Isolering af cirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodel af kolorektal cancer

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver etableringen af ​​ortotopiske kolorektale tumorer via injektion af tumorceller eller organoider i musens cecum og den efterfølgende isolering af cirkulerende tumorceller (CTC'er) fra denne model.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

På trods af fordelene ved let anvendelighed og omkostningseffektivitet har subkutane musemodeller alvorlige begrænsninger og simulerer ikke nøjagtigt tumorbiologi og tumorcelleformidling. Ortotopiske musemodeller er blevet introduceret for at overvinde disse begrænsninger; Imidlertid er sådanne modeller teknisk krævende, især i hule organer som tyktarmen. For at producere ensartede tumorer, som pålideligt vokser og metastaserer, er standardiserede teknikker til fremstilling af tumorceller og injektion kritiske.

Vi har udviklet en orthotopisk musemodel af kolorektal cancer (CRC), der udvikler stærkt ensartede tumorer og kan anvendes til tumorbiologi studier samt terapeutiske forsøg. Tumorceller fra enten primære tumorer, 2 -dimensionelle (2D) cellelinier eller 3-dimensionelle (3D) organoider injiceres i cecum og afhænger af metastatiske potentialer af de injicerede tumorceller danner stærkt metastaserede tumorer. Desuden,CTC'er findes regelmæssigt. Her beskriver vi teknikken for tumorcellepræparation fra både 2D-cellelinier og 3D-organoider såvel som primær tumorvæv, kirurgiske og injektionsteknikker samt isolering af CTC'er fra de tumorbærende mus og aktuelle tips til fejlfinding.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige årsager til kræftdød i de vestlige lande. 1 Mens den primære tumor ofte kan resekteres, forværrer fjerntliggende metastaser dramatisk prognosen og fører ofte til døden. 2 , 3 Den biologiske korrelat af metastase er cirkulerende tumorceller (CTC'er), som løsner fra tumoren, overlever i omløb, fastgøres til epitelet i målorganet, invaderer orgelet og i sidste ende vokser ud til nye læsioner. 4 Selvom CTCs er kendt for at være af prognostisk relevans, er deres biologi kun delvis forstået som følge af deres ekstreme sjældenhed i CRC, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . 10

Musemodeller er en kraftig tOol at studere forskellige aspekter af kræftbiologi. Klassiske subkutane tumormodeller fremstilles ved subkutan injektion af tumorceller i modtagermus, som kan være enten immunokompetente (hvis syngene murine tumorceller anvendes) eller immunodeficient. Subkutane tumormodeller er billige og producerer data hurtigt; Deres slutpunkt tumor vækst kan let og ikke-invasivt måles. Imidlertid mislykkes 88% af de nye forbindelser, der har påvist antitumoraktivitet i sådanne modeller i kliniske forsøg. 11 Dette skyldes dels forskelle mellem mennesker og mus; En stor del af dette svigt skyldes imidlertid den lave prædiktive værdi af subkutane musemodeller.

Ortotopiske musemodeller, hvor tumorcellerne injiceres i oprindelsesorganet og således vokser i deres oprindelige mikromiljø, anvendes derfor i stigende grad i kræftforskning. 11 , 12 , 13 , 14 Ortotopiske modeller simulerer ikke kun lokale tumorvækstbetingelser; Som et resultat af det anatomisk korrekte sted for tumorvækst tillader orthotopiske musemodeller også realistisk simulering af metastase og bruges derfor til at studere CTC biologi 8 , 15 , 16 eller deres respons på forskellige behandlinger i CRC. 13 , 17

En stor ulempe ved orthotopiske musemodeller er deres tekniske kompleksitet. Afhængigt af orglet, hvor cellerne skal injiceres, er læringskurven indtil eksperimenten i stand til at inducere reproducerbare tumorer ret lang. Dette gælder især for kolorektale kræftmodeller, da tumorcellerne skal injiceres i tarmvæggen, hvilket ofte resulterer i perforering, tumorcellelækage eller endoluminalt tumorcelletab. DetRticle er beregnet til at beskrive fremgangsmåden til cellepræparation fra primære vævsprøver, 2D cellelinier og 3D organoid kultur og deres injektion i cecum af mus. Teknikken beskrevet her fører til stærkt ensartede tumorer og afhænger af tumorbiologien af ​​den cellelinie, der anvendes til injektion, reproducerbar dannelse af fjerne metastaser og CTC'er i modtagermuserne. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dyreforsøg, der blev præsenteret her, blev uafhængigt gennemgået og godkendt af en institutionel og en offentlig dyrepleje- og brugskomité og blev udført i henhold til retningslinjerne for FELASA ( Federation of Laboratory Animal Science Associations ). Alle mulige foranstaltninger blev truffet for at minimere lidelse, herunder anæstesi og analgesi eller om nødvendigt for tidlig eutanasi.

1. Fremstilling af celler og organoider

BEMÆRK: Brug et volumen på 20 μL med 100.000 celler til hver injektion. Brug kælder membran matrix (BMM) for at forhindre lækage og sikre standardiseret injektion. For at sikre reproducerbare resultater, udføre cellelinieautentificeringsassays ( f.eks . Via STR profilering) med jævne mellemrum.

  1. Fremstilling af primære cellesuspensioner fra frisk væv
    BEMÆRK: Arbejd altid under sterile forhold. Øjeblikkelig overførsel af friskResekteret væv fra operationsrummet til laboratoriet på is er påkrævet for at sikre en høj levedygtighed af cellerne.
    Patientens velvære og optimal behandling skal altid være den første prioritet. Derfor skal vævsprøver til forskning opnås på en måde, som ikke forstyrrer den efterfølgende patologiske oparbejdning og opstilling af den resekterede tumor. I de fleste tilfælde er det derfor rimeligt at have prøverne til forskning opnået af en uddannet patolog for at sikre, at den patologiske diagnose ikke interfereres.
    1. Straks efter steril fjernelse fra den resekterede prøve (ideelt ~ 1 cm 3 ) skal vævsprøven placeres i et 50 ml rør, der er fyldt med 20-30 ml phosphatbufret saltvand (PBS). Opbevar røret på is og straks overfør til laboratoriet.
    2. Sæt vævet i en petriskål og vask det to gange med masser af PBS for at fjerne det resterende blod.
    3. Skær vævet i små stykker (~ 2-4 mm) med en scaLpel ( fx med en # 20 eller # 36 blad).
    4. Brug dissociatoren ifølge producentens anvisninger for yderligere at adskille tumorvævet til en enkeltcellesuspension. Alternativt kan du bruge andre protokoller med enzymatisk tumorfordøjelse.
    5. Tæl cellerne i den resulterende enkeltcellesuspension ( fx i en coulter tæller eller et hæmocytometer).
    6. Centrifuge (5 minutter ved 1500 xg) og vask cellesuspensionen to gange med PBS.
    7. Resuspender cellerne i BMM i en koncentration på 5 x 106 celler / ml og hold dem på is.
  2. Fremstilling af cellelinjer til injektion
    1. Grow alle kolorektale cancercellelinjer under standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO2) og forberede dem på dagen for operationen.
    2. Høst cellerne i overensstemmelse med standardcellekulturprotokoller, tæl cellerne ( fx i en coulter-tæller eller et hæmocytometer) og beregne reqUudnyttet mængde for alle injektioner afhængigt af antallet af dyr, der skal injiceres.
    3. Forbered 3-5x af den faktisk nødvendige mængde for at tage højde for pipetteringstab og det døde volumen af ​​injektionssprøjten.
    4. Centrifuge (5 minutter ved 1500 g) og vask cellesuspensionen to gange med PBS.
    5. Resuspender cellerne i BMM i en koncentration på 5 x 106 celler / ml og hold dem på is.
  3. Organoid forberedelse
    BEMÆRK: Alle 3D organoide dyrkes under standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO2). Detaljerede protokoller for organoid kultur er blevet offentliggjort før. 18 , 19 , 20 I lighed med konventionelle cellelinier anbefaler vi et volumen på 20 μL BMM med 100.000 celler pr injektion. Organoiderne fremstilles på operationsdagen som følger:
    1. Forbered det følgende medium (i det følgende omtalteTil DMEM / F12 +++): Avanceret Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamin (200 mM) + 1% Penicillin / Streptomycin.
    2. Forfyld 15 ml rør med 1 ml DMEM / F12 +++.
    3. Aspirer forsigtigt organoiderne fra overfladen af ​​kulturpladen og overfør indholdet af 3 til 5 brønde i et 15 ml rør.
    4. Forsigtigt bryd organoiderne op i mindre stykker ved at pipettere dem op og ned med en udvidet glaspipette.
    5. Tilsæt 5 ml DMEM / F12 +++ til røret, efterfulgt af centrifugering ved 1000 xg i 5 min.
    6. Efter centrifugering fjernes supernatanten, resuspenderes pelleten i 600 μl enzymatisk dissociation buffer og overfører suspensionen til en brønd i en 6-brønds plade.
    7. Inkuber ved 37 ° C i 1-5 minutter, og rør forsigtigt suspensionen op og ned for at opløse organoiderne.
      BEMÆRK: Bekræft fordøjelsen via mikroskop; Det er fuldstændigt, når alle celleklynger er blevet adskiltD til enkeltceller.
    8. Efter vellykket fordøjelse tilsættes 1,4 ml DMEM / F12 +++ for at stoppe fordøjelsen. Derefter overføres alle brønde af fordøjede organoider til et 50 ml rør.
    9. Tæl cellerne og bereg den nødvendige mængde for alle injektioner.
    10. Forbered 3 - 5x af den faktisk nødvendige mængde for at tage højde for pipetteringstab og det døde volumen af ​​injektionssprøjten
    11. Centrifuge (5 minutter ved 1500 xg) og vask cellesuspensionen to gange med PBS.
    12. Resuspenderede cellerne i BMM til en koncentration på 5 x 106 celler / ml og opbevar dem på is.

2. Orthotopic Mouse Model

  1. Forberedelse af modtagende dyr til kirurgi
    BEMÆRK: Brug 6-8 uger gamle NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) mus som modtagere. 21 NSG er blandt de mest immunokompromitterede mus, der mangler modne B-, T- og NK-celler sammen med flere andre immune deeffekt for. 21 De dyrker pålideligt på trods af, at lavt antal celler injiceres og er meget tilbøjelige til fjernmetastaser. NSG-mus er fremragende opdrættere og kan opbevares i konventionelle specifikke patogenfrie (SPF) enheder.
    1. Inden første snit indsprøjtes 0,05 mg / kg buprenorphin subkutant.
    2. Brug sevofluran ved 3-3,5 vol% til generel anæstesi. Et tab af tåhinderefleksen indikerer tilstrækkelig bedøvelse.
    3. Dæk de bedøvede muss øjne med oftalmisk salve for at undgå udtørring af hornhinden.
    4. Hold musene i en liggende position på et lille bord.
    5. Barber maven med en elektrisk barbermaskine (depilatory cream kan alternativt anvendes) og desinficere med mindst 3 gange clorhexidin / iod og 70% alkohol alternativt.
    6. Dæk det kirurgiske felt med sterile gardiner.
      BEMÆRK: Brug af perioperative antibiotika er valgfrit og underlagt institutionelle retningslinjer.
  2. Midline laparotomi og eksponering af cecum
    1. Brug saks (skalpeller kan alternativt bruges) til at lave en lille midterskæring (3 - 5 mm) af huden på underlivet. Optag muskulaturen i mavemusklerne med pincet og omhyggeligt oplys det med en saks og åbner dermed bukhulen.
    2. Identificer og omhyggeligt udvendige cecum med atraumatiske tang. Placer den blinde endepose af cecum på underlivet, der peger kranisk.
    3. Når du er udvendig, skal du holde cecum fugtig ved hjælp af varme saltvandspropper hele tiden.
  3. Ortopotopisk injektion, lukning af maven og postoperativ genopretning
    1. Til intravenøs injektion, brug en standard 1 ml sprøjte med en 30 G kanyle. Monter sprøjten på en mikroinjektionspumpe, som igen er monteret på en mikromanipulator.
    2. Tag forsigtigt spidsen af ​​cecum med atraumatiske tang og blid det forsigtigt ved at strække det nedadD med et andet sæt tænger fugtet med varm saltvand.
    3. Placer kanylen direkte over cecum.
    4. Udfør følgende trin under visuel kontrol med et binokulært kirurgisk mikroskop.
    5. Tag forsigtigt cecum med to atraumatiske tang i begge ender af den udvendige del af cecum, strække den lidt og træk den langsomt over kanylen, der er placeret parallelt og direkte over. Det er afgørende at ikke perforere hele tarmvæggen (således at injicere cellerne i lumen) samt ikke at perforere serosen ud over det oprindelige indtrængspunkt, da dette ville føre til lækage og peritoneal formidling.
      1. Flyt tarmen mod kanylen, ikke kanylen mod tarmen. Hold og stræk tarmen mellem to tang. Kirurgens hænder skal hvile på en overflade for at reducere tremor.
    6. Injicer cellerne mellem serosa (set som meget tyndt, gennemskinneligt foder over thE intramurale blodkar) og muskulaturen. Kanylen skal derfor placeres visuelt over blodkarrene og under den tynde gennemskinnelige membran.
    7. Brug en fodkontakt til at starte injektionen for at reducere tremor, mens kanylen er inden i tarmvæggen.
    8. Når kanylen er på plads, skal du starte injektionen. Brug en varighed på 20 s, hvilket resulterer i 1 μl / s indstilling på pumpens styreenhed.
      BEMÆRK: Injektionen i eller nær et beskadiget blodkar fører til direkte intravaskulær formidling og fjern metastase og bør derfor undgås.
    9. Efter afslutning af injektionen skal du forsigtigt fjerne kanylen ved at trække den baglæns.
    10. Placer en tør vatpind under cecum, og skyll derefter cecum grundigt med destilleret vand for at lyse lækkede celler og dermed forhindre kunstig peritoneal formidling.
  4. Afslutning af maven og postoperativ genopretning
    1. Efter rIndsætte, forsigtigt returnere cecum til bukhulen.
    2. Luk mavevæggen med 6-0 hurtigt absorberbare løbe suturer.
    3. Luk huden med kirurgiske sårklip.
    4. Anbring musen på et varmekort indstillet til 38 ° C, indtil det er fuldt ud genoprettet fra bedøvelsen.
    5. Følg nøjagtigt musens postoperative tilstand i de følgende 48 timer. I tilfælde af nød skal du behandle med 0,05 mg / kg buprenorphin hver 12. time.
    6. Overvåg musene mindst en gang dagligt for tegn på nød som følge af tumorvækst.

3. Isolering af cirkulerende tumorceller fra helblodprøver

BEMÆRK: Hent blod ved transkutan hjertepunktur på bedøvede mus, efterfulgt af eutanasi. Ideelt set trækkes 1.000 μL blod i en sprøjte, der er fyldt med 100 μl af en antikoagulant (Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) eller heparin). Brug en anti-human-EpCAM (epitelcelleadhæsionMolekyle) antistof for at identificere CTC'erne. Dette virker meget godt, hvis menneskelige epithelcelleminer anvendes i musemodellen. For andre apparater kan der kræves forskellige antistoffer.

  1. CTC berigelse:
    1. Forfyld 15 ml rør med 5 ml densitetsgradientmedium og overfør forsigtigt blodet ind i 15 ml rør.
    2. Centrifuge (30 min ved 300 xg uden bremse) og fjern omhyggeligt den øverste supernatant.
    3. Hæld resten i et nyt 15 ml rør og centrifuge (15 min, 300 xg med bremse).
    4. Genoprette interfasen indeholdende de mononukleære celler (kassere resten) og vask cellerne to gange med PBS.
    5. Resuspender pelleten i 200 μl PBS / 1% EDTA og tilsæt 4 μl EpCAM antistof. Inkubér 20 min på is i mørket.
  2. Screening og plukning
    1. Forbered følgende buffer (i det følgende benævnt plukningsbuffer): PBS + 10% føtalt kalveserum (FCS) + 1% Penicillin / STreptomycin (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Brug en PAP-pen til at tegne en cirkel på ca. 1 cm i en 6 cm steril petriskål (forhindrer væsken i at sprede sig i fadet) og piper 700 μL plukbuffer i denne cirkel.
    3. Tilsæt 50 μl cellesuspension til 700 μL plukningsbufferen i cirklen. Kontroller tætheden af ​​celler med mikroskopet. Del prøven i forskellige retter, hvis den er for tæt.
    4. Vent til cellerne sætter sig ned (~ 5 min).
    5. Skærm faldet af cellesuspension for farvede (= EpCAM-positive) celler.
    6. Når en celle er fundet, pluk cellen med micromanipulatoren og læg den i 50 μl puffer afhængigt af den tilsigtede nedstrømsanalyse ( fx RNA-ekstraktionsbuffer eller dyrkningsmedium).
    7. Afhængig af de påtænkte downstream-analyser isolerer EpCAM-negative celler og / eller medium som negative kontroller.
    8. Fortsæt med downstream analyser ( fx cellekultur, PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den succesrige og reproducerbare generation af kolorektale tumorer i denne model afhænger kritisk af nøjagtig injektion af cellerne uden spild eller lækage. Hvis dette opnås, er denne model ekstremt pålidelig og resulterer meget sjældent i kunstig peritoneal formidling. Vækstkinetikken af ​​tumorerne såvel som deres spredningsmønstre afhænger af biologien af ​​de anvendte organoider og celler. 15 Mens HCT116-celler pålideligt metastaserer til leveren i denne model, danner SW620-celler orthotopiske tumorer, men må ikke metastasere. 15

Brugen af ​​HCT116-celler i denne model giver pålideligt i moribundmus inden for 35 dage efter injektion af tumorceller. Primære tumorer måler ca. 10 mm i størrelse ( figur 1A og figur 2A ), levermetastaser ( figur 1B Ong> og figur 2B ), lungemetastaser ( figur 1C og figur 2C ) og cirkulerende tumorceller ( figur 3 ) er næsten uvægerligt til stede. Hos mus, der bærer HCT116-tumorer, er 35 dage efter tumorcelleinjektion CTC'er til stede i højfrekvens og mængde og kan let isoleres til downstream-analyser ( Figur 3 ).

figur 1
Figur 1: Makroskopiske billeder efter dissektion 35 dage efter den ortopotiske injektion af HCT116-humane CRC-celler i NSG-mus. ( A ) Primær tumor (streget linje) i cecum. ( B ) Lever med flere metastaser. ( C ) Lungemetastaser (pile).1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Histologiske billeder af organerne vist i figur 1 . ( A ) Primær tumor (H & E). ( B ) Levermetastase (H & E). ( C ) Lungemetastase (anti-EpCAM immunhistokemi). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Cirkulerende tumorceller (HCT116-celler i NSG-mus, 35 dage efter tumorcelleinjektion). Lyse felt ( A B )) billeder af CTC'er i den perifere blodmononukleære celle (PBMC) fraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På trods af deres præklinisk dokumenterede aktivitet i subkutane musemodeller fejler det store flertal af nye forbindelser i kliniske forsøg og når aldrig klinikken. 11 Denne åbenlyse mangel på subkutane musemodeller til nøjagtigt at simulere tumorens biologi og vækstmønstre har ført til udviklingen af ​​orthotopiske musemodeller baseret på injektion af tumorceller direkte ind i det oprindelige organ.

Ortotopiske musemodeller er i stand til at simulere biologien og formidlingen af ​​faste tumorer meget mere præcist end subkutane modeller. 15 imidlertid store ulemper er ringe reproducerbarhed især i teknisk krævende organer, såsom hule organer samt teknisk krævende overvågning af tumorvækst. I vores model har vi derfor fokuseret på tumorstørrelse på et foruddefineret tidspunkt snarere end gentagne billeddannelsesprocedurer, hvilket begrænser antallet af tekniskeUddyb og for dyrets stressfulde undersøgelser. Den her beskrevne model kan anvendes til forskellige anvendelser, såsom karakterisering af tumorcellelinier, 15 undersøgelse af tumor biologi og formidling samt terapeutiske undersøgelser. 17 Tydelige endepunkter er størrelsen af ​​den primære tumor og antallet af fjerne metastaser, men mere udførlige endepunkter som CTC-numre 17 eller billeddannelsesmodaliteter kan også anvendes.

Det mest kritiske trin i vores protokol er subserosal tumorcelleinjektion. Det kræver øvelse og skal altid udføres under direkte visuel kontrol. Hvis depositumet er andetsteds men under serosa men over slimhinden, vil der enten ikke være nogen tumorvækst overhovedet eller uforudsigelig vækst og formidling, hvilket giver resultaterne uforlignelige. Andre mulige årsager til manglende udvikling af tumorer omfatter ikke-levedygtige celler ( fx </ Em> på grund af den lange tidsperiode mellem høst og injektion af cellerne) eller ikke helt syngene mus. Dette er muligt, hvis C57Bl / 6-mus anvendes; Da der er flere understammer af C57Bl / 6 ( fx C57Bl / 6J og C57Bl / 6N), som viser forskellige genetiske og fænotypiske forskelle 22, som også reflekteres i tumoroptagelseshastigheder. 23

Den her beskrevne højstyrede injektionsmetode fører til høj reproducerbar tumorvækst og spredning og skelner denne model fra tidligere beskrevne ortototopiske modeller. 24 Hertil kommer, skylning coecum med destilleret vand efter tumorcelleinjektion reducerer hastigheden for kunstig peritoneal formidling dramatisk; Derfor, hvis peritoneal carcinomatose forekommer i vores model, er det højst sandsynligt et resultat af cellens biologi snarere end en iatrogen tumorcelle lækage.

Begrænsninger af denne mOdel er modtagermusene, som skal være immunodeficiente, hvis humane cellelinier skal anvendes. Dette begrænser alvorligt modelens anvendelse i immunologiske undersøgelser. Denne begrænsning kan imidlertid overvindes ved brug af syngene musecellelinier eller organoider (upublicerede data). En anden begrænsning er brugen af ​​cellelinjer selv. Tumorcellelinier er ofte meget anaplastiske, hvilket efterlader spørgsmål om deres repræsentativitet af den oprindelige tumors biologi. Denne begrænsning er ikke til stede i genetisk manipulerede musemodeller (GEMM'er), der udvikler en ny tumor ved indføring af vævsspecifikke onkogene mutationer. 12 Sådanne GEMM'er er sædvanligvis baseret på betingede kimlinjemutationer ( fx et fluxet Apc-gen) og Cre-medieret aktivering af mutationerne, enten ved lokal infektion med adeno-cre 25 , 27 , 28 eller en vævsspecifik promotor kørsel creudtryk. 29 , 30 , 31 Imidlertid kræver sådanne modeller ofte omfattende krydsninger og har en meget variabel biologi. Hvis primære cellelinier anvendes i den her præsenterede model, kan begrænsningen af ​​lav repræsentativitet overvindes uden tab af de andre fordele ved vores model, såsom reproducerbarhed og relativ omkostningseffektivitet.

En anden begrænsning af den her foreslåede teknik er afhængigheden af ​​EpCAM som overflademarkør. Det er velkendt, at EpCAM kan gå tabt under EMT, og at der er en brøkdel af CTC'er, der er EpCAM-negative. 10 , 15 Derfor kan der, afhængigt af forsøgets formål og de anvendte cellelinjer til injektion, anvendes andre midler til identifikation ( f.eks . GFP-mærkning af cellerne før injektion).

Som konklusion er den her præsenterede model cOmsætter et fleksibelt værktøj til at studere tumorudvikling og formidling i forbindelse med tumorens oprindelige mikromiljø i tyktarmen. Hvis der anvendes metastatiske cellelinjer, simulerer det på trods af tumorcelleformidling på alle relevante steder for CRC, herunder CTC'er i blodstrømmen. Det er derfor et nyttigt værktøj til at studere de fænotypiske ændringer under tumorvækst og formidling og muliggør gentagen isolering og karakterisering af CTC'er i CRC. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den tyske forskningsstiftelse (WE 3548 / 4-1) og Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365, (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1, (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397, (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20, (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112, (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19, (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263, (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138, (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74, (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5, (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33, (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6, (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4, (11), e1042201 (2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7, (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6, (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74, (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159, (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100, (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14, (7), R82 (2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347, (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19, (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7, (351), ra107 (2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61, (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8, (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (42), 11859-11864 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics