Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Huang, J., Gali, H., Gichimu, J., Bellani, M. A., Pokharel, D., Paramasivam, M., Seidman, M. M. Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts. J. Vis. Exp. (122), e55541, doi:10.3791/55541 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA hasarı yanıt (DDR) yaygın olarak canlı hücreler lazer mikro ışın demeti radyasyonu ile indüklenen çift iplik kırılmaları (DSB'ler) çalışmalarında karakterize edilmiştir. DDR kol içi çapraz bağlantılar DNA (ICLs) de dahil olmak üzere kovalent DNA modifikasyonları bozucu sarmalı için, hem de tanımlanmamıştır. Biz canlı hücrelerin çekirdeklerinde, immunotagged psoralenler laser fotoaktivasyon tarafından lokalize ICLs tarafından uyarılan DDR, inceledik. yaklaşımlı dağıtım ve çoğaltma çatal karşılaşmalar hakkında temel sorulara cevap bulmak amacıyla, biz iki diğer teknolojilerle lazer yerelleştirme birleştirdi. DNA, elyaf genellikle kısa darbeler sırasında eklenen nükleosit analoglarının immünofloresansla replikasyon çatalları ilerleyişini görüntülemek için kullanılır. Immunoquantum noktalar yaygın tek bir molekül görüntüleme için kullanılmıştır. yeni bir yaklaşım ise, lazer lokalize ICLs taşıyan hücreler DNA lifler mikroskop lamı üzerine yayılır. Etiketlenmiş ICLs immunoquantum noktalar ve inci ile görüntülenirE arası lezyon mesafeleri tespit edilmiştir. ICLs ile Çoğaltma çatal çarpışmalar görülebilir ve farklı karşılaşma desenler belirlendi ve miktarı belirlenir.

Introduction

DNA, ek olarak, bu oksidatif metabolizma tarafından üretilen endojen radikal türleri tarafından saldırıya vb radyasyon, ultraviyole ışık, çevresel toksinler, yanma ürünleri gibi eksojen maddeler sürekli saldırı altındadır. Bunların hepsi, kimyasal veya fiziksel olarak DNA 1 bütünlüğünü bozmak için potansiyele sahiptir. genomunda pertübasyonlar lezyon onarımında yer alan proteinleri ve mikroRNA binlerce değilse, yüzlerce, DNA hasarına (DDR), bir işe ve post-translasyonel modifikasyonlar kaskadını aktive edebilirler, hücre döngüsü, apoptoz, yaşlanma ve inflamatuar yolların düzenlenmesi 2.

DDR hakkındaki bilgilerin çoğu DSBs ile çalışmalardan gelmektedir. Bunun nedeni canlı hücreler 3'te genomik DNA'da, sekans spesifik sonları dahil, sonları tanıştırmak için teknolojilerin kullanılabilirliği büyük ölçüde olduğunu. Buna ek olarak, propensitsonları y immünofloresansla görüntülenebilir DDR proteinlerin odakları indükleme, kinetik ve yanıt proteinlerinin gereksinimlerini tanımlanması için yararlı olmuştur. DDR eğitimi için anahtar teknolojilerden biri canlı hücreler 4 çekirdeklerinde bir "İlgi Bölgesi" içinde DSBs bir şerit yönlendirmek için (YG) bir lazer ışını kullanılır Bonner ve arkadaşları tarafından tanıtıldı. Aslında, onlar DDR proteinler Immünofloresan tarafından tespit edilebilir ki uzun bir odak oluşturdu. Bu lazer maruz bırakılmış hücreler içinde fosforile histon H2AX güçlü şerit (γ-H2AX) kendi gösterilmesiyle izah edildi. O zamandan beri, lazer yaklaşım DSBs tarafından uyarılan DDR sayısız çalışmalarda kullanılmıştır. Güçlü ve popüler ve dramatik immünfloresans görüntülerin kaynağı olsa da, lezyon kimlik kaygısı olmadan, gözlemlenebilir sonuçlar üretmek üzere en deneylerinde lazer yoğunluğu ayarlanır unutulmamalıdıryoğunluk ya da aralık. Gerçekten de, tahminler yapmak zor olabilir. Böylece büyük ölçüde lazerler 5 ile DNA içine lezyonların çokluğu rağmen göz ardı edilir. Bu literatürde 6'da birçok çelişkiler katkıda bulunur.

DSBs aksine, DNA'nın çoğu kimyasal modifikasyonlar, DDR proteinlerin ayrı kümelerle oluşumunu teşvik etmemektedir. Bu lezyon frekanslarının mevcut anlayış ışığında önemlidir. Kültürde insan hücreleri S fazında 7, 8, 9 sırasında büyük ölçüde oluşan hücre döngüsü başına 50 kadar DSBs, tabi olduğu tahmin edilmiştir. Daha az çoğalmayan hücrelerden oluşur. Bu hücre / gün 1, 10 başına binlerce olan nükleobaz kayıp veya değişiklik olaylarının sayısı ile tezat teşkil etmektedir. Böylece, en biliyorNispeten nadir bulunur ve bütünüyle çok daha yaygındır sarmal bozan lezyonlar, neden oldukları hakkında çok az olan olaylar neden olduğu DDR.

Genomik DNA modifikasyonları kovalent hücresel yanıtı hakkında sorulara cevap bulmak amacıyla, biz doğal DDR indüksiyon aktivitesine sahip bir helezon bozan DNA adükt ile çalışmak istediğini. Dahası, deneysel tasarım kolaylaştırmak ve yorumlama kimin giriş zamana göre kontrol edilen ve görselleştirme edilebilir niteliktedir edilebilecek bir yapıda ilgi için. Buna göre, psoralen dayalı bir strateji geliştirdi. siteleri: AT psoralenler de 5' TA lehine fotoaktif DNA araya karakterize edilir. nitrojen hardalları ve mitomisin C (MMC) uzun dalga UV (UVB) ışığa maruz sürece, DNA reaktif değildir gibi diğer çapraz bağlama maddeleri aksine. birleştirilmiş moleküller sarmal bozan içi çapraz bağlantılar üretebilme karşıt şeritler üzerindeki timin bazların (ICLs ile reaksiyona) 11. Deneylerde kullanılan trimetil psoralen ile en ürünleri oluşmadığı nispeten az monoadüktler içeren gruptan (% 10'dan az) oluşturulur ICLs, 12 ve bir iplik üzerindeki bitişik bazlar arasında şerit-arası çapraz bağları olan. bunlar sis-platin ve MMC gibi replikasyon ve transkripsiyon, psoralen ve diğer çapraz bağlama maddeleri, güçlü blok için, yaygın olarak kemoterapi kullanılır. Bu nedenle, psoralen bir helis bozan yapı ile DDR aktivasyonunu takip ve aynı zamanda klinik öneme sahip bir bileşiğin hücresel tepki ilişkin bilgi temin çalışmalar sağladı.

Bu trimetil psoralen digoksijenin (DIG) ile bağlantılı olduğu bir reaktif sentezlenmiş, bir bitki sterol memeli hücrelerinde bulunan ve sık sık bir immunotag olarak kullanılmaz. fotoaktivasyon şartı canlı hücrelerde çekirdek tanımlanan ROI içinde psoralen ICLs lazer ışığına (365 nm) ile konumlandırılmasına olanak vermektedir. Bunlar imm tarafından görüntülenebilirKazı etiketine karşı unofluorescence. DNA onarımı ve DDR proteinleri ICLs 13, 14 lokal lazer çizgili ortaya çıktı.

DSBs üretilmesi için kullanılan yüksek lazer yoğunlukları ile aktive DDR izole edilmiş ya da kümelenmiş hasar 15, 16 nedeniyle olabilir. Sonuç olarak, bu deneyden elde edilen sonuçlar ile ilgisi doğal lezyonlar, bu çok daha düşük bir konsantrasyonda meydana için, kesin değildir. DNA psoralen adükt sıklığı ve aralığı ile ilgili benzer soruları için, DNA elyaf teknolojisi 17 ve immunoquantum noktaların yararlandı. Kuantum nokta floresan boyalar daha parlak ve ışığa maruz kalma ile ağartılmış değildir. Bu nedenle sık sık, tek molekül görüntüleme 18 için kullanılan bir uygulama olan floresan boyalar yeterince parlak. Bireysel DNA lifler g üzerinde gerilebilirkız slaytlar ve hasat hücre önce inkubasyon sırasında dahil nükleosid analogları karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Biz Dig-psoralen ile hücreleri tedavi ve lazer mikro ışınımına yatırım getirisi teşhir etti. Elyaf immunoquantum noktalarla görüntülenebildi hücrelerin ve tek tek Dig-psoralen adüktleri hazırlanmıştır. nispeten kısa sürelerde (20-60 dakika), nükleozid analogları ile hücrelerin maruz lazer lokalize ICLs yakın çoğaltma yolları görüntü ile birlikte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dig-TMP hazırlanması 1.

  1. 50 mg (0.18 mmol) 8-trımetılpsoralen'dır 4'-klorometil-4,5' , ve bir kuru 25 mL'lik yuvarlak 590 mg (2.7 mmol) 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanedi-amin karıştırın nitrojen altında bir şişeye -Dip. 12 saat için 10 ml toluen ve geri akış ekleyin. Indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın.
    1. Silika jel üzerinde flaş kolon kromatografisiyle artığı arıtın. (: 1: 0.5, 9), kloroform, metanol ve% 28 amonyak çözeltisi ile sütun elute. düşük basınç altında bir döner buharlaştırıcı çözücü buharlaşır ve geri saf 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5', 8-trımetılpsoralen'dır yapışkan sarı bir soluk sıvı.
    2. 4, 5.5 mg (0.012 mmol) karıştırın '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5', digoksigenin NHS ester 5 mg (0.008 mmol) içindeki bir 8-trımetılpsoralen'dır azot altında kuru bir yuvarlak dipli şişeye. 0.5 ml susuz dimetil formamid ekleme (DMF) bird trimetilamin 3.4 uL, 18 saat boyunca 50 ° C'de karıştırın.
    3. indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın.
    4. diklorometan minimum miktarda tortu çözülür. yatay bir durağan faz olarak silis jeli ile hazırlayıcı ince tabaka levhasının alt kısmı boyunca 2 uL noktalar çözelti uygulanır. metanol: kloroform içinde hazırlayıcı TLC çalıştırın% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1).
    5. dikey kenarlarda hariç plaka Maske ve kısa dalga boylu UV 254 nm lambası ile ürünün bandını belirlemek. Bir spatula ile plakadan kazıyın ve ürün kloroform kullanılarak saf ürün izole: metanol:% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1) karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
    6. indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içinde çözücüleri çıkarın. % 50 1 mL EtOH içinde kalan pelet çözülür: H2O, tüm solvent (~ 3 saat) buharlaştırılır kadar bir santrifüjlü buharlaştıncı içerisinde 1.5 ml tüpler (~ 20 kısımlar) ve kuru 50 uL'lik bölümler halinde dağıtmak.
    7. Bir santrifüjlü buharlaştıncı içerisinde yeniden H2O ve kuru:% 50 EtOH, 200 uL, her bir kısım yeniden çözündürülür. % 50 EtOH 200 uL yeniden her kısım çözülür: H2O, uzun süreli depolama için -20 ° C 'de santrifüj buharlaştırıcı ve mağaza peletler kuru.
  2. H2 O, 1 hazırlayın: H2O içinde çözülmüş Dig-TMP 100 seyreltme ve 250 nm 'de OD ölçümü kullanmak için,% 50 EtOH 50 uL pelet çözülür. Dig-TMP ekstinksiyon katsayısı 25.000'dir. -20 ° C'de muhafaza edildiğinde çözeltisi yaklaşık bir ay boyunca stabildir. Her kullanımdan önce, 250 nm 'de OD ölçümü ile konsantrasyonunu kontrol edin.
    1. Stok konsantrasyonu hesaplanır: Abs x 100 x 10 (uM olarak) 6 / 25,000 = Konsantrasyon. Tipik olarak, stok çözeltisi, yaklaşık 3 mM'dir. Ortama ilave EtOH hacmini en aza indirmek için, bu aralık içinde olması önem taşımaktadır.

2. Lazer Lokalize Dig-TMP ICLs

  1. peBir SRS azot lazeri (337 nm) ile bir eş odaklı mikroskop ile rform lazer lokalizasyonu 365 nm'lik bir çizgi yayan ve 0.7 nW bir güç ile, 10 Hz, 3 ns darbeleri ateşleme bir boya hücresi içinden pompalanır.
  2. 35 mm cam tarafında dikey bir işaret koyun bir işaret kalemi ile hücre kültür çanağı tabanı. Bir elmas kalem ile kültür yüzey üzerinde cam merkezinde bir çapraz kaşı bu çanak tarafındaki siyah şerit çapraz bir kol üstünde olduğundan emin olun. Bu ve hücreler aynı odak düzleminde olacak şekilde enine cam büyüme yüzeyi üzerine işaretlenir.
  3. % 70 EtOH durulama ile işaretlendikten sonra plaka sterilize edin. Hücreleri kaplama önce kuru.
  4. ortada plakası hücreleri (örneğin, HeLa veya U2OS gibi standart laboratuar suşları) bir ya da iki gün önce kültür kaplarına oldu. Hücre aktif olarak bölünen ve deney günü% 50-70 konfluent olmalıdır. eşit etiket DNA 1 uM 5-kloro-2-deoksiüridin (CldU) ile 24 saat inkübe edin.
  5. Eklemek% 50 EtOH Dig-TMP: 20 uM nihai konsantrasyona kadar hücre kültürü ortamına H2O. 37 ° C'ye kadar ortam getirin. Inkübatörde hücre ve yer üzerinde orta değiştirme (37 ° C,% 5 CO2) 30 dakika Dig-TMP dengeye gelmesine izin vermek için.
  6. Hücreler kuluçka iken, lazer aktif olduğu görüş alanının x / y koordinatlarını belirlemek. Lazer, yatay ve diyagonal bir hat boyunca yansıtılmış cam slayt etch yazılım tarafından yönlendirildiği üreticinin kalibrasyon prosedürünü izleyin. iki satır lazer hedef grev hangi alanın sınırlarını tanımlar.
  7. Mikroskop sahnede kontrol CO2 ve nem ile 37 ° C 'de, çevre odasında plaka koyun ve çapraz kesiştiği 60X yağa amacı ile odaklanır.
  8. yazılım şekil aracıyla araştırmacı tarafından kurulmuş bir ROI, 365 nm lazer ışını doğrudan, 3 ve bir şerit oluşturmak üzere# 181; 0.6 um mx. ROI anahat haç kesiştiği hemen yakınında bulunan hücrelerin çekirdeklerinde imleç tarafından yerleştirilir. çekirdek boyunca lazer yarıda hedef z odak düzlemi ayarlayın. 350-370 nm aralığında bir lazer kullanın. 405 nm lazer çapraz bağ 19 neden olamaz.
    NOT: diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntülemede nükleolazma ayırt edilebilir nükleol dışında nükleoplazmik alanlarda yatırım getirisini bulun.
  9. Bir hücreyi (hücre karartmak ve ardından kaybolur) yoketmek için yeterli bir seviyeye güç ayarını artırarak lazer odak ve aktivitesini kontrol edin. Bu mikroskopta ve sonra lamel içinden ve hücrelere lazer için engelsiz bir ışık yolu için önemli bir tanı olduğunu.
    1. psoralen ve ICL uyarılan DDR (bu her lazer / mikrofon için ampirik olarak tespit edilmelidir aktive etmek için yeterli güç ayarını düşürünroscope kombinasyon). (Γ-H2AX oluşumu ile izlenmiştir) psoralen yokluğunda DDR aktif olmayan bir lazer yoğunluğu ayarını (burada% 1.7) kullanın.
      NOT: Bu önemli bir belirlenmesidir ve lazer kaynağı veya ışık yolu bir bileşen değiştirilirse ayarlarının yapılmasını gerektirebilir. GFP birikimi lazer psoralen çizgili tür hızlı bir şekilde (saniye olarak) ortaya çıkar, her ikisi de XPC veya OPT_FAN1 gibi tamir etiketli proteinlerin izleyin, ancak tek başına lazer maruz ROI için değil. Birkaç dakika diğerleri için gerekli olabilecek iken DDR Bazı proteinler, saniyeler içinde görünür. Ilgi her protein için zaman ders saptamaları yapmak gereklidir. Biz de lazere maruz kalmamış hücrelerden yanıt proteinlerin hiçbir çizgiler olduğunu unutmayın.
  10. Bir alandaki tüm hücreler haç kesiştiği yakın kalarak hareket ettiremeyecek yeni bir alana plaka hedeflenmiş sonra.
  11. deneylerde unsurlar için tasarlanmışarası lezyon mesafelerin dağıtım kesişme 20-25 alanları (4-5 hücre / görüş alanı), lazere hücreler maruz ine. lokalize ICLs yakın çoğaltma kalıpları analiz etmek için lazer atışı sonrasında 10 uM 5-İyodo-2-deoksiüridin (DUK) ile hücrelerin inkübe edin.
    NOT: DUK ile inkübasyon süresi biraz keyfi olduğu. Bu, 20 dakika kadar kısa ve en fazla 60, min (aşağıya bakınız) olarak kullanılmıştır. Daha uzun bakliyat (birkaç saat) genellikle böylece görüntüye tek çatal ilerlemesini fırsat kaybediyor, kaynaştırma çoklu çoğaltma yolları ile sonuçlanır. Bazı deneylerde, ces çoğaltma yolları darbe etiketleme ve ardından Dig-TMP maruz bırakılmadan önce etiket DNA muntazam üzere 24 saat boyunca CldU ile etiketlenmiştir.

3. Hücreleri hasat ve DNA Liflerin germe

  1. Sahneden plaka çıkarın orta kaldırmak ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanır. PBS çözüm çıkarın. Ticari bir tripsin 10 mcL damla yerleştirin/ Cam yüzeyinin ortasında çapraz kesişme EDTA çözeltisi.
  2. Oda sıcaklığında (RT) 3-4 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra pipet ucuna müstakil hücreler tripsin solüsyonu çizin. tripsin nötralize etmeye gerek yoktur.
  3. bir silanize cam mikroskop lamı bir ucunda hücreler tripsin / EDTA damla yerleştirin. Hücreleri, ve kurumaya havuzun çevresini sağlayan,% 0.5 SDS çözeltisi 10 uL eklenmesiyle DNA'yı serbest bırakmak ve pipet ucu ile hafifçe karıştırılarak oda sıcaklığında 3-4 dakika inkübe edilir.
  4. slayt eğin 20 ° ve sıvı aşağı ucuna çalışmasına izin verir. DNA, lifler akan sıvının hidrodinamik kuvvetler tarafından gerilir / uzatılır. Slaytlar kuru hava (yaklaşık 10 dakika) izin 3 düzeltmek: 10 dakika için 1 metanol / asetik asit. Tekrar düzeltme çözümü ve kuru hava slaytları çıkarın. Bu noktada, -20 ° C'de% 70 EtOH içinde süresiz olarak saklanabilir. % 70 EtOH çıkarıldıktan NE önce kurumaya bırakınxt adım.
  5. PBS içinde slaytlar yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2.5 M HCl içinde denatüre. Bu işlem, DNA antikorlara dahil halojenlenmiş nükleobaz erişilebilir hale depurinates.
  6. 0.4 M Tris-HCI, pH 7.4 içinde kayar nötralize. PBS içinde iki kere yıkayın /% 0.5 Tween-20 (PBST) her biri 5 dakika için.
  7. Blok PBS içinde% 5 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 keçi serumu ile kayar. slayt üzerine eşit bir şekilde bloke çözeltisi yayılır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bir parafilm yavaşça slaytlar örtün.
  8. 1 pipetleyin 100 uL: sıçan anti-bromodeoksiüridin çözümü engelleme 200 seyreltme Her bir slayt, birincil antikor (özellikle CldU tespit eder). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada sürgü üzerinde eşit olarak seyreltme yayılmış ve inkübasyona bir parafilm yavaşça slaytlar örtün. parafilm çıkarın ve 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın.
  9. Her bir slayt çözüm engelleme: (1: 100) keçi anti-fare Alexa Fluor 647 seyreltilmiş pipetleyin 100 uL. KapakBir parafilm nazikçe kayar ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın.
  10. 200: seyreltilmiş (1:40) fare anti-bromodeoksiüridin pipetleyin 100 uL primer antikor ile ve tavşan anti-DIG antikoru (1 (. LDU ve CldU Bu çift özgüllük sıçan inkübasyondan önce anti BrdU ile CldU bloke gerektiren tespit eder) ) her bir slayta çözüm engelleme. bir parafilm yavaşça slaytlar kapatılır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın.
  11. Her bir slayt çözüm engelleme keçi anti-tavşan prob (örneğin, Qdot 655) (: 1: 100), keçi anti-fare Alexa Fluor 488 andC (5.000 1) ile seyreltildi pipetleyin 100 uL. nazikçe parafilm slaytlar örtün ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın.
  12. bir kağıt havlu üzerine aşırı PBST boşaltın. Her bir slayt üzerine antifade montaj orta 50 uL ekleyin ve bir lamel ile kaplayın. Görüntü veya mağaza için-20 ° C de bir fazla 48 saat.

Floresan mikroskobu ile 4. Fiber Görüntüleme

  1. FITC, Cy5 ve Q Dot 655 algılama ile ekli bir tam motorlu filtre çarkı ile bir inverted mikroskop ile 63X objektif ile görüntü alımı gerçekleştirin. Uyarma filtresi 425 nm ve emisyon filtresi emisyon tepe 20 ortalanan 20 nm ile 655 nm arasındadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Lazer lokalize Dig-TMP (Şekil 1A) ICLs psoralen ile bağlantılı Dig-etiketine karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Lazer, herhangi bir konturun bir alanda vurmaya yönelik olmasına rağmen, şeritler hücrelerde "doğal" biçimleri değildir ve yasal sinyalleri kolayca Primer ya da sekonder antikor ile spesifik olmayan bağlanma için eserler ayırt edilebilir. Mükemmel özgüllük daha az antikorlar kullanılırken bu özellik yararlıdır. Dig-TMP ICLs bir şerit DDR, y-H2AX iyi bilinen markeri, bir örneği Şekil 1 B 'de gösterilmiştir.

Dig immünofloresan adüktlerin sıklığı ve aralığı herhangi bir sonuç izin vermez lazer çizgili lezyon etiketli. yapmak için bu belirleme önce hücreler ICLs tanıtılması, 24 saat boyunca CldU ile inkübe edilmiştir. th karşı boyamae CldU Dig görselleştirme uzun lifler ile ilgili lezyonlar etiketli izin verir ve bu DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ya da YOYO {1,1' , direkt lekeleri daha net elyaf kalıpları elde edilir - (4,4,8 , 8-tetrametil-4,8-diazaundecamethylene) [4 - [(3-metil-benzo-1,3-oksazol-2-il) metiliden] -l, 4-dihydroquinolinium] bis tetraiyodid}. Lazer fotoaktivasyonu tarafından ICLs girişten sonra, lifler hedeflenen hücrelerden yayıldı. Örneğin, Şekil 2'de gösterilen gibi lifler üzerinde Dig sinyallerin analizi son yayın 21 de tarif edildiği gibi arası ICL mesafeler, daha büyük 160 kb'ye az 10 kb arasında değiştiğini ortaya koymuştur. kümelenmiş katkılar temin hiçbir kanıt yoktu. Böylece Kazı etiketi ve şerit DDR proteinlerinin birikimi şerit, uzatılmış DNA boyunca ölçüldüğünde en azından, iyi ayrılmış lezyonları yansıtmaktadır. 6 ile, nükleozomal diziler oluşan ICLs durumunda hücresel kromatin açısından bakıldığındauzatılmış DNA uzunluğu sıkıştırma kat, hala DNA'nın yaklaşık 1.6 kb eşdeğeri ile ayrılabilecektir.

Lazer neden olduğu DNA hasarına sahip Deneyler genellikle DDR indüksiyonunu takip edin. Bu deneyler nadiren DNA replikasyonu ile ilgili sorularını ilgileniyoruz. Öte yandan, bir DNA elyaf tahliller tipik olarak bir replikasyon çalışmaları için kullanılır. DNA içine dahil olarak halojenlenmiş nükleosid analogları sonuçların kısa darbeler hücrelerin maruz kalma. DNA liflerinin immünofloresan analizi son DNA sentezini temsil dahil analoglarının yolları ortaya koymaktadır. DNA replikasyonu ICL çizgili lokalize lazer meydana eğer sormak ilgi oldu ve eğer öyleyse ne ICLs civarında replikasyon desen olurdu? Hücreler, uzun liflerin bir görüntü olmasını kolaylaştırmak için CldU ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Lazer lokalize ICLs Idu 1 saatlik puls ve ardından hücrelere dahil edilmiştir. DNA, f Ibers hedef hücrelerden hazırlanan ve Dig ICLs ve görüntülenen çoğaltma yolları etiketlendi. Sonuçlar psoralen lazer aktivasyonu çoğaltma kapatmaya veya çoğaltma şekilleri sıklığını etkilemediğini göstermiştir. Kısa bir süre önce 21 gösterildiği gibi 1 çoğunluğu: çoğaltma 4 çift taraflı desenleri ile, bir tarafta meydana gelen ve aynı zamanda ICLs her iki tarafında.

Şekil 1
Şekil 1: Lazer Lokalize Dig-TMP ICLs üretilmesi. Dig-trimetil psoralen (A) yapısı. Lazer lokalize ICLs (kırmızı Dig) içeren YG γ-H2AX'e (yeşil) (B) Birikim. çekirdeği DAPI (mavi) ile boyandı. aydınlık fotoğraf elmas kalemle yapılan isabetli kısmen bir hücreyi gösterir. nükleollü ve bunların dışında ROI yerleştirilmesi unutmayın.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2: Lazer Lokalize Dig-TMP Sinyalleri DNA elyaflar. (A) Hücreler DNA işaretlemek için CldU ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra bir lazer lokalize ICLs tanıtıldı ve (B) hücreler hasat edilmiştir ve lifler yayıldı. (C, D) Dig sinyaller, bir immunoquantum nokta (kırmızı) ve immünofloresans (yeşil) ile CldU ile sergilendi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lazer lokalizasyon teknolojisi parlak alan mikroskopisi de görebilir çekirdekleri yapışan hücrelerin kullanımını gerektirmektedir. Böyle polilisin veya kolajen veya daha fazla kompleks karışımlar olarak hücre yapıştırma preparatları ile cam yüzeyine, örneğin primer lenfositler, ya da AD293 olarak gevşek bir şekilde yapışık kültürlenmiş hücreler gibi yapışmayan hücreler, takmak için çalışılmıştır. bu tedaviler yüzeye hücreleri bağlamak olsa bile, genellikle çok zor çekirdekleri içine odaklanmak için yapım yuvarlak kalmak görüyoruz. Bundan başka, hücrelerin çoğu büyüme ortamının ayrılmasından sonra ilk yıkamayı hayatta başarısız. Bununla birlikte, yapışkan hücreler için gereksinimi içinde, başarılı bu çalışmalar için standart hücre çizgilerinin geniş hem de esas hücreleri kullanılmıştır. Mikoplazma kontaminasyonu için test hücrelerine yararlıdır. Biz hücre yanıtları bu enfeksiyonların tarafından değiştirilmiş olduğunu bulmak.

lazerin odak düzlemi önemlidir. Amaç etmektirÇekirdek içerisindeki ICLs yerleştirin. Çok yüksek ve foto-aktifleştirme çekirdeği üzerinde olacak; çok düşük ve cama olacak. Biz yararlı sitoplazma ve çekirdekten kesiştiği DIC görüntünün odağını netleştirmek bulabilirsiniz.

Fiber tahliller zor değildir, ancak yorumlanabilir alanlar kurtarıldı önce biraz pratik gerektirir. Düzgün bu tekniği uygulamak için önemlidir. Lazer deneylerden kazanılan hücre sayısı düşüktür ve her bir örnek, bir, tek slayt üzerinde bütünüyle kullanılır. Numuneler, daha sonra analiz için saklandı alikotları ile, bölme edilemez Sonuç olarak, her bir deneyden elde edilen verimini maksimize etmek esastır. Ancak, olayların yüzlerce tek bir örnekten elde edilebilir. Prosedürün İki özellikleri merkezi öneme sahiptir. Bir slayt aşağı hücre lizatının akış oranıdır. Çok hızlı olursa, DNA'nın çok slayt kapalı çalışacaktır. cam slaytların kalitesi de önemlidir. Zaman zaman Receetkisiz bir sürü ive. Sonuç olarak her yeni lot kullanımdan önce test edilmelidir.

Vb ticari reaktifler-antikorları, immunoquantum noktalar güvenilirliği tüm laboratuar manipülasyonları için geçerli olduğu gibi, her zaman bir husustur. Bunlar hep stabil değildir ve deneysel başarısızlık genellikle bir ya da başka bir reaktif ile sorunlara kadar takip edilir. immunoquantum noktalar sorunludur, ve birden fazla çok kabul edilebilir bir tespit için test edilmesi gerekebilir. Etkisiz çok yüksek arkaplan sinyalleriyle işaretlenmiştir. Bu lifler ile ilişkili değildir ve herhangi bir DNA'ya sahiptir sürgünün bölgelere görülecektir.

O Bonner grubunun 4 ile tanıtılan bu yana yerel DNA hasarını tanıtmak lazerlerin kullanımı oldukça popüler hale gelmiştir. doğrudan DDR uyaracak şekilde olanlar ve en sonraki deneylerde lazer güç ayarlarını ayarlanır. Biz yeterince düşük suc ayarı gücünü kullanmış olanDDR aktivasyonu lazer ve psoralen hem bağlıdır h. Yukarıda ele alındığı gibi, psoralen adüktleri arasındaki ayrılma tek tek olaylara yanıt bakıyor iddia etmektedir. Endojen çapraz bağlama maddeleri ile oluşturulmaktadır ICLs sayısı bilinmemektedir birlikte, 6-8 saat (yayınlanmamış veriler) içinde psoralen ilave maddelerin kaldırmak mümkün olduğu gibi psoralen adüktlerin lokalizasyonu, hücreleri öldürmez olduğunu not edin ve mevcut ve sağlıklı, 24 saat sonra bulunmaktadır. Dolayısıyla bu yaklaşım daha az toksik çekirdek ve mitokondri içinde DNA hasarına tanıtmak ajanlara maruz gerektirir protokollere göre hücreler etmektir.

lazer / psoralen kombinasyonu DDR aktive bir sarmal çarpıtan yapısını tanıtmak. Bu bağlamda, bu yaklaşım elde edilen sonuçlar, ATM / DNAPK / ATR aktivasyonundan sonra, DDR basamaklı doğası göz önüne alındığında, helezon bozan lezyonların bir dizi için geçerli olduğu, 22. kinaz.Bu bağlamda, burada açıklanan DNA elyaf yaklaşım floresan ile görüntülenebilir immünolojik veya kimyasal veya biyokimyasal yollarla saptanabilir herhangi bir DNA yapısı genişletilebilir. UV içerebilir Bu 23, hacimli alkilatörler 24, G quadruplexes 25 ve oksidatif lezyonlar 5 PHOTOPRODUCTS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Bu araştırma (Z01 AG000746-08) ve Fanconi Anemisi Araştırma Fonu Yaşlanma üzerine NIH, Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digoxigenin NHS ester Sigma-Aldrich 11333054001
Chloro-psoralen Berry and Associates PS 5000
diaminoglycol Sigma-Aldrich 369519 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform Acros Organics 423550040
Methanol Fisher Scientific A4524
Ammonium solution Sigma-Aldrich 5002
TLC plates Analtech, Inc. P02511
Flass glass column 24/40, 100 mL Chemglass Life Sciences CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder Perkin Elmer With Volocity Software
Micropoint Galvo  Andor Technologies with a Nitrogen pulsed laser 
dye cell Andor Technologies MP-2250-2-365
365 dye Andor Technologies MP-27-365-DYE
IdU  Sigma-Aldrich 17125
35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated Matek P35G-1.5-10-C
microscope slides New Comer Supply Part # 5070 New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU) BD Biosciences 347580 1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU) Abcam ab6326 1 in 200 
Rabbit anti Dig antibody ThermoFisher Scientific 710019 1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG ThermoFisher Scientific Q-11421MP 1 in 5,000
AF647- goat anti Rat IgG Jackson Immunoresearch 112-605-167 1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-545-166 1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200 Zeiss  with Axiovision software
Q-dot 655 filter Chroma 39107

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55, (30), 8528-8534 (2016).
  2. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
  3. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3, (5), 915-922 (2008).
  4. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
  5. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
  6. Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
  7. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
  8. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
  9. Aguilera, A., Garcia-Muse, T. Causes of genome instability. Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).
  10. Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120, (1), S130-S145 (2011).
  11. Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
  12. Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
  13. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
  14. Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284, (41), 27908-27917 (2009).
  15. Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
  16. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
  17. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
  18. Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37, (5), 702-713 (2010).
  19. Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, (10), 4514-4518 (1992).
  20. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
  21. Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
  22. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
  23. Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
  24. Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
  25. Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics