Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

Immunology and Infection

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Summary

Ce protocole permet un chercheur d’isoler et de caractériser les tissus-résident hallmark de macrophages dans divers tissus enflammés extraites de modèles induite par le régime alimentaire des troubles métaboliques.

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Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

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Abstract

L’obésité favorise un état inflammatoire chronique qui est largement médiatisé par les macrophages tissulaires-résident ainsi que les macrophages dérivés de monocytes. L’obésité induite par l’alimentation (DIO) est un modèle précieux pour l’étude du rôle de l’hétérogénéité des macrophages ; Cependant, des isolations de macrophage adéquates sont difficiles à acquérir à partir de tissus enflammés. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes de l’isolement et les directives de dépannage nécessaires provenant de nos études pour obtenir une population convenable des macrophages de tissu-résident de souris après 18 semaines de haute teneur en graisses (HFD) ou de la haute-graisse/riche en cholestérol ( Intervention HFHCD) de régime. Ce protocole se concentre sur trois tissus de hallmark étudiés dans l’obésité et l’athérosclérose y compris le foie, le tissu adipeux blanc (WAT) et l’aorte. Nous mettons en évidence l’utilisation comment dualiste de l’écoulement cytometry peut atteindre une nouvelle dimension de l’isolement et la caractérisation des macrophages de tissu-résident. Un article fondamental du présent protocole aborde les subtilités qui sous-tendent les digestions enzymatiques spécifiques des tissus et l’isolement de macrophage et ultérieures anticorps de surface cellulaire coloration pour cytométrie. Ce protocole traite des complexités existantes qui sous-tendent la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et présente des éclaircissements à ces complexités afin d’obtenir la caractérisation de la vaste gamme de populations cellulaires correctement trié. Méthodes d’enrichissement de rechange sont inclus pour le tri des cellules, comme le foie dense, permettant la gestion de la flexibilité et l’heure lorsque vous travaillez avec des FACS. En bref, ce protocole facilite le chercheur pour évaluer l’hétérogénéité des macrophages d’une multitude de tissus enflammés dans une étude donnée et fournit des conseils de dépannage perspicaces qui ont réussi pour la caractérisation et l’isolement cellulaire favorable des cellules immunitaires dans l’inflammation induite par la DIO.

Introduction

Modèles de souris ont été largement utilisés pour étudier la dynamique des maladies humaines. Isolation correcte des cellules résidentes des souris dans un état de malade peut fournir une plate-forme pour comprendre les contributions moléculaires et cellulaires à la pathogenèse de la maladie1. Un trouble qui est d’une importance cruciale est l’obésité. L’incidence de l’obésité continue d’augmenter dans le monde entier en parallèle avec la résistance à l’insuline et le type 2 mellitus de diabète, maladies cardiovasculaires et stéatose hépatique2,3. Une consommation excessive en éléments nutritifs est plus biaisée par la diminution de l’activité physique déclenchant des signaux altérés provenant du tissu adipeux, ce qui peut modifier le milieu cellulaire des autres tissus périphériques tels que l' aorte et le foie4. Ces perturbations de l’homéostasie métabolique se traduit par une inflammation systémique de chroniques de bas grade5.

Classique activation des macrophages résidents à l’aorte et du foie ainsi que leur recrutement dans le tissu adipeux blanc (WAT) s’est avérée non seulement lancer le dérèglement des signaux métaboliques mais également soutenir l’inflammation6,7. L’hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des macrophages est fortement liée à la pathogenèse de l’obésité des comorbidités7. La plasticité dynamique en polarisation macrophage permet ces cellules présentent un éventail des phénotypes activés qui coordonnent la progression et la résolution de l’inflammation,8. Tandis que les macrophages activés de façon classique (M1) sont impliqués dans la propagation de l’inflammation, alternativement activés macrophages (M2) ont été associés à la résolution et le tissu réparation9,10.

Comme le corps subit des stress métabolique, le tissu adipeux blanc s’accumule anormalement. Le tissu adipeux élargi attire et retient les cellules inflammatoires qui modifient profondément les fonction d’adipocyte normal pour favoriser la résistance à l’insuline, hyperglycémie et diabète de type 2 en fin de compte, insulinorésistance ou hyperglycémie11, 12. En parallèle, le tissu adipeux blanc remodèle en réponse à des signaux inflammatoires libérés par infiltré classiquement activés (M1) du tissu adipeux macrophages (ATMs)13,14. Cet organe multicellulaire exerce une cascade de signaux qui déraille la fonction normale des autre organes du corps humain tels que l’aorte et du foie4.

Le foie est un puissant métabolique qui s’adapte en réponse à des stimuli provenant du voisin dysrégulation WAT15. Macrophages hépatiques ou des cellules de Kupffer, en réponse à des changements métaboliques, sécrètent des cytokines inflammatoires qui transforment les deux parenchymateuses et phénotype cellulaire non parenchymateuses et promouvoir le remodelage tissulaire. Accumulation de lipides hépatiques, inflammation, dépôts excessifs de la matrice extracellulaire, nécrose et fonction éventuelle perte suit les insultes inflammatoires qui contribuent à la vaste gamme d’atteinte hépatique associées non alcoolisées stéatose hépatique 16,17,18.

Parallèlement au WAT compromise et la fonction hépatique, grosses artères s’accumulent des lipides dans la paroi artérielle que le corps subit un stress métabolique chronique19. Accumulation de lipides artérielle déclenche la sécrétion de chimiokines par les cellules endothéliales activées et le recrutement des monocytes20. Une fois recrutés, monocytes prolifèrent, se différencient, ingèrent des lipoprotéines et deviennent des cellules spumeuses. Athérogenèse est initiée et soutenue par l’activité pro-inflammatoire des recrutés et les tissus résident macrophages chargés de lipides. Succomber aux signaux extracellulaires et intracellulaires stress relayés dans ce micro-environnement athérogène, ces macrophages puis s’engager dans une apoptose cascade de signalisation. Comme ces cellules meurent, elles contribuent à leur teneur en lipides rempli au noyau nécrotique de la lésion, ce qui mène à la rupture de plaque, infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral.

Collectivement, l’hétérogénéité des phénotypes macrophage orchestre en partie l’obésité induite par les changements inflammatoires observées dans les tissus de dysrégulation tels que WAT, foie et aorte8,21. Caractérisation des recrutés et macrophages résident tissulaires pourraient donner un aperçu de potentielles cibles moléculaires qui manipulent des macrophages phénotype1. Afin de caractériser efficacement les macrophages des tissus enflammés induites par l’obésité, une suspension de cellules individuelles peut être obtenue par digestion enzymatique. Ces protocoles de dissociation doivent être efficaces dans la dégradation suffisamment de tissu conjonctif tout en minimisant la mort des cellules immunitaires et fournir le rendement cellulaire optimal. Le mélange d’enzymes est dépendant du type de tissu et son maquillage structurelle. Tissus résistants tels que l’aorte nécessite plus forte activité enzymatique, par rapport au foie et WAT, pour atteindre la dissociation tissulaire. De la suspension monocellulaire, macrophages résident tissulaires peuvent être sans ambiguïté caractérise ou isolés pour approfondir les analyses en aval comme le profilage transcriptionnel.

Ici est décrit un protocole tissu-spécifique qui utilise la digestion de collagénase dépendant des tissus et cytométrie polychromatique pour effectivement isoler et de caractériser des macrophages de tissu-résident provenant du régime alimentaire traditionnel induites par l’obésité, l’athérosclérose, simple stéatose et stéato-hépatite modèles murins. Simultanée de la coloration des marqueurs de surface de cellules avec des anticorps dirigés contre les leucocytes-(CD45 et/ou CD11b) et macrophage - antigènes spécifiques (F4/80) est souvent utilisé pour identifier les populations de macrophage22. Cellule activée par fluorescence triant (FACS) est une stratégie puissante permet de trier ces populations identifiées à haute pureté. La population triée peut ensuite être évaluée pour profils de gènes spécifiques de phénotype à l’aide de l’analyse moléculaire en aval (par exemple la PCR quantitative en temps réel)23. Bien que standard cytométrie en flux et tri de cellule axée sur la cytométrie en flux sont des outils puissants pour distinguer les macrophages dans une suspension de cellules très hétérogène, anciens protocoles doivent être optimisés pour assurer une sortie réussie. Dans cette étude, les protocoles qui effectivement isoler et caractérisent les macrophages des tissus viables sont décrits ; plus important encore, cette étude donne un aperçu crucial de questions techniques qui se posent souvent, ainsi que des stratégies proactives et dépannage afin d’éviter et/ou de les résoudre.

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Protocol

Tous les protocoles expérimentaux (Sections 1, 1.2 et 1.3) ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à la Pennsylvania State University.

Tissu Préparation de mémoires tampons de dissociation Volume final Stockage
Tissu adipeux blanc (WAT) Tampon de dissociation : 2,5 % HEPES, 10 mg/mL, l’albumine sérique Bovine (BSA), 3 mg/mL (0,3 %) Collagénase de Type II dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose sans pyruvate de sodium et de L-glutamine 500 mL moins 80° C (aliquots de 10 mL)
Foie 25 x concentré de tampon de Perfusion (PBC) : 3,55 M NaCl, KCl, 168 mM 240 mM HEPES, 150 mM NaOH en distillée désionisée H2O 500 mL moins 20° C (aliquots de 40 mL)
Tampon de préservation (PRB) : 1 % BSA en 1 x tampon de Perfusion 1 L 4 ° C
Tampon de dissociation : 1 x tampon de Perfusion additionnée de 4,76 mM CaCl2 et 72 U/mL collagénase de Type IV 50 mL (pour la souris) Préparer immédiatement avant utilisation
Aorte Tampon de dissociation : 125 U/mL collagénase Type XI, 60 U/mL Hyaluronidase dactylographiez I, 60 U/mL DNase I, 450 U/mL collagénase de Type I, 20 mM HEPES dans 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS) 500 mL moins 80° C (aliquots de 10 mL)

Tableau 1 : Recettes de tampon tissu spécifique de perfusion.

1. dissociation et l’isolement de tissu

  1. Dissociation et l’isolement de WAT
    1. Préparer les mémoires tampons de tissu-spécifiques conformément au tableau 1et les stocker comme décrit.
    2. Préparer les réactifs suivants.
      1. Préparer le tampon de la digestion en dégel le volume suffisant de tampon de dissociation de WAT et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Immédiatement avant l’utilisation, réchauffer le tampon à 37 ° C. Préparer le tampon de FACS en préparer 1 x une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2 % sérum fœtal (SVF).
    3. Isolement de WAT
      1. Euthanasier une chambre de souris dans un dioxyde de carbone (CO2) remplie. Vérifier l’efficacité avant de poursuivre à l’étape de la dissection.
      2. Trempez la souris euthanasiée brièvement dans un bécher contenant de l’éthanol 70 % jusqu'à ce que complètement trempée et enduit avec de l’éthanol. Placer la surface ventrale de la souris vers le haut sur la scène de la dissection et fixez la souris avant et les pattes postérieures à la Commission de la dissection à l’aide d’aiguilles 21 G.
      3. Utiliser des pinces de pointe pointe moyenne à saisir la peau abdominale antérieure le méat urétral, puis utiliser des ciseaux de dissection pointus pour faire une incision dans la peau abdominale à saisir.
      4. Insérez la lame inférieure des ciseaux dans la petite incision entre la peau et le péritoine et pratiquer une incision latérale de l’abdomen à la cage thoracique.
      5. Tirez doucement la peau pour exposer la cavité péritonéale intacte et faire une incision latérale à travers le péritoine et soit replier la membrane transparente ou exciser les tissus afin d’exposer le WAT abdominale.
      6. Recueillir les coussinets adipeux perigonadal comme décrit dans Mann et al. 24
        1. Les coussinets adipeux perigonadal chez les souris mâles sont faiblement liés à l’épididyme et les testicules. Tout d’abord localiser les testicules puis avec support point pince, saisir la main sur la tête de l’épididyme et tirez doucement.
        2. À l’aide de ciseaux pointus de dissection, l’accise chaque coussinets adipeux épididymaire en coupant le long de la surface de l’épididyme (tête, corps et queue) et les testicules.
        3. Avec la pince, tirez doucement sur les coussinets adipeux tout en coupant à travers le tissu conjonctif directement liée à la structure de l’épididyme.
        4. À l’aide de la pince, tenez fermement l’extrémité des coussinets adipeux proximale de l’épididyme et décoller doucement les coussinets adipeux loin les gonades
        5. Chez les souris femelles, les coussinets adipeux perigonadal sont vaguement bond pour le corps de l’utérus et de la corne utérine.
        6. À l’aide de pinces de pointe moyenne, saisir le tissu graisseux perigonadal et tirez doucement le tissu loin du corps de l’utérus et de la corne utérine.
        7. L’accise chaque grosse garniture en coupant le long du corps de l’utérus et de la corne utérine à l’aide de ciseaux pointus de dissection.
      7. Placez la graisse dans une boîte de Pétri-rempli de PBS et garder sur la glace pour garder le tissu humide.
    4. Dissociation du WAT en Suspensions unicellulaires
      1. Retirer les excès PBS de la boîte de Pétri et utiliser un grattoir à lame unique à mâcher le WAT abdominale en petits morceaux.
      2. Avec le tranchant de la lame de rasoir, grattez légèrement le WAT abdominale hachée dans un tube de collection polypropylène marqué 15 mL contenant 2 mL de tampon de dissociation WAT.
      3. Incuber à ce mélange de tampon de tissu-digestion lente rotation continue à 37 ° C pendant 45 min.
      4. Filtrer les tissus digérés à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube de 50 mL collection tout en déplaçant le piston en caoutchouc d’un piston de la seringue dans un mouvement circulaire et continuer à tamiser la suspension cellulaire à travers le filtre.
      5. Pipette de 2 mL de Dulbecco de Eagle modifié (DMEM) à un tube de prélèvement de 15 mL, pipette doucement verticalement et laver le filtre avec la suspension de cellules individuelles.
      6. Laver le filtre deux fois supplémentaires avec DMEM froide et placez la suspension monocellulaire sur glace.
      7. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g à 4 ° C pendant 8 min.
      8. Utilisez un aspirateur vide pour retirer délicatement les adipocytes flottantes (d’abord) et restant surnageant. Veillez à ne pas déranger la fraction de stroma vasculaire granulée (SVF).
      9. Avec une pipette 1 000 µL, doucement Resuspendre le culot dans un tampon de lyse des érythrocytes selon les instructions du fabricant en potassium chlorure d’ammonium (ACK).
      10. Diluer la suspension de cellules ci-dessus avec DMEM et centrifuger la suspension de cellules à 300 g à 4 ° C pendant 8 min.
      11. Remettre en suspension les cellules en froid PBS contenant 2 % SVF (tampon de FACS) et compter les cellules dans un chambre de Burker/hémocytomètre.
      12. Transférer 1 x 106 cellules (pour la base de cytométrie) ou la suspension de toute cellule (pour FACS) à labellisé 5 mL tubes polystyrène fond rond. Continuer à la Section 2 pour cytométrie en souillant le protocole.
  2. Dissociation et l’isolement de tissu hépatique
    Remarque : Ce protocole est une adaptation de Smedsrød25.
    1. Préparer les mémoires tampons de tissu-spécifique selon le tableau 1 et les stocker comme décrit.
    2. Préparer les réactifs suivants.
      1. Préparer 1 x tampon de Perfusion (PB), de diluant à 40 mL de PBC en 960 mL ultrapure H2O. chaud avant une seringue rempli avec 50 mL de PB à 37 ° C, juste avant la perfusion commence. Éliminer les bulles d’air présentes.
        1. Pour éliminer les bulles d’air, il faut inverser la seringue où la pointe de verrouiller leur est pointée vers le haut. Appuyez sur ou de balayer la seringue jusqu'à ce que les bulles d’air sont à la pf albums la seringue. Poussez doucement sur le piston pour évacuer l’air
      2. Préparer le tampon de la digestion en diluant 0,5 mL de 476 mM CaCl2 solutionà 49,5 mL 1 x tampon de Perfusion. Ajouter 3600U de collagénase de Type IV à la 4,76 mM CaCl2 – solution PB. Réchauffez une seringue remplie de 50 mL de tampon de digestion à 37 ° C, juste avant la perfusion commence. Éliminer les bulles d’air présentes tel que décrit à l’étape 1.2.2.1.1.
      3. Préparer la conservation Buffer (PRB) en dissolvant 2,5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 250 mL de tampon de perfusion 1 x. Conserver à 4 ° C ou rester sur la glace jusqu'à utilisation.
      4. Préparer des FACS tampon avec 1 x PBS et 2 % FBS.
    3. Isolement de tissu hépatique
      1. Euthanasier une souris par asphyxie de CO2 , saturer des souris avec de l’éthanol 70 % pour prévenir la contamination des organes intraabdominale avec fourrure.
      2. Position de la face ventrale de la souris vers le haut, sur un polystyrène mousse Conseil de dissection et fixer la souris avant et arrière les pattes à l’Office de la dissection à l’aide d’aiguilles 21 G.
      3. Pour exposer la paroi thoracique et la cavité péritonéale, saisir la peau abdominale près le méat urétral à l’aide d’une pince de pointe pointe moyenne. Utilisez ensuite une paire de ciseaux pointu dissection pour créer une petite incision de la peau abdominale à saisir.
      4. Insérez la lame inférieure des ciseaux dans la petite incision entre la peau et le péritoine et faire une incision latérale de groin à menton.
      5. Tirez doucement la peau pour exposer la cavité péritonéale intacte et la paroi thoracique, faire une incision latérale à travers le péritoine et la membrane de l’accise.
      6. Soulevez le sternum et soigneusement Inciser le diaphragme, veillez à ne pas déranger la veine cave inférieure (VCI). Déplacer les organes digestifs sur le côté et localisez la VCI subhepatic. Utiliser des pinces hémostatiques afin de serrer le sus-hépatique IVC pour maintenir une perfusion localisée.
        Remarque : Une accumulation Excessive de blanc le tissu adipeux viscéral peut souvent masquer la VCI. Pour mieux visualiser ce navire, une petite zone de tissu adipeux à côté de la VCI peut être excisée. La fenêtre incisée dans le tissu graisseux pliable peut être puis positionnée sur la VCI pour exposer le navire pour canulation.
      7. Connecter la seringue remplie de PB préchauffé à l’ensemble de collection et de la perfusion de sang 23 G. Poussez doucement sur le piston jusqu'à ce que le tube et l’aiguille sont remplis de PB.
      8. Insérer l’aiguille 23 G, parallèle au niveau de la VCI subhepatic. Fixer l’aiguille en place à l’aide d’une pince hémostatique de 4 cm.
        NOTE : Canulation de le subhepatic QU'IVC est préférable dans les souris nourries à la diète que la VCI peut être mieux visualisé et canulé dans la cavité remplie de graisse.
      9. Poussez doucement sur le piston pour commencer la perfusion, la couleur se videra rapidement du foie (droite tout d’abord le lobe) si l’aiguille est correctement positionné dans le vaisseau. L’élargissement des lobes est aussi visible que si l’aiguille est correctement insérée dans la VCI subhepatic.
      10. Rapidement couper la veine pour permettre le PB de circuler facilement dans le foie.
      11. Perfuse le foie jusqu'à ce que le sang n’est plus visible. Masser à l’occasion des lobes du foie entre fore-doigt et le pouce afin de faciliter la perfusion.
        Remarque : Il est important d’utiliser des outils tranchants non non dentelé pour gérer le foie pour éviter d’endommager les tissus.
      12. Lorsque 5 mL de PB reste dans la seringue, changer à la seringue remplie de tampon de dissociation préchauffé. Ne pas déranger la position de l’aiguille sécurisée durant cette période.
        Remarque : Agrandi foies significativement supérieure à 1,5 g doit être perfusé avec un plus grand volume de tampon de digestion préchauffé garantissant une dissociation du foie réussie.
      13. Perfuse le foie jusqu'à ce que complètement digéré. Massez délicatement les lobes du foie pour faciliter la perfusion.
        NOTE : Séparation de la capsule de Glisson du parenchyme est observable dans le foie avec succès digéré. Afin d’évaluer cela, utilisez le tranchant émoussé d’une paire de pinces, pour appuyer doucement sur le lobe latéral gauche. L’impression doit apparaître sur la surface et l’indentation doit remplir lentement une fois la pince est retirée.
      14. Retirer l’aiguille de la VCI subhepatic. Ne pas enlever la pince hémostatique serrage le sus-hépatique IVC.
      15. Excise le foie entier en coupant soigneusement à travers la connexion à l’aide d’une lame droite courte ciseaux de dissection de ligaments et enlever la vésicule biliaire.
      16. Placer le foie entier dans un plat de Pétri de 10 cm contenant 10 mL glacee conservation Buffer et le magasin à 4 оC jusqu’au prêt à libérer des cellules.
    4. Dissociation des cellules hépatiques
      1. Transférer le foie dans un plat de 10 cm contenant 10 mL DMEM glacée.
      2. Attrapez le sus-hépatique dissociée QU'IVC attachée au foie excisé à l’aide d’une pince crantée. Pinces à pointe moyenne permet de libérer les cellules de la capsule de la Glisson en appliquant un mouvement caressant rapide à chaque lobe.
      3. Passez le DMEM saturée à travers un tamis de cellule 70 µm attaché à un tube de prélèvement de 50 mL.
      4. Pipette 10 mL glacee DMEM aux 10 cm boîte de Pétri et répétez les étapes 1.2.4.1 à 1.2.4.3 jusqu'à saturation des médias on observe n’est plus. Placez la suspension cellulaire sur la glace ou à 4 ° C.
      5. Mélanger délicatement la suspension cellulaire en inversant le tube de prélèvement et puis centrifuger à 54 x g pendant 2 min à 4 ° C.
      6. Récupérer le surnageant dans un tube de prélèvement propre de 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire à 54 x g pendant 2 min à 4 ° C.
      7. Répétez l’étape 1.2.4.6 deux fois supplémentaires avant de passer à l’étape 1.2.4.8.
      8. Transférer le surnageant dans un tube propre 50 mL-collection et centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
      9. Resuspendre le culot cellulaire non parenchymateuses dans le tampon de FACS et dénombrer dans un chambre de Burker/hémocytomètre.
      10. Transfert en 1 x 106 cellules (pour la base de cytométrie) ou 15 x 106 - 20 x 106 cellules (pour les FACS) à marqué tubes polystyrène fond rond de 5 mL. Continuer à la Section 2 pour cytométrie en souillant le protocole.
  3. Dissociation et l’isolement de l’aorte
    Remarque : Ce protocole est une adaptation de boucheret al.26
    1. Préparer les mémoires tampons de tissu-spécifique fondées sur les recettes détaillées dans le tableau 1 et les stocker comme décrit.
    2. Préparer les réactifs suivants.
      1. Préparer le tampon de la digestion en dégel le volume suffisant de tampon de dissociation de WAT et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Immédiatement avant l’utilisation, réchauffer le tampon à 37 ° C.
      2. Préparer une solution de l’héparine 10 x en dissolvant l’héparine sel de sodium dans du PBS 1 x à une concentration de 200 U/mL. Diluer 10 x solution mère de l’héparine avec du PBS 1 x à préparer un 1 x solution héparinée. Conserver le x 10 et 1 x solutions d’héparine à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
      3. Préparer le tampon PBS 1 x contenant 2 % de FACS FBS.
    3. Dissection de l’aorte
      1. Euthanasier une souris dans une chambre rempli de dioxyde de carbone et le rinçage avec de l’éthanol à 70 %.
      2. Placer la face ventrale de la souris vers le haut sur la scène de la dissection, propager la souris avant et les pattes postérieures et fixez-les à la Commission de la dissection à l’aide d’aiguilles 21 G.
      3. Immédiatement après l’euthanasie de la souris, effectuer la ponction cardiaque. Se référer aux étapes 1.3.3.4 à 1.3.3.9, si nécessaire.
      4. Localiser le processus xiphoïde à l’extrémité inférieure du sternum
      5. Pour ce faire, placez un point médian du doigt le long de la largeur du cou de l’animal. Remonter le long de la ligne ventrale médiane du cou à l’extrémité caudale du sternum jusqu'à sentait une extension cartilagineuse.
      6. Pointe moyenne pince permet de saisir l’extension cartilagineuse et si nécessaire, marquez l’emplacement du processus xiphoïde en enlevant le patch de cheveux ou de peau dans la région.
      7. Insérer partiellement une aiguille de 26 G sous le processus xiphoïde en position 20-30 °.
      8. Doucement, appliquer une pression négative sur la seringue en retirant lentement le piston, puis insérez l’aiguille plus loin dans la cavité jusqu'à ce que le flux de sang.
      9. En cas d’arrêt de la circulation sanguine, lentement tourner l’aiguille ou déplacer légèrement en et hors.
      10. Utiliser la paire de pinces pour saisir la main sur la peau abdominale antérieure urétrale d’ouverture et utilisez une paire de ciseaux de dissection tranchant pour couper le long de la ligne ventrale médiane par le péritoine de l’aine à menton.
      11. Tirez la peau pour exposer les organes abdominaux et la cage thoracique avec les doigts ou pince émoussée déplacez doucement les organes abdominaux sur le côté.
      12. Utiliser la pince pour attraper la main sur le processus xiphoïde, soulevez le sternum et Inciser le diaphragme.
      13. Utilisant des ciseaux de dissection, coupez à travers les nervures latérales des deux côtés. Préhension du sternum, flip la cage thoracique vers le haut et couper à travers la base de raccordement. Enlever la cage thoracique, exposant ainsi les organes thoraciques sous-jacents.
      14. Perfuse l’aorte avec une aiguille de calibre 26 attachée à une seringue de 10 mL remplie avec 1 x solution de l’héparine en injectant de 1 à 2 mL de solution dans le ventricule gauche (VG) du cœur.
        Remarque : Veillez à perfuse à un rythme lent avec peu de pression pour s’assurer que les lésions aortiques athéromateuses intactes.
      15. L’accise le thymus, les poumons et les tissus conjonctifs. Se référer aux étapes 1.3.3.16 et 1.3.3.17, si nécessaire.
        1. Antérieur à cœur localiser le blanc bi-lobé (ou en forme de papillon) orgue et fermement grab cale du thymus avec la pince. Tirer vers le haut les deux lobes de la cavité et coupé à la base avec les ciseaux.
        2. Pour supprimer les poumons, pincer un lobe de poumon avec la pince, arracher les tissus de la cavité thoracique et coupez à la base. Répétez pour chaque lobe restant.
      16. Utiliser un microscope à dissection micro-dissection, outils et Arch. de l’aorte (y compris l’artère innominée, artère carotide commune gauche et l’artère sous-clavière gauche), l’ascendant, descendant, aorte thoracique et abdominale à frais virés.
        1. Localiser l’aorte dans le ventricule gauche du cœur.
        2. Avec une paire de courbes 0,07 x 0,04 mm-Embout pince saisir délicatement la partie de l’aorte ascendante qui sortent d’un ventricule gauche.
          Remarque : Par rapport au tissu graisseux environnant teinté de jaune, l’aorte sera un navire blanc lumineux provenant de la LV lorsque suffisamment Rincer avec la solution de l’héparine.
          1. Si l’aorte n’était pas correctement rincé par perfusion cardiaque, rincer à nouveau l’aorte l’aorte reste connecté à la cavité. Pour ce faire, coupées près de la jonction de coeur-aorte, enlever le coeur et couper horizontalement par l’extrémité inférieure de l’aorte abdominale. Insérer une aiguille 26 G dans l’ouverture de l’aorte ascendante et rincer doucement l’aorte avec la 1 x solution de l’héparine.
          2. Tirer doucement sur l’aorte ascendante pour mieux distinguer les tissus adipeux et l’aorte incorporé.
          3. En tirant toujours doucement sur l’aorte ascendante, utilisez la pointe de fermé printemps ciseaux de dissection pour effacer la graisse qui encapsulent l’aorte et l’aorte ascendante. Pour ce faire caresser le tissu graisseux avec le bout des lames des ciseaux fermés à arracher la raccordement de la graisse.
            Remarque : S’abstenir d’excision des tissus adipeux en coupant jusqu'à ce que l’aorte ascendante et les arc peuvent être clairement visualisées. Ceci permet d’éviter de couper l’aorte.
          4. Si l’aorte ascendante et les arche peuvent être clairement délimitées du tissu adipeux surround, utilisez le ressort ciseaux de dissection pour exciser l’excès de graisse.
          5. Doucement s’emparer de l’arc aortique avec la pince. Encore une fois à l’aide de pointe de ciseaux le printemps, accident vasculaire cérébral à la graisse le long de l’aorte descendante, thoracique et abdominale à l’extrémité caudale de l’aorte abdominale, faire sur le côté droit de l’enveloppe de graisse.
          6. Continuer à saisir le long de l’aorte, lors de la déchirure à la graisse. N’oubliez pas de faire tellement doucement pour ne pas endommager l’aorte.
          7. Tirez doucement sur l’aorte vers le haut, vers le microscope pour que la graisse est maintenant positionnée derrière l’aorte.
          8. Insérer les lames des ciseaux fermés entre l’interface de graisse-aorte près de l’extrémité antérieure de l’aorte, sévère attachement du tissu graisseux à la surface de l’aorte sans ménagement à l’aide d’un mouvement de balayage.
            NOTE : Bien enlever l’excès de graisse et reliant le tissu tandis que l’aorte est encore au sein de la cavité est recommandé.
          9. Au cœur de l’accise et coupés transversalement à l’extrémité caudale de l’aorte abdominale. Supprimer l’aorte ensemble.
          10. Placer l’aorte dans un plat de 35 mm et taquiner loin de tout excès de graisse sur l’aorte à l’aide de deux aiguilles de calibre 21. Placez l’aorte excisé en tubes de microcentrifuge 1,7 mL sur la glace.
    4. Dissociation de l’aorte en Suspensions unicellulaires
      1. Pipette 0,2 mL aorte dissociation d’un amortisseur dans le tube contenant l’aorte. Insérer les lames de ciseaux vers l’extrémité effilée du tube et hacher rapidement l’aorte pour faciliter la digestion enzymatique.
      2. Transférer le mélange tissu-solution sur un 15 mL collection tube et pipette de 1,8 mL aorte dissociation buffer pour un volume total de 2 mL.
        Remarque : Pour transférer facilement de la suspension de tissu, couper le 1 cm au-delà de l’extrémité conique d’un standard de pipette 1 000 µL. La pointe raccourcie permet de transférer la suspension avec une micropipette.
      3. Incuber l’aorte hachée dans le tampon de dissociation aorte pendant 55 min à 37 ° C, agitation à 220 tr/mn (0.514 x g).
      4. Traverser la suspension tamis cellulaire de 50 µm dans un tube de 15 mL en polypropylène collection. Utiliser le piston en caoutchouc d’un piston de la seringue pour faciliter le filtrage.
      5. Rincer le tube de prélèvement de 15 mL avec le tampon de 1 mL FACS, recueillir la suspension et passent par le filtre de la cellule.
      6. Laver le filtre de cellule 50 µm deux fois supplémentaires avec 1 mL de tampon de FACS.
      7. Les cellules de granule par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de FACS froid. Compter les cellules dans un chambre de Burker/hémocytomètre.
      8. Transfert des cellules de 1 x 106 (à la base de cytométrie) ou la suspension de toute cellule (pour FACS) à un tubes de polystyrène fond rond marqué 5 mL. Continuer à la Section 2 pour cytométrie en souillant le protocole.

2. écoulement Cytometry et coloration des FACS

Fluorophore R-phycoérythrine (PE) PE/Cyanine (Cy) 7 PE/Cyanine (Cy) 5 Bleu Pacifique (PB)
Laser (nm) Bleu (488 nm) / jaune (561-570 nm) - vert (532 nm) Bleu (488 nm) / jaune (561-570 nm) - vert (532 nm) Bleu (488 nm) / jaune (561-570 nm) - vert (532 nm) Violet (405 nm)
ExcitationMAX (nm) 496 496 496 401
EmissionMAX (nm) 578 785 667 455
Marqueurs phénotypiques F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 L’intégrine αX, intégrine αX chaîne, CR4, p150, ITGAX Intégrine αM, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, Mac-1, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Type de cellules ciblées Résidents Macrophages tissulaires Macrophages activés de façon classique (M1) Monocytes / macrophages Leucocytes (Macrophages / granulocytes, les monocytes et les lymphocytes)
Sous-ensemble de cellules dendritiques Les cellules dendritiques, cellules NK, lymphocytes T activés et un sous-ensemble des lymphocytes intra-épithéliaux intestinaux (IEL) Granulocytes, cellules dendritiques, cellules NK et sous-ensembles de cellules T et B
Facteur de dilution 01:50 1/100 1/100 1/100
Isotype contrôles PE Rat IgG2a PE/Cy7 Hamster arménienne IgG PE/Cy5 Rat IgG2b Rat bleu du Pacifique IgG2c

Tableau 2 : Liste du fluorophore balisé anticorps spécifiques pour discriminant macrophages résident tissulaires.

  1. Recueillir et préparer les éléments suivants : les tubes de polystyrène de FACS tampon 5 mL fond rond, récepteurs Fc CD16/32 anti-souris anticorps, fluorophore conjugué ou non des anticorps primaires, Anticorps secondaires conjugué à un fluorophore (if nécessaire), 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    Remarque : Pour la coloration de grandes quantités de cellules, concentration en anticorps est plus critique plutôt que le nombre de cellules. Par exemple, si la coloration 10 x 106 cellules le volume tampon coloration et la concentration d’anticorps devrait être les mêmes que si coloration 1,0 x 106 cellules en volume de tampon de 100 µL. Pour la coloration 1,0 x 108 cellules, augmentant la quantité d’anticorps 5 fois est recommandé.
  2. Ajouter le tampon de FACS glacée supplémentaire dans chaque tube de FACS si nécessaire, cellules de granule par centrifugation à 751 x g pendant 5 min (4 ° C). Aspirer la surnageante centrifugation suivante.
  3. Ajouter des récepteurs Fc CD16/CD32 anti-souris anticorps de tous les échantillons selon les instructions du fabricant. Incuber pendant 15 min à 4 ° C ou sur la glace.
  4. Ajoutez l’anticorps primaire conjugué fluorophore cocktail directement au récepteur Fc contenant des anticorps bloquant suspension de cellules et incuber les échantillons à 4 ° C pendant 30 min. échantillons de protéger de la lumière pour réduire au minimum le blanchissement des anticorps conjugués fluorophore.
    1. En cas de non conjugués anticorps primaires ont été utilisés, procédez comme suit à la suite de remplir étape 2.4.
    2. Lavage d’anticorps primaire teinté d’échantillons par centrifugation à 751 x g pendant 5 min (4 ° C).
    3. Retirez le surnageant par décantation et Resuspendre le culot dans 100 µL de tampon de FACS.
    4. Ajouter un anticorps secondaire conjugué à tous les échantillons nécessaires et incuber 30 min à 4 ° C. Passez à l’étape 2.5.
  5. Après incubation de l’anticorps, ajouter 2 mL de tampon de FACS froid glace puis granules des cellules à 751 x g pendant 5 minutes (4 ° C). Décanter le liquide surnageant et veillez à ne pas déranger les granulés.
  6. Mélanger doucement les cellules puis remettre en suspension avec 200-400 µL de tampon de FACS, puis gardez cela à l’obscurité à 4 ° C jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux standard ou le tri des cellules.
  7. Pour la fixation à court terme de cellules colorées, passez à étapes 2.8 à 2.10. Utilisez la fixation pour cytométrie standard seulement.
  8. Immédiatement après étape 2.5, remettre en suspension les cellules dans 0,5 mL de paraformaldéhyde à 2-4 % (PFA) pour 15-30 min à 4 ° C.
    NOTE : Attention : PFA est un irritant connu avec effets cancérigènes et toxiques. Lorsque vous utilisez PFA, traiter avec un soin extrême. N’oubliez pas d’utiliser l’équipement de protection individuelle approprié et d’aspiration localisée.
  9. Après fixation, laver les cellules en ajoutant 2 mL FACS d’un amortisseur à tous les échantillons et centrifuger à 751 g à 4 ° C pendant 5 min. Retirer surnageant suivante centrifugation.
  10. Remettre en suspension les cellules fixes dans 200 µL de tampon de FACS froid glace et conserver à 4 ° C. Fix de magasin cellules jusqu'à 1 semaine à 4 ° C, idéalement faire acquisition de cytométrie de flux dans les 48 heures afin de minimiser l’autofluorescence.
  11. Acquérir les données de cytométrie de flux selon les instructions du fabricant cytomètre en flux ou effectuer fluorescent cellulaire activé tri tel que décrit par Ben Ali et al.. 23

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Representative Results

Lorsque vous utilisez la souris C57BL/6 (ApoE KO) (BL6) déficientes en apolipoprotéine E, soumis à une diète de haute graisse cholestérol élevé (HCHFD ou HCD) pendant 18 semaines, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ de F4/80 macrophages aortiques peuvent être isolés, lorsque les deux échantillons sont mis en commun. Les foies disséqués des souris nourries HFHCD ApoE KO, produit plus de 5 x 105 trier des cellules de Kupffer (qui dépend des temps de tri disponible). Quand à l’aide de régime riche en graisses (HFD) alimenté par des souris C57BL/6 type sauvage (WT), 5 x 105 à 1 x 106 résidents du tissu adipeux macrophages (ATMs) peuvent être triés de la fraction stroma vasculaire (SVF). Le nombre total mentionné des macrophages qui peuvent être triées à partir d’un tissu donné était suffisant pour effectuer l’analyse de l’expression génique par réaction en chaîne polymérase quantitative en temps réel (qPCR). Pour les tissus où le moins grand nombre de populations de macrophages est récupéré, tels que l’aorte, il est recommandé d’utiliser des co précipitants (glycogène, par exemple) et des précipitations durant la nuit lorsque isoler l’ARN est nécessaire pour ces analyses.

Ici, les effets des troubles métaboliques induite par l’alimentation sur le phénotype macrophage à l’aide de base flow cytometry, tri cellulaire activés par fluorescence (FACS) et tri post en aval des analyses sont affichés. Ces résultats corroborent les observations publiées antérieurement que les souris nourries une infiltration de pièce a augmenté HFD ou HFHCD des activés de façon classique (M1) macrophages dans les tissus affectés tels que l’aorte (Figure 1 b). Profitant de la cytométrie en flux, FACS et profil d’expression génique (par l’intermédiaire de réaction en chaîne polymérase quantitative (qPCR), le phénotype prédominant pour la tyrosine de récepteur de Ron kinase exprimant CD45+ + de F4/80 macrophages dérivés de les tissus prélevés chez les souris nourries à la diète a été observée. Ron exprimant le récepteur aortiques macrophages qui ont démontré un phénotype anti-inflammatoires ont diminué chez les souris nourries HFHCD (Figure 1 et D). Triée macrophages exprimant le récepteur de Ron dérivé arginase augmentation démontrée aortes digérées 1 expression de gène (Arg1), qui est un marqueur de macrophage M2 bien établi (Figure 1E). Les macrophages pro-inflammatoires qui ont été qualifiées de CD45+ + CD11c de F4/80+ ont augmenté dans les aortes isolées de souris nourries HFHCD (Figure 1 b et D). Caractériser les macrophages du foie-résident encore élucidé le phénotype dominant des sous-populations exprimant le récepteur de Ron (Figure 2 a). Les populations de macrophages pro-inflammatoires CD11c + a démontré une diminution de l’expression de gènes qui sont fortement associées à un phénotype (M2) anti-inflammatoires tels que Arg1 et Ron (Figure 2 b). Des tendances similaires ont été observés dans les populations de macrophage isolées de digéré le tissu adipeux blanc (Figure 3). Population de macrophages avec une signature pro-inflammatoires a montré une diminution modelé du récepteur Ron (Figure 3). Combinant les approches, la cytométrie en flux de base et la FACS, a entraîné des données probantes qui valide également le récepteur Ron régulateur des alternatives (M2) activation de macrophages32. Cette partialité vers un phénotype (M2) anti-inflammatoire a été démontrée à jouer un rôle protecteur dans le développement et la progression de l’obésité, l’athérosclérose et stéatohépatite31.

Figure 1
Figure 1 : Caractérisation des macrophages isolés d’aorte dissocié retiré des souris ApoE KO maintenus sur un HCD pendant 18 semaines. (A) les cellules ont été tout d’abord bloquées sur CD45+ leucocytes, à l’exclusion des débris cellulaires. (B) CD45 coloration en conjonction avec F4/80 est utilisée pour délimiter les doubles populations positives présumées être des macrophages. Gating supplémentaires a été utilisé pour démontrer le pourcentage de CD11c+CD45+F4/80+ (M1) et Ron (C)+CD45+F4/80+ (potentiel M2) les macrophages dans les aortes provenant de souris se nourrissent soit un chow normaux ou régime riche en cholestérol pendant 18 semaines. (D) a augmenté le pourcentage de CD11c+CD45++ (M1) de F4/80 macrophages, ainsi que d’un pourcentage de diminution de Ron+CD45+F4/80+ (potentiel M2) les macrophages ont été observés dans les aortes dérivé de souris nourries HCD par rapport aux souris nourries avec un régime normal. (E) analyse d’expression génique de Ron trié+CD45+macrophages F4/80+ a démontré une expression accrue de l’arginase j’ai (un marqueur bien connu de la M2 murin). Les valeurs ont été obtenues par les analyses de test t de Student effectuée à l’aide du logiciel d’analyse statistique et représenté comme moyenne ± SEM. P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative (* P < 0,05, *** P < 0,001). La figure a été modifiée par Yu et al. (2016) 31. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : profil de transcription génique des populations de cellules de Kupffer triées des foies digérées disséqué des souris ApoE KO maintenus sur un HCD pendant 18 semaines. (A) régime de blocage général pour caractériser et tri des populations de cellules de Kupffer. (B) analyse l’expression génique de Ron exprimant (Ron+) trié et non exprimant (Ron) CD45++ de F4/80 macrophages par RT PCR quantitative. Analyses de test t de Student ont été effectuées à l’aide de logiciels statistiques et valeurs étaient représentés comme moyenne ± SEM. P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative (* P < 0,05, *** P < 0,001). La figure a été modifiée par Yu et al. (2016) 31 . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Caractérisation des guichets automatiques isolée du tissu adipeux blanc disséqué des souris WT BL6 nourri un HFD pendant 18 semaines. Régime de blocage général (A) pour la caractérisation et le tissu adipeux de tri dérivé des populations de macrophages (B) pourcentage de Ron + cellules CD45++CD11c de F4/80et CD45++CD11c de F4/80+ des populations de macrophage triées de WAT. La figure a été modifiée par Yu et al. (2016) 31 . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Modèles de trouble métabolique induite par l’alimentation qui imitent des co-morbidités telles que l’athérosclérose, la stéatose simple, stéato-hépatite et diabète de type 2 sont largement utilisés pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents de la progression de la maladie. La charge digestion de collagénase est souvent utilisée pour dissocier les tissus pour libérer les cellules de la matrice extracellulaire (ECM)16,27. Enzymes comme la collagénase perturbent le collagène qui fournit un soutien structurel pour les cellules voisines. La composition structurelle des tissus dicte la rigidité de matrice tissulaire (résistance à la déformation) et quel produit de collagénase est plus efficace pour assurer le succès ECM perturbation28. WAT, qui est composé de « matrice doux » est souvent assimilée avec collagénase de Type II pour libérer les adipocytes et les cellules immunitaires résidents tout en conservant en même temps l’intégrité de la cellule de récepteurs d’insuline surface29. La microarchitecture des composantes de l’aorte fibrille contribue à la « matrice rigide », pour lequel efficace digestion aortique avec type XI de la collagénase (qui a la plus forte activité de la collagénase) est utilisée en combinaison avec d’autres enzymes. Contrairement à l’aorte, la digestion foie utilise une collagénase avec une plus faible activité enzymatique, collagénase de Type IV, de perturber la matrice et de libérer des cellules parenchymateuses et non parenchymateuses viables30. Tissus chroniquement enflammés dérivé alimenté par régime alimentaire de type sauvage ou déficientes de l’apolipoprotéine E (ApoE KO) de souris sur un C57BL6 fond souvent subir une retouche qui peuvent empêcher une bonne digestion enzymatique. Cet article discutera des stratégies afin de réduire et/ou d’éliminer la possibilité de dissociation tissu impropre et récupération cellulaire faible.

Une caractéristique commune des tissus provenant de modèles de souris nourris à la diète qui imitent l’obésité, l’athérosclérose, et/ou stéatose hépatique non alcoolique, est le remodelage du tissu anormal. Dans le tissu adipeux blanc, l’aorte et le foie, ECM composition est modifiée, ce qui entraîne souvent des dépôts excessifs des composants tels que les collagènes fibrillaires. Type sauvage C57BL6 souris maintenus sur un régime riche en graisses pendant dix-huit semaines, expérience tissu-spécifique des anomalies telles que le tissu adipeux blanc élargi et agrandi foie gras (stéatose simple). Souvent ces caractéristiques métaboliques ne sont pas gênants obstacles à surmonter au cours du processus de dissociation tissulaire. En revanche, dans d’autres modèles de régime induit qui reflètent des phénotypes plus exacerbées, le vaste remodelage du tissu peut poser un problème lors de la digestion des tissus. HFHCD nourri de souris ApoE KO sont souvent utilisés pour modèle l’athérosclérose et la stéatose hépatique. Une caractéristique commune associée stéatohépatite avancé est le dépôt excessif d’ECM dans le foie (ou fibrose). Fibrose foie s’est avéré être très problématique au cours de la dissociation enzymatique tissulaire et produit souvent faible rendement31. Afin d’améliorer le rendement des cellules, il est essentiel que les protocoles de digestion suivie sans déviation. Bien que le foie normal peut être hachées et immergé dans un tampon de digestion pour atteindre la dissociation, perfusion avec tampon de digestion maximise le contact entre la matrice extracellulaire du foie et de la solution de collagénase ; et cette approche est donc fortement recommandée. En outre, 20-30 mL de tampon de la digestion est souvent un volume suffisant de dissociation réussie du foie normal ; Toutefois, en ce qui concerne les modèles de souris qui développent des foies élargies et/ou fibreuses, perfusion avec 50 mL de tampon de digestion est préférable pour assurer une bonne digestion tout en minimisant la mort cellulaire. Pour les foies avec des poids qui dépassent considérablement 1,5 g, augmentant le volume de tampon de digestion est recommandée pour garantir une digestion efficace.

Tissu Problème Raisons possibles Solution
Tissu adipeux blanc (WAT) Dissociation cellulaire pauvre Mauvaise Digestion Assurez-vous que le tampon de digestion est à 37° C
Mort cellulaire Digestion de collagénase excessive Réduire le temps de digestion
Réduire le volume de tampon de digestion
Aorte Dissociation cellulaire pauvre Mauvaise Digestion Assurez-vous que le tampon de digestion est à 37 ° C
Aorte morceaux dans un tampon digestion étaient trop gros S’assurer que l’aorte est coupé en morceaux de 1 mm environ
Morceaux de l’aorte ne tremblaient pas dans le tampon de dissociation durant l’incubation N’oubliez pas les pièces de l’aorte tremblent dans la solution de digestion
Mort cellulaire Digestion de collagénase excessive Réduire le temps de digestion
Réduire le volume de tampon de digestion
Foie Dissociation cellulaire pauvre Mauvaise Digestion Assurez-vous que le tampon de digestion est à 37 ° C
Augmenter le volume de tampon de digestion
Une mauvaise canulation de l’IVC (gonflement des tissus qu'environnant IVC se produit) Veillez à ce que l’aiguille est correctement insérée dans la VCI
IVC rupture Aiguille bien sûre à IVC avant la perfusion
Réduire la vitesse de perfusion
Rupture des tissus Réduire la vitesse de perfusion
Mort cellulaire Une mauvaise sortie de cellules de capsule de la Glisson N’oubliez pas de dissocier les cellules à l’aide de capsule évoquées précédemment caressant méthode
Digestion de collagénase excessive Réduire le temps de digestion
Réduire le volume de tampon de digestion

Tableau 3 : Dépannage dissociation tissulaire infructueuse. Flow cytometry basé cellulaire tri ou FACS est une technique puissante pour isoler des populations de cellules où haute pureté est une nécessité. Lors de l’épuration des cellules par un tri de la cellule, parvenir à rendement élevé de cellulaire, mais aussi une sorte de grande pureté exige en utilisant les stratégies appropriées de tri. Dans cette section, méthodes visant à améliorer les multi-fluorophore flow cytometry-base cell tri du tissu des macrophages résidents provenant de souris nourries à la diète sont décrites. Pour l’isolation de tissus distincts de macrophages résident, sélection des marqueurs de surface est une étape cruciale. Les macrophages dérivés de WAT, aorte et du foie sont souvent distinguent au moyen d’un CD45+, CD11b+, F4/80+ stratégie de blocage. Panneaux de cytométrie en flux supplémentaire peut servir à identifier les résidents macrophages tissulaires. Ces comités comprennent des anticorps qui la sonde pour l’expression en surface des macrophages glycoprotéines spécifiques (CD64 CD68, complexes et CD14), majeur d’histocompatibilité (MHCII) et apoptose cellulaire tyrosine kinase des récepteurs (MerTK)32, 33. phénotype macrophage spécifique peut alors être délimité par sondage pour l’expression en surface sélective de M2 (CD163, CD209 et CD206) ou marqueurs (CD38, CD40, CD80 et CD86)34,M135. Auto-fluorescence générée par les macrophages chargés de lipides peut présenter certains problèmes lorsque blocage des populations. En utilisant des anticorps tag fluorochromes qui sont excités par le laser jaune-vert (par exemple, PE, PE/Cy5, PE/Cy7) ou laser rouge (telles que APC, APC Cy7) se traduit par fluorescence émise nettement plus brillante que l’auto-fluorescence et donc peut améliorer résultats36. Quand choisissant fluorophore conjugue avec tel chevauchement de spectres d’émission index et potentiel coloration haute, inclusion de contrôles appropriés est essentielle. Lors de l’identification des bornes limites, inclusion des contrôles de l’unique tache (SS) et isotype contrôles permettent la délimitation des populations positif/négatif et la mesure du signal de fond non spécifiques causée par des anticorps primaires, respectivement 37. dans des circonstances où les cellules sont rares, nous recommandons l’utilisation de particules de compensation pour les SS et isotype contrôles. Particules de compensation généralement émettent des signaux plus lumineux que les contrôles biologiques et ont moins variance en fluorescence de fond. En outre, fluorescence moins un contrôles (FMO) sont idéales pour tracer des limites de blocage. En incluant des contrôles de la FMO, la fluorescence maximale attendue pour un sous-ensemble de coloration se révèle dans un canal donné lorsque l’anticorps marqués fluorochrome spécifique pour ce canal de fluorescence particulière est exclu38. Dans notre expérience, en plus des contrôles de particule unique compensation tachée, un contrôle sans coloration comparaison biologique doit être inclus pour fixer des limites plus précises de positif/négatif.

À l’exclusion des débris cellulaires et des agrégats de cellules dans la stratégie de blocage, c’est aussi une approche supplémentaire permettant de minimiser les auto-fluorescence. Pour distinguer les débris cellulaires de la population de cellules viables, à l’aide de forward scatter (FSC) et la diffusion latérale (SSC) est la stratégie de blocage plus courante. Pour les cellules isolées qui seront utilisés pour les analyses de type post et exigent plus de viabilité pour les extractions d’ADN/ARN, il est recommandé que les taches de viabilité ne pas servir avec toute procédure de fixation et/ou perméabilisation. Formaldéhyde de fixation des cellules peut compromettre l’intégrité de l’acide nucléique à cause des acides nucléiques-protéines de réticulation et limiter l’efficacité de l’isolation, la détection et la quantification précise. Agrégats cellulaires comme mentionné précédemment ne peut pas seulement contribuer à signaux auto-fluorescent émis, mais aussi entraîner dans « abandons de coïncidence ». Cette action se produit afin de maintenir le haut degré de pureté dans une sorte mais si trop fréquente, elle réduit le rendement des cellules triées. Tri buffer (tampon de FACS) additionné de DNAse et MgCl2 au cours de la coloration de la cellule peut réduire l’agrégation cellulaire. Il est recommandé de ne pas utiliser de EDTA en combinaison avec la DNAse car elle inhibe l’activité de l’enzyme. Filtrage de la suspension cellulaire unique à travers un tamis de cellule de 70 µm avant tri peut aussi libérer cellules d’agrégats. Il est impératif de noter que, pour minimiser l’agrégation, des suspensions cellulaires devraient être à une concentration de 5 millions de cellules / mL dans un volume minimum de 0,4 mL. Les cellules isolées de tissus adipeux chargé ont tendance à être plus sujettes à l’agrégation et cela peut entraîner une coïncidence abandons et le tri faible rendement. Il est recommandé que les échantillons sont plus dilués si agrégation persiste. Macrophages triés peuvent être collectées dans les tubes de prélèvement de fond rond polypropylène contenant fœtal bovin milieu riche afin de maximiser la récupération de la cellule. Une forte concentration de FBS initiale assure cellule récupération puisque la concentration devient éventuellement diluée avec chaque gouttelette triée. Pour prélever des cellules qui seront utilisés pour l’analyse d’ADN ou d’ARN, les cellules peuvent être triés directement dans le réactif d’extraction appropriée (p. ex. TriZol) pour prévenir la contamination de la RNAse. Lors du tri des volumes élevés, tri des cellules dans des milieux de culture supplémentés avec des concentrations plus faibles de FBS, est recommandé. Immédiatement après tri, cellules devraient ensuite être granulées et lysées pour extraction de l’ADN/ARN. Le matériel génétique isolé peut ensuite être profilé pour l’expression des gènes altérés. Les gènes pro-inflammatoires dont TNFα, il-1β, IL-6, IL-12, 1L-23, IFNγ, Nos2 et MCP1 (CCL2) sont souvent surexprimés dans les macrophages présentant un classiquement activés du phénotype (M1)39. En revanche, alternativement activé phénotype (M2) dans les macrophages est souvent marquée par l’induction de gènes codant pour la Chi3l3 (Ym1), Fizz1, 1 de l’Arginase, CD206, CD163, CD209 1L-10 et TGFβ34,40. Récemment, CD38 Fpr2 et Gpr18 ont été validés comme les gènes spécifiques M1 et c-Myc et Egr2 comme M2 propres gènes34.

Bien que multi-color flow cytometry-base cell tri est un outil précieux pour isoler les macrophages à haute pureté, cette approche peut être coûteuse. Les avantages puissants de FACS médiée par tri dépendent du personnel d’exploitation qui peut manoeuvrer un trieur de cellules, en plus du coût élevé des réactifs de maintenance pour le trieur cellulaire. Approches alternatives peuvent être utilisés en substitut de coûteux écoulement cytometry basé cellule Tri. Elles incluent magnétique cellulaire activé tri (Mac) ou centrifugation en gradient de densité. La première cellule de rechange tri méthode mentionné englobe magnétique et/ou faisant colonne isolement kits pour séparer les cellules d’intérêt du sang ou des tissus solides41. La deuxième cellule Tri approche sépare une suspension de cellules hétérogènes basée sur la densité et la force de la centrifugation. Malheureusement, la densité médiée par centrifugation n’est pas pratique pour isoler les macrophages des suspensions de cellules du même dérivés aorte ou WAT. Souvent, le produit obtenu par centrifugation différentielle est contaminée et de faible rendement. Par conséquent, les tissus plus petits (comme l’aorte ou WAT) qui donnent lieu à quelques cellules initialement après digestion enzymatique ne sont pas des candidats idéaux pour la centrifugation différentielle. En revanche, des suspensions de cellules dérivées de foies dissociés peuvent produire un nombre suffisant de macrophages triés qui peut être utilisé en poste tri expérimentations et analyses telles que les stimulations de la culture, qPCR ou analyse épongeante occidentale. Ces approches alternatives permet également d’enrichir les populations avant FACS, permettant des sortes plus propres. À noter, les résidents macrophages tissulaires composent un petit pourcentage de la population de toute cellule en WAT, le foie et l’aorte. Enrichissement des cellules avant FACS Trier a été une approche utilisée lors de l’isolement des populations de cellules qui sont moins fréquentes. Une question qui est fréquente chez les petites populations d’isolement est cette cellule grande nombres doit être traité pour obtenir suffisamment de cellules pour une analyse ultérieure. Enrichissement ou tri préalable permet de résoudre un tel problème. Cette méthode aide à obtenir une population plus concise des cellules par le biais de sélection positive et négative, mais elle permet également conservation du temps comme FACS Trier peut être un processus durable pour les sources de tissus denses tels que le foie.

Les progrès récents en biologie de l’inflammation soulignent l’importance de la caractérisation phénotypique et fonctionnelle de l’hétérogénéité des macrophages à mieux comprendre le rôle complexe de ces cellules immunitaires dans la régulation de l’inflammation chronique. En bref, ce protocole complet fournit une approche multidimensionnelle pour caractériser les macrophages résidents provenant de tissus de marque trois étudiés en régime établi induites par l’obésité et les modèles de l’inflammation des tissus. Plus important encore, ce protocole prend en compte la difficulté et les mesures nécessaires pour isoler propre single des suspensions cellulaires de dysrégulation inflammation des tissus tels que WAT, plaques aortiques et foies gras. Le protocole permet au chercheur d’appliquer la cytométrie en flux et outils de tri FACS dans une dimension novatrice pour caractériser les macrophages résident tissulaires, régulateurs clés de l’inflammation dans l’obésité. Caractérisation approfondie de la dynamique de population de macrophages peut donnent un aperçu de monocyte traite des tissus enflammés et permettent des évaluations mécanistes continues à travers une multitude d’approches expérimentales sur les macrophages triées. Une caractérisation plus poussée des populations de macrophages peut fournir un aperçu essentiel sur les fondements biologiques qui régissent l’hétérogénéité des macrophages dans la santé et la maladie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le Flow Cytometry Core Facility à The Pennsylvania State Université millénaire Science complexe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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