Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Cancer Research

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Summary

Nous décrivons l'établissement de tumeurs colorectales orthotopiques par injection de cellules tumorales ou organoïdes dans le cécum des souris et l'isolement subséquent des cellules tumorales circulantes (CTC) de ce modèle.

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Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

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Abstract

Malgré les avantages d'une applicabilité et d'une rentabilité faciles, les modèles de souris sous-cutanés ont de graves limites et ne simulent pas exactement la biologie tumorale et la dissémination de cellules tumorales. Des modèles de souris orthotopiques ont été introduits pour surmonter ces limites; Cependant, ces modèles sont techniquement exigeants, en particulier dans les organes creux tels que le gros intestin. Afin de produire des tumeurs uniformes qui se développent de manière fiable et de métastases, des techniques normalisées de préparation et d'injection de cellules tumorales sont essentielles.

Nous avons développé un modèle orthotopique de cancer colorectal (CRC) qui développe des tumeurs hautement uniformes et peut être utilisé pour des études de biologie tumorale ainsi que des essais thérapeutiques. Les cellules tumorales provenant des tumeurs primaires, des lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) ou des organoïdes tridimensionnels (3D) sont injectées dans le cécum et, selon le potentiel métastatique des cellules tumorales injectées, forment des tumeurs hautement métastatiques. En outre,Les CTC peuvent être consultés régulièrement. Nous décrivons ici la technique de la préparation des cellules tumorales à partir des lignées cellulaires 2D et des organoïdes 3D, ainsi que du tissu tumoral primaire, des techniques chirurgicales et d'injection ainsi que de l'isolement des CTC des souris portant une tumeur et des conseils pour le dépannage.

Introduction

Le cancer colorectal (CRC) est l'une des causes les plus fréquentes de décès par cancer dans les pays occidentaux. 1 Alors que la tumeur primaire peut souvent être réséquée, l'apparition de métastases à distance aggrave considérablement le pronostic et conduit souvent à la mort. 2 , 3 La corrélation biologique de la métastase est la circulation des cellules tumorales (CTC), qui se détachent de la tumeur, survivent en circulation, attachent à l'épithélium dans l'organe cible, envahissent l'organe et finissent par dépasser de nouvelles lésions. 4 Bien que les CTC connaissent une pertinence pronostique, 5 , 6 , 7 , 8 , 9, leur biologie n'est que partiellement comprise en raison de leur extrême rareté dans le CRC. dix

Les modèles de souris sont un puissant tOol pour étudier divers aspects de la biologie du cancer. Les modèles classiques de tumeur sous-cutanée sont produits par injection sous-cutanée de cellules tumorales dans des souris destinataires, qui peuvent être immunocompétentes (si des cellules tumorales murines syngéniques sont utilisées) ou immunodéficientes. Les modèles de tumeur sous-cutanée sont peu coûteux et produisent rapidement des données; Leur croissance tumorale de point final peut être mesurée de manière simple et non invasive. Cependant, 88% des nouveaux composés qui ont démontré une activité antitumorale dans de tels modèles échouent dans les essais cliniques. 11 Cela s'explique en partie par les différences interspécifiques entre les humains et les souris; Cependant, une grande partie de cette défaillance est due à la faible valeur prédictive des modèles de souris sous-cutanés.

Les modèles de souris orthotopiques, dans lesquels les cellules tumorales sont injectées dans l'organe d'origine et donc poussent dans leur microenvironnement original, sont de plus en plus utilisés dans la recherche sur le cancer. 11 , 12 , 13 , 14 Les modèles orthotopiques ne simulent pas seulement les conditions locales de croissance tumorale; En raison du site anatomiquement correct de la croissance de la tumeur, les modèles de souris orthotopiques permettent également une simulation réaliste des métastases et sont donc utilisés pour étudier la biologie CTC 8 , 15 , 16 ou leur réponse à différents traitements dans le CRC. 13 , 17

Un inconvénient majeur des modèles de souris orthotopiques est leur complexité technique. Selon l'organe dans lequel les cellules doivent être injectées, la courbe d'apprentissage jusqu'à ce que l'expérimentateur puisse induire des tumeurs reproductibles soit assez longue. Cela s'applique particulièrement aux modèles de cancer colorectal, car les cellules tumorales doivent être injectées dans la paroi intestinale, ce qui entraîne souvent une perforation, une fuite de cellules tumorales ou une perte de cellules tumorales endoluminales. C'est unL'article a pour but de décrire le procédé de préparation cellulaire à partir d'échantillons de tissus primaires, de lignées cellulaires 2D et de culture organo-3D et leur injection dans le cécum des souris. La technique décrite ici conduit à des tumeurs hautement uniformes et, en fonction de la biologie tumorale de la lignée cellulaire utilisée pour l'injection, de la formation reproductible de métastases à distance et de CTC chez la souris destinataire. 15

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Protocol

Les expériences sur les animaux présentées ici ont été revues et autorisées indépendamment par un comité institutionnel et gouvernemental de soins et d'utilisation des animaux et ont été menées selon les directives de la Fédération des associations de scientifiques de laboratoire (FELASA). Toutes les mesures possibles ont été prises pour minimiser les souffrances, y compris l'anesthésie et l'analgésie ou, si nécessaire, une euthanasie prématurée.

1. Préparation des cellules et des organoïdes

REMARQUE: Utilisez un volume de 20 μL avec 100 000 cellules pour chaque injection. Utilisez la matrice de membrane basique (BMM) afin d'éviter les fuites et d'assurer une injection standardisée. Afin d'assurer des résultats reproductibles, effectuer des analyses d'authentification de ligne cellulaire ( par exemple , via un profilage STR) à intervalles réguliers.

  1. Préparation des suspensions de cellules primaires à partir de tissus frais
    REMARQUE: Toujours travailler dans des conditions stériles. Transfert immédiat de la fraîcheurLes tissus réséqués de la salle d'opération au laboratoire sur glace sont requis pour assurer une viabilité élevée des cellules.
    Le bien-être et le traitement optimal du patient doivent toujours être la première priorité. Par conséquent, les échantillons de tissus pour la recherche doivent être obtenus d'une manière qui n'interfère pas avec le traitement pathologique et la mise en scène de la tumeur réséquée. Dans la plupart des cas, il est donc raisonnable d'avoir les échantillons pour la recherche obtenus par un pathologiste formé afin d'assurer la non-interférence avec le diagnostic pathologique.
    1. Immédiatement après l'élimination stérile de l'échantillon réséqué (idéalement ~ 1 cm 3 ), placez l'échantillon de tissu dans un tube de 50 ml prérempli avec 20 à 30 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Rangez le tube sur glace et transférez immédiatement au laboratoire.
    2. Mettez le tissu dans une boîte de Petri et lavez-le deux fois avec de l'ABS pour éliminer le sang restant.
    3. Couper le tissu en petits morceaux (~ 2-4 mm) avec une scaLpel ( par exemple , avec une lame # 20 ou # 36).
    4. Utiliser le dissociateur selon les instructions du fabricant afin de dissocier davantage le tissu tumoral à une suspension à une seule cellule. Alternativement, utiliser d'autres protocoles de digestion enzymatique des tumeurs.
    5. Comptez les cellules de la suspension à une seule cellule résultante ( par exemple , dans un compteur de coultre ou un hémocytomètre).
    6. Centrifugeuse (5 min à 1.500 xg) et lavez la suspension cellulaire deux fois avec du PBS.
    7. Ressusciter les cellules dans le BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace.
  2. Préparation des lignées cellulaires pour injection
    1. Cultiver toutes les lignées cellulaires du cancer colorectal dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ) et les préparer au jour de la chirurgie.
    2. Récoltez les cellules selon les protocoles de culture cellulaire standard, comptez les cellules ( p . Ex. , Dans un compteur de coultre ou un hémocytomètre) et calculez la requêteQuantité utilisée pour toutes les injections selon le nombre d'animaux à injecter.
    3. Préparez 3-5x du volume réellement nécessaire pour tenir compte des pertes de pipetage et du volume mort de la seringue d'injection.
    4. Centrifugeuse (5 min à 1500 g) et lave la suspension cellulaire deux fois avec du PBS.
    5. Ressusciter les cellules dans le BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace.
  3. Préparation organoïde
    NOTE: Toutes les cultures organoïdes 3D sont cultivées dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ). Des protocoles détaillés pour la culture organoïde ont déjà été publiés. 18 , 19 , 20 Comme pour les lignées cellulaires conventionnelles, nous recommandons un volume de 20 μL de BMM avec 100 000 cellules par injection. Les organoïdes sont préparés au jour de l'opération comme suit:
    1. Préparez le support suivant (mentionné ci-aprèsDMEM / F12 +++): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamine (200 mM) + 1% de pénicilline / Streptomycine.
    2. Pré-remplir les tubes de 15 mL avec 1 mL de DMEM / F12 +++.
    3. Aspirer soigneusement les organoïdes de la surface de la plaque de culture et transférer le contenu de 3 à 5 puits dans un tube de 15 mL.
    4. Calez soigneusement les organoïdes en petits morceaux en les pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette en verre étendue.
    5. Ajouter 5 mL de DMEM / F12 +++ au tube, puis centrifuger à 1000 xg pendant 5 min.
    6. Après centrifugation, éliminer le surnageant, remettre à nouveau le culot dans 600 μL de tampon de dissociation enzymatique et transférer la suspension dans un puits d'une plaque à 6 puits.
    7. Incuber à 37 ° C pendant 1 à 5 minutes, puis faire pipeter soigneusement la suspension vers le haut et vers le bas pour dissoudre les organoïdes.
      REMARQUE: vérifier la digestion par microscope; Il est complet lorsque tous les clusters cellulaires ont été dissociésD aux cellules simples.
    8. Après une digestion réussie, ajouter 1,4 mL de DMEM / F12 +++ pour arrêter la digestion. Ensuite, transférer tous les puits d'organoïdes digérés dans un tube de 50 ml.
    9. Comptez les cellules et calculez la quantité requise pour toutes les injections.
    10. Préparez 3 à 5 fois le volume réellement nécessaire pour tenir compte des pertes de pipetage et du volume mort de la seringue d'injection
    11. Centrifugeuse (5 min à 1.500 xg) et lavez la suspension cellulaire deux fois avec du PBS.
    12. Remis en suspension les cellules dans BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace.

2. Modèle de souris orthotopique

  1. Préparation des animaux receveurs pour la chirurgie
    REMARQUE: Utilisez des souris NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) de 6-8 semaines, en tant que destinataires. 21 NSG sont parmi les souris les plus immunodéprimées, dépourvues de cellules B, T et NK matures, ainsi que de multiples autres immunoglobulinesLes effets. 21 Ils développent de manière fiable des tumeurs même si des nombres de cellules faibles sont injectés et sont très susceptibles d'être exposés à des métastases à distance. Les souris NSG sont d'excellents éleveurs et peuvent être conservées dans des unités spécifiques de pathogènes spécifiques (SPF).
    1. Avant la première incision, injecter 0,05 mg / kg de buprénorphine par voie sous-cutanée.
    2. Utilisez le sévoflurane à 3-3,5 vol% pour l'anesthésie générale. Une perte du réflexe de pincement indique une anesthésie suffisante.
    3. Couvrir les yeux des souris anesthésiées avec une pommade ophtalmique pour éviter la dessiccation de la cornée.
    4. Rallongez les souris en position couchée sur une petite table.
    5. Raser l'abdomen avec un rasoir électrique (la crème dépilatoire peut être utilisée alternativement) et désinfecter avec au moins 3 fois de chlorhexidine / iode et 70% d'alcool en alternance.
    6. Couvrir le champ chirurgical avec des rideaux stériles.
      NOTE: L'utilisation d'antibiotiques périopératoires est facultative et est assujettie aux lignes directrices institutionnelles.
  2. Laparotomie à la ligne médiane et l'exposition du cécum
    1. Utilisez des ciseaux (les scalpels peuvent être utilisés alternativement) pour faire une petite incision de la ligne médiane (3 à 5 mm) de la peau sur le bas ventre. Ramassez la musculature de la paroi abdominale avec une pince et soigneusement l'inciser avec des ciseaux, ouvrant ainsi la cavité abdominale.
    2. Identifier et soigneusement extérioriser le cecum avec des pinces atraumatic. Placez la poche terminale aveugle du cecum sur l'abdomen qui pointe de manière crânienne.
    3. Une fois extériorisé, garder le cécum humide en utilisant des écouvillons salins chauds en tout temps.
  3. Injection orthotopique, fermeture de l'abdomen et récupération postopératoire
    1. Pour l'injection intracecale, utiliser une seringue standard de 1 ml avec une canule 30 G. Montez cette seringue sur une pompe à micro-injection, qui est à son tour montée sur un micromanipulateur.
    2. Saisissez soigneusement la pointe du cecum avec des pinces atraumatiques et lissez-la doucement en la caressant en avalD avec un deuxième ensemble de pinces humidifié avec une solution salée chaude.
    3. Placez la canule directement au-dessus du cecum.
    4. Effectuez les étapes suivantes sous contrôle visuel avec un microscope chirurgical binoculaire.
    5. Saisissez soigneusement le cecum avec deux pinces atraumatiques aux deux extrémités de la partie extériorisée du cecum, étirez-la légèrement puis tirez lentement sur la canule qui est positionnée parallèlement et directement au-dessus. Il est crucial de ne pas perforer la totalité de la paroi intestinale (en injectant ainsi les cellules dans la lumière) et de ne pas perforer la séreuse au-delà du point de pénétration initial car cela entraînerait une fuite et une diffusion péritonéale.
      1. Déplacez l'intestin vers la canule, pas la canule vers l'intestin. Tenir et étirer l'intestin entre deux pinces. Les mains du chirurgien doivent reposer sur une surface afin de réduire les tremblements.
    6. Injecter les cellules entre la serose (vue comme une doublure très mince et translucide au-dessus de laE les vaisseaux sanguins intra-moraux) et la musculaire. La canule doit donc être placée visuellement au-dessus des vaisseaux sanguins et sous la mince membrane translucide.
    7. Utilisez un interrupteur pour démarrer l'injection afin de réduire le tremblement pendant que la canule est à l'intérieur de la paroi intestinale.
    8. Une fois que la canule est en position, commencer l'injection. Utilisez une durée de 20 s, ce qui entraîne un réglage de 1 μL / s sur l'unité de commande de la pompe.
      REMARQUE: L'injection dans un vaisseau sanguin endommagé ou proche d'elle entraîne une dissémination intravasculaire directe et une métastase à distance et devrait donc être évitée.
    9. Une fois l'injection terminée, retirez soigneusement la canule en la tirant vers l'arrière.
    10. Placez un écouvillon sec sous le cécum, puis rincez soigneusement le cecum avec de l'eau distillée pour lyser les cellules filtrées et ainsi éviter la dissémination artificielle péritonéale.
  4. Fermeture de l'abdomen et récupération postopératoire
    1. Après rEn train de déposer doucement le cecum à la cavité abdominale.
    2. Fermer la paroi abdominale avec des sutures de course 6-0 rapidement absorbables.
    3. Fermez la peau avec des clips chirurgicaux.
    4. Placez la souris sur un plan de chauffage réglé à 38 ° C jusqu'à ce qu'il soit complètement récupéré de l'anesthésie.
    5. Observez de près l'état postopératoire des souris pendant les 48 h suivantes. En cas de détresse, traiter avec 0,05 mg / kg buprénorphine toutes les 12 h.
    6. Surveiller les souris au moins une fois par jour pour détecter les signes de détresse due à la croissance tumorale.

3. Isolation des cellules tumorales circulantes à partir d'échantillons de sang total

NOTE: Obtenez du sang par ponction cardiaque transcutanée chez des souris anesthésiées, suivi d'une euthanasie. Idéalement, 1000 μL de sang sont aspirés dans une seringue préremplie de 100 μl d'anticoagulant (acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) ou héparine). Utiliser un anti-humain-EpCAM (adhésion de cellules épithélialesMolécule) pour identifier les CTC. Cela fonctionne très bien si les lignées cellulaires épithéliales humaines sont utilisées dans le modèle de la souris. Pour d'autres appareils, des anticorps différents peuvent être nécessaires.

  1. L'enrichissement en CTC:
    1. Pré-remplir des tubes de 15 mL avec un milieu gradient de densité de 5 mL et transférer soigneusement le sang dans le tube de 15 mL.
    2. Centrifugeuse (30 min à 300 xg sans frein) et retirez soigneusement le surnageant supérieur.
    3. Versez le reste dans un nouveau tube de 15 ml et centrifugez (15 min, 300 xg avec frein).
    4. Récupérer l'interphase contenant les cellules mononucléaires (jeter le reste) et laver les cellules deux fois avec du PBS.
    5. Remettre en suspension la pastille dans 200 μl de PBS / 1% d'EDTA et ajouter 4 μL d'anticorps EpCAM. Incuber 20 min sur de la glace dans le noir.
  2. Projection et sélection
    1. Préparez le tampon suivant (appelé ci-après tampon de prélèvement): PBS + 10% de sérum de veau foetal (FCS) + 1% de pénicilline / STreptomycine (1%) + 0,8% d'EDTA.
    2. Utilisez un stylo PAP pour dessiner un cercle de ~ 1 cm dans une boîte de Petri stérile de 6 cm (empêche le fluide de se disperser dans le plat) et faites pipeter 700 μL de tampon de prélèvement dans ce cercle.
    3. Ajouter 50 μL de suspension cellulaire au tampon de prélèvement de 700 μL dans le cercle. Vérifiez la densité des cellules au microscope. Divisez l'échantillon dans différentes plats s'il est trop dense.
    4. Attendez que les cellules s'installent (~ 5 min).
    5. Écran de la goutte de suspension cellulaire pour les cellules colorées (= EpCAM-positives).
    6. Une fois qu'une cellule est trouvée, choisissez la cellule avec le micromanipulateur et placez-le dans un tampon de 50 μl en fonction de l'analyse en aval prévue ( p . Ex. , Tampon d'extraction d'ARN ou milieu de culture).
    7. Selon les analyses en aval prévues, isoler les cellules négatives et / ou les médiums par EpCAM comme témoins négatifs.
    8. Procédez avec des analyses en aval ( p . Ex. , Culture cellulaire, PCR).

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Representative Results

La génération réussie et reproductible de tumeurs colorectales dans ce modèle dépend de manière critique d'une injection précise des cellules sans déversement ou fuite. Si cela est atteint, ce modèle est extrêmement fiable et entraîne très rarement une diffusion péritonéale artificielle. La cinétique de croissance des tumeurs ainsi que leurs profils de diffusion dépendent de la biologie des organoïdes et des cellules utilisés. 15 Alors que les cellules HCT116 mettent une métastélisation fiable sur le foie dans ce modèle, les cellules SW620 forment des tumeurs orthotopiques, mais ne mettent pas de métastases. 15

L'utilisation de cellules HCT116 dans ce modèle résulte de manière fiable chez des souris moribondes dans les 35 jours de l'injection de cellules tumorales. Les tumeurs primaires mesurent environ 10 mm ( Figure 1A et Figure 2A ), les métastases hépatiques ( Figure 1B Ong> et Figure 2B ), les métastases pulmonaires ( Figure 1C et Figure 2C ) et les cellules tumorales circulantes ( Figure 3 ) sont presque toujours présentes. Chez les souris portant des tumeurs HCT116, 35 jours après l'injection de cellules tumorales, les CTC sont présents en haute fréquence et en quantité et peuvent être facilement isolés pour les analyses en aval ( Figure 3 ).

Figure 1
Figure 1: Images macroscopiques après la dissection 35 jours après l'injection orthotopique des cellules CRC humaines HCT116 chez les souris NSG. ( A ) Tumeur primaire (ligne pointillée) dans le cécum. ( B ) Foie avec de multiples métastases. ( C ) Les métastases pulmonaires (flèches).1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Images histologiques des organes présentées à la figure 1 . ( A ) Tumeur primaire (H & E). ( B ) métastase hépatique (H & E). ( C ) Métastase pulmonaire (anti-immunohistochimie anti-EpCAM). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Cellules tumorales circulantes (cellules HCT116 dans des souris NSG, 35 jours après injection de cellules tumorales). Champ lumineux ( A B )) des images de CTC dans la fraction de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Malgré leur activité précliniquement prouvée dans les modèles de souris sous-cutanés, la grande majorité des nouveaux composés échouent dans les essais cliniques et n'atteignent jamais la clinique. 11 Cette insuffisance évidente de modèles de souris sous-cutanés pour simuler de manière précise la biologie et les modèles de croissance des tumeurs a conduit au développement de modèles de souris orthotopiques basés sur l'injection de cellules tumorales directement dans l'organe original.

Les modèles de souris orthotopiques sont capables de simuler la biologie et la diffusion de tumeurs solides beaucoup plus précisément que les modèles sous-cutanés. 15 Cependant, les inconvénients majeurs sont une reproductibilité insuffisante, en particulier dans les organes techniquement exigeants tels que les organes creux ainsi que la surveillance techniquement exigeante de la croissance tumorale. Dans notre modèle, nous nous sommes donc concentrés sur la taille de la tumeur à un point de temps prédéfini plutôt que des procédures d'imagerie répétées, ce qui limite le nombre de techniquesTrès élaboré et pour les examens stressants des animaux. Le modèle décrit ici peut être utilisé pour diverses applications telles que la caractérisation des lignées cellulaires tumorales, 15 recherches sur la biologie tumorale et la dissémination ainsi que sur les essais thérapeutiques. 17 Les points finaux évidents sont la taille de la tumeur primaire et le nombre de métastases à distance, mais des points d'extrémité plus élaborés tels que les nombres CTC 17 ou des modalités d'imagerie peuvent également être utilisés.

L'étape la plus critique de notre protocole est l'injection de cellules tumorales subserosales. Cela nécessite une pratique et doit être effectué en tout temps sous contrôle visuel direct. Si le dépôt est ailleurs que sous la serose, mais au-dessus de la muqueuse, il n'y aura ni croissance tumorale ni croissance ou diffusion imprévisibles, rendant les résultats incomparables. D'autres raisons possibles pour le manque de développement de tumeur comprennent des cellules non viables ( par exemple, </ Em>, en raison de la longue période entre la récolte et l'injection des cellules) ou pas de souris entièrement syngéniques. Ceci est possible si des souris C57Bl / 6 sont utilisées; Car il existe plusieurs sous-tendances de C57Bl / 6 ( par exemple , C57Bl / 6J et C57Bl / 6N) qui présentent des différences génétiques et phénotypiques distinctes 22 qui se reflètent également dans les taux de prise tumorale. 23

La technique d'injection fortement contrôlée décrite ici conduit à une croissance et une diffusion tumorale hautement reproductibles et distingue ce modèle des modèles orthotopiques décrits précédemment. 24 En outre, le rinçage du cécum avec de l'eau distillée après une injection de cellules tumorales réduit considérablement le taux de dissémination péritonéale artificielle; Par conséquent, si la carcinomatose péritonéale se produit dans notre modèle, il est probablement le résultat de la biologie de la lignée cellulaire plutôt que d'une fuite de cellules tumorales iatrogènes.

Limites de ce mOdel sont les souris destinataires qui doivent être immunodéficientes si des lignées cellulaires humaines doivent être utilisées. Ceci limite sévèrement la demande du modèle dans les études immunologiques. Cependant, cette limitation peut être surmontée par l'utilisation de lignées cellulaires murines syngéniques ou organoïdes (données non publiées). Une autre limitation est l'utilisation des lignées cellulaires elles-mêmes. Les lignées de cellules tumorales sont souvent très anaplasiques, ce qui pose des questions sur leur représentativité de la biologie de la tumeur originale. Cette limitation n'est pas présente dans les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM), qui développent une nouvelle tumeur par l'introduction de mutations oncogènes spécifiques des tissus. 12 De tels GEMM sont généralement basés sur des mutations de la ligne germinale conditionnelle ( p. Ex . Un gène Apc floxed) et une activation médiée par Cre des mutations, soit par infection locale avec adeno-cre 25 , 27 , 28, soit par un promoteur spécifique du tissuexpression. 29 , 30 , 31 Cependant, de tels modèles exigent souvent des passages à niveau et ont une biologie très variable. Si les lignes cellulaires primaires sont utilisées dans le modèle présenté ici, la limitation de la faible représentativité peut être surmontée sans perte des autres avantages de notre modèle, comme la reproductibilité et la rentabilité relative.

Une autre limitation de la technique proposée ici est la dépendance à l'EpCAM comme marqueur de surface. Il est bien connu que l'EpCAM peut être perdu pendant l'EMT et qu'il existe une fraction de CTC qui sont négatifs pour EpCAM. 10 , 15 Par conséquent, selon le but de l'expérience et les lignées cellulaires utilisées pour l'injection, d'autres moyens d'identification ( par exemple , l'étiquetage GFP des cellules avant l'injection) peuvent être utilisés.

En conclusion, le modèle présenté ici cInstitue un outil flexible pour étudier le développement et la dissémination de tumeurs dans le contexte du microenvironnement original de la tumeur dans le côlon. Si des lignées cellulaires métastatiques sont utilisées, elles simulent fidèlement la dissémination de cellules tumorales dans tous les sites pertinents pour la CRC, y compris les CTC dans la circulation sanguine. C'est donc un outil utile pour étudier les changements phénotypiques lors de la croissance et de la diffusion de la tumeur et permet l'isolement et la caractérisation répétés des CTC dans le CRC. 15

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la fondation allemande de recherche (WE 3548 / 4-1) et Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

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References

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