMM כדי לחזק; צעדים נוספים המתוארים בשלב 6.1.1.

4.הקפאת קולון CF Organoids

הערה: איבריםOIDs מוכן להקפיא למטה 1-2 ימים לאחר trypsinization ו culturing, כך organoids עדיין יהיה קטן, דבר אשר מגביר את היעילות של הישרדות לאחר הפשרה.

  1. הוסף 1 מ"ל של BM ולשבור את BMM טיפות בעזרת פיפטה P1000. מעבירים צינור חרוטי 15 מ"ל.
  2. לשטוף היטב עם 1 מ"ל אחר של BM ולהעביר שפופרת 15 מ"ל אותו.
  3. חזור על שלבי 4.1 ו -4.2 עם כל הבארות.
    הערה: כדי למנוע עודף BMM, 3 בארות צלחת 6-גם הם אספו בצינור אחד 15 מ"ל.
  4. מלאו את הצינור 15 מ"ל המכיל את organoids עם 12 מ"ל של קר בע"מ פיפטה מעלה ומטה עם טפטפת 5 מ"ל. השאר את הצינור על קרח למשך 5 דקות.
  5. ספין 3 דקות ב 450 XG ו -8 ° C ולהסיר את supernatant.
  6. ממס את הגלולה של organoids עם ההקפאה בינונית ו פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend את organoids כראוי.
    הערה: 500 μl של מדיום הקפאה משמש עבור כל 100 μl של BMM.
  7. שימוש pipet 5 מ"ל, להעביר 0.5 מ"ל שלorganoids resuspended במדיום הקפאה כדי סטרילית בקבוקונים קריוגני.
  8. העבר צלוחיות למיכל הקפאה תא והכניס אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר 24 שעות, להעביר את הבקבוקונים לאחסון בחנקן נוזלי.

5. הקמת תרבויות מן קפואים Organoids

הערה: להפשיר את BMM על קרח ולשמור אותו על קרח. תנו BM להגיע RT, ויחממו aliquot 10 מ"ל ל 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים את ההליך של cryovial הפשרה אחד.

  1. להפשיר את הבקבוקון במהירות על ידי תסיסה בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שיש עדיין חומר קפוא מעט.
  2. מעבירים את organoids מופשר צינור חרוטי 15 מ"ל בעזרת פיפטה P1000.
  3. מיד לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של ירידה בע"מ חם אחר טיפה תוך רעד התחתון של הצינור. לאחר 1 מ"ל של מדיום נוסף, לערבב בקפידה על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לדלל את המדיום הקפאת.
  4. לאט (טיפה אחר טיפה) להוסיף 9 מ"ל של חם BM אל conta צינור חרוטיining organoids. הפוך כמה פעמים.
  5. ספין ההשעיה תא 3 דקות ב 85 XG ו -8 מעלות צלזיוס.
  6. בטל supernatant בזהירות מבלי להפריע גלולה. Resuspend את organoid ב 90 μl של FCM בתוספת RhoKi (שלב 1.3.3). לאחר מכן, להוסיף 110 μl של BMM.
  7. להוסיף 35 μl היטב בכל צלחת 24 גם מחומם מראש, מה שהופך טיפות זעירות, מופרדים.
  8. מעביר את הצלחת אל 37 ° C החממה, עוזב את הצלחת במהופך במשך 20-30 דקות.
  9. הוסף 500 μl של FCM עם RhoKi היטב כל ולהעביר את הצלחת בחזרה אל האינקובטור (איור 4 א - 4C).
  10. לאחר organoids התאוששו כראוי מן הפשרה, לדלל בלמעלה BMM ולכן כל 10 μl של BMM מכיל 25-30 organoids. הליך זה יכול להיעשות 2-3 ימים לאחר ההפשרה (איור 4D - 4G) ומבטיח את הצמיחה התקינה של organoid.

6. נגרמת Forskolin נפיחותאומר (FIS)

הערה: טיטרציה FSK מאפשרת מדידה של תפקוד שיורי CFTR. עבור אפנון CFTR, organoids נחשף מתקן נתון (למשל, VX-809) ו / או potentiator (למשל, VX-770), תלוי גנוטיפ. בדרך כלל, VX-809 הוא הוסיף 18-24 שעות לפני המדידה, תוך VX-770 ו FSK מתווספים ממש לפני תחילת המדידות. עליך להיות מודע לכך מאפננים כמה (מתקן / potentiators) יכול להיקשר אל פני השטח הפלסטיק של צלחת assay.

  1. ציפוי עבור assay
    הערה: מניות VX-809 הם aliquoted ב 20 מ"מ ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס. כאשר מפשיר, לעזוב ב RT ולהגן מפני אור.
    1. לעבד את organoids כמפורט בסעיף 3.3.
    2. אם בודקים את מתקן VX-809, להכין עקומת מנה-תגובה ב triplicates עם הריכוזים הבאים: 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0, ו -30 מיקרומטר. כן הדילולים ב FCM.
    3. אל צלחת 96-היטב, להוסיף או 100 μ; L של FCM עם VX-809 ריכוז או 100 μl של FCM בהתאמה רק דגירה הצלחת.
  2. מדידת Assay
    הערה: VX-770 מניות הם aliquoted ב 20 מ"מ, בעוד FSK נמצא במרחק של 10 מ"מ; שניהם מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס. כאשר מפשיר, ומשאירים בטמפרטורת החדר ולהגן מפני אור.
    1. קח בקבוקון של calcein ו DMSO ולהשאיר ב RT במשך 15 דקות.
    2. להוסיף 5.1 μl של DMSO כדי הבקבוקון שבו calcein מסופק כאבקה, אם לא נפתח. אחרת, להשתמש בקבוקון calcein resuspended כבר המכיל 2.5 μl של calcein.
    3. להוסיף 2.5 μl של calcein ל -580 μl של BM צינור 1.5 מ"ל ולתייג אותה.
    4. הוסף 10 μl של פתרון צבע זה (BM + calcein) זה טוב בעזרת פיפטה חוזרים.
    5. Resuspend פעם עם רב על מנת להבטיח כי הצבע מעורבב היטב.
    6. דגירה את הצלחת באינקובטור 37 ° C למשך 30 דקות.
    7. במהלך הדגירה calcein, להתחיל להכין את FSKופתרונות VX-770, אם יש צורך בכך.
    8. אם אתה משתמש potentiator VX-770, להכין עקומת מנה-תגובה בשלושה עותקים עם הריכוזים הבאים: 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0, ו -30 מיקרומטר. במקרה של טיטרציה FSK, הריכוזים הם: 0, 0.008, 0.02, 0.05, 0.12, 0.32, 0.8, 2.0, ו -5.0 מיקרומטר. הכן את הדילולים בע"מ.
      הערה: לקבלת FSK, VX-770, או כל תרופה אחרת הוסיפה ביום השני, חייבים להיות מוכנים הדילולים בריכוז סופי 2x, מאז 100 μl של FSK / סמי טיטרציה פתרון יתווסף כל טוב, שכבר מכילים 100 μl של FCM.
    9. מעבירים את FSK ופתרונות VX-770, פיפטה p200, וטיפים לחדר מיקרוסקופ.
    10. הדמית assay FIS, השתמש במיקרוסקופ confocal הדמית תא חי מצויד שלב אוטומטית, מחומם חדר, ותזרים 2 CO.
      הערה: השלבים הבאים מתייחסים מיקרוסקופ ספציפי. setups השונה צריך לחול מיקרוסקופים אחרים בא יצרןהוראות.
    11. מכניסים את הצלחת 96-היטב בעל צלחת.
    12. הזן את הגדרות confocal הדמיה.
      1. מראש את כלי הדמיה לחיות עד 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולתת לתא מראש דגירה למשך תקופה מינימלית של 30 דקות לפני המדידה.
      2. השתמש באפשרות "חכמה ההתקנה" כדי לבחור את מסלול Alexa פלואוריד-488.
      3. הגדר את עדשת 5X ואזור סריקת 0.6X כדי להתרחק וללכוד הבאר כולו.
      4. התאם את הרגישות כוח גלאי לייזר כדי לאפשר זיהוי אופטימלי של organoids שכותרתו ירוק calcein מעל ברקע. החריר ניתן להגדיל עד 130 מיקרומטר ו מיצוע התמונה ניתן להגדיר 2.
      5. הגדר את העומק הסיבי ב 8 ואת גודל מסגרת 512 x 512.
      6. השתמש באפשרות סדרת הזמן כדי להגדיר את הזמן, תדירות מדידה, ומרווחים.
        הערה: המומלצת למדידות רגילות: 1 hr עם 10 דקות הפסקה: מחזורים = 7 (מחזור 1 הוא T = 0). עבור מדידות של הנפיחות ירדה organoids ניתן הדמיה של עד 3 שעות.
      7. השתמש באפשרות אריח כדי לקבוע את העמדות של הפרט באופן ידני.
    13. הוספת 100 μl של FSK ו / או VX-770 פתרונות בארות המקביל, בעקבות אותו סדר גודל כמו המדידה. מתחיל להוסיף הפתרונים הראשונים צלמו היטב להמשיך עם הסדר ההדמיה.
    14. התחל את המדידה.
    15. לאחר הניסוי נגמר, לשמור את הקובץ.
  3. ניתוח של נתוני Assay FIS
    1. צור מאקרו "ניתוח organoid" לניתוח הנתונים של assay FIS שימוש באפשרות ניתוח תוכנת ניתוח תמונה שמכירה כל המבנים צלמו דרך מסלול Alexa-488 וממלא מבנים שזוהו עד לחשב את העלייה של אזור organoid המלא על בנקודות זמן שונות.
    2. פתח את קובץ הנתונים עם תמונות שנרכשו בתוכנית ניתוח התמונה.
    3. בחר את המאקרו לניתוח organoid.
    4. <li> הגדר את סף לאזן את יחס אות לרעש באחד היטב בשלב נקודת 1 ולהבטיח כי כל המבנים organoid מוכרים ומילא.
      1. הגעת 4-6 בארות כדי לראות אם כל המבנים מוכרים גם בנקודת זמן 7. מעט לשנות את הסף על מנת להבטיח כי אותות הרקע בנקודת זמן 7 אינם מוכרים מבנים (הסף הספציפי עשוי להשתנות במקצת בין ניסויים).
    5. הגדר את הקריטריונים של גודל השטח המינימלי של אובייקטים מוכרים 1,000 מיקרומטר 2.
    6. לחץ "לנתח" כדי להתחיל. הניתוח לוקח כ 3 דקות, בהתאם לתוכנה בשימוש.
    7. כאשר התוכנה סיימה, ללכת על "פתח שולחן" ובחר את הנתונים הבאים: גם מספרים (שולחן צריך להגדיל בסדר הזה), בנקודות זמן, ואת השטח הכולל לכל טוב.
    8. שמור את הקובץ כקובץ .xlm לייצא תוכנית גיליון אלקטרוני.
    9. בתוכנית זו, לחשב את העלייה היחסית באזור לכל well על ידי קביעת השטח של נקודת זמן 1 ב 100%. ולחשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) מנקודות זמן 1-7 לכל מצב; הגבול התחתון של האזור (Y-ערך) מוגדר ב 100%. titrations FSK או סמים (ציר ה- X) הם זממו נגד AUC (ציר Y).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1A מראה בידוד טרי נציג של מאורות מוטבעים על BMM. המאורות הם מ ביופסיה גסה של נושא CF. לרוב, מוסיפים organoid מופק כל כוך (איור 1 א - ג). בשל התפקוד הלקוי של CFTR, רוב organoids CF המעי הגס אינם פיברוזיס, אלא הם קומפקטיים עם תחזיות buddings (איור 2 א - 2B). עם זאת, חלק CF organoid תרבויות, במיוחד עם פונקציה שיורית גבוהה, יש כמה organoids עם צורה פיברוזיס (איור 2 ג), כמו בתרבויות organoid wild-type (איור 2 ד).

לפני passaging organoids להרחבת תרבות או שהזרעים הבשילו assay FIS, חשוב כי יש organoids בגודל גדול עם buddings מרובים, כפי שמוצג באיור 3 א. אם organoids קטן וללא nbuddings umerous כאשר מעובד passaging, התרבות organoid מושפע לשלילה. בהתאם לאיכות ופעילות של גורמי גדילה החיוניים כמו EGF, Wnt-3A, ו Rspo3, את organoids להגיע לגודל הרצוי בין 7 ל 12 ימים (איור 3 א). לאחר הפרעה מכנית, buddings הם שיבשו ו המשמש לייצור organoids חדש בקטע הבא (איור 3 ב). אם עיבוד organoids להקפאה, חשוב כי הם trypsinized לגודל קטן, כפי שהוא מיוצג באיור 3C. לאחר trypsinization, את organoids הם מצופים עבור 1 או 2 ימים על מנת לאפשר להם להתאושש מן הלחץ של המניפולציה. צעד זה, יחד עם הגודל הקטן של organoids, מבטיח התאוששות תא 98% לאחר ההפשרה (איור 4 א).

כאשר organoids הם הפשירו, חשוב שיהיו להם בצפיפות גבוהה, כך בדרך כלל, הם מופשרים בתוךנפח קטן (Figure4A). לאחר יום או יומיים בתרבות, ואחרי התבוננות כי organoids מתרבים גודל (השווה איור 4A עם איור 4B - 4C), את organoids מדוללים ביחס של 20-30 organoids לכל 10 μl של BMM, מתן בצפיפות הנכונה לגדול לתוך גודל גדול. אם organoids מדולל מדי, הם יכולים להאט את הצמיחה ואף יכולים להבדיל ולמות. אם organoids עמוס מדי, חוסר המקום או המחסור של גורמי גדילה גם מאט את הצמיחה של organoids ומקטין את מספר buddings.

ציפוי של organoids מתרבויות קיימא עם פסולת הסלולר מוגבלת צריך לגרום התנאים שבהם> 95% של organoids להתנפח על גירוי FSK, ובלבד פונקציה CFTR מספיק נוכחת (איור 5 א - 5 ב). Organoids להתנפח בצורת genotype- סמים תלויה, כפי מאויר על ידי נציג תמונות של organoids עם שני אללים F508del (איור 5 א) ו organoids מתחם הטרוזיגוטיים F508del ו S1251N (איור 5), מוטציה gating CFTR הקשורים עם תפקיד שיורית.

כדי לכמת נפיחות, שטח פנים calcein-ירוק הכולל נבחרים לכל נקודת זמן מבוטא כאחוז של T = 0 (נקבע על 100%; איור 6 א). רסיסים קטנים, שאינן נפיחות מבנים הם בדרך כלל מתחת ל -5% של שטח הפנים הכולל. הגידול באזור היחסי מתבטא לכל ער זמן 10 דק ', ו AUC (יחידות שרירותיות) מדידות נוצרות עבור כל תנאי (ט = 0 עד 60 דק', סף הבסיס נקבע על 100%; איור 6). מצאנו AUC להיות הכי חזקים, כפי שהיא משלבת כמה וריאציה בייזום של נפיחות, כמו גם מערכת יחסים curvilinear מעבר 30-40 דקות של FSK ברמות תפקוד גבוהה CFTR.

"Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> מדידות פונקציה השיורי F508del / organoids F508del בדרך כלל להגיע 0-200 יחידות AUC (100-110% של עלייה שטח הפנים לאחר 60 דקות של טיפול 5 מיקרומטר FSK) , אשר יכול להגדיל ל ~ 2,500-3,500 יחידות AUC על דגירה עם מאפנני CFTR (VX809 + VX770; איור 6 ג). Organoids הקשורים בתפקוד שיורית CFTR יכול להגיע עד ל -4,500 יחידות AUC לאחר 60 דקות של גירוי 5 מיקרומטר FSK בהעדר מאפננים CFTR (שטח הפנים 200-220% מכל המצבים מראש FSK). נפיחות Organoid מגיעות לתקרה ב ~ 4,500 יחידות AUC, ככל הנראה בשל המגבלות הפיזיות של מבני organoid, השפעת שער הגבלת תחבורת יון basolateral, והקמת הומאוסטזיס יון נוזלת-תחבורה בתנאים "נמתח". ניתן טיטרציה FSK להרחיב את הטווח הדינמי נוסף של assay ברמות תפקוד שיורי CFTR הגבוהות אלה כדי לכמת פונקציה שיורית טובה יותר או יעילה טיפול מורכב (למשל, כפי שצוין על ידי הפעילות הגבוהה של VX770 על הנפיחות של organoids S1251N על גירוי עם ריכוזי FSK נמוכים; איור 6 ד).

איור 1
איור 1: הקמת organoids הגס CF ביופסיות. (א) נציג תמונות של חומר מבודד ביופסיה רקטלית לאחר מוטבע BMM ביום בידוד (מעבר 0, יום 0). הגדלה של הקריפטה המצוין מוצגת בלוח הימני התחתון. אותו (B) מאורות היו במעקב לאחר 7 ימים בתרבות (מעבר 0, יום 7). הרחבה של אותו הקריפטה המוצג פנל מוצגת. (C) תמונה תציג אותה תרבות organoid 11 ימים לאחר הפיצול (מעבר 1, יום 11). ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר.
159fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תמונות נציג organoids CF הגס נגזר נבדק עם מוטציות CFTR שונות. נציג תמונות של organoids הגס CF מן הנבדקים עם F508del / F508del (א), F508del / R117H-7T (B), ואת F508del / S1251N (C) מוטציות. (D) תמונת נציג תרבות organoid גסת מנושא CFTR wildtype. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. תמונות אלה התקבלו ללא גירוי FSK. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5159 / 55159fig3.jpg "/>
איור 3: organoids המעי הגס CF עיבוד לצורך תחזוקה assay או להקפאה. (א) נציג תמונות של תרבות המעי הגס CF organoid מוכן להיות מעובד או passaging (B) או הקפאה (C). (ב) לאחר ההפרעה המכאנית שלהם, חתיכות קטנות נוצרות, אשר תפיק את organoids החדש לקטע הבא. (ג) לאחר trypsinization, מאוד קטן, organoids העגול נוצרים, הקלת הכדאיות שלהם במהלך תהליך ההקפאה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הקמת תרבות organoid CF גסה מן organoids הקפוא. (<> חזק A - C) נציג תמונות של תרבות CF גסת organoid מופשרות ביום 0 (א). תמונות מאותה הבאר נלקחו אחד (B) ושני (C) ימים לאחר. (D - G) נציג תמונות של צעד דילול בסעיף 5.9. לאחר organoids התאושש כראוי מן הפשרה (יום 3 לאחר הפשרה), הם מדוללים ולכן יש להם מקום לגדול (D). תמונות מאותו היטב נלקחו שש (E), עשר (F), וחמש עשרה (C) ימים לאחר ההפשרה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: נפיחות הנגרמת Forskolin של CForganoids. (A ו- B) נציג תמונות של F508del / F508del (א) או F508del / S1251N (B) organoids הגס לפני או אחרי 60 דקות של גירוי עם FSK (5 מיקרומטר) בהעדר או בנוכחות VX-770 (3 מיקרומטר]) או VX-770 בשילוב עם VX-809 (3 מיקרומטר). ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: כימות Forskolin-induced נפיחות. (א) נציג תמונות של אזור הבחירה organoid ידי תוכנת ניתוח תמונה של F508del / S1251N organoids לפני (0 דקות) ולאחר 60 דקות של גירוי עם FSK (5 מיקרומטר) ו VX770 (3 מיקרומטר). ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר. (ב) Represתמונות entative הגידול באזור היחסית של F508del / F508del או F508del / S1251N organoids במהלך 60 דקות של FSK (5 מיקרומטר) גירוי בהעדר או בנוכחות VX770 (3 מיקרומטר) ו / או VX809 (3 מיקרומטר). שטח (C) תחת המדידות העקומות תנאים מצוינים (B) (T = 60 דק ', = סף בסיס 100%). שטח (D) תחת המדידות העקומות של F508del / F508del או F508del / S1251N organoids בריכוזים שונים של FSK. הנתונים מייצגים את ממוצע ± סטיית תקן מניסויים נציג יחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מלא ל הדור, הרחבה, הקפאה, הפשרה של organoids הגס האנושי. בעוד הקמנו תרבויות organoid אדם קצת זמן לפני 17, זה לפעמים הוכיח קשה לקבוע את הטכנולוגיה במעבדות אחרות בלי הדרכה מעשית. אנו צופים כי הפרוטוקולים הללו יחליפו הכשרה כזו.

Wnt-3A ממוזג בינוני הוא אחד ריאגנטים החיוני ביותר על מנת להצליח בהקמת ואחזקה לטווח ארוך organoid תרבות. ואכן, בתרבויות organoid אולי "התרסקות" כאשר הם נחשפים Wnt-3A-conditoned בינוני עם פעילות נמוכה. מאז Wnt-3A ממוזג בינוני מתבצעת ללא צורך במיקור חוץ, ישנם מספר היבטים שיש לקחת בחשבון בעת ​​יצירת מדיום פעיל. Wnt-3A פעיל יכול להיות מיוצר רק במדיום עם סרום שור העובר באיכות גבוהה (FBS) המספק את האותות לצמיחה תקינה של תאים L והתייצבות הידרופובימולקולות-3A Wnt. כשפעילות Wnt-3A הוא נמוך (כלומר, TOP נמוך / יחסי FOP, ראה להלן), זה בדרך כלל FBS כי היא זו שגורמת לבעיה.

Wnt רקומביננטי המסחרי עובד גרוע, אז אנחנו לא ממליצים להשתמש בו כביקורת חיובית ובאשר assay כתב TOP / FOP Wnt. היחס בין TOP / Renilla ו FOP / Renilla הוא אינדיקציה לפעילות Wnt של המדיום מותנה, כך אצווה טוב של המדיום Wnt-3A ממוזג נותן יחס TOP / FOP גבוה מ -25, לעומת הערך TOP / FOP מ הביקורת השלילית: בינוני שלא נחשפו תאים-3A-ייצור Wnt. שגולגולת רקומביננטי ו R-spondin יכולים להיות מוחלפים על ידי שהגולגולת ו- R-spondin ממוזג בינוני 28, 29.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר גם מבחן פונקציונלי עבור CFTR-the assay FIS. אנחנו הוכחנו את הקשר לאחרונה בין גנוטיפ CFTR ו FIS ואיך זה משקף genoty CFTR שפורסםיחסי PE-פנוטיפ המתקבלים מרשמיים קליני (www.CFTR2.org) 25. שימוש assay זה, שני אנשים עם מוטציות CFTR נדירים ביותר זוהו organoids אשר היו מגיבים ivacaftor (VX-770) 25. מרשם עוקב של תרופה זו הביא תגובה קלינית מובהקת, המדגיש את הערך של assay FIS להתאים תרופות ספציפיות עם חולים עם מוטציות נדירות בהעדר נתוני ניסויים קליניים. אתריים עבור כימות של FIS הם תנאים לצמיחת assay אופטימליים, גורם היחיד המעיד על חלק מצומצם של organoids שאינם נפיחות (בדרך כלל מתחת ל -5%). רמות גבוהות של פסולת להוביל הערכה נמוכה מדי של נפיחות, כמו שיעור גבוה יותר של אי-קיימא, מבנים שאינם נפיחות מוכרים על ידי תוכנת ניתוח התמונה.

קורלציות בין במבחנת FIS תגובות-הוקמו בעבר סמני CFTR התלוי (ריכוז כלוריד זיעה intestמדידות זרם Inal) ברמה אישית היו להוכחה בקלות במחקרים הקודמים שלנו 19, 25. זה תמך ברעיון כי מדידות פונקציה שיורית באמצעות FIS בנושאים עם CF עשויות להשלים גישות עכשוויות כסמן אבחון או פרוגנוסטית בצורה אישית. התפוקה של assay FIS לעומת סמנים ביולוגיים אחרים של תפקוד CFTR, כגון מדידות ריכוז כלוריד זיעה in vivo ומדידות הנוכחי מעיים בביופסיה רקטלית vivo לשעבר, מאפשרת בקרה טובה יותר של השתנות טכנית. הוא גם מספק readout CFTR תלוי לחלוטין טווח דינמי גדול באמצעות טיטרציה של FSK במדויק סוגי פונקצית CFTR שיורית.

עם זאת, assay FIS משקף רק את ההשפעה של גנוטיפ הפרט על השתנות של יעילות התרופה, בעוד אפנון של מחלת CF מושפע יותר מאשר פונקציה CFTR בלבד. לקבלת druבתגובה גרם, assay הוא רעיונית של תגובת רקמות פוטנציאלית. אמנם מאוד מדויק במדידה CFTR, וריאציה האדם הפרמקוקינטיקה אינו מאוגד, להבדיל אחרים in vivo 7, 8 או מדידות CFTR vivo לשעבר ישירה 32. כפי שנאמר קודם לכן, מכפילי CF הלא (הן גנטיים וסביבתיים) גם משפיעים פנוטיפ, גרימת נתק בין תצפיות חוץ גופית או סמנים ביולוגיים CFTR לבין פנוטיפ 2 קליניים. יתר על כן, זיהוי של מוטציות פוטנציאל תגובה באמצעות שורות תאים 33 מזוהה עם פחות השפעה על חולים הזקוקים לקבל ביופסיה רקטלית להקמת organoids.

תרופות CFTR-מיקוד מרובה כרגע בפיתוח 1. זה צפוי כי ניסויים קליניים לא ייאפשרו ניבוי נכון של b יעילות הקליניתased על מצב מוטציוני CFTR לבד. כמו assay FIS מודד תפקוד CFTR ותגובה התרופה מבחינה תפקודית, הוא עשוי להפוך את שיטת הבחירה לקבוע באיזו תרופה עובד הכי טוב עבורו המטופל. את assay FIS יכול להיות גם שימושי עבור זיהוי של קבוצות חולות להיכלל בניסויי רישום לפיתוח שיטות תרופה חדשניות. גירוי של organoids הגס עם פלזמה לפני ובמהלך הטיפול עשוי לעזור עוד יותר לכמת כמויות תפקודיות של מחזורי מאפנני CFTR בדם, באופן פוטנציאלי להקל מינון אישי והבחירה במינוני תרופה בניסוי קליני 30, 31. לבסוף, FIS עשוי להיות שימושי עבור הבנה בסיסית יותר של תפקוד CFTR ויחסי הגומלין שלהן עם אחרים -אז כה בעיקר מכפילים גנטיים unknown- תפקידיו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תכנית HIT-CF של קרן CF ההולנדית (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), קרן המחקר החולה וילהלמינה הילדים ו CZ, ו Zilverenkruis / Achmea. ברצוננו להודות ס Heida-מישל, M. Geerdink, KM דה וינטר-דה גרוט, וג 'Berkers (מחלקת ריאות ילדים, ביה"ח של וילהלמינה ילדים, UMC אוטרכט), ו RHJ Houwen (המחלקה לגסטרואנטרולוגיה ילדים, וילהלמינה בית החולים לילדים, אוטרכט UMC) מתקרב החולים מקבלים ביופסיות עבור הדור של Biobank CF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4, (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16, (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45, (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67, (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106, (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108, (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363, (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13, (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2, (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373, (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13, (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165, (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19, (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, (1), e27112 (2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15, (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8, (344), 344ra84 (2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266, (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143, (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48, (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14, (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192, (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11, (3), 237-245 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics