Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir
1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Published 2/11/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CF bir epitel anyon kanalı kodlar kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) geninde mutasyon neden olur. CF dünya çapında 1 yaklaşık 85.000 kişiyi etkilemektedir. 2000'den fazla CFTR mutasyonları (tespit edilmiştir www.genet.sickkids.on.ca ). Bu çeşitlilik, kısmen görülen hastalık fenotipleri (çok geniş bir yelpaze açıklar www.CFTR2.org ) 2, 3. CFTR mutasyonu altı sınıfları CFTR proteini ifade ve işlevi üzerindeki etkisi göre tanımlanmıştır: (i) sentezi (II) bozulmuş trafik, (III) hatalı kanalı geçit (IV) 'değiştirilmiş iletkenliği, (V), normal olarak, azaltılmış seviyelerde CFTR işleyen ve (VI) bozulmuş hücre yüzey kararlılığı 4. Ortak CFTR mutasyonlar iyi çalışılmış olmasına rağmen, CFTR fonksiyonu ve klinik durumu ile ilişkisi poorl kalıry özellikle nadir "yetim" mutasyon (büyük bir grup için, birey düzeyinde anlaşılan www.CFTR2.org ) 1, 3.

Son zamanlarda, ilaçların mutasyon belirli bir tarz içinde CFTR proteini hedef geliştirilmiştir. CFTR proteini hedefleme ilaçların iki sınıf klinik şu anda kullanımda olan ve eylem farklı modu var. Böyle VX-770 olarak Potansryatörler, apikal-lokalize mutant CFTR açık olasılığını artırmak ve hücrelerin 5 onların ilavesinden sonra doğrudan etki. Böyle VX-809 olarak Düzelticiler, endoplazmik retikulum-lokalize katlanan CFTR ticaretini yeniden ve etkileri önce hücreler 6 gözlenmektedir önceden inkübasyon gerektirir. CFTR potensiyatör, VX-770, hem de diğer sekiz olarak, G551D mutasyonu 7, 8 ile denekler için tescil edilmişCFTR S1251N 9 da dahil olmak üzere mutasyon yolluk; Birlikte, bu mutasyonların KF deneklerin% 5 tarafından taşınır. Diğer klinik çalışmalar, VX-770, düzeltici VX-809 ile birlikte, akciğer fonksiyonu üzerinde henüz önemli etkileri sınırlı olduğu belirtilmiştir ve hastaların 10% 45-50 taşıdığı F508del mutasyonu için homozigot bireylerde alevlenme oranlarında azalmaya neden var 11.

KF hastalarının kalan% 50 içinde uyuşturucu duyarlı kişileri belirlemek geleneksel klinik çalışmalar maliyetli ve zaman alıcıdır ve çok nadir CFTR genotipleri olan bireyler için uygun değildir. Roman, maliyet-etkin, kişiselleştirilmiş yöntemler CFTR mutasyonu her türlü taşıma bireylere CFTR modülatörlerinin artan sayıda maç için çok önemlidir. Şimdiye kadar, belirli CFTR mutasyonları taşıyan hasta gruplarında deneme eklenmesi h mutant CFTR gen transfeksiyon kullanarak çalışmalar rehberliğinde edilmiştirodaları 5, 6, 12 Ussing elektrofizyolojik çalışmalar takip eterologous hücre sistemleri. Nedeniyle CF akciğer eksplant malzemeleri elde edilen hava-sıvı arayüz diferansiye bronşiyal epitel hücrelerinin yeterli CF hayvan modellerinde, ilaç etkinlik çalışmaları eksikliğine ilaç geliştirme 13, 14, 15 kullanılmıştır. Ancak, akciğer eksplant doku ve invaziv prosedürlerin sınırlı sayıda daha az yaygın CFTR mutasyonlar analizini engel son dönem hastalığı olmayan kişilerde bronş hücreleri almak ve kişiselleştirilmiş bir şekilde uyuşturucu testi önlemek için. Bu sınırlamaları gibi kolorektal organoids, burun hava yolu hücreleri ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen havayolu hücreleri gibi "kolay erişim" dokuların, üstesinden gelmek için, şu anda kişiselleştirilmiş ilaç tedavileri için araştırılmaktadır.

16, 17 biçiminde bir mide-bağırsak bir organ kültür epitel kök hücrelerine protokolleri. insan kolon / rektum için kültür koşulları tanımlanmış barındırır büyüme faktörleri (epitel büyüme faktörü (EGF), gastrin, Wnt-3A, R spondin 3 (Rspo3) ve Noggin) küçük moleküller (nikotinamid, A83-01 ile birlikte, bir bazal membran matris içinde ve SB202190). Bu koşullar altında, bir kök hücre ya da küçük doku parçaları dışarıya doğru yönlendirilmiş olan taban yüzü yüksek polarize epitel oluşturduğu kapalı kistik 3D yapıları içine büyür. Tüm hücre tipleri genellikle normal oranlarda ve konumlarda da görünebilir. Organoids haftalık mekanik bozulma ve yeniden kaplama uzun süreler boyunca açılabilir. Bunlar genetik ve fenotipik kararlı ve uzun süreli yayılmasını ve biyo-bankacılık 17 izin saklanabilir. Onlar mükellef bulunmaktadırTüm standart hücre / biyolojik genetik manipülasyonlar ve analitik teknikler 2B hücre hatları 18 için geliştirilmiş.

Son zamanlarda CFTR işlevi hali hazırda, bir forskolin kaynaklı şişme (FIS) deneyi 19, 20 kolorektal organoids ölçülebilir olduğunu göstermiştir. Kolera toksini alternatif forskolin (FSK) ya da, maruz kaldıklarında, organoids hızla kendi siklik adenozin monofosfat (cAMP) seviyeleri artıran CFTR kanal 19 açılması yol açmasıdır. Bireylerden, veya kalıntı işlevi ile ilişkili CFTR mutasyonu olan deneklerden Organoids ardından organoid lümen sekretuar ishal in vitro eşdeğer iyonu ve su taşıma bir sonucu olarak şişer. CFTR boş bireylerden türetilen organoids ile gösterildiği gibi kolorektal organoids arasında FIS cevabı, daha önce tam olarak CFTR bağlı olduğu gösterilmiştir birSpesifik bir farmakolojik CFTR önleyicileri 19 kullanımı ile nd. Büyük konuya özel veri setleri biyopsi aldıktan sonra birkaç hafta içinde elde edilebilir.

Burada detaylı bir şekilde tarif FIS deneyi için organoids herhangi bir yaşta ve sadece sınırlı bir rahatsızlık 21 elde edilebilir rektal biyopsilerinden kültürlenir. Organoids kolayca yeniden mühürlemek ve yeni organoids oluşturan tek crypts içine mekanik bozulma ile haftalık geçişli. FIS deneyi çalıştırmak için, ~ Bu bozulmuş küçük organoids 30-80, 96 oyuklu bir plaka 19 her çukuruna yerleştirilir. Deney gününde da organoids kalsein yeşil, canlı görüntülenmesini kolaylaştırmaktadır, canlı hücreler içinde yerinde tutulan bir floresan hücre geçirgen boya ile boyanır. Daha sonra, hücre içi cAMP yükseltir ve böylece CFTR aktive FSK,, organoid şişme teşvik etmek için ilave edilir. Apikal CFTR üzerine hareket potansiyatörler eşzamanlı W ilave edilirforskolin i, CFTR ticaretini geri düzelticisi ise FSK ilave edilmeden önce 24 saat eklenir. organoid şişme forskolin ilave edilmesi üzerine, her bir zaman noktası için, tüm fluoresan toplam nesne bölgede göreli bir artış hesaplar otomatik bir görüntü analizi ile saptanır.

3D şişme odaları Ussing 2B kültür havayolu hücrelerinde mevcut elektrofizyolojik CFTR okumalarla üzerinde avantaj ve dezavantajlarını sağlar organoid. Önemli bir avantajı, şişme tahlilin kapasiteye sahip olmasıdır. Hücreler ekilir ve kültür ortamının tek bir türünü kullanarak tahlil edilmiştir ve deneyimli bir teknisyen 12 hasta numunelerinde yaklaşık olarak haftada 1200 veri noktası kültürü haftalık olarak 25 organoid örneğe kadar miktarının süre. Biz geleneksel plaka başına yinelenen veya üç ölçümden tek bir deneysel koşul yazıp üç bağımsız inkübasyon süresi noktalarında bu tür ölçümleri tekrarlayın. Toplamda yaklaşık 300-500 single organoid yapılar daha sonra sınırlı teknik değişkenlik CFTR fonksiyonu çok hassas ölçümler yol açar deneysel koşul başına ölçülür. Bu hassas bize açıkça CFTR modülatörlere rezidüel fonksiyon ve tepki farklılıkları tanımlamak için izin verir ve kolayca özdeş CFTR mutasyonları 19, 22, 23, 24, 25 taşıyan hastalar arasında genetik arka plan efektleri almak için bize izin verir. Veri kalitesi kolaylıkla mikroskop görüntülerinden tespit edilebilir. FIS tam CFTR bağlı iken, CFTR fonksiyonu için dolaylı bir ölçüm sonucudur, sıvı taşıma, iyon taşıma bağlanması neden olan Okuması. Bu transepitelyal iyon akımları 26 ölçmek Ussing odalarına doğrudan CFTR fonksiyonu ölçümleri ile çelişmektedir. Ussing odaları apikal veya bazolateral c seçin uyarılması izinompartments (organoid deney izin vermez); bazolateral membranlar permeabilizing tarafından, apikal CFTR-bağımlı anyon salgılanması seçici 27 ölçülebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan insan dokuları kullanılarak tüm deney Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi etik kurul tarafından onaylandı (UMCU; TcBio # 14-008). Doku toplanması, üretimi, depolanması ve organoids kullanımı için bilgilendirilmiş onam Wilhelmina Çocuk Hastanesi (WKZ) -UMCU hastaların elde edildi.

ekipman tüketilir Araçlar
Laminer akış kaputu 15 ve 50 ml konik tüp Zeiss LSM 800 - görüntüleri ölçmek için Zen 2 (Mavi baskı) yazılım
CO 2 inkübatör mikrofüj tüplerine Microsoft Excel programı
Hücre kültürü Mikroskop (ışık / optik mikroskop) 0.22 um filtre
Santrifüj serolojik pipetler
Rolling Shaker Mikropipet filtre ipuçları
inkübatör 4 ° C ila oda ya da 4 ° C buzdolabı cryovials
Container Donma CoolCell Hücre
serolojik pipet
Micropippette (1000, 200 ve 20 ul)
Viaflo tekrarlayın pipet
(Canlı hücresi) Konfokal Mikroskop
Bilgisayar
Sıvı azot tankı
Çok kanallı (200 ul)

Kültür hazırlanması 1. Reaktifler

  1. Bazal Orta Hazırlık
    Not: bazal ortam (BM) (4- (2-hydroxyethil) ile takviye edilmiş Ham besin karışımı F-12 (Ad-DF) -1piperazineethanesulfonic asit (HEPES), glutamin ve penisilin / streptomisin ile gelişmiş Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı kalem değinmektedir / Strep).
    1. 500 ml'lik bir Ad-DF ortamı şişesinde, 5 ile 200 mM glutamin mi, 1 M HEPES 5 ml ve pen / strep çözeltilerinin 5 ml (10.000 U / ml, 10,000 ug / ml) ekleyin.
    2. en az 4 hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında saklayın BM.
  2. Wnt-3a-koşullu ortam hazırlanması
    NOT: Wnt-3A klimalı ortam yapılır içi istimalg, üreticinin talimatlarına göre hücre çizgisi, L-Wnt-3A.
    1. Wnt-3A klimalı ortam hasat için, bir hafta süreyle hücrelere maruz orta toplamak ve yüzen hücreleri çıkarmak için 450 xg'de 5 dakika için aşağı doğru döndürün.
    2. 0.22 um'lik bir filtreden Wnt-3a-koşullu ortam filtre edin ve 50 ml konik tüp içinde 40 ml alikotları bölün. aktivitede bir kayıp olmadan en az 4 ay için 4 ° C'de saklayın.
    3. Insan embriyonik böbrek (HEK) kullanarak bir TOP / FOP tahlilinde bir Renilla ile üst ve FOP-lusiferaz ve TK- Renilla ile transfekte edilmiş ve ölçülen -293 hücre Wnt-3a-kıvamlandırılmış ortam aktivitesini test etmek için uygun deney kiti Lusiferaz üreticinin talimatları.
      Not: Üst lusiferaz vahşi tip TCF bağlanma bölgelerini içeren bir raportör plazmiddir. Wnt-3A-klimalı ortamda aktif ise, kanonik Wnt sinyal devreye girer. Beta-katenin zekâ ilişkilendirmek için çekirdeğin içine translocatesH TCF / LEF transkripsiyon faktörleri ve alt tabaka ilave edildiğinde nisbi lusiferaz aktivitesinde bir artışın uyarılması, lusiferaz raportör transkripsiyonunu aktive eder. TCF mutasyona uğratılır lusiferaz geninin yukarı bağlanma bölgeleri için FOP-lusiferaz, negatif kontrol olarak kullanılır.
  3. Kolon Orta Hazırlık
    NOT: hazırlayın ve üreticinin tavsiyelerine göre tüm büyüme faktörleri ve reaktif sulandırmak. küçük boyutlu alikotları bir kaçının donma-çözülme döngüleri kullanın. Fonksiyonel büyüme faktörleri sonuçları için gereklidir.
    1. 1 x B27, 1.25 mM N-Asetilsistein, 50 ng / ml hEGF, 5 nM gastrin, 10 mM nikotinamid, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 uM A83-01 ile BM ilave, kolonun orta (CM) hazırlanması birincil hücreleri için bir antimikrobik 10 uM SB202190 ve 100 ug / ml.
    2. kısma CM Böl ve en fazla 4 ay boyunca -20 ° C'de onları dondurmak. Tam kolon hazırlamak için alikotları çözülme% 50 ekleyerek orta (FCM) CM orta Wnt-3A-conditoned. aktivitede bir kayıp olmadan 4 ° C 'de 7 gün deposu FCM.
    3. rektal biyopsi bir organoid kültürünün oluşturulması için, 50 ug / ml, vankomisin, 50 ug / ml gentamisin ile takviye FCM ve 10 uM Rho-bağlantılı sarmal-halka oluşturucu protein serin / treonin kinaz inhibitörleri (RhoKi). Sadece kültüründe ilk iki ya da üç gün boyunca, bu orta denilen izolasyon ortamı (IM) kullanın.
  4. EDTA Stok Çözelti Hazırlama
    1. 0.22 um filtre ile steril aşırı saf, H2O içinde 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), pH 8 hazırlayın.
  5. Basement Membran Matrix Manipülasyon
    1. üreticinin tavsiyesine göre bazal membran matrisi (BMM) hazırlayın.
    2. Gecede buz üzerinde Çözülme BMM.
    3. 15 ml konik tüp, kullanımı şişeden BMM aktarırken5 ml'lik bir pipetle konik tüp -20 ° C'de önceden soğutulmuş 15 mi.
    4. çözülmüş sonra, 4 ° C'de bir buzdolabı içinde BMM depolamak ve kullanılmadan önce en az 30-60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
      NOT: Sipariş en iyi sonuçları elde etmek için ise, BMM soğuk ve düzgün crypts veya organoids gömmeden önce karıştırılmalıdır olmalıdır.

2. CF Hasta biyopsisi gelen Kolon Organoids oluşturulması

Not: Doku toplanmasından sonra bu bölge tuz içerisinde buz üzerinde örnek muhafaza etmek önemlidir, Ca + 2 ve Mg + 2 (DPBS) ya da BM olmayan Dulbecco Fosfat Tamponlu Tuzu. biyopsilerin Hızlı işlem tavsiye edilir, ancak 7 güne kadar buz üzerinde saklanır biyopsilerinden organoid kültürleri tespit etmek mümkün olduğu kanıtlanmıştır.

  1. biyopsiler 15 ml konik tüpün dibinde yerleşmek ve süpernatant kaldırmak edelim.
  2. 10 ml'lik pipet kullanarak yukarı ve aşağı biyopsi ve pipet 10-20 kez DPBS 10 ml ekleyin.
    NOT: pipet biyopsi pipetlenmesinden önce BM ile önceden ıslatılmış gerekmektedir.
  3. biyopsiler dibinde yerleşmek ve süpernatant kaldırmak edelim.
  4. süpernatant netleşene kadar tekrarlayın 2.2 ve 2.3 4-5 kez yineleyin.
  5. biyopsi DBPlerin 10 mi, 200 ul EDTA (0.5 M) ilave edin ve 4 ° C'de 60-120 dakika boyunca bir sallama tüpü platformunda tüp yerleştirin.
    NOT: İnkübasyon süresi, hasta başına farklı olabilir. kriptler serbest ise, DPBS bulutlu olur. kriptler mikroskop altında görülebilir zaman EDTA inkübasyon sonlandırılmış olabilir.
  6. kriptler yerleşmek için izin verin. süpernatant atın.
  7. kadar BM 2 ml alın ve yeni bir 15 ml konik tüp ekleyin. içindeki BM ile kaplıdır şekilde manuel olarak yeni bir tüp çalkalayın.
  8. Bir pipet kullanarak BM ile önceden ıslatılmış, yukarı ve aşağı 10-20 kez biyopsi ve pipet içeren tüp DPBS 2 ml ekleyin.
  9. biyopsiler yerleşmek ve yeni için crypts ile DPBS aktarmak için izinAdım 2.7 hazırlanan BM 2 ml içeren tüp.
  10. artık kriptler bırakılıncaya kadar tekrarlayın 2.8 ve 2.9 adımları tekrarlayın.
  11. 8 ° C 'de 5 dakika boyunca 130 x g'de crypts dönerler.
  12. Bu süre içinde, oda sıcaklığında, güvenlik kabini (RT) IM aktarın.
  13. Süpernatantı atın ve kript pelet ve tekrar adım 2.11, BM'nin 10 ml ekleyin.
  14. BM 1 ml pelletini. 5-10 ul alın ve bir mikroskop altında gözle kriptalarının sayısını.
  15. 8 ° C 'de 5 dakika boyunca 130 x g'de crypts dönerler.
  16. Süpernatantı ve% 55 BMM (v IM v BMM) 'de pelletini.
    Not: kript ul başına 1 mahzenmezarda% 55 BMM karşılık gelen hacim içinde tekrar süspanse edilir. Yeterli kriptler yoksa, BMM minimum hacmi 40 ul olduğunu.
  17. tohumlama için, oyuk başına 35 ul pipet (24 oyuklu bir plaka içerisinde). 3-5 içine BMM 35 ul bölün gro difüzyonunu arttırmak için ayrı ayrı damlalarBMM içine faktörler wth. kabarcıklar oluşturmak etmeyin.
  18. Yerleştirin ve BMM katılaşması için en az 20 dakika süreyle, 37 ° C'de ters inkübatör plaka bırakın.
  19. Oyuk başına IM 500 ul ilave edin ve CO2 37 ° C'de inkübatör içinde tutmak ve% 5.
  20. her 2-3 günde bir orta yenileyin. BMM bozulmamış damla bırakarak, P1000 pipet ile pipetleme eski orta çıkarın. Dikkatli olmayan, doğrudan BMM damla üzerinde, kuyunun yan bunu pipetleme FCM ekleyin.
    NOT: kriptler izolasyon protokolünde yayımlanan varsa, süpernatant santrifüj BM ile pelet 2-3 kez yıkayın ve BMM bunu tekrar süspansiyon. artık doku alın ve bir ustura ile küçük parçalar halinde kesin. , 15 ml konik tüp içine bu toplayın, onları santrifüj ve aynı BMM onları tekrar süspansiyon. Herhangi bir epitel kök hücreler varsa, bunlar da organoids üretecektir.

Bakım, Donma ve için için Kolon Organoids 3. Pasajlanmasıskolin kaynaklı Şişme Testi (FIS)

NOT: Her organoid kültürü kendi katlama süresi vardır. Normalde, kolorektal CF organoids 1 genişletilebilir: 3-1: 5 kez her 7-10 gün. tomurcuklanan yapılar gözlenir eğer iyi bir işarettir. Kolorektal, normal organoids (Şekil 2D) - daha Kolorektal CF organoids az kistik (2C Şekil 2A) bulunmaktadır. kurulması ve bakım için, organoids 24 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi; dondurma, 6 oyuklu plakalarda; 96 oyuklu FLINT FIS tahlilinde için.

  1. Organoids pasajı
    1. kullanmadan önce en az 30-60 dakika boyunca buz üzerinde BMM tutun.
    2. kullanmadan önce en az 1 saat süre ile, oda sıcaklığında bir FCM tutun.
    3. Örnek adı ve başka bir tüp ile bir 15 ml konik tüp Label "yıkanmış".
    4. Dikkatle BMM damla bozmadan P1000 pipet kullanarak kuyulardan orta aspire.
    5. iyi 1 ve b BM 1 ml ekleyinyukarı reak BMM P1000 pipet kullanarak düşer. Örnek adı ile 15 ml konik tüp içine bu 1 ml aktarın.
    6. BM başka 1 ml iyice yıkayın ve aynı 15 ml tüp aktarın.
    7. Tekrar (bir 15 ml konik bir tüp içinde yıkanabilir bir 24-çukurlu plaka 6 kuyu kadar) 5 daha fazla kuyu ile 3.1.5, 3.1.6 adımları tekrarlayın.
    8. BM ile 12 ml tüp kadar doldurun. Pipet yukarı ve önceden ıslatılmış 5 ml pipet kullanarak aşağı.
    9. 8 ° C 'de 5 dakika boyunca 85 xg dönerler.
    10. Süpernatantı atın ve pelet BM 1 ml ekleyin. Aynı P1000 pipet ile, bir filtre olmadan P10 ucu kadar sürebilir ve aşağı 20 kere yukarı pipet ve. P1000 ve P10 ipuçları hem atın.
    11. 5 ml pipet ile BM 4 ml ilave edilir ve bir tarafa doğru dikeyden yaklaşık 70 ° 'de eğik tüpü tutmak. Yeni P1000 ucu ön ıslak ve P1000 (1 ml hacim) ile kuvvetlice 2-3 kez karıştırın.
    12. eğik pozisyonda kalırken, 10'a kadar say w dikkatle üst tabaka toplamakolarak etiketlenmiş tüpe P1000 pipet ve transferi 4 x 1 ml i "yıkanır."
    13. eğimli tüp içinde dibe yerleşme organoids gözlemlemek; undisrupted organoids ve daha büyük parçalar dibine batar. Santrifüj 15 mi 85 xg ve 8 ° C 'de 5 dakika boyunca tüp "yıkanmış".
    14. Süpernatant atılır ve% 55 BMM bir son konsantrasyona kadar organoid pelet orta ve BMM gerekli miktarda ilave edin. Kabarcıklar (Şekil 3B) yaratmadan yukarı pipetleme ve aşağı karıştırın.
      Not: iyi bir yoğunluk BMM 10 ul 25-30 organoids tohumlama ile elde edilir.
    15. Takip 2.17-2.19 adımları.
  2. Donmaya için Pasajlanması
    1. kullanımdan önce en az 30-60 dakika boyunca buz içinde BM tutun. kullanımdan önce en az 1 saat süre ile, oda sıcaklığında bir FCM tutun.
    2. RhoKi (Aşama 1.3.3) ile takviye FCM hazırlayın.
    3. buzdolabı kaynaklı tripsin almak ve kullanılmadan önce en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
    4. adımları izleyin 3.1.5-3.1.10.
    5. , Mümkün olduğu kadar çok süpernatantı 30 saniye için 4 tripsin ml ve vorteks ekleyin.
    6. 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde 1 dakika ve vorteks 37 ° C 'de sıcak bir su banyosu içinde tüp koyun.
    7. tüp içinde çözüm olup olmadığını kontrol edin. bozulmamış organoids mikroskop altında hala görünür ise, adım 3.2.7 tekrarlayın.
    8. organoids kesintiye zaman, tripsin ve pipet 10 kat nötralize etmek için BM 8 ml ekleyin.
    9. 8 ° C'de 450 x g'de 3 dakika boyunca spin.
    10. Süpernatantı atın ve% 55 BMM çözüme ulaşmak için organoids orta ve BMM gerekli miktarda ekleyebilirsiniz. hava kabarcıkları oluşturarak olmadan pipetleme ve aşağı karıştırın.
      NOT: trypsinization sonra: 1 oranında donma için organoids 1 numaralı seribaşı olması gerekir.
    11. Tohum ~ 10 ul küçük ayrıldı, damlacıklar meydana önceden ısıtılmış 6 oyuklu doku kültürü plakası, tek bir oyuk 250 ul. 37 ° C'de inkübatörde başaşağı plaka koyun ve bırakınBMM 20-30 dakika süreyle katılaştırılır.
    12. Her bir 6 plaka taze FCM + RhoKi 2.5 ml ekleyin ve inkübatör (Şekil 3C) plaka transfer.
  3. FIS Testi için Organoids pasaj
    Not: 24 oyuklu plaka 4 ile 6 oyuklar arasındaki organoids sayısı ve büyüklüğüne bağlı olarak, 96 oyuklu bir plaka 27 kuyu tohumlama için yeterlidir.
    1. adım 3.1-3.1.13 altında tarif edildiği gibi organoids işleyin.
    2. % 50 BMM 120 ul pelletini.
    3. mikroskop altında 3 ul BMM damla organoids sayısını (30-50) onaylayın.
    4. Plaka, 96 oyuklu pate her çukuruna ortasına yerleştirilir 3 ul'lik bir damla kullanılarak organoids.
    5. BMM katılaşması için 15 dakika için 37 ° C inkübatör plakasını; daha fazla adım adım 6.1.1 tarif edilmiştir.

4. Donma Colon CF Organoids

NOT: OrganOID'ler 1-2 gün trypsinization ve kültürleme sonra aşağı dondurulmuş hazır, bu yüzden organoids hala çözdürme sonrası hayatta kalma verimliliğini artırır, küçük olacaktır.

  1. BM 1 ml ekleyin ve BMM P1000 pipet kullanarak damla break up. 15 ml konik tüp aktarın.
  2. Aynı 15 ml tüp BM ve transfer başka bir 1 ml ile iyice yıkayın.
  3. Tekrarlayın tüm kuyulara ile 4.1 ve 4.2 adımları tekrarlayın.
    Not: aşırı BMM önlemek için, bir 6-yuvalı plaka 3 kuyu bir 15 ml tüp içinde bir araya getirilir.
  4. 12 soğuk BM ml ve pipet yukarı ve aşağı 5 ml pipet ile organoids içeren 15 ml tüp doldurun. 5 dakika boyunca buz üzerinde tüp bırakın.
  5. 450 x g'de 3 dakika ve 8 ° C Spin ve süpernatant kaldırmak.
  6. Düzgün organoids tekrar süspansiyon yukarı ve aşağı orta ve pipet dondurma ile organoids pelet çözülür.
    Not: dondurma ortamı 500 ul BMM her 100 ul için kullanılmaktadır.
  7. 5 ml'lik bir pipet kullanılarak, 0.5 ml aktarmakdondurma ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirildi organoids kriyojenik şişeleri steril için.
  8. Bir hücre dondurma kabına şişeleri aktarın ve -80 ° C'de koydu.
  9. 24 saat sonra, sıvı azot içinde depolama şişeleri aktarın.

5. Dondurulmuş Organoids gelen Kültürleri kurulması

NOT: buz üzerinde BMM çözülme ve buz üzerinde tutmak. BM RT ulaşmak ve çözme bir cryovial prosedürü başlamadan önce 37 ° C 10 ml'lik bir şişe sıcak edelim.

  1. hala biraz dondurulmuş malzeme kalmayıncaya kadar 37 ° C su banyosunda ajitasyon hızla şişe çözülme.
  2. P1000 pipet kullanarak 15 ml konik tüp çözülmüş organoids aktarın.
  3. tüpün dibine sallayarak hemen sonra damla sıcak BM damla 1 ml ekleyin. ortam 1 ml eklendikten sonra, donma orta seyreltmek için bir kaç kez yukarı pipetleme ve aşağı iyice karıştırın.
  4. Yavaş yavaş (damla damla) konik tüp conta sıcak BM 9 ml ekleyinorganoids düzeyine getirildi. birkaç kez ters çevirin.
  5. 85 xg ve 8 ° C 'de 3 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu dönerler.
  6. pelet bozmadan özenle süpernatant atın. RhoKi (aşama 1.3.3) ile takviye FCM 90 ul organoid süspanse edin. Daha sonra, BMM 110 ul ekle.
  7. küçük, ayrı damlalar haline önceden ısıtılmış 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 35 ul ekle.
  8. baş aşağı 20-30 dakika süreyle plaka bırakarak, 37 ° C inkübatör plaka aktarın.
  9. Her bir kuyunun RhoKi ile FCM 500 ul ekleyin ve geri inkübatör (Şekil 4A - 4C) plaka transfer.
  10. organoids çözülme düzgün kurtardıktan sonra, yani BMM her 10 ul 25-30 organoids içeren daha BMM sulandırmak. Bu prosedür (Şekil 4D - 4G) çözülme sonra 2-3 gün yapılabilir ve organoid doğru büyümesini sağlar.

6. Forskolin kaynaklı şişmesi gibidemek (FIS)

NOT: Fsk titrasyon CFTR artık fonksiyon ölçümü için izin verir. CFTR modülasyonu için, organoids belirli bir düzeltici (örneğin VX-809) ve / veya güçlendirici maruz (örneğin VX-770), genotipe bağlı olarak değişir. VX-770 ve Fsk doğru ölçümleri başlamadan önce eklenir ise genellikle VX-809, ölçüm öncesinde 18-24 saat eklenir. Bazı modülatörleri (düzelticiler / Potansryatörler) deney plakasının plastik yüzeye bağlamak farkında olun.

  1. Testi için Kaplama
    Not: VX-809 ve stokları 20 mM bölünerek ve -80 ° C'de saklanır. çözülmesi zaman oda sıcaklığında bırakın ve ışıktan korumak.
    1. bölüm 3.3 de anlatıldığı gibi organoids işleyin.
    2. VX-809 ve düzeltici test, aşağıdaki konsantrasyonlarda, üç kez bir doz-yanıt eğrisi hazırlama: 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0 ve 30 uM. FCM içinde dilüsyonları hazırlayın.
    3. 96-iyi levhaya ya 100 μ ekleme; FCM ilgili VX-809 konsantrasyonu veya 100 ul FCM l sadece ve plaka kuluçkaya yatmaktadır.
  2. Testi ölçme
    NOT: Fsk 10 mM'de ise VX-770 hisse senetleri, 20 mM bölünür; Her iki -80 ° C'de saklanır. çözülme, oda sıcaklığında bekletin ve ışıktan korumak.
    1. kalsein DMSO bir şişe alın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
    2. açılmamış ise kalsein bir toz olarak sağlanır şişeye DMSO 5.1 ul ekle. Aksi takdirde, kalsein 2.5 ul ihtiva eden önceden yeniden süspansiyon haline kalsein flakon kullanın.
    3. 1.5 ml tüp içinde BM 580 ul kalseinin 2.5 ul ekleyin ve etiketleyin.
    4. Her kuyu tekrar pipet kullanarak bu boya çözeltisi (BM + kalsein) 10 ul ekleyin.
    5. boya iyice karıştırılır sağlamak için çok kanallı bir kez yeniden süspanse edin.
    6. 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatör plaka inkübe edin.
    7. kalsein İnkübasyon sırasında, FSK hazırlamaya başlayınve VX-770 çözümleri, gerekirse.
    8. VX-770 güçlendiricisini kullanılarak, aşağıdaki konsantrasyonlarda üç kopya halinde, bir doz-yanıt eğrisi hazırlama: 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0 ve 30 uM. FSK titrasyon durumunda, konsantrasyonlar: 0, 0.008, 0.02, 0.05, 0.12, 0.32, 0.8, 2.0, ve 5.0 uM. Kemik iliğinde dilüsyonları hazırlayın.
      Not: FSK, VX-770 ya da ikinci günde eklenen herhangi bir ilaç için, seyreltme önce 100 ul ihtiva / ilaç titrasyon solüsyonu her bir kuyucuğa ilave edilir FSK 100 ul, çünkü, 2x nihai konsantrasyonda hazırlanmış olmalıdır FCM.
    9. mikroskop odasına FSK ve VX-770 çözüm, bir P200 pipet ve ipuçları aktarın.
    10. FIS deneyi görüntüleme için otomatik bir aşamada, ısıtmalı odasına ve CO 2 akışı ile donatılmış bir canlı hücre görüntüleme konfokal mikroskop kullanın.
      NOT: Aşağıdaki adımlar, belirli bir mikroskop bakın. Farklı kurulumları aşağıdaki diğer mikroskoplar üreticinin başvurmalıdırtalimatlar.
    11. plaka tutucuya 96 oyuklu plaka koyun.
    12. görüntüleme için konfokal ayarlarını girin.
      1. 37 ° C'ye kadar canlı görüntüleme aracı ayarlayın ve% 5 CO2 ve oda ölçümden önce 30 dakika en az önceden inkübe edin.
      2. Alexa fluor-488 parça seçmek için "Akıllı kurulum" seçeneğini kullanın.
      3. uzaklaştırmak ve tüm kuyu yakalamak için 0.6X için 5X lens ve tarama alanını ayarlayın.
      4. arka plan üzerinde Calcein-yeşil etiketli organoids optimal algılanmasını sağlamak için lazer gücü ve dedektör hassasiyetini uyarlayın. iğne deliği 130 mikron kadar artırılabilir ve görüntü ortalama 2'de ayarlanabilir.
      5. 8 bit derinliği ve 512 x 512 çerçeve boyutunu ayarlayın.
      6. ölçüm süresi, sıklığı ve aralıkları ayarlamak için zaman serisi seçeneğini kullanın.
        NOT: Sürekli ölçümler için önerilen: 10 dk aralığı ile 1 saat: döngüleri = 7 (Döngü 1 T = 0). Azaltılmış şişme, Orga ölçümleri içinnoids 3 saat kadar için görüntülenebilir.
      7. elle tek tek kuyu pozisyonlarını belirlemek için karo seçeneğini kullanın.
    13. Ölçme aynı sırayla takip karşılık gelen oyuklara FSK ve / veya VX-770 çözümlerin 100 ul ekleyin. iyi görüntülü ilk çözüm ekleyerek başlamak ve görüntüleme düzeni ile devam ediyor.
    14. Ölçümü başlatın.
    15. Deney tamamlandıktan sonra, dosyayı kaydedin.
  3. FIS Testi Veri Analizi
    1. üzerinde toplam organoid alanın artışı hesaplamak için belirlenen yapılar Alexa-488 parça ile görüntülenmiş tüm yapıları tanır ve doldurur bir görüntü analiz yazılımı analiz aracını kullanarak FIS testinin veri analizi için bir "organoid analiz" makro oluşturun farklı zaman noktalarında.
    2. görüntü analiz programı elde görüntüleri ile veri dosyasını açın.
    3. organoid analiz için makro seçin.
    4. <li> de bir zaman noktasında 1 de bir sinyal-gürültü oranı dengelemek ve organoid yapılar tanınan ve dolmasını sağlamak için eşik olarak ayarlayın.
      1. Tüm yapılar aynı zamanda bir zaman noktasında 7. kayıtlara alınır eğer biraz zaman noktasında 7 arka plan sinyalleri (belirli eşik deneyler arasında biraz değişebilir) yapılar olarak kabul edilmemesini sağlamak için eşik değiştirmek görmek için 4-6 kuyularda edin.
    5. 1.000 mikron 2 tanınan nesnelerin minimal alan büyüklüğünün kriterlerini ayarlayın.
    6. Başlatmak için basın "analiz". Analiz kullanılan yazılıma bağlı olarak yaklaşık 3 dakika sürer.
    7. kuyu başına kuyu sayıları (tablo, bu sırayla artırması gerektiğini), zaman noktaları ve toplam alanı: Yazılım bittiğinde, "tablo oluşturmak" ve aşağıdaki verileri seçmek için gidin.
    8. Bir elektronik tablo programına ihracat bir .xlm olarak dosyayı kaydedin.
    9. Bu programda, wel başına alanda göreli bir artış hesaplamak% 100 bir zaman noktasında 1 alanı ayarlayarak l. zaman noktalarında durum başına 1-7 arasında, eğri (AUC) altındaki alanı hesaplanır; alan (E-değeri) alt sınırı,% 100 olarak belirlenmiştir. FSK veya ilaç titrasyonları (X-ekseni) AUC (Y-ekseni) karşı grafik olarak gösterilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1A BMM üzerinde gömülü crypts bir temsilcisi taze izolasyon gösterir. kriptler CF konunun kolorektal biyopsi alınmıştır. Genellikle, bir organoid her crypt (- C Şekil 1A) oluşturulur. Nedeniyle CFTR disfonksiyonu, kolon CF organoids çoğu kistik değil, oldukça kompakt ve projeksiyonlar ve buddings (Şekil 2A - 2B) ile vardır. Bununla birlikte, bazı CF kistik şekli (Şekil 2C), vahşi tip organoid kültürler gibi (Şekil 2D) ile birkaç organoids sahip özellikle yüksek artık işlevi, kültür organoid.

Kültür genişletilmesi veya FIS deneyi Ekimlik organoids pasaj önce Şekil 3A'da gösterildiği gibi, organoids, çoklu buddings büyük bir boyuta sahip olması önemlidir. organoids küçük ve N olmayan isegeçiş için işlendiğinde umerous buddings, organoid kültür olumsuz olarak etkilenmektedir. EGF, Wnt-3A ve Rspo3 gibi temel büyüme faktörlerinin kalitesi ve etkinliği ile ilgili olarak, organoids 7 ve 12 gün sonra (Şekil 3A) arasında arzu edilen büyüklüğe ulaşmak. Mekanik olarak parçalanmasından sonra, buddings bozulur aşağıdaki pasajda (Şekil 3B) yeni organoids oluşturmak için kullanılır. Dondurma organoids işlem, Şekil 3C'de gösterildiği gibi bu, küçük bir boyuta tripsinize edilmesi önemlidir. trypsinization sonra organoids onları manipülasyon stresten kurtarmak izin için 1 ya da 2 gün boyunca kaplanmıştır. Bu adım, bir araya organoids küçük boyutu ile, (Şekil 4A) çözündükten sonra bir% 98 hücre iyileşme sağlar.

organoids eritildi, yüksek yoğunluklu bunları olması önemlidir, bu nedenle normal olarak bir bölgesindeki çözdürülenküçük hacimli (Figure4A). , Organoids doğru yoğunluk sağlayan BMM 10 ul başına 20-30 organoids bir oranda seyreltilir - kültürde bir veya iki gün sonra ve organoids boyutu (4C Şekil 4B Şekil 4A karşılaştırın) arttığı gözlemleyerek Daha büyük bir boyuta büyümek. organoids çok seyreltilmiş, bunlar büyümeyi yavaşlatabilir ve hatta farklılaştırmak ve ölebilir. organoids çok kalabalık ise, alanı eksikliği ya da büyüme faktörlerinin sıkıntısı da organoids büyümesini yavaşlatır ve buddings sayısını azaltır.

Sınırlı hücre kalıntıları ile uygulanabilir kültürlerden organoids tabaklanması yeterli CFTR fonksiyonu (Şekil 5A - 5B), mevcut olması koşuluyla organoids>% 95 Fsk stimülasyon üzerine şişen olan koşullar ile sonuçlanmalıdır. gibi bir genotype- ve ilaca bağlı bir şekilde şişme Organoidsİki F508del allel (Şekil 5A) ve organoids bileşik-heterozigot F508del ve S1251N (Şekil 5B) için, bir miktar fonksiyonu ile bağlantılı bir CFTR yolluk mutasyonlu organoids temsili görüntüleri gösterilmektedir.

Şişme nicelendirmek için toplam Calcein-yeşil bir yüzey alanı her bir zaman noktası seçilir ve T = 0 yüzdesi olarak ifade edilmiştir (% 100 olarak belirlenmiştir; Şekil 6A). Kalıntı, küçük olmayan şişlik yapılar tipik aşağıdaki toplam yüzey alanının% 5'tir. Göre alan artışı 10 dakikalık bir zaman aralığı başına ifade edilir ve AUC (rasgele birim) ölçümleri, her durumda (t = 0 ila 60 dakika,% 100 olarak belirlenmiştir taban eşiği; Şekil 6B) üretilir. Biz şişme başlamasında bazı değişiklikler, yanı sıra yüksek CFTR fonksiyonu seviyelerinde FSK 30-40 dakika dışında eğrisel bir ilişki içeriyor olarak AUC, en sağlam olarak bulundu.

Şekil 6C). CFTR artık fonksiyon ile ilişkili Organoids CFTR modülatörlere (pre-Fsk koşullarının 200-220% yüzey alanının) yokluğunda 5 uM Fsk stimülasyon 60 dakika sonra 4.500 EAA üniteye kadar ulaşabilir. Organoid şişme aktivasyonu nedeniyle organoid yapılar, bazolateral iyon taşıma oran-sınırlayıcı etkisi fiziksel kısıtlamalar sebebi ile ~ 4.500 EAA birimleri, bir tavan ve "gergin" koşullar altında iyon ve sıvı taşıma homeostazının kurulması ulaşır. FSK daha iyi kalan fonksiyonel ya da son derece etkili miktarını belirlemek için, bu yüksek CFTR bakiye fonksiyon seviyelerinde tahlilinin dinamik aralığını genişletmek için titre edilebilir bileşik tedavisi (örneğin, daha düşük Fsk konsantrasyonları ile uyarma üzerine S1251N organoids şişmesi üzerinde VX770 yüksek aktivitesi ile gösterildiği gibi, Şekil 6D).

Şekil 1
Şekil 1: biyopsi CF kolorektal organoids kurulması. (A) izolasyon gün (geçit 0 gün 0) hakkında BMM gömülü sonra bir rektal biyopsi izole malzemenin Temsilcisi görüntüler. Belirtilen crypt Genişleme sağ alt panelde gösterilir. (B), aynı kriptler kültürdeki 7 günden (geçit 0, gün 7) sonra takip edildi. Panel A'da sunulan aynı crypt Genişleme gösterilir. 11 gün bölme kaldıktan sonra (C) aynı organoid kültürün Temsilcisi görüntü (geçit 1, gün 11). Ölçek çubukları 100 mikron =.
159fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Farklı mutasyonların CFTR olan deneklerden elde edilen CF kolorektal organoids temsili görüntüler. F508del / F508del (A) F508del / R117H-7T (B) ve F508del / S1251N (C) mutasyonlarla deneklerden CF kolorektal organoids temsili görüntüler. (D) yabanitip CFTR denekten kolorektal organoid kültür Örnek görüntüsü. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu resimler Resim Fsk uyarımı ile elde edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5159 / 55159fig3.jpg "/>
Şekil 3: bakım ve tahlil için ya da dondurma için İşleme CF kolon organoids. (A), (B), pasaj ya da (C) dondurma ya da işlenmek için CF kolon organoid kültür Örnek resim hazırdır. (B) mekanik olarak parçalanmasından sonra, küçük parçalar aşağıdaki pasajda yeni organoids oluşturur ki oluşturulur. (C) trypsinization sonra, çok küçük, yuvarlak organoids dondurma işlemi sırasında canlılığını kolaylaştırılması, oluşturulur. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: dondurulmuş organoids bir CF kolorektal organoid kültürü oluşturulması. (<strong> A - C) günlük 0 (A çözülmüş bir CF kolorektal organoid kültürünün Temsilcisi görüntüler). Aynı kaynaktan Fotoğraflar bir (B) ve sonra iki (C) gün alındı. (D - G) bölümünde 5.9 açıklanan seyreltme adımı Temsilcisi görüntüler. Organoids çözülme (çözülme gün sonra 3) düzgün kurtardıktan sonra onlar (D) büyümek için yer var bu yüzden onlar sulandırılır. Aynı kuyudan Görüntüler altı (E), on (F) ve çözdürme sonrası onbeş (C) gün alındı. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: CF Forskolin kaynaklı şişlikorganoids. (A ve B) F508del / F508del (A) ya da F508del / S1251N (b) 770 VX önce veya yokluğunda veya varlığında, FSK (5 um) ile uyarma 60 dakika sonra kolorektal organoids temsili görüntüleri (3 um]) veya VX-770, VX-809 (3 mm) ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Ölçek çubukları 200 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: ükler şişme Forskolin ile uyarılan. (A) F508del / S1251N bir görüntü analizi yazılımı ile organoids önce (0 dakika) ve FSK (5 uM) ve VX770 (3 uM) ile stimülasyonu 60 dakika sonra organoid alanı seçimi Örnek ve görüntüler. Ölçek çubukları 200 mikron =. (B) represFSK varlığı veya yokluğu VX770 (3 mm) ve / veya VX809 (3 mm) (5 um) uyarma 60 dakika boyunca F508del F508del / veya F508del / S1251N organoids göreli alanı artış entative ve görüntüler. (B) (T = 60 dakika, taban eşiği =% 100) 'de belirtilen koşullar eğrisi ölçümleri (c) Bölge. FSK farklı konsantrasyonlarda F508del / F508del veya F508del / S1251N organoids eğrisi ölçümleri altında (D) alanı. Veriler tek temsilcisi deneylerden ± SD ortalamasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, insan kolorektal organoids üretimi, genişleme işlemi, dondurma ve eritme için tam bir protokol sağlar. Insan organoid Kültürlerin biraz zaman önce 17 kurduk iken, bazen uygulamalı eğitim olmadan başka laboratuarlarda teknolojiyi kurmak zor olduğu kanıtlanmıştır. Biz bu protokoller bu eğitimi yerini alacak tahmin ediyoruz.

Wnt-3A klimalı ortam oluşturulması ve organoid kültür uzun vadeli korumada başarılı olmak için en önemli reaktiflerin biridir. Nitekim, organoid kültürleri düşük aktiviteli Wnt-3A-conditoned orta "çarpışma" maruz ne zaman. Wnt-3a-koşullandırılmış ortam içinde yapılan olduğundan, aktif ortam üretilmesi dikkate alınması gereken çeşitli yönleri vardır. Aktif Wnt-3A yalnızca L hücreleri ve hidrofobik stabilizasyonu için uygun bir büyüme sinyalleri sağlayan yüksek kaliteli fetal sığır serumu (FBS) ile ortam içinde üretilebilirWnt-3A molekülleri. Wnt-3A aktivitesi düşük (yani, düşük TOP / FOP oranları, aşağıya bakınız) olduğunda, genellikle soruna neden olan FBS olduğunu.

Ticari rekombinant Wnt kötü çalışır, bu yüzden biz TOP / FOP Wnt muhabiri tahlil için pozitif kontrol kullanmanızı tavsiye etmiyoruz. ÜST / Renilla ve FOP / Renilla arasındaki oran koşullu ortam Wnt aktivitesinin bir göstergesi, Wnt-3a-koşullu ortam bu nedenle iyi bir toplu bir TOP / FOP değeri ile karşılaştırıldığında, 25 daha ÜST / FOP oranı yüksek verir negatif kontrol: orta Wnt-3a-üreten hücrelerin maruz kalmayan. Rekombinant Noggin ve R-spondin Noggin yerini ve R-spondin klimalı orta 28, 29 olabilir.

Geçerli protokol de CFTR-FIS deneyi için bir fonksiyon testi açıklar. Biz son zamanlarda CFTR genotip ve FIS ve nasıl bu yayınlanmış CFTR genoty yansıtır arasındaki ilişkiyi ortaya koymuşturKlinik kayıtlarında (www.CFTR2.org) 25 elde edilen pe-fenotip ilişkileri. Bu tahlili kullanarak, son derece nadir CFTR mutasyonu iki Bireyler organoids (VX-770) 25 ivacaftor yanıt veren tespit edilmiştir. Bu ilacın sonraki reçete klinik çalışma verilerinin yokluğunda nadir mutasyonları olan hastalarda spesifik ilaç maç için FIS testinin değerini vurgulayarak, kesin klinik yanıt sonuçlandı. FIS ölçümü için gerekli olmayan şişen organoids sınırlı fraksiyonu (genellikle aşağıdaki% 5) sadece belirtilen uygun büyüme ve tahlil koşulları vardır. cansız olmayan şişme yapıların büyük bir kısmı görüntü analiz yazılımı tarafından tanınan olarak şişme küçümsenmesi enkaz kurşun düzeylerini yüksek.

In vitro FIS yanıtları ve daha önce kurulmuş CFTR-bağımlı biyomarkerların (ter konsantrasyonu ve intest arasındaki ilişkilerKişiselleştirilmiş düzeyde inal akım ölçümleri) bizim önceki çalışmalarda 19, 25 kolayca kanıtlanabilir idi. Bu CF ile konularda FIS kullanarak artık işlev ölçümleri kişiselleştirilmiş moda bir teşhis veya prognostik güncel yaklaşımlar tamamlayıcı olabilir fikrini destekledi. Böyle ter klor konsantrasyonu in vivo ölçümler ve ex vivo rektal biyopsi intestinal akım ölçümleri olarak CFTR fonksiyonu diğer biyobelirteçlerin kıyasla FIS testinin hacmi, teknik değişkenlik daha iyi kontrol sağlar. Ayrıca tam CFTR bağlı okuma ve FSK bir titrasyon doğru türleri artık CFTR işlevini kullanarak geniş bir dinamik aralığı sağlar.

KF hastalığının modülasyonu sadece CFTR işlevi daha fazla etkilenir Ancak, FIS tahlil, ilaç etkinliğinin değişkenliği bireysel genotip yalnızca etkisini yansıtmaktadır. dru içing yanıt deney, potansiyel doku yanıtının yansımasıdır. In vivo 7, 8 ya da doğrudan, ex vivo CFTR ölçümleri 32 diğer karşı CFTR ölçümünde çok hassas olsa da, farmakokinetik insan varyasyon dahil değildir. Daha önce belirtildiği gibi, (genetik ve çevresel) olmayan KF değiştiriciler de, in vitro gözlem ya da CFTR biyolojik ve klinik fenotip 2 arasında bir ayrılma neden fenotip etkilemektedir. Dahası, hücre hatları 33 kullanılarak potansiyel duyarlı mutasyonların belirlenmesi organoids kurulması için bir rektal biyopsi almak gerekir hastalarda daha az etki ile ilişkilidir.

Birden fazla CFTR hedefleme ilaçlar geliştirme 1 şu anda. Klinik araştırmalar klinik etkinliği b doğru tahmin izin vermez tahmin edilmektediryalnız CFTR mutasyon durumu hakkında ased. FIS tahlil işlevsel CFTR fonksiyonu ve ilaç yanıtı ölçer gibi, hangi hasta için en uygun hangi ilaç belirlemek için tercih edilen bir yöntem haline gelebilir. hasta gruplarının tanımlanması kayıt çalışmalarda ve yeni ilaç yöntemlerinin geliştirilmesi için dahil edilmesi için FIS deneyi de yararlı olabilir. Önce ve tedavi sırasında plazma ile kolorektal organoids uyarılması daha potansiyel kan CFTR modülatörlerinin dolaşımdaki kişiselleştirilmiş dozaj ve klinik çalışmalarda 30 ilaç dozlarının seçimi, 31 kolaylaştırmak fonksiyonel miktarını nicelleştirmek için yardımcı olabilir. Son olarak, FIS CFTR fonksiyonu ve işlevi diğer -so kadar çoğunlukla bilinmemektedir genetik nitelemeler ile etkileşimleri daha iyi temel bir anlayış için yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma Hollandalı CF kuruluşundan (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), Wilhelmina Çocuk Hastanesi Araştırma Fonu ve CZ ve Zilverenkruis / ACHMEA HIT-CF programı tarafından desteklenmiştir. Biz S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot ve G. Berkers (Pediatrik Göğüs, Wilhelmina Çocuk Hastanesi, UMC Utrecht Bölümü), ve RHJ Houwen (Pediatrik Gastroenteroloji, Wilhelmina Bölümü teşekkür etmek istiyorum hastaları yaklaşan ve CF Biobank üretimi için biyopsi almak için Çocuk Hastanesi, UMC Utrecht).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4, (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16, (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45, (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67, (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106, (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108, (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363, (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13, (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2, (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373, (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13, (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165, (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19, (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, (1), e27112 (2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15, (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8, (344), 344ra84 (2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266, (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143, (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48, (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14, (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192, (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11, (3), 237-245 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats