Forskolininducerad Svullnad i Intestinal Organoids: An
1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Published 2/11/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CF orsakas av mutationer i cystisk fibros transmembran konduktans regulator (CFTR) -genen som kodar för en epitelial anjon kanal. CF påverkar cirka 85.000 människor över hela världen en. Över 2000 CFTR mutationer har identifierats ( www.genet.sickkids.on.ca ). Denna mångfald förklarar delvis ett brett spektrum av observerade fenotyper sjukdoms ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Sex klasser av CFTR mutationer definieras baserat på deras effekt på CFTR proteinuttryck och funktion: (I) inte syntes, (II) nedsatt handel, (III) defekt kanal gating, (IV) förändrad konduktans, (V) minskade nivåer av normalt fungerande CFTR, och (VI) nedsatt cellytan stabilitet 4. Även om den gemensamma CFTR mutationer välstuderade, CFTR funktion och samband med klinisk status förblir poorly förstås på nivån för den enskilda, i synnerhet för den stora gruppen av sällsynta "föräldralösa" mutationer ( www.CFTR2.org ) 1, 3.

Nyligen har läkemedel utvecklats, vilka riktar sig mot CFTR-proteinet i en mutation-specifikt sätt. Två klasser av CFTR-proteinet inriktning läkemedel är för närvarande i klinisk användning och har olika verkningsmekanismer. Potentiatorer, såsom VX-770, förbättra den öppna sannolikheten för apikalt-lokaliserad mutant CFTR och agera direkt på deras Förutom celler 5. Korrektorer, såsom VX-809, återställa handel med endoplasmatiska nätverket lokaliserad felveckade CFTR och kräver pre-inkubation med celler innan effekter observeras 6. CFTR potentiator, VX-770, har registrerats för patienter med G551D-mutationen 7, 8, liksom för åtta andraCFTR gating mutationer, inklusive S1251N 9; tillsammans, är dessa mutationer som bärs av 5% av alla CF-patienter. Andra studier har visat att VX-770 i kombination med corrector VX-809, har begränsad ännu betydande påverkan på lungfunktionen och orsakar en minskning i exacerbationsgrad i ämnen homozygota för F508del mutation bärs av 45-50% av patienterna 10, 11.

Konventionella kliniska studier för att identifiera läkemedelskänsliga ämnen inom de återstående 50% av CF-patienter är kostsamma och tidskrävande och är inte möjligt för personer med extremt sällsynta CFTR genotyper. Roman, kostnadseffektiva, personlig metoder är avgörande för att matcha det ökande antalet CFTR modulatorer till individer som bär någon typ av CFTR mutation. Hittills har rättegången införandet av patientgrupper som bär specifika CFTR mutationer styrts av studier med muterade CFTR-genen transfektion i heterologous cellsystem, följt av elektrofysiologiska studier i Ussing-kamrarna 5, 6, 12. På grund av brist på lämpliga CF djurmodeller, läkemedelseffektstudier i luft-vätske gränssnitt-differentierade bronkiala epitelceller härledda från CF lung Explantation material har använts för läkemedelsutveckling 13, 14, 15. Men för att den begränsade tillgången på lung Explantation vävnader och ingrepp får luftrörs celler från patienter utan slutstadiet sjukdom hindrar analys av mindre vanliga CFTR mutationer och förhindra drogtestning i en personligt sätt. För att övervinna dessa begränsningar, "easy access" vävnader, såsom kolorektala organoids, nasala luftvägsceller, och luftvägsceller härledda från inducerade pluripotenta stamceller, är för närvarande på att undersökas för personligt anpassade läkemedelsbehandlingar.

16, 17. För human kolon / rektum, innebär odlingsbetingelserna definierade tillväxtfaktorerna (Epithelial tillväxtfaktor (EGF), gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), och Noggin) i kombination med små molekyler (nikotinamid, A83-01, och SB202190) i en källare membranmatrisen. Under dessa betingelser, enkel stamceller eller små vävnadsfragment växa ut till slutna, cystisk, 3D-strukturer som bildas av högt polariserat epitel med dess basalsidan orienterad mot utsidan. Alla celltyper visas normalt i sina normala förhållanden och positioner. Organoids kan utökas över långa tidsperioder av vecko mekanisk sönderdelning och åter plätering. De är genetiskt och fenotypiskt stabila och kan lagras, vilket gör långsiktig expansion och bio-banking 17. De är mottagliga föralla vanliga cellbiologiska / genetiska manipulationer och analysmetoder som utvecklats för 2D-cellinjer 18.

Vi visade nyligen att CFTR funktion lätt kan mätas i kolorektala organoids i en forskolin-inducerad svullnad (FIS) -analys 19, 20. När de utsätts för forskolin (FSK) eller, alternativt, till koleratoxin, organoids snabbt öka sin cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) nivåer, vilket i sin tur resulterar i öppnandet av CFTR kanal 19. Organoids från friska individer eller från patienter med CFTR mutationer som förknippas med kvarstående funktion, kommer därefter att svälla till följd av jon och vattentransport till organoid lumen, vilket motsvarar sekretorisk diarré in vitro. FIS svaret hos kolorektala organoids har tidigare visat sig vara fullt CFTR-beroende, såsom indikeras av organoids härledda från CFTR-null individer ennd genom användning av specifika farmakologiska CFTR-hämmare 19. Stora ämnesspecifika datamängder kan härledas inom flera veckor efter att ha tagit en biopsi.

För FIS-analysen beskrivs i detalj här, organoids odlas från rektala biopsier som kan erhållas i alla åldrar och med endast begränsad obehag 21. Organoids passeras varje vecka genom mekanisk störning i enstaka kryptor som lätt återförsluta och bildar nya organoids. För att köra FIS-analysen, ~ 30-80 av dessa sönderdelade små organoids stryks ut i varje brunn i en 96-brunnsplatta 19. Vid dagen för analysen, är organoids färgas med kalcein grönt, en fluorescerande cell-permeabel färgämne som den kvarhålles i levande celler, vilket underlättar levande avbildning. Sedan, FSK, vilket väcker intracellulär cAMP och därigenom aktiverar CFTR, tillsätts för att stimulera organoid svullnad. Potentiatorer som verkar på apikal CFTR tillsätts samtidigt wed forskolin, medan Korrektorer som åter CFTR trafficking tillsätts 24 timmar före tillsats av Fsk. Den organoid svullnad kvantifieras av en automatiserad bildanalys som beräknar den relativa ökningen av den totala arean av alla fluorescerande objekt för varje tidpunkt på forskolin tillägg.

3D organoida svullnad ger fördelar och nackdelar jämfört med existerande elektro CFTR avläsning i 2D odlade luftvägsceller i Ussing kammare. En stor fördel är genomströmningen av svällt analysen. Cellerna odlas och analyseras med hjälp av en enda typ av odlingsmedium, och en erfaren tekniker kan kulturen upp till 25 organoid prover på veckobasis medan kvantifiera ca 1200 datapunkter per vecka i 12 patientprover. Vi skriver konventionellt en enda försöks tillstånd genom dubbla eller tredubbla mätningar per platta och upprepa sådana mätningar vid tre oberoende inkubation tidpunkter. Totalt, cirka 300-500 sIngle organoid strukturer mäts sedan per experimentell tillstånd, vilket leder till mycket exakta mätningar av CFTR-funktion med begränsad teknisk variabilitet. Denna precision ger oss möjlighet att tydligt definiera skillnader i restfunktion och svar på CFTR modulatorer och tillåter oss att enkelt plocka upp genetiska bakgrundseffekter mellan patienter som bär identiska CFTR-mutationer 19, 22, 23, 24, 25. Datakvalitet kan enkelt bedömas från mikroskopbilder. Medan FIS är helt CFTR beroende, är det en indirekt effektmåttet för CFTR-funktion, dess utläsning orsakas av koppling av jontransport till vätsketransport. Detta kan jämföras med direkta CFTR funktionsmätningar i Ussing-kammare, som mäter transepitelial jonströmmar 26. Ussing-kammare tillåter väljer stimulering av apikal eller basolateral compartments (som organoid analysen inte tillåter); genom permeabilisering basolaterala membran, kan den apikala CFTR beroende anjon sekre selektivt mätas 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment med mänskliga vävnader beskrivs häri godkändes av den etiska kommittén vid University Medical Center Utrecht (UMCU, TcBio # 14-008). Informerat samtycke för vävnadssamling, generation, lagring och användning av organoids erhölls från patienter vid Wilhelmina Barnsjukhus (WKZ) -UMCU.

Utrustning förbrukningsartikel verktyg
Huv med laminärt flöde 15 och 50 ml koniska rör Zeiss LSM 800 - Zen 2 (blå upplagan) programvara för att mäta bilder
CO2-inkubator mikrocentrifugrör Microsoft Excel-program
Cellodlingsmikroskop (ljus / optisk mikroskop) 0,22 um filter
Centrifug serologiska pipetter
Rolling Shaker Mikropipett filterspetsar
4 ° C rum eller 4 ° C kylskåp för inkubator cryovials
CoolCell Cell Frysning Container
serologisk Pipetterings
Micropippette (1000, 200 och 20 | j, l)
Viaflo Upprepa pipett
(Levande cell) konfokalmikroskop
Dator
Flytande kväve tank
Multichannel (200 | il)

1. Förbereda Reagens för kultur

  1. Basal Medium Framställning
    OBS: Basal medium (BM) hänvisar till Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium med Hams Nutrient Mixture F-12 (Ad-DF) med tillsats av 4- (2-hydroxyethil) -1piperazineethanesulfonic syra (HEPES), glutamin och penicillin / streptomycin (Pen / Strep).
    1. I en 500 ml Ad-DF-medium flaska, tillsätt 5 ml 200 mM glutamin, 5 ml 1 M HEPES och 5 ml pen / strep lösningar (10.000 U / ml, 10000 Mg / ml).
    2. Store BM i kylskåp vid 4 ° C under åtminstone 4 veckor.
  2. Wnt-3A konditionerat medium Förberedelse
    OBS: Wnt-3A-konditionerade mediet görs internt using cellinjen L-Wnt-3A i enlighet med tillverkarens instruktioner.
    1. För skörd av Wnt-3A-konditionerat medium, samla mediet exponeras till cellerna under en vecka och snurra det ner under 5 minuter vid 450 xg för att avlägsna flytande celler.
    2. Filtrera det Wnt-3A-konditionerat medium genom ett 0,22 pm filter och dela upp den i 40 ml alikvoter i 50 ml koniska rör. Förvara dem vid 4 ° C under minst 4 månader utan förlust i aktivitet.
    3. Testa aktiviteten av Wnt-3A konditionerat medium i en TOP / FOP analys med användning av humana embryonala njur (HEK) -293-celler transfekterade med topp- och FOP-luciferas och TK- Renilla och uppmätta med en Renilla -luciferase assay kit enligt tillverkarens instruktioner.
      OBS: TOP-luciferas är en reporter plasmid som innehåller vildtyp TCF bindande regioner. Om Wnt-3A-konditionerat medium är aktiv, är den kanoniska Wnt signalering aktiveras. Beta-catenin translokerar in i kärnan att associera intelligensh TCF / LEF transkriptionsfaktorer och aktiverar transkription av luciferas reporter, som inducerar en ökning av den relativa luciferasaktiviteten när substratet tillsätts. FOP-luciferas används som en negativ kontroll, eftersom den TCF-bindande regioner uppströms om luciferasgenen är muterade.
  3. Kolon Medium Framställning
    OBS: Förbered och späd alla tillväxtfaktorer och reagens enligt tillverkarens rekommendationer. Använd liten storlek portioner ett område att undvika frysupptiningscykler. Funktionella tillväxtfaktorer är viktiga för resultaten.
    1. Förbereda kolon medium (CM) genom att komplettera BM med 1x B27, 1,25 mM N-acetylcystein, 50 ng / ml hEGF, 5 nM gastrin, 10 mM nikotinamid, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 pM A83-01 , 10 | iM SB202190, och 100 | ig / ml av ett antimikrobiellt för primära celler.
    2. Dela upp CM i portioner och frysa dem vid -20 ° C i upp till 4 månader. Tina portioner att förbereda hela kolonmedium (FCM) genom att tillsätta 50% Wnt-3A-conditoned medium till CM. Store FCM upp till 7 dagar vid 4 ° C utan förlust av aktivitet.
    3. Vid fastställandet av en organoid kultur från rektala biopsier, komplettera FCM med 50 mikrogram / ml vancomycin, 50 mikrogram / ml gentamycin och 10 ^ M Rho-associerade ringlad-spiralbildande protein serin / treonin-kinashämmare (RhoKi). Använd detta medium, kallad isoleringsmedium (IM), endast under de första två till tre dagar i odling.
  4. EDTA Stock Solution Preparation
    1. Förbereda 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA), pH 8, i ultrarent H2O, steriliseras med en 0,22 pm filter.
  5. Manipulering av Basement Membrane Matrix
    1. Förbered basalmembranet matris (BMM) enligt tillverkarens rekommendation.
    2. Tina BMM över natten på is.
    3. Vid överföring BMM från flaskan till en 15 ml koniskt rör, användningen 5 ml pipett och en 15 ml koniskt rör förkylts vid -20 ° C.
    4. När tinats, förvara BMM i kylskåp vid 4 ° C och inkubera på is under minst 30-60 minuter före användning.
      OBS: För att uppnå bästa resultat, måste BMM vara kall och blandas ordentligt innan inbäddning kryptor eller organoids.

2. Fastställande Colon Organoids från en CF-patient Biopsi

OBS: Efter vävnadsuppsamlings, är det viktigt att hålla provet på is i saltlösning, Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning utan Ca2 + och Mg2 + (DPBS), eller BM. Snabb behandling av biopsier rekommenderas, men det har visat sig möjligt att fastställa organoid kulturer från biopsier lagras på is i upp till 7 dagar.

  1. Låt de biopsier avsätts i botten av en 15 ml koniskt rör och avlägsna supernatanten.
  2. Tillsätt 10 ml DPBS till biopsier och pipett upp och ner 10-20 gånger med hjälp av en 10 ml pipett.
    OBS! Pipetten måste i förväg fuktats med BM innan pipettering biopsi.
  3. Låt de biopsier avsätts i botten och avlägsna supernatanten.
  4. Upprepa steg 2.2 och 2.3 4-5 gånger tills supernatanten är klar.
  5. Tillsätt 10 ml DBPS och 200 pl EDTA (0,5 M) till de biopsier och placera röret på en gungande röret plattform för 60-120 min vid 4 ° C.
    OBS: Inkubationstiden kan variera per patient. Om kryptor släpps, blir DPBS grumlig. EDTA inkubation kan slutföras när kryptor kan observeras under ett mikroskop.
  6. Låt kryptor att lösa. Kassera supernatanten.
  7. Ta upp 2 ml BM och lägga till en ny 15 ml koniska rör. Skaka denna nya röret manuellt på ett sådant sätt att insidan är täckt med BM.
  8. Med användning av en pipett för-vätt med BM, tillsätt 2 ml DPBS till röret innehållande de biopsier och pipettera upp och ned 10-20 gånger.
  9. Låt biopsier för att reglera och överföra DPBS med kryptor till den nyarör innehållande 2 ml av BM som framställdes i steg 2,7.
  10. Upprepa steg 2,8 och 2,9 tills inga fler kryptor släpps.
  11. Snurra kryptor ner vid 130 xg under 5 minuter vid 8 ° C.
  12. Under tiden, överföra IM till säkerhetsskåpet vid rumstemperatur (RT).
  13. Kasta bort supernatanten och tillsätt 10 ml BM till kryptan pellets och upprepar steg 2,11.
  14. Resuspendera pelleten i 1 ml BM. Ta 5-10 pl och räkna antalet kryptor med ögat under ett mikroskop.
  15. Snurra kryptor ner vid 130 xg under 5 minuter vid 8 ° C.
  16. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 55% BMM (v BMM till v IM).
    OBS: kryptor återsuspenderas i motsvarande volym av 55% BMM vid en krypta per il. Om det inte finns tillräckligt kryptor, är den minsta volymen av BMM 40 ^.
  17. För sådd, pipett 35 ul per brunn (i en platta med 24 brunnar). Dela upp 35 pl BMM i 3-5 droppar separat för att förbättra spridningen av growth faktorer i BMM. Inte skapa bubblor.
  18. Placera och lämnar plattan upp och ner i inkubator vid 37 ° C under minst 20 min för BMM stelna.
  19. Tillsätt 500 | il av IM per brunn och hålla den i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
  20. Uppdatera medium var 2-3 dagar. Ta bort den gamla mediet genom att pipettera med en P1000 pipett lämnar BMM droppar intakt. Försiktigt FCM genom att pipettera den i sidan av brunnen, inte direkt på BMM droppar.
    OBS: Om inga kryptor släpps i isoleringsprotokollet, centrifugera supernatanten, tvätta pelleten 2-3 gånger med BM, och återsuspendera den i BMM. Ta överblivna vävnad och skär den i små bitar med en rakkniv. Samla dessa i en 15 ml koniskt rör, centrifugera dem, och återsuspendera dem i samma BMM. Om några epitelstamceller är närvarande, kommer dessa också att generera organoids.

3. Passaging av Colon Organoids för underhåll, Frysning och förskolin-inducerad Svullnad analys (FIS)

OBS: Varje organoid kultur har sin egen fördubbling tid. Normalt kan kolorektal CF organoids utökas 1: 3-1: 5 gånger var 7-10 dagar. Det är ett gott tecken om spirande strukturer observeras. Colorectal CF organoids är mindre cystisk (Figur 2A - 2C) än kolorektal normala organoids (figur 2D). För etablering och underhåll, organoids odlas i 24-brunnsplattor; för frysning, i 6-brunnsplattor; och för FIS-analys i 96-brunnars patéer.

  1. Passage av Organoids
    1. Håll BMM på is under minst 30-60 minuter innan du använder den.
    2. Hålla FCM vid RT under minst 1 timme före användning.
    3. Märk ett 15 ml koniskt rör med provnamn och ett annat rör som "tvättas".
    4. Försiktigt aspirera mediet från brunnarna med användning av en P1000 pipett utan att störa BMM droppar.
    5. Tillsätt 1 ml av BM till en bra och bryt upp BMM sjunker med en P1000 pipett. Överför 1 ml till 15 ml koniska rör med provnamnet.
    6. Tvätta väl med ytterligare 1 ml av BM och överföra den till samma 15 ml rör.
    7. Upprepa steg 3.1.5 och 3.1.6 med ytterligare 5 brunnar (upp till 6 brunnar i en 24-brunnar kommer att tvättas i en 15 ml koniska rör).
    8. Fyll röret upp till 12 ml med BM. Pipettera upp och ned med hjälp av en i förväg vätt 5 ml pipett.
    9. Centrifugering vid 85 xg under 5 minuter vid 8 ° C.
    10. Kasta bort supernatanten och tillsätt 1 ml av BM till pelleten. Med samma P1000 pipettspetsen, tar upp en P10 spets utan filter, och pipettera upp och ner 20 gånger. Kasta både P1000 och P10 tips.
    11. Tillsätt 4 ml av BM med en 5 ml pipett och hålla röret lutas ca 70 ° från vertikalt till en sida. Pre-våt en ny P1000 spets och blanda kraftfullt 2-3 gånger med P1000 (1 ml volym).
    12. Räkna till 10 samtidigt som den är i lutande läge, samla det översta skiktet noggrant wed P1000 pipett och överföra 4 x 1 ml i röret märkt som "tvättas".
    13. Beakta organoids lösa till botten i det tippade röret; störningsfri organoids och större bitar kommer att sjunka till botten. Centrifugera 15 ml "tvättas" rör under 5 minuter vid 85 xg och 8 ° C.
    14. Kassera supernatanten och tillsätt tillräcklig mängd av substratet och BMM till organoid pelleten till en slutlig koncentration av 55% BMM. Blanda genom att pipettera upp och ned utan att skapa bubblor (Figur 3B).
      ANMÄRKNING: En god täthet uppnås genom att ympa 25-30 organoids i 10 fil BMM.
    15. Följ steg 2,17-2,19.
  2. Passage för frysning
    1. Hålla BM i is under åtminstone 30 till 60 min före användning. Hålla FCM vid RT under minst 1 timme före användning.
    2. Förbereda FCM kompletterat med RhoKi (steg 1.3.3).
    3. Ta trypsin från kylskåpet och låt den vid rumstemperatur under minst 30 minuter före användning.
    4. Följ steg 3.1.5-3.1.10.
    5. Avlägsna så mycket supernatant som möjligt, tillsätt 4 ml trypsin, och vortexa i 30 sek.
    6. Placera sedan röret i ett varmt vattenbad vid 37 ° C under 1 min och skaka kraftigt under 30 sek.
    7. Inspektera lösningen i röret. Om intakta organoids är fortfarande synliga under mikroskop, upprepa steg 3.2.7.
    8. När organoids störs, tillsätt 8 ml BM för att neutralisera trypsin och pipetten 10 gånger.
    9. Spin 3 min vid 450 xg vid 8 ° C.
    10. Kassera supernatanten och tillsätt tillräcklig mängd av substratet och BMM till organoids att nå en 55% BMM lösning. Blanda genom att pipettera upp och ned utan att skapa bubblor.
      OBS: För frysning måste organoids seedas i en 1: 1-förhållande efter trypsinisering.
    11. Seed 250 | il i en enda brunn i en förvärmda 6-brunnars vävnadsodlingsplatta, som producerar mycket litet, separerade droppar av ~ 10 | il. Placera plattan upp och ner i inkubator vid 37 ° C och lämnaBMM stelna i 20-30 min.
    12. Tillsätt 2,5 ml färskt FCM + RhoKi i varje 6-brunnsplatta väl och överföra plattan till inkubatorn (figur 3C).
  3. Passage Organoids för FIS-analys
    OBS: Beroende på antalet och storleken på organoids, mellan 4 och 6 brunnar i en 24-brunnar är tillräckligt för sådd 27 brunnar i en 96-brunnar.
    1. Behandla organoids som beskrivs från steg 3.1-3.1.13.
    2. Återsuspendera pelleten i 120 | il 50% BMM.
    3. Bekräfta antalet organoids (30-50) i en 3 l BMM droppe under mikroskop.
    4. Plattan de organoids med användning av en enda droppe av 3 | il placerade i mitten av varje brunn i en 96-brunnars pate.
    5. Placera plattan i 37 ° C inkubator i 15 min för BMM att stelna; ytterligare åtgärder beskrivs i steg 6.1.1.

4. Frys Colon CF Organoids

OBS: OrganOID är redo att frysas ned 1-2 dagar efter trypsinisering och odling, så organoids kommer fortfarande att vara liten, vilket ökar effektiviteten på överlevnad efter upptining.

  1. Tillsätt 1 ml av BM och bryta upp BMM droppar med hjälp av en P1000 pipett. Överföring till en 15 ml koniska rör.
  2. Tvätta väl med ytterligare 1 ml BM och överföring till samma 15 ml rör.
  3. Upprepa steg 4,1 och 4,2 med alla brunnar.
    OBS: För att undvika överskott BMM är 3 brunnar i en 6-brunnar samlas i ett 15 ml rör.
  4. Fyll upp 15 ml rör innehållande organoids med 12 ml kall BM och pipett upp och ner med en 5 ml pipett. Låt röret på is under 5 min.
  5. Snurra under 3 min vid 450 xg och 8 ° C och avlägsna supernatanten.
  6. Lös pelleten av organoids med frysmedium och pipett upp och ner för att korrekt resuspendera organoids.
    OBSERVERA: 500 pl av frysmedium används för varje 100 | il av BMM.
  7. Med användning av en 5 ml pipett, överför 0,5 mlorganoids återsuspenderas i frysmedium till sterila kryogena flaskor.
  8. Överför flaskorna till en cell frysbehållare och lägga den vid -80 ° C.
  9. Efter 24 timmar, överföra flaskorna för lagring i flytande kväve.

5. Upprättande av kulturer från frysta Organoids

OBS: Tina BMM på is och hålla den på is. Låt BM nå RT, och värma en 10 ml portion till 37 ° C innan förfarandet för upptining en cryovial.

  1. Tina flaskan snabbt genom omröring i en 37 ° C vattenbad tills det finns fortfarande en liten frysta materialet.
  2. Överför tinade organoids till en 15 ml koniska rör med hjälp av en P1000 pipett.
  3. Omedelbart efter, tillsätt 1 ml varmt BM droppe för droppe under omskakning i botten av röret. Så snart de 1 ml medium tillsätts, blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner några gånger för att späda ut frysmedium.
  4. Långsamt (droppe för droppe) tillsätt 9 ml varmt BM till det koniska röret containing de organoids. Skaka.
  5. Snurra cellsuspensionen under 3 min vid 85 xg och 8 ° C.
  6. Kassera supernatanten försiktigt utan att störa pelleten. Resuspendera organoid i 90 pl av FCM kompletterat med RhoKi (steg 1.3.3). Lägg sedan till 110 pl BMM.
  7. Lägga 35 ul till varje brunn i en förvärmd 24-brunnar, vilket gör små, åtskilda droppar.
  8. Överför plattan till 37 ° C inkubator och lämnade plattan upp och ner för 20 till 30 min.
  9. Tillsätt 500 l av FCM med RhoKi till varje brunn och överföra plattan tillbaka till inkubatorn (figur 4A - 4C).
  10. När organoids har återhämtat sig ordentligt från upptining, späd mer BMM så att varje 10 pl av BMM innehåller 25-30 organoids. Detta förfarande kan göras 2-3 dagar efter upptining (Figur 4D - 4G) och säkerställer god tillväxt av organoid.

6. Forskolin-inducerad Svullnad Såsomsäger (FIS)

OBS: Fsk titrering möjliggör mätning av CFTR restfunktion. För CFTR modulation, är organoids utsätts för en given corrector (t.ex., VX-809) och / eller potentiator (t.ex., VX-770), beroende på genotyp. Vanligtvis är VX-809 tillsattes 18-24 timmar före mätningen, medan VX-770 och FSK tillsätts precis innan mätningarna. Var medveten om att vissa modulatorer (Korrektorer / potentiatorer) kan binda till plastytan av analysplattan.

  1. Plätering för analysen
    OBS: VX-809 lagren är i alikvoter vid 20 mM och lagrades vid -80 ° C. När upptining, lämnar vid RT och skyddas mot ljus.
    1. Behandla organoids som beskrivs i avsnitt 3.3.
    2. Om testa VX-809 corrector, förbereda en dos-responskurva i triplikat med följande koncentrationer: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0, och 30 ^ M. Förbereda utspädningar i FCM.
    3. Till den 96-brunnar, tillsätt antingen 100 μ; L av FCM med respektive VX-809 koncentration eller 100 | il av FCM endast och inkubera plattan.
  2. Mätning av analys
    OBS: VX-770 aktier alikvoteras på 20 mM, medan Fsk är på 10 mM; båda lagras vid -80 ° C. När upptining, låt stå i rumstemperatur och skyddas mot ljus.
    1. Ta en ampull av kalcein och DMSO och lämna vid RT under 15 min.
    2. Lägg 5,1 pl av DMSO till flaskan där kalcein tillhandahålls som ett pulver, om oöppnade. Annars använder en redan återsuspenderade kalcein flaska innehållande 2,5 pl kalcein.
    3. Tillsätt 2,5 pl av kalcein till 580 pl av BM i ett 1,5 ml rör och märka den.
    4. Tillsätt 10 pl av denna färglösningen (BM + calcein) till varje brunn med en upprepning pipett.
    5. Resuspendera en gång med en flerkanalig att säkerställa att färgämnet blandas väl.
    6. Inkubera plattan i en 37 ° C inkubator i 30 min.
    7. Under kalcein inkubation börja förbereda FSKoch VX-770-lösningar, om det behövs.
    8. Om du använder en VX-770 potentiator, förbereda en dos-responskurva i tre exemplar med följande koncentrationer: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0, och 30 ^ M. I händelse av en FSK-titrering, koncentrationerna är: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0, och 5,0 ^ M. Förbered späd i BM.
      OBS: För FSK, VX-770, eller någon annan drog till på den andra dagen, de späd måste vara beredda på 2x slutlig koncentration, sedan 100 pl Fsk / läkemedels titreringslösningen kommer att läggas till varje brunn, som redan innehåller 100 pl av FCM.
    9. Överför FSK och VX-770-lösningar, en P200 pipett och tips till mikroskop rummet.
    10. För avbildning FIS analysen använda en levande cell imaging konfokalmikroskop utrustad med en automatiserad skede en uppvärmd kammare, och CO2 flöde.
      OBS: Följande steg avser ett specifikt mikroskop. Olika inställningar skall gälla för andra mikroskop efter tillverkarensinstruktioner.
    11. Sätta 96-brunnar i plåthållaren.
    12. Ange konfokala inställningar för avbildning.
      1. Förinställa levande imaging verktyg till 37 ° C och 5% CO2 och låta kammaren förväg inkubera under minst 30 min före mätning.
      2. Använd "Smart inställning" för att välja Alexa Fluor-488 spår.
      3. Ställ in 5X objektiv och skanningsområdet till 0,6x att zooma ut och fånga hela brunnen.
      4. Anpassa lasereffekt och detektorkänslighet för att möjliggöra optimal detektering av kalcein-grön märkta organoids över bakgrunden. Pinhole kan ökas till 130 | j, m och bildmedelvärdes kan ställas in på två.
      5. Ställ in bitdjupet på 8 och ramstorleken till 512 x 512.
      6. Använd alternativet tidsserier att ställa in mättiden, frekvens och intervall.
        OBS: Föreslagna för regelbundna mätningar: 1 tim med 10 minuters intervall: cykler = 7 (cykel 1 är T = 0). För mätningar av minskad svullnad, organoids kan avbildas i upp till tre timmar.
      7. Använd kakel möjlighet att manuellt bestämma de individuella brunnarnas positioner.
    13. Tillsätt 100 | il av en FSK-och / eller VX-770-lösningar till de motsvarande brunnarna, efter samma ordning som mätningen. Börja lägga lösningarna i första avbildade väl och fortsätta med bild ordning.
    14. Starta mätningen.
    15. Efter experimentet är klar, spara filen.
  3. Analys av FIS analysdata
    1. Skapa en "organoid analys" makro för dataanalysen av FIS analys med hjälp av analysverktyget i en bildanalysprogram som känner igen alla strukturer avbildas genom Alexa-488 spår och fyller de identifierade strukturer för att beräkna ökningen av den totala organoid området ovanför olika tidpunkter.
    2. Öppna datafilen med de förvärvade bilderna i bildanalysprogram.
    3. Välj makrot för organoid analys.
    4. <li> Ställ in tröskelvärdet för att balansera signal-brusförhållande i en brunn vid tidpunkten 1 och se till att alla organoid strukturer redovisas och fylls.
      1. Checka in 4-6 brunnar för att se om alla strukturer redovisas också vid tidpunkten 7. Något ändra tröskeln för att se till att bakgrundssignaler vid tidpunkten 7 inte redovisas som strukturer (den specifika tröskel kan ändras något mellan experiment).
    5. Ställ in kriterierna för minimal ytstorlek av erkända objekt till 1000 pm 2.
    6. Tryck på "analysera" för att starta. Analysen tar ungefär tre minuter, beroende på den programvara som används.
    7. När programmet är klar, gå till "skapa bord" och välj följande uppgifter: väl nummer (tabell bör öka i den här ordningen), tidpunkter och total yta per brunn.
    8. Spara filen som en .xlm att exportera till ett kalkylprogram.
    9. I detta program, beräkna den relativa ökningen i området per well genom att ställa in området för tidspunkt en till 100%. Beräkna arean under kurvan (AUC) från tidpunkter 1-7 per tillstånd; den nedre gränsen av området (Y-värde) är satt till 100%. FSK eller drog titreringar (X-axeln) är avsatt mot AUC (Y-axeln).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A visar en representativ ny isolering av kryptor inbäddade på BMM. Kryptor är från en kolorektal biopsi av en CF ämne. Vanligtvis är en organoid genereras från varje crypt (figur 1 A - C). På grund av dysfunktion av CFTR, de flesta av de kolon CF organoids inte är cystisk, utan snarare är kompakta och med projektioner och buddings (Figur 2A - 2B). Men organoid några CF kulturer, särskilt med hög restfunktion, har några organoids med cystisk form (figur 2C), som vildtyp organoid kulturer (figur 2D).

Innan passage av organoids för expandering av kultur eller sådd en FIS-analys, är det viktigt att de organoids har en stor storlek med flera buddings, såsom visas i fig 3A. Om organoids är små och utan numerous buddings när de behandlas för passage är organoid kulturen påverkas negativt. Beroende på kvaliteten och aktiviteten hos viktiga tillväxtfaktorer som EGF, Wnt-3A, och Rspo3 de organoids når önskad storlek mellan 7 och 12 dagar (figur 3a). Efter mekanisk söndring, är buddings störs och används för att generera nya organoids i följande passage (figur 3B). Om bearbetning av de organoids för frysning, är det viktigt att de trypsiniseras till en liten storlek, såsom visas i fig 3C. Efter trypsinisering, är organoids pläterade för 1 eller 2 dagar för att låta dem återhämta sig från stress manipulation. Detta steg, tillsammans med den lilla storleken på de organoids, säkerställer en cellutvinning 98% efter upptining (Figur 4A).

När organoids tinas, är det viktigt att ha dem i hög densitet, så normalt är de tinas i ettliten volym (Figure4A). Efter en eller två dagar i kultur, och efter att ha konstaterat att de organoids ökar storleken (jämför figur 4A med figur 4B - 4C), de organoids späds i förhållandet 20-30 organoids per 10 pl BMM, ger rätt densitet att växa till en större storlek. Om organoids är alltför utspädd, kan de bromsa tillväxten och kan även differentiera och dö. Om organoids är alltför trångt, bristen på utrymme eller bristen på tillväxtfaktorer bromsar också tillväxten av organoids och minskar antalet buddings.

Pläteringen av organoids från viabla kulturer med begränsad cellrester bör resultera i förhållanden i vilka> 95% av de organoids sväller vid Fsk stimulering, under förutsättning att tillräcklig CFTR-funktion är närvarande (figur 5A - 5B). Organoids svälla i en genotype- och drogberoende sätt, såsomillustreras av representativa bilder av organoids med två F508del alleler (figur 5A) och organoids förening-heterozygota för F508del och S1251N (Figur 5B), en CFTR grind mutation i samband med några restfunktion.

För att kvantifiera svullnad, är totala kalcein-grön ytareor ut för varje tidpunkt och uttrycktes som procent av T = 0 (satt till 100%; figur 6A). Skräp och små, icke-svällande strukturer är typiskt under 5% av den totala ytarean. Den relativa ökningen område uttrycks per 10 min tidsintervall, och AUC (godtyckliga enheter) mätningar genereras för varje tillstånd (T = 0 till 60 min, baslinje tröskelvärde på 100%, figur 6B). Vi hittade AUC vara den mest robusta, eftersom det innehåller en viss variation i initiering av svullnad, samt en krökt förhållande än 30-40 minuter av Fsk vid höga CFTR funktionsnivåer.

figur 6C). Organoids samband med CFTR restfunktion kan nå upp till 4500 AUC enheter efter 60 minuter av 5 iM Fsk stimulering i frånvaro av CFTR modulatorer (200-220% yta av pre-FSK förhållanden). Organoid svullnad når ett tak på ~ 4500 AUC enheter, förmodligen på grund av de fysiska begränsningarna i organoid strukturer, hastighetsbegränsande effekter basolaterala jontransport, och inrättandet av jon- och vätsketransport homeostas under "utsträckt" förhållanden. FSK kan titreras för att ytterligare utöka det dynamiska området för analysen vid dessa höga CFTR resterande funktionsnivåer för att bättre kvantifiera restfunktion eller högeffektiva förening behandling (t.ex., såsom indikeras av den högre aktiviteten hos VX770 på svallningen av S1251N organoids vid stimulering med lägre FSK-koncentrationer, fig 6D).

Figur 1
Figur 1: Etablering av CF kolorektala organoids från biopsier. (A) Representativa bilder av isolerade materialet från en rektal biopsi efter inbäddad i BMM på isoleringsdagen (passage 0, dag 0). Utvidgningen av det angivna kryptan visas på den nedre högra panelen. (B) Samma kryptor följdes efter 7 dagar i odling (passage 0, dag 7). Utvidgningen av samma kryptan presenteras i panel A visas. (C) representant bild av samma organoid kulturen 11 dagar efter att ha split (passage 1, dag 11). Skalstrecken = 100 ^ m.
159fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Representant bilder av CF kolorektala organoids härledda från patienter med olika CFTR mutationer. Representativa bilder av CF kolorektala organoids från försökspersoner med F508del / F508del (A), F508del / R117H-7T (B), och F508del / S1251N (C) mutationer. (D) representativ bild av en kolorektal organoid kultur från en vildtyp CFTR ämne. Skalstrecken = 100 ^ m. Dessa bilder erhölls med någon Fsk stimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5159 / 55159fig3.jpg "/>
Figur 3: Bearbetning CF kolon organoids för underhåll och analys eller för frysning. (A) Representativa bilder av en CF kolon organoid kultur redo att behandlas för antingen passage (B) eller frysning (C). (B) Efter deras mekanisk sönderdelning, är små bitar bildas, som kommer att generera de nya organoids i nästa passage. (C) Efter trypsinisering, är mycket små, runda organoids genereras, vilket underlättar deras livskraft under frysprocessen. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Upprätta en CF kolorektal organoid kultur från frysta organoids. (<strong> A - C) Representativa bilder av en CF kolorektal organoid kultur tinade på dag 0 (A). Bilder från samma brunn togs en (B) och två (C) dagar efter. (D - G) Representativa bilder av utspädningssteget som beskrivs i avsnitt 5.9. När organoids har återhämtat sig ordentligt från upptining (dag 3 efter upptining), spädes de så de har utrymme att växa (D). Bilder från samma brunn togs sex (E), tio (F), och femton (C) dagar efter upptining. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Forskolin-inducerad svallning av CForganoids. (A och B) Representativa bilder av F508del / F508del (A) eller F508del / S1251N (B) kolorektala organoids före eller efter 60 minuter av stimulering med Fsk (5 pm) i frånvaro eller närvaro av VX-770 (3 pm]) eller VX-770 i kombination med VX-809 (3 pm). Skalstrecken = 200 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: kvantifiera forskolininducerad svullnad. (A) Representativa bilder av organoid markerat område av ett bildanalysprogram av F508del / S1251N organoids före (0 min) och efter 60 minuter av stimulering med Fsk (5 M) och VX770 (3 M). Skalstrecken = 200 | j, m. (B) Represdare bilder av den relativa ökningen av F508del / F508del eller F508del / S1251N organoids området under 60 min av Fsk (5 ^ m) stimulering i frånvaro eller närvaro av VX770 (3 | j, m) och / eller VX809 (3 | j, m). (C) area under kurvan mätningar av villkor som anges i (B) (T = 60 min, baslinjen tröskeln = 100%). (D) area under kurvan mätningar av F508del / F508del eller F508del / S1251N organoids vid olika koncentrationer av Fsk. Data representerar medelvärden ± SD från enskilda representativa experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här ger vi en komplett protokoll för generering, expansion, frysning och upptining av humana kolorektala organoids. Även om vi har etablerat mänskliga organoid kulturer för en tid sedan 17, har det ibland varit svårt att etablera tekniken på andra labb utan praktisk utbildning. Vi räknar med att dessa protokoll kommer att ersätta sådan utbildning.

Wnt-3A-konditionerat medium är en av de mest avgörande reagens för att lyckas etablera och upprätthålla en långsiktig organoida kultur. I själva verket kan organoid kulturer "krasch" när de utsätts för Wnt-3A-conditoned medium med låg aktivitet. Eftersom Wnt-3A-konditionerat medium görs internt, det finns flera aspekter som måste beaktas när du skapar ett aktivt medium. Aktiv Wnt-3A kan endast produceras i medium med hög kvalitet fetalt bovint serum (FBS) som ger de rätta tillväxtsignaler för L-celler och stabilisering av hydrofobaWnt-3a-molekyler. När Wnt-3A aktivitet är låg (dvs låg TOP / FOP förhållanden, se nedan), är det oftast FBS som orsakar problemet.

Kommersiell rekombinant Wnt fungerar dåligt, så vi rekommenderar inte att använda det som positiv kontroll för TOP / FOP Wnt reporter analys. Förhållandet mellan TOP / Renilla och FOP / Renilla är en indikation på Wnt aktiviteten av det konditionerade mediet, så en bra sats av Wnt-3A-konditionerat medium ger en TOP / FOP-förhållande högre än 25, jämfört med TOP / FOP värde från den negativa kontrollen: medel inte utsätts för Wnt-3A producerande celler. Rekombinant Noggin och R-spondin kan ersättas av noggin och R-spondin rade-mediet 28, 29.

Det nuvarande protokollet beskriver också ett funktionstest för CFTR-FIS-analysen. Vi har nyligen visat att förhållandet mellan CFTR genotyp och FIS och hur detta speglar publicerade CFTR genotype-fenotyp relationer som erhållits från kliniska register (www.CFTR2.org) 25. Användning av denna analys har två individer med ytterst sällsynta CFTR mutationer identifierades vars organoids var mottaglig för ivacaftor (VX-770) 25. Efterföljande förskrivning av detta läkemedel resulterade i tydlig klinisk respons, med fokus på värdet av FIS analys för att matcha specifika läkemedel med patienter med sällsynta mutationer i avsaknad av data från kliniska prövningar. Väsentligt för kvantifiering av FIS är optimala tillväxt och analysförhållanden, endast indikeras av en begränsad del av icke-svällande organoids (vanligen under 5%). Höga nivåer av skräp leder till underskattning av svullnad, som en större andel icke-livsdugliga, icke svällande strukturer känns igen av bildanalysmjukvara.

Samband mellan in vitro FIS svar och tidigare etablerade CFTR beroende biomarkörer (svett kloridhalt och intestInal strömmätningar) på personlig nivå var lätt påvisbar i våra tidigare studier 19, 25. Detta stödde uppfattningen att restfunktion mätningar med FIS på patienter med CF kan komplettera nuvarande metoder som en diagnostisk eller prognostisk markör i en personligt sätt. Genomströmningen av FIS-analysen jämfört med andra biomarkörer för CFTR funktion, såsom mätningar svett kloridhalt in vivo och tarmströmmätningar i ex vivo rektala biopsier, möjliggör bättre kontroll av tekniskt variabilitet. Det ger också en helt CFTR beroende avläsning och ett stort dynamiskt område genom att använda en titrering av Fsk som exakt typer rest CFTR funktion.

Men speglar FIS-analysen endast effekterna av den individuella genotyp på variabiliteten av läkemedlets effektivitet, medan modulering av CF sjukdom påverkas av mer än bara CFTR funktion. för drug svar, är analysen reflekterande av en potentiell vävnadssvar. Även om mycket exakt i CFTR mätningen mänsklig variation i farmakokinetik inte förts, i motsats till andra in vivo 7, 8 eller direkt ex vivo CFTR mätningar 32. Som diskuterats tidigare, är icke CF modifierings (både genetiska och miljömässiga) också påverka fenotyp, vilket orsakar en klyfta mellan in vitro observationer eller CFTR biomarkörer och kliniska fenotyp 2. Vidare är identifiering av potentiella responsiva mutationer med hjälp av cellinjer 33 i samband med mindre påverkan på patienter som behöver få en rektal biopsi för fastställandet av organoids.

Flera CFTR inriktning läkemedel är för närvarande under utveckling en. Det förväntas att kliniska prövningar inte kommer att tillåta en korrekt förutsägelse av klinisk effekt Bvisar därmed CFTR mutationsstatus ensam. Som FIS-analysen mäter CFTR funktion och läkemedelssvar funktionellt, kan det bli en lämplig metod för att avgöra vilka läkemedel som fungerar bäst för vilken patient. FIS-analysen kan också vara användbar för identifiering av patientgrupper som ska ingå i registreringsförsök och för utveckling av nya läkemedelsformer. Stimulering av kolorektala organoids med plasma före och under behandling kan dessutom hjälpa till att kvantifiera funktionella mängder av cirkulerande CFTR modulatorer i blodet, vilket kan underlätta personlig dosering och val av läkemedelsdoser i kliniska prövningar 30, 31. Slutligen kan FIS vara användbar för en bättre grundläggande förståelse av CFTR funktion och dess interaktioner med andra -så långt till stor del unknown- genetiska modifierings av dess funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av HIT-CF program i den holländska CF foundation (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), Wilhelmina Barnsjukhus Research Fund och CZ, och Zilverenkruis / Achmea. Vi vill tacka S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, och G. Berkers (Institutionen för Pediatric Pulmonology, Wilhelmina Barnsjukhus, UMC Utrecht), och RHJ Houwen (Institutionen för Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Barnsjukhus, UMC Utrecht) för att närma patienterna och få biopsier för generering av en CF Biobank.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4, (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16, (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45, (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67, (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106, (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108, (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363, (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13, (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2, (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373, (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13, (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165, (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19, (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, (1), e27112 (2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15, (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8, (344), 344ra84 (2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266, (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143, (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48, (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14, (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192, (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11, (3), 237-245 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats