Exame de fenótipos de acolhimento em

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Este estudo envolve métodos para revelar efeitos sobre um modelo hospedeiro peixe seguintes alterações da pele e do intestino composição comunidades microbioma por um antibiótico.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carlson, J. M., Chavez, O., Aggarwal, S., Primm, T. P. Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment. J. Vis. Exp. (120), e55170, doi:10.3791/55170 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Foi estabelecido que os antibióticos podem perturbar o microbioma humano levando a dysbiosis, o que significa um desequilíbrio comunidade microbiana. Alteração da composição da microbiota após tratamentos com antibióticos foi demonstrado para diminuir a diversidade da comunidade, reduzir os membros-chave, e alterar o metabolismo da comunidade, especialmente no intestino 1, 2. Perturbação antibiótico do microbioma intestinal pode reduzir a resistência à colonização a Clostridium difficile 3, 4 e 5 Salmonella.

Além disso, a interrupção da microbiota tem sido associada com o desenvolvimento de muitas doenças e síndromes em seres humanos (por exemplo, associada a antibióticos enterocolite, doença inflamatória do intestino, desordens metabólicas, etc.). Os antibióticos também são amplamente implementadas na agricultura como promotores de crescimento nagado e aves de produção 6. O uso dessas ferramentas poderosas não é sem efeitos colaterais, o que é evidente no rápido aumento da resistência aos antibióticos, bem como os efeitos de um microbioma interrompido tem com seu hospedeiro habitado. Muitos estudos têm mostrado que o amplo espectro da utilização de antibióticos tem longos consequências duradouras para a estrutura e função da microbiota, mas os efeitos colaterais de um microbioma impactando fisiologia acolhimento interrompido aos antibióticos são apenas especulações que ainda têm de ser suportados.

A interação entre hospedeiros, microbiota e antibióticos está longe de ser entendida de uma forma concisa. Portanto, um modelo simples e mais tratável é vantajoso para lançar luz sobre o sistema de mamíferos altamente complexa. superfícies mucosas em seres humanos, incluindo o intestino, abrigam a maior densidade e diversidade de micróbios, e também as interações entre microorganismos e acolhimento mais íntimos. O microbioma da pele da mucosa oferece peixes svantagens everal como um sistema modelo. O Teleostei (peixes ósseos) é uma das primeiras linhagens a divergir na acepção Vertebrados que teleósteos ter tanto inata e adquirida sistemas imunitários que co-evoluíram um relacionamento com comunidades bacterianas comensais 7. Partes de pele de peixe muitas características com as superfícies das mucosas um tipo de mamíferos, tais como as funções fisiológicas, componentes de imunidade, e arranjo de células produtoras de muco 8. A localização externa da superfície do peixe pele mucosa oferece um microbioma fácil de manipular experimentalmente e amostra.

O mosquitofish Ocidental, Gambusia affinis (G. affinis), é um modelo de peixe que tem sido utilizado no passado para o estudo de toxicologia de acoplamento e 9, 10, 11. Dado o pequeno tamanho, abundância população em estado selvagem como uma espécie invasora, m o custo de cuidados inimal e natureza resistente, temos desenvolvido G. affinis como um modelo microbioma mucosa. Além disso, Gambusia compartilhar a fisiologia de dar à luz filhotes vivos com mamíferos vivíparos, o que é raro em espécies de peixes. Nós completaram o estudo mais extenso no momento da pele de peixe microbiota normal usando 16S perfilar com Gambusia 12. Além disso trabalho demonstrou três efeitos negativos sobre o hospedeiro seguintes perturbações da pele e da flora intestinal através de um antibiótico de largo espectro 13.

Cinco efeitos diferentes foram examinados nos peixes após a exposição aos antibióticos. O benefício de acolhimento mais bem estabelecida do microbioma é a exclusão competitiva de patógenos. O patógeno peixes Edwardsiella ictaluri é conhecido por causar surtos de septicemia entérica em fazendas catfish comerciais 14. E. ictaluri também foi mostrado para infectar letalmente peixe-zebraclass = "xref"> 15, 16 e 17 Gambusia. Um desafio com este agente patogénico a partir da coluna de água pode servir como uma medida de exclusão. Como uma comparação para susceptibilidade a um patógeno indivíduo, sobrevivência durante a exposição a uma alta densidade de organismos mistos também foi efectuada. Fezes e solo orgânico-ricos foram usados ​​como fontes comumente encontradas de comunidades microbianas.

Outro papel estabelecido a comunidade intestino bacteriana executa é o processamento de nutrientes e energia colheita, afetando a absorção nutricional global para o anfitrião. Como uma medição bruta de alimentação, o peso do corpo dos peixes foi comparado antes e depois de um mês de ser alimentados com uma dieta padrão. Tratados com antibióticos de peixe como uma média perderam peso, enquanto peixes de controle, em média, ganho de peso ao longo do mês. O mecanismo para esta falta de ganho de peso não é clara. Um factor que contribui possível é o tempo de trânsito dos alimentos no intestino. A moti GIlidade método foi adaptado do peixe-zebra (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicação pessoal) para determinar o tempo de trânsito. Ainda não foi determinado se os peixes tratados com antibiótico tem um tempo de trânsito alterada.

Um desafio comum vivida no ambiente natural por todos os organismos, especialmente peixes, é o estresse osmótico. Gambusia foram mostrados para adaptar-se rapidamente quando agudamente sublinhado em altas concentrações de salinidade 18. Surpreendentemente, os peixes com um microbioma alterou a antibióticos exibiu reduzido sobrevivência a uma tensão elevada de sal. O mecanismo para este romance fenótipo está sob investigação. Outro esforço comum em animais aquáticos, especialmente em aquários, é formas tóxicas de azoto (amoníaco, nitrato e nitrito). Sobrevivência contra o nitrato não foi significativamente diferente entre os tratados com antibiótico e controle de peixe. Os métodos apresentados neste manuscrito pode ser usado com ou Gambusia modelo peixe semelhante organismos, tais como zebrapeixes e medaka, para medir fenótipos nos peixes após a manipulação experimental.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados sob a aprovação de protocolos IACUC, numeradas 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 e 14-04-17-1018-3-01.

1. Animal Collection, manuseio e cuidados éticos

  1. Recolha Gambusia affinis do local de campo (guia de identificação no http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) usando uma pequena rede de mergulho e coloque em 19 baldes L. Use inspeção visual para identificar as espécies.
  2. peixes descanso para 1-2 d em um balde com água da lagoa. Em seguida, transferir o peixe até 76 ou 189 tanques L aquário cheio de meia água da lagoa / metade água da torneira a 25 ° C, gaseificadas com uma pedra porosa borbulhante. Use uma pequena rede de mergulho durante o manuseamento de peixe como para perturbar minimamente o seu microbioma da pele.
    NOTA: densidade de peixes deve ser superior a 20 peixes / 38 L de água do aquário. Os peixes são aclimatados para o aquário por pelo menos 5 d antes de experimentação.
  3. Alimentar os peixes em um regime diário com 5 mg de ração por peixe. Hopeixes ld com um 12 h ciclo claro / escuro de 12 h.

2. A exposição a antibióticos inicial para todas as experiências

  1. Tiragem Todos os peixes de cada experimento do mesmo aquário, coloque em dois grupos separados (tratados: expostos a antibióticos e controle: não exposto) em 19 baldes L. Dados anteriores recolhidos mostram que o peixe no mesmo aquário têm homogeneizados microbiomes pele que têm pouca variação na composição da comunidade. 12
  2. Durante as experiências, manter os peixes em 2 L de lagoa artificial água (APW; 0,33 g / L de CaCl2, 0,33 g / L de MgSO4, 0,19 g / L de NaHCO3) que é esterilizada em autoclave antes do uso.
  3. Preparar a solução stock de antibiótico rifampicina por adição de 50 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (DMSO). A rifampicina é um antibiótico de largo espectro representativo que é não-tóxica para os peixes. Em humanos e ratos, distribui-se bem nos tecidos.
  4. A partir do estoque rifampicina administrar uma finalconcentração de 25 ug / mL em 2 L de APW para exposição aos antibióticos do grupo dos peixes tratados durante 3 dias. Note-se que após 3 d, pele cultivável números bacterianos retornar semelhante à da pele de peixe pré-tratado.
  5. Em paralelo, manter um grupo de peixe não tratado em APW e dar uma quantidade equivalente de DMSO (0,5 mL por cada L de APW) na coluna de água para actuar como um grupo de controlo.
  6. Como as experiências sejam destina-se a medir os efeitos de uma microbiota alterou-antibiótico em fenótipos de peixe, a fim de evitar efeitos directamente a partir do próprio antibiótico, após a exposição de três dias de antibiótico (ou de controlo) período, a transferência de peixe dentro de um balde com 2 L de APW fresco.
    1. Use um período de descanso de 10 horas para que o antibiótico é removido por os corpos dos peixes. Base de Dados desta vez eliminação em experimentos onde os peixes foram expostos a 25 mg / mL de antibiótico durante três dias. Euthanize o peixe cortando a medula espinhal seguido de mielotomia, homogeneizar em seguida o corpo inteiro usando um triturador de tecidos.
    2. Determinar a presença de antibióticos através da colocação de 50 ul desta suspensão, depois de filtração de 0,2 um para o centro de uma placa de petri de agar. Faça um buraco para esta suspensão pressionando uma cabeça para baixo estéril 200 mL ponta da pipeta na agar, que remove um pequeno plug.
    3. Utilizar placas de agar com 20 ml de volume medido de ágar nutriente, e espalhar uniformemente usando um cotonete de algodão com um organismo indicador, Bacillus subtilis, que é sensível à rifampicina. Obter o B. subtilis a partir de um ágar nutriente incubadas a 25 ° CO / N e utilizando a haste de algodão para se obter uma colónia. Observando-se uma zona de inibição após incubação durante a noite a 25 ° C, indica a presença de antibiótico nos tecidos de peixes.

3. Microbiome Extração

  1. Extrair uma amostra de pele a partir de microbioma epiderme mucosas exteriores, colocando o peixe dentro de um tubo estéril cónico de 15 mL cheio com 2 ml de PBST estéril (Na 137 mMCl, 10 mM de fosfato, 0,1% de Tween-20, pH 7,4) e solução de vórtex com uma definição de 10 durante 1 min, com incrementos de 10 s pausa. Detergente e sal no tampão promove a dispersão uniforme de bactérias em solução. Resultados comparáveis ​​foram encontrados com 0,85% de solução salina mas baixou contagens bacterianas com água pura.
  2. Transferir o peixe do tubo cónico para um balde de recuperação. A letalidade de extracção da pele é tipicamente menor do que 10%. Ou, analisar a suspensão bacteriana no tubo imediatamente após extracção ou sedimentar as bactérias por centrifugação a 2 minutos numa centrifugadora à temperatura ambiente a 15000 xg e armazenar a -80 ° C para análise futura.
    NOTA: Toda a cultura e análises bioquímicas são imediatos; ADN ou de extracção de proteína pode ser a partir de amostras congeladas.
  3. Para obter uma amostra do intestino microbioma, primeiro coloque o peixe em uma placa de Petri estéril. Euthanize o peixe, cortando a medula espinhal cervical diretamente atrás da cabeça com uma tesoura cirúrgica, seguido por mielotomia, E, em seguida, o corpo higienizar externamente com 70% de etanol toalhetes.
  4. Após a dissecção, remover todo o intestino por corte após o esôfago e antes do ânus.
  5. Cortar o intestino em seções pequenas 1 - 2 mm de comprimento e coloque todas as seções em duas mL de solução PBST em um tubo cônico. Após vortex durante 1 min, remover o sobrenadante para outro tubo limpo (tome cuidado para não chamar-se as secções do intestino).
    NOTA: O sobrenadante contém as bactérias do intestino extraídos que podem ser utilizados para análises directas ou granuladas pelo método anterior mencionados para amostras de pele.

4. Infecção preparação do modelo e banho de um patógeno específico

  1. Obter uma estirpe infecciosa de Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) e manter a cultura armazenada a -80 ° C. Strain 93-146 utilizados neste estudo, isolado a partir de um peixe-gato infectado, foi obtido de Mark Lawrence, Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Mississippi.
  2. streestoque ictaluri AK E. para um meio selectivo e diferenciais chamada E. ictaluri meios (MIE) de agar de 19 a cultura das bactérias e incubar durante 2 d a 27 ° C.
  3. Transferir uma colónia puro isolado a partir da cultura e inocular um frasco de 150 ml contendo 40 ml de caldo nutriente (NB; 5 g / L de peptona, 4 g / L de extracto de carne de vaca). Colocar o balão num agitador ajustado a 150 rpm durante 2 d a 27 ° C.
  4. Após a incubação, dilui-se uma amostra da cultura em PBST a um espectrómetro de leitura de 0,2 DO a 650 nm para calibrar E. cultura ictaluri para volumes de doses infecciosas desejados.
  5. Próxima transferência ambas tratadas (após 3 d da exposição a antibióticos) e grupos de peixes não tratados em copos plásticos contendo 130 mL de água doce da lagoa artificial, ou APW por aproximadamente 10 h para a eliminação da droga dos tecidos do peixe.
  6. Em seguida, de ambos os grupos, transferir novamente a cada peixe em copos de plástico de 8 onças contendo 130 mL de APW limpo. Dê a cada peixe uma dose letal contendo 2,8 x 10 6 UFC / mL de E. cultura ictaluri na APW (modelo de infecção banheira) e manter-se em um 27 ° C incubadora por 24 h.
  7. Após o banho ictaluri E., transferir peixe individualmente em novos copos com 130 mL de APW.
  8. Na sequência de reposição de água, ficha mortandade de peixes ao longo da duração de uma semana. Os peixes não são alimentados ao longo deste período. Em contraste com o peixe-gato, Gambusia não mostram sinais externos de infecção, portanto, é essencial utilizar letalidade como um ponto final experimental.

5. polimicrobiana Desafio com fezes e solo

  1. Tratamento fezes
    1. Obter fezes humanas frescas de um assunto voluntários saudáveis ​​que não receberam antibióticos nas duas semanas anteriores, usando luvas estéreis e um tubo cônico estéril 50 mL.
    2. Após a coleta, recolher a matéria fecal em um saco plástico estéril e, em seguida, transferir para um estéril 15 mL ctubo onical. Criar uma concentração da suspensão por fezes em PBST para se obter uma solução de estoque de 500-800 mg / mL. Esta mistura espessa é melhor para transferir com um 1 ml ou maior ponta de pipeta de plástico que tenha sido cortada na parte inferior com uma tesoura esterilizada de modo a que a abertura é maior.
    3. Após a exposição inicial de antibióticos de grupos de peixes tratados e não tratados controle, separam-se em copos de plástico individuais contendo suspensão fecal em concentrações finais de qualquer de 15 mg / mL ou 10 mg / mL em APW com um volume total de 130 mL. Segurar copos numa incubadora a 25 ° C.
    4. mortandade de peixes registro durante a exposição fecal pela observação atenta sobre 2 d.
  2. O tratamento do solo
    1. Recolha 1 - 2 kg de rico solo orgânico (deve conter a maior densidade e diversidade de micróbios) aproximadamente 7 - 15 centímetros para baixo em profundidade e coloque em um recipiente de plástico limpo. Note-se que o solo deve ser utilizado no prazo de dois dias após a colheita.
    2. terrívelctly após o período de exposição inicial, separar ambos os grupos de antibiótico tratado e não tratado de peixes em copos de plástico individuais contendo 18,2 g de solo em 130 mL de APW. Misturar o solo no poço de água à mão antes de adicionar o peixe. A maioria das partículas não suspender e ficar no fundo do copo.
    3. Expor peixe para uma duração de 3 d a 25 ° C e registar qualquer mortalidade.

6. Desafio estresse osmótico

  1. Após o tratamento, seguido de um período de repouso de 10 h, como descrito acima, individualizar peixes em copos separados contendo NaCl a 17,5 mg / mL (300 mM) em 150 mL de APW. Isto é metade da salinidade da água do mar normal, o que não é completamente letal (<50%) para controlar peixes, mas é fortemente estressante, exigindo osmoregulação eficaz.
  2. Observar o desenvolvimento de mortandade de peixes ao longo de um período de 36 h.

7. Nitrate Toxicidade Desafio

  1. peixes descanso por um período de 10 h após expos antibióticosUre, peixes e, em seguida, separado em copos individuais contendo uma concentração de nitrato de sódio 10 mg / ml (118 mM) ou 17,5 mg / ml (206 mM) em 130 mL de APW.
  2. Recorde de mortalidade durante 4 d para a dose baixa e 1 d para a dose alta.

8. Análise de crescimento dos peixes individualizada ou agrupada

  1. exposição a antibióticos ou controle período de 3 d completa como grupos em baldes.
  2. Para individual, preencher 8-oz copos de isopor com 150 mL APW cada, transferir uma peixes individuais no copo e registe o peso total do corpo para a avaliação inicial.
    1. Repita o procedimento para todos os peixes em ambos os grupos tratados e não tratados. Use copos de isopor branco em vez de copos de plástico transparente porque o peixe não vai comer quando nos copos claros.
  3. Alimentar os peixes diariamente com a dieta padrão de duas pelotas por peixes. Os sedimentos foram usadas em vez de flocos, devido aos projéteis têm baixa variação na massa individual (3,53 ± 0,42 mg cada um, ou variação de 8%), resulting em peixes recebendo quantidades similares de alimentos. Monitorar o consumo gravando visualmente pelotas não consumidos. As taxas de consumo eram tipicamente acima de 80%.
  4. No final de cada semana, durante 4 semanas, determinar o peso do peixe. Prepare um novo copo com APW fresco, coloque em um equilíbrio, e, em seguida, registrar o peso. Em seguida, verter um peixe em uma rede de mergulho do copo original e transferir para a nova taça, que é então pesado novamente. Os peixes não são tratadas para evitar o estresse.
  5. Para grupos, coloque 2 litros de APW em um 19 L balde e rasgou a escala. Manter os peixes juntos em ambos os grupos durante a transferência para novos baldes APW, em seguida, gravar o peso total do grupo. Registro do peso do grupo de peixe a cada semana mais de um mês período de tempo, transferindo para um novo balde.

9. Gut Transit Time

  1. Use 70 kDa aniónico dextrano marcado com fluoresceína. O dextrano não é significativamente digerido, e é muito grande para ser absorvida através da camada do intestino, assim, a passagem irá medir o tempo de trânsito através do intestino.dextrano marcado foi incorporado em alimentos para peixes.
  2. Para um tubo de 1,7 ml estéril, adicionar 360 mL de água desionizada estéril e 52 mg de gelatina (solução a 13%), e colocar o tubo num bloco de calor a 60 ° C até derreter gelatina e é totalmente dissolvido.
    1. Moagem flocos de peixe do alimento até um pó fino usando um almofariz e pilão, e adicionar 40 mg deste pó ao tubo, em conjunto com 20 uL de óleo de peixe. Depois de misturar, adicionar 1,6 mg de FITC-dextrano.
  3. Distribua a mistura de líquido quente em 20 mL cai sobre Parafilm na bancada do laboratório, e deixá-los esfriar rapidamente e solidificar. Drops pode ser armazenado por até 4 d antes que se tornem muito difícil para os peixes para comer. Loja gotas no frigorífico, colocando o Parafilm para metade de uma placa de Petri, que é então lançada sobre água esterilizada dentro de um recipiente de plástico fechado, o que mantém as gotas umidificadas.
  4. Pouco antes de alimentação, trimestre cai em seções usando uma lâmina de barbear. Aclimatar o peixe para o Styrocopos de espuma individualmente por 2 dias sem alimentação (Nota: foram utilizados apenas os peixes de controlo não exposto). Coloque quatro trimestres de a comida no copo com o peixe, e observar o peixe por 30 minutos por quantos pedaços de comida que cada um comer.
  5. Para começar o período de monitoramento, a transferência de peixe individualmente em copos com 80 ml de APW, utilizando uma rede de mergulho. A cada 2 h, rode suavemente o APW à mão, e em seguida, tomar uma amostra de 1 mL e armazenar em um 1,7 tubo rotulado mL a 4 ° C. Colher amostras para 36 h.
  6. fluorescência da ficha, com um espectrofotómetro de fluorescência, de todas as amostras, ao mesmo tempo após a conclusão do ensaio. Coloque toda a amostra 1 mL numa cuvete e gravar a fluorescência medida com excitação a 495 nm e emissão a 520 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Um diagrama esquemático geral do sistema experimental utilizado para estudar os efeitos da exposição do hospedeiro peixe antibiótico 13 está representada na Figura 1A e inclui a técnica para a extracção da pele (Figura 1B) e intestino (Figura 1C) microbiomas do peixe. Três dias foi seleccionado como o período de exposição aos antibióticos porque dados anteriores revela que, enquanto o número total de pele cultivável gotas no início do tratamento, que voltou para níveis pré-tratamento após três d. Enquanto isso, a composição da comunidade, como determinado pelo perfil 16S, tem sido fortemente alteradas. Por conseguinte, o período de 3 dias deve ser óptimo para analisar os efeitos de uma comunidade alterado de aproximadamente a mesma densidade. Note-se que a análise da cultura, usando números de colónias em placas de agar, pode deixar de fora um número de espécies. A eficiência do método de dispersão microbioma pele (Figura 1B abril 10 - maio 10 CFU / g de peso de peixe) para o número de colónias de vários peixes sujeitos ao mesmo procedimento de suspensão em uma segunda vez (para quantificar qualquer remanescente bactérias). As contagens a partir desta segunda suspensão foram mais baixas do que 100 CFU / g, sugerindo que o método é eficaz suspensão (não publicado).

Peixe com um microbioma antibióticos alterou parecia ser mais suscetíveis a uma infecção ictaluri E. do que os peixes de controle (Figura 2). A diferença em tempo médio para a morte de 56,1 ± 15 h para os peixes tratados e 98,5 ± 48 h para peixes de controlo não foi estatisticamente significativa (two-tailed t-teste de Student, p = 0,12). Isto é provavelmente devido ao tamanho pequeno grupo (n = 6 tratado, controlo n = 5). tamanhos de grupo de pelo menos uma dúzia são, portanto, recomendada. Uma vantagem deste modelo de infecção é a bProtocolo ATH, que não necessita de agulhas para a infecção ou o seguimento da ingestão de alimentos. E. ictaluri naturalmente invade catfish da coluna de água. A segurança é alto porque E. ictaluri é sensível à temperatura, e, assim, mal infecciosa para os seres humanos. Outros estudos revelaram que o tempo até à morte em G. affinis correlaciona-se com a dose inicial de bactérias. A temperatura de incubação de 27 ° C foi seleccionada como óptimo para ambas as bactérias e peixes.

Tratadas ou peixe controle não têm diferenças significativas na sobrevivência em água contaminada com altas contagens de micróbios mistos. Nenhuma mortalidade foi observada ao longo de 4 dias para o controlo (n = 8) ou tratados (n = 9) de peixe quando o solo foi utilizado como a fonte microbiana. Enquanto alguns mortalidade ocorreu com fezes humanas como fonte de micróbios (Tabela 1), o tratamento antibiótico não fez diferença. Quando a concentração de fezes em APW foi a 20 mg / ml, 40 - 50%dos peixes morreram. No entanto, a concentração de oxigénio dissolvido foi de apenas 10% (em comparação com> 80% em baldes ou aquários), assim, as condições de hipóxia confundiu a interpretação. Quando / mL foram utilizados níveis mais baixos de 16 ou 10 mg, as taxas de sobrevivência foram pareados (frente e verso do teste exato de Fisher, p = 0,95 ou maior para uma diferença entre os grupos). níveis de oxigênio dissolvido nestes dois ensaios foram superiores a 65% ou. Gambusia são uma espécie invasora muito resistentes que podem viver em água de baixa qualidade. Seria interessante para utilizar nestes ensaios de exposição microbiana natural para medir a sobrevivência de outras espécies contra um desafio de água contaminada. As amostras de água de locais específicos ambientais, especialmente aqueles submetidos a eutrofização, pode ser utilizado num ensaio semelhante, embora a qualidade da água (O2 dissolvido, nitrato, salinidade, etc.) Que terão de ser determinada, como um factor potencialmente de confusão.

fish eXposed à rifampicina foram mais suscetíveis ao estresse osmótico do que os peixes de controle (Figura 3). O teste de log-rank observada uma diferença significativa (p = 0,049) na taxa de sobrevivência (43% de morte no grupo de controlo e 88% de morte no grupo tratado, n = 9 para ambos os grupos), quando desafiados com salinidade elevada. Os resultados deste ensaio concordou com uma determinação de 18,1 mg / ml, como o CL 50 de NaCl com G. affinis às 24 h em água doce 20. Sinais de estresse salino que os peixes exibem incluem vermelhidão em torno das brânquias e diminuição do movimento de natação. Com este ensaio, os níveis de salinidade acima de 18 mg / mL resultou em morte rápida peixe.

Quando exposta ao nitrato de toxina na coluna de água, pré-exposição a antibióticos não afectaram a sobrevivência (Tabela 2). Para cada ensaio, a morte foi gravado em ambos um ponto de tempo curto e longo prazo, representando efeitos agudos e mais crônicos. a concentraçãode 10 mg / mL foi seleccionada com base no mesmo sendo a LD 50 para G. affinis em água doce às 48 h 21. Os resultados deste ensaio foram consistentes com este valor de LD 50, com uma letalidade de 50% em ambos os grupos tratados e de controlo após 90 h. Um desafio maior de nitrato (17,5 mg / ml) também foi examinado, levando à morte mais rápida. Mais uma vez não houve diferença nos grupos de tratamento. Nitrito é dramaticamente mais tóxico do que o nitrato de G. affinis, com um LD50 de 0,0015 mg / ml às 48 h 22. análise bioquímica Comunidade utilizando o sistema analítico índice de perfil (não publicado) que mostra a microbiota pele de peixe tem o potencial para reduzir o nitrato. No entanto, os níveis de nitrito na APW durante ambos os ensaios manteve-se abaixo do limite de detecção (0,001 mg / mL). Este método de desafio pode ser usado com quaisquer produtos químicos solúveis pequenos.

Quando individualizados em copos e fed tele mesmo valor para cada peixe durante um mês, a tendência foi observada para os peixes tratados com antibiótico para não ganhar peso, bem como peixes de controle, sem diferença estatisticamente significante (dados não mostrados). Para evitar o estresse de individualização, os peixes foram alojados juntos como um grupo para os peixes tratados e não tratados em baldes para um mês e dada quantidades correspondentes de alimentos. A limitação dessa configuração é que os peixes podem não estar recebendo a mesma comida em uma base individual. No entanto, no modelo de grupo, tratado peixes em média de peso e controle de peixe perdido no peso médio ganhou (Tabela 3). A quantidade de alimentos que os peixes estavam consumindo não parecem ser afetados pela exposição a antibióticos antes, portanto, a supressão do apetite é uma explicação candidato improvável por falta de ganho de peso. Inúmeros outros fatores poderiam contribuir, incluindo mudanças na inflamação no intestino, os níveis de produção de muco, a permeabilidade do intestino e / ou motilidade intestinal. Uma grande vantagem deste ensaio para medir a alimentação desefeitos onal é a simplicidade. É barato, e só requer um equilíbrio de laboratório como instrumentação. É apropriado para o rastreio de um efeito, levando a outra experimentação envolvido para determinar mecanismo.

Um exemplo, o factor a analisar relacionada com o ganho de peso dos peixes é o tempo de trânsito de alimentos, que está relacionado com a motilidade intestinal. dextrano rotulado FITC podem ser incorporados em alimentos gelatinizados e é não-letal para os peixes. Medição da fluorescência na água circundante ao longo do tempo dá uma medida da rapidez com que o FITC-dextrano está a passar através do intestino. A fluorescência acima do fundo pode ser detectada logo que 2 horas, com um máximo alcançado após 16 horas após a alimentação (Figura 4). Este resultado é com peixes de controle de um aquário. resultados confiáveis ​​de peixes tratados com antibióticos ainda não foram obtidos. Uma limitação deste processo é que um período de jejum de 2-d é necessário para peixes para comer a comida. um adv antage do protocolo é alta sensibilidade (baixa fluorescência de fundo), como comer peixe apenas uma seção de alimentos pode dar resultados, embora os dados é mais consistente quando duas secções são comidos. Este protocolo é menos complicado do que um método similar e letal para os ratos 23.

figura 1
Figura 1: Visão esquemática do protocolo experimental comum. Um é um fluxograma ilustrando, esquerda para a direita, o peixe transferido do tanque do aquário, separados em grupos (azul) tratados com antibióticos (representado por água vermelha) ou de controlo, e em seguida colocadas em copos individuais para rastrear fenótipos. B e C descrevem o processo de extrair a pele de peixe e intestino microbiomes. Após agitação em vórtice, as bactérias são suspendidas na solução durante a análise da comunidade microbiana.55170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Pathogen Susceptibilidade. A curva de sobrevivência durante a exposição a E. ictaluri para peixes pré-tratados com rifampicina (linha vermelha) ou um grupo de controlo não tratado (linha preta) peixes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: susceptibilidade ao estresse osmótico. Uma curva de sobrevivência durante a exposição a elevada salinidade para peixes em ambos os grupos tratados com antibióticos e não tratados. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Alimentos Transit Time. A fluorescência ao longo do tempo em água a partir de dois peixes alimentados com FITC-dextrano. Peixe Um comeu duas seções de alimentos gelatina e peixes B comeu um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1: Suscetibilidade a ambientes de alta microbiana. A exposição a matéria fecal humana foi avaliada a 3 concentrações diferentes. relação entre mortes de x: y mostra o número total de peixes mortos no ponto de tempo indicado x em comparação com o número total de peixes no grupo experimental y.


Tabela 2: Nitrato Toxicidade desafio. Gravado momento da mortandade de peixes nos grupos tratados e de controlo em toda a exposição a uma concentração de nitrato tóxico. relação entre mortes de x: y mostra o número total de peixes mortos no ponto de tempo indicado x em comparação com o número total de peixes no grupo experimental y.

tabela 3
Tabela 3: Análise do crescimento. Alterações no peso total do corpo depois de um mês após o tratamento com antibióticos ou controle. A diferença percentual em peso inicial corporal médio (para os peixes nesse grupo de teste) em relação ao peso final corporal média é a coluna Δweight. N é o número de peixes em que o grupo. O peso médio por peixe no final do julgamento está abaixo do peso / peixe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alguns desafios requerem um período de descanso na APW limpo após o tratamento antibiótico para a droga para ser empobrecido em tecidos de peixes. Se o período de descanso é ignorado, então a presença de antibióticos podem confundir os resultados, especialmente quando o ensaio envolve a exposição a bactérias. A fim de examinar os efeitos de uma composição microbioma alterada sem grandes alterações no número total de micróbios no host, experimentos preliminares monitorização da composição da microbiota (16S perfis ou sequenciamento do genoma inteiro) e densidade populacional (16S quantificação através de qPCR) durante a exposição aos antibióticos seria requeridos. Enquanto 3 d é óptimo neste sistema, mudando o hospedeiro e / ou antibióticos exigiria recalibração.

Típico de pesquisa biomédica, o modelo do rato é comumente utilizado para estudos microbioma. O modelo de peixe mais comum é peixe-zebra. A fim de obter uma melhor compreensão das propriedades universais da estrutura e função da mucosa Microbiomes e interações de host, modelos novos e atípicos são uma necessidade. Nosso modelo WT peixe serve como uma fonte de fé para o estudo de interações hospedeiro-microbioma, incluindo variabilidade genética hospedeiro natural que outros modelos têm perdido devido a gerações de endogamia animais criados em laboratório 24. Uma grande vantagem de Gambusia experimental é a sua natureza Hardy, tolerar uma ampla gama de condições. Elevadas taxas de sobrevivência foram observados em água que varia em temperatura (4-38 ° C), salinidade (0-17 mg / mL), de oxigénio dissolvido (110 - 25%), e o pH (4-8). Isto permite não só examinando muitas condições ambientais, mas também para os procedimentos experimentais de várias etapas que são muitas vezes demasiado estressante para outras espécies de peixes.

Os procedimentos aqui apresentados são adequados para triagem rápida de descobrir efeitos de host de um tratamento particular. Estudos de seguimento são necessários para determinar a causalidade directa e mecanismo. Exemplo extensão studies para os efeitos hospedeiras microbioma peixes incluem: medir a inflamação intestinal, exame de saúde dos peixes por meio da quantificação reservas de gordura e medição dos níveis de muco na pele e no intestino. Um sistema gnotobiótico está sendo desenvolvido para estudar em ligações de micróbios específicos para determinados fenótipos hospedeiras detalhe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rifampicin Calbiochem 557303-1GM
Sodium Nitrate Sigma Aldrich S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran ThermoFisher Scientific D1823
Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets Calbiochem 6500-OP tablets dissolve in water to make PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9, (4), 95476 (2014).
  2. Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62, (11), 1591-1601 (2013).
  3. Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5, (1), 86-95 (2014).
  4. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
  5. Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76, (10), 4726-4736 (2008).
  6. Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3, (5), 463-467 (2012).
  7. Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20, (2), 137-151 (2006).
  8. Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35, (6), 1729-1739 (2013).
  9. Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68, (2), 331-381 (2014).
  10. Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. 22 (2015).
  11. Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. 1-8 (2016).
  12. Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
  13. Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
  14. Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75, (7), 2166-2175 (2009).
  15. Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25, (3), 171-183 (2013).
  16. Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19, (3), 151-158 (2007).
  17. Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
  18. Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
  19. Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
  20. Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  21. Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  22. Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  23. Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086 (2012).
  24. Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. National Academies Press. (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics