Verwendung von außergewöhnlichen optischen Übertragung kardiale Biomarker in humanem Serum quantifizieren

Bioengineering

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Summary

Diese Arbeit beschreibt eine Nanoimprinting Lithografie Methode, um qualitativ hochwertige Sensoren Arrays zu fabrizieren, die auf dem Prinzip der außergewöhnlichen optischen Übertragung arbeiten. Der Biosensor ist kostengünstige, robuste, einfach zu bedienen und erkennt kardiale Troponin im Serum bei klinisch relevanten Konzentrationen (99th Perzentil cutoff ∼10-400 Pg/mL, abhängig von der Assay).

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Patra, A., Ding, T., Hong, M., Richards, A. M., Wong, T. I., Zhou, X., Drum, C. L. Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum. J. Vis. Exp. (130), e55597, doi:10.3791/55597 (2017).

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Abstract

Für eine Biosensoren Plattform für klinische Relevanz in den Point-of-Care (POC) Einstellungen haben sind Assay Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und zuverlässig überwachen Analyten vor dem Hintergrund von Humanserum entscheidend.

Nanoimprinting Lithographie (NIL) wurde verwendet, um zu einem niedrigen Preis zu fabrizieren sensing Bereichen so groß wie 1,5 x 1,5 mm. Die Sensorfläche wurde von High-Fidelity-Arrays von Aluminiummedien, jeweils mit einer Fläche von etwa 140 nm2gemacht. Die gute Reproduzierbarkeit der NIL machte es möglich, eine ein-Chip, eine Messung Strategie auf 12 individuell gefertigten Oberflächen mit minimalen Span-zu-Variation zu beschäftigen. Diese Nanoimprinted lokalisiert Surface Plasmon Resonance (LSPR) Chips wurden ausgiebig getestet auf ihre Fähigkeit, eine Bioanalyte bei Konzentrationen variierend von 2,5 bis 75 ng/mL inmitten der Hintergrund eines komplexen Biofluid-in diesem Fall, menschlichen Serum zuverlässig zu messen. Die High-Fidelity des NIL ermöglicht die Generierung von Großflächen Fernerkundung, die wiederum eliminiert die Notwendigkeit für ein Mikroskop, wie dieser Biosensor problemlos mit einer handelsüblichen Labor Lichtquelle verbunden werden kann. Diese Biosensoren erkennt kardiale Troponin im Serum mit einer hohen Empfindlichkeit auf eine Begrenzung der Nachweisgrenze (LOD) von 0,55 ng/mL, was klinisch relevant ist. Sie zeigen auch geringe Span-zu-Streuung (durch die hohe Qualität der Fertigung). Die Ergebnisse sind vergleichbar mit weit verbreitetes Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)-Assays basieren, aber die Technik behält die Vorteile einer LSPR basierende Sensor Plattform (z.B. Hilfsbereitschaft, Miniaturisierung und multiplexing, so dass es mehr machbar für POC-Anwendungen).

Introduction

Chemosensoren basierend auf Nanohole Arrays wurden Gegenstand zahlreicher Untersuchungen seit der erste Bericht über außergewöhnliche optische Übertragung (EOT) durch Ebbesen Et Al. 19981veröffentlicht wurde. Wenn Licht auf regelmäßige Anordnungen von Nanohole Strukturen der Sub Wellenlänge Dimensionen auftrifft, erfolgt die verstärkte Übertragung bei bestimmten Wellenlängen. Dies tritt auf, wenn das einfallende Licht mit Bloch-Welle Oberfläche Polariton (BW-SPP) und/oder lokalisierte Oberflächenplasmonen (LSP)2Paare.

Das zugrunde liegende physikalische Prinzip ausgenutzt, wenn Biosensoren mit solchen regelmäßigen Arrays einfach ist. Adsorption von Molekülen auf oder nahe der Oberfläche des Metalls ändert die Dielektrizitätskonstante des Mediums in Kontakt mit Metall, im Gegenzug verschieben die Lage der Übertragung Banden im Spektrum. Das Spektrum des Lichts kann durch Nano-Engineering die Form, Größe und Trennung Abstand3,4,5eingestellt werden. Standardmäßig haben Sensoren basierend auf EOT charakteristische Bands in ihren Spektren, die spezifische Aufgaben6,7,8 während der Untersuchung der molekularen Bindung Veranstaltungen zu erleichtern. Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber handelsüblichen Surface Plasmon Resonance (SPR) Plattformen.

Sensoren mit EOT in der Regel beinhalten eine Lichtquelle optisch ausgerichtet, so dass ein kollimierten Strahl auf die Sensorfläche ist. Techniken, um große Nanohole Oberflächen, wie Co-Polymer Vorlagen und Störungen und Nanosphere Lithografie, erzeugen haben schlechte Reproduzierbarkeit9. Aufgrund dieser Einschränkungen in präzise Herstellung große Flächen, die das EOT-Phänomen zu zeigen, wurde dem Lichtmikroskop erforderlich, um die Lichtquelle und Detektor richtig zu positionieren. Zur Vereinfachung der Technik, qualitativ hochwertige Nanoimprinting Lithographie wurde (NIL)10 eingesetzt. Dies ermöglichte die Produktion von großen Sensor Flächen11 (mm-Skala), entfällt die Notwendigkeit für ein Mikroskop zu suchen die Sensorfläche auf einem Chip. Stattdessen könnte dieser Sensor leicht mit einem standard-LWL-Kabel verbunden werden.

Da die Übertragung Gipfel für das Nanohole-Array in der sichtbaren Region Nah-Infrarot (NIR) enthalten sind, ist es perfekt geeignet, um verbindliche Veranstaltungen für Biomoleküle in einer wässrigen Umgebung spüren. Das erwartete optische Verhalten des Nanohole Arrays wurde simuliert. Das Ergebnis wurde dann durch Studien mit Flüssigkeiten der standard Brechungsindex (RI) überprüft. Dieses Array diente zur Messung der Konzentration des kardialen Troponin I (cTnI) die komplexen Hintergrund von Humanserum. cTnI ist der klinische Goldstandard für die Diagnose eines akuten Myokardinfarkts.

Mit diesem Sensor, ist es möglich zu erkennen und zu quantifizieren cTnI in humanem Serum an eine Grenze der Nachweisgrenze (LOD) von 0,55 ng/mL, was klinisch relevant ist. Die Erkennung ist viel schneller als die am häufigsten Technologie in diesem Bereich, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA verwendeten). Darüber hinaus kann die Sensorfläche leicht regeneriert und somit wiederverwendet werden. Daher zeigt diese Arbeit das Versprechen der Nanohole Arrays als tragfähige Point-of-Care (POC) Technologie für Biosensoren innerhalb komplexer auszahlt.

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Protocol

1. Herstellung des Sensors und der Erfassung der Daten

  1. Vorbereitung der Nickel-Form
    1. Mantel einer 220 nm dicke Schicht von negativen Elektronenstrahl widerstehen auf einem 600 µm dicken 4-in Silizium-Wafer. Schreiben Sie gestaltete Nanohole Array auf diese Wafer mit einem Elektron Lichtstrahl Lithographie System.
      1. Um den Elektronenstrahl schreiben zu beschleunigen, schreiben die Muster mit einer niedrigen man (N) von 20k für jeweils 300 µm Feldgröße (A) (d. h. es sind 0,4 Milliarden Punkte auf jeder 300 µm-2 -Gebiet abgebildet, und jeder Punkt wird entweder durch den Elektronenstrahl ausgesetzt sein, oder nicht Je nach Muster). Der Elektronenstrahl widerstehen Strahlendosis für Fotolack auf 110 µC cm−2 und schreiben bei einem Strom (I) von 800 PA.
        Hinweis: E-Beam schriftlich die Strahlendosis (D) wird gesteuert durch die Belichtungszeit für jeden Punkt (T-Punkt), berechnet, indem Equation 1 . Für die Strahlendosis bei 110 µC cm−2ist der Elektronenstrahl-Verweilzeit auf jeder exponierten Punkt 0,5 µs12. Da das Array eine Fläche von 1,8 mm2erfasst, gibt es insgesamt 36 Flecken von 300 µm2 Flächen in Form eines großen, goldenen Nanohole Array zusammen genäht.
    2. Entwickeln der Resist durch Eintauchen der 4 Zoll Silizium-Wafer in der Entwicklerlösung für 10 s und den Wafer an der Luft trocknen zu lassen.
    3. Hinterlegen Sie eine Samen-Schicht aus einem Metall wie Nickel, Kupfer oder Aluminium, auf dem Siliziumwafer.
    4. Galvanisieren Sie die Wafer in einem Überzug-System in ein Nickelbad Sulfamate. Die Galvanik in zwei Schritten durchführen. Verwenden Sie im ersten Schritt, dauerhafte 95 min. eine Stromdichte von 0,7 A dm−2; Dies erfüllt vollständig die Nanopatterns mit Nickel. Im zweiten Schritt, 125 min Dauer verwenden 12 A dm−2 , um 300 µm als die endgültige Nickel Schimmel Dicke zu erreichen (20 nm). Sicherzustellen Sie, dass der pH-Wert 3,5-3,8 ist und, dass die Temperatur bei 52-54 ° C.
    5. Trennen Sie die Nickel-Form von Silizium-Substrat durch sanfte mechanische Krafteinwirkung. Genießen Sie die Nickel-Form in etwa 100 mL positiven Photoresist Entfernung Reagenz über Nacht die Rückstände aus der e-Beam Resist abzuwaschen.
    6. Feed die Nickel-Form in einem Ofen und trocken es bei 100 ° C für 3 h reinigen in einem Plasma Ätzen System mit O2 Gas bei 10 Sccm und 100 Watt für 3 Minuten.
  2. Herstellung von gold Nanostruktur
    1. Mantel von 150 µL Heptadecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrodecyl Trichlorsilan (FDTS) auf der Nickel-Form in eine Selbstmontage Monolayer (SAM) Streichmaschine bei 80 ° C.
      Hinweis: Dies wird eine Antihaft-Schicht, die ermöglichen die Trennung der Form von den Fotolack ("Entformung") nach dem Abschluss der Nanoimprinting Schritt bilden. Die verdunstende Zeit sollte 180 s und die Reaktionszeit sollte 900 s.
    2. Impressum der Nanopatterns auf ein 4 - In-Glas-Wafer, die mit einer 300 nm dicke Schicht von Foto-härtbar Null überzogen wurde mit einer Nano-Imprinter bei einem Druck von 10 Bar und einer Temperatur von 40 ° C für 10 min widerstehen.
    3. Übertragen Sie den Schimmel, den Fotolack und Glas-Wafer auf eine UV-Lichthärtung System und lichthärtenden mit 75 mW cm-2 der UV-Exposition für 30 s.
      Hinweis: Wenn alle Schritte korrekt befolgt wurden, sollte die Nickel-Form leicht von den Fotolack auszuschmelzen.
    4. In eine reaktive Ionen Ätzen (RIE) System, führen Sie eine leere Ätzen der Fotolack auf dem Glassubstrat mit einem O2 Gasstrom von 10 Sccm, bei 50 W für 2 s, das Glas auf den eingerückten Bereichen verfügbar zu machen.
    5. Hinterlegen Sie eine 5 nm dicke Schicht aus Chrom (Cr) für Metall Adhäsion und einer 100-nm-Schicht aus Gold (Au) für den plasmonische Sensor auf dem Glas-Wafer in einem Elektronenstrahl Ablagerung-Maschine. Verwenden Sie eine Abscheiderate 1 Å s−1 für Cr und 2 Å s−1 für Au.
    6. Durchführen Sie Lift-off von der Fotolack durch O2 Plasma Ätzen für 3 min, gefolgt von einer 15-s Sonifikation Schritt in Aceton.
    7. Würfeln Sie die Probe in 5 mm × 5 mm Chips. Das Nanohole-Array wird die zentrale 2 mm × 2 mm des Chips zu besetzen.
  3. Erfassung der Daten
    1. Der Apparat für die optische Messungen so gestalten, dass ein Strahl von weißem Licht durch das Ende des Lichtleiters Sender kollimiert ist und auf die Sensorfläche (Nanohole Array) im 90 °-Winkel ist eingerichtet.
      Hinweis: Licht wird durch das ganze Nanohole Array übertragen.
    2. Das übertragene Signal mit der Empfänger-Lichtleiter zu sammeln und aufzeichnen mit einem UV-VIS-Spektrometer im Bereich von 300 bis 1000 nm.
    3. Legen Sie die Erfassungszeit für jeden Frame auf 20 Frau durchschnittlich 100 Bilder erhalten die endgültige Spektrum um den Lärm in den Messungen zu senken.
    4. Verwenden Sie Plotten Software zum Analysieren der Daten basierend auf der zuvor identifizierten Getriebe-Gipfel (mit einer Lorentz-basierte Methode).

2. Sensor Bulk Empfindlichkeitstest

  1. Zahlen Sie die standard-RI-Flüssigkeit auf der flüssigen Zelle, mit der RI variierend von 1,31 bis 1,39 ein.
  2. Tauchen Sie den Sensor-Chip in der standard-RI-Flüssigkeit und richten Sie sie mit dem Strahl des weißen Lichts. Erhalten Sie die Übertragungsspektrum.
  3. Reinigen Sie den Sensor-Chip nach jeder Messung mit einem oberflächenaktiven Reinigung Reagenz und trocknen Sie es mit Stickstoffgas.

3. Sensor Oberflächenmodifizierung

  1. Reinigen Sie vor jeder chemischen Modifikationen die Sensor-Chips durch sequentielle eintauchen in Isopropanol, Aceton und deionisiertes Wasser. Trocken bei Raumtemperatur in einem Strom von trockenem Stickstoffgas.
  2. Inkubieren Sie die Sensor-Chips in eine ethanolische Lösung von 0,4 mM 10-Carboxy-1-Decanethiol und 1,6 mM 1-Octanethiol für 12 h bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Dies wird bilden ein Amin-reaktive Selbstmontage Monolayer (SAM).
  3. Verwenden Sie Ethanol, gründlich abspülen und Trocknen bei Zimmertemperatur.
  4. Machen Sie eine Mischung aus 75 mM Sulfo-N-Hydroxysuccinimide (Sulfo-NHS) und 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC). Tauchen Sie die Chips in dieser Mischung für 15 Minuten.
    Hinweis: Dadurch wird die carboxylic Gruppe des SAM aktiviert.
  5. Vor Ort 50 µL 200 µg/mL Anti-Troponin Antikörperlösung gemacht in einem pH 4,5-Acetat-Puffer auf die Sensoroberfläche und 30 min inkubieren.
  6. Deaktivieren Sie die nicht umgesetztes Ester durch Eintauchen des Sensor-Chips in Ethanolamin-HCl-Lösung für 15 min. 1 M.
  7. Spülen Sie den Chip mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie ihn in einen Strom von trockenem Stickstoffgas bei Zimmertemperatur.

4. cTnI Assay

  1. Unspezifische Bindung durch spotting 100 µL einer 1 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung auf die Oberfläche zu blockieren.
15 min inkubieren.
  • Spülen Sie die Sensor-Chips dreimal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Legen Sie den Chip in der Messzelle, die Übertragungsspektrum aufzuzeichnen.
    Hinweis: Dies ist das Referenzspektrum.
  • 50 µL cTnI standard auf die Chipoberfläche zu erkennen und in einer feuchten Umgebung für 30 min inkubieren.
  • Spülen Sie der Sensorchips dreimal in PBS-Lösung und setzen Sie ihn in die Messzelle, die Übertragungsspektrum aufzuzeichnen.
    Hinweis: Dies ist das After-Bindung-Spektrum.
  • Tauchen die Chips in 50 mM Glycin-HCl (pH 2) für 1 min und dann spülen in PBS-Lösung dreimal die Chipfläche zu regenerieren. Messen Sie die Übertragungsspektrum in PBS, den Erfolg der Regenerierung Schritt überprüfen.
  • (5) Surface Plasmon Resonance (SPR) Messung

    1. Den Multiplex SPR-Sensor-Chip auf dem SPR-System mit PBS-T Puffer ausgeführt.
      Hinweis: Die Zusammensetzung des PBS-T Puffer ist 20 mM Na-Phosphat, 150 mM NaCl und 0,05 % Tween 20. Der pH-Wert ist 7,4.
    2. CTnI-Standard und der Antikörper zu verwenden, wie in Schritt 4 beschrieben.
    3. 3 von 6 verfügbaren Kanäle mit einer Mischung von EDC (0,2 M) und Sulfo-NHS (0,05 M) für 5 min. führen eine 5 min Injektion von 50 µg/mL Antikörper 560 und eine 5-min-Injektion von 1 M Ethanolamin-HCl-Lösung zu aktivieren.
    4. Den Sensor-Chip um 90° drehen und die cTnI-Standards bei verschiedenen Konzentrationen zu injizieren (75, 30 7,5 und 2,5 ng/mL).
    5. Beobachten Sie die Konjugation an den Antikörper an Stellen der Interaktion auf dem Chip in Echtzeit durch das SPR auslesen.
    6. Den Chip durch die Injektion von 50 mM Glycin-HCl (pH 2) für 1 min zu regenerieren.

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    Representative Results

    Der optische Aufbau für die Messungen ist in Abbildung 1Adargestellt. Ein Bild des tatsächlichen Nanohole Arrays ist in Abbildung 1 bgegeben. Um die Physik der Fernerkundung Prozeß zu verstehen, wurde der COMSOL-Simulations-Software verwendet, um die Verteilung des Feldes plasmonische in einer wässrigen Umgebung zu simulieren. Die Ergebnisse der Simulation bezogen sich dann auf die eigentliche Messung. Eine zuvor veröffentlichte Studie enthält Angaben zu den getroffenen Annahmen und Parameter in der Simulation11,13. Die physischen Dimensionen simuliert plasmonische Feld für das Nanohole-Array wie folgt war: p = 400 nm, D = 150 nm und T = 100 nm. Absorption und Streuung Effekte sind Konto14 berücksichtigt bei der Berechnung der Übertragungsspektrum. Das simulierte Spektrum ist im Vergleich zu den experimentell gemessenen Spektrum in Abbildung 1. Die simulierten und gemessenen Spektren vermitteln die Existenz von vier Bands von 450 bis 850 nm. Die Band bei 495 nm entspricht den interband Übergang von Gold. Die drei nachfolgenden Bands, Bands I-III in aufsteigender Reihenfolge der Wellenlänge, bezeichnet befinden sich auf 560 nm, 645 nm und 712 nm, beziehungsweise. Bänder-III beobachtet akzeptable Ausrichtung zu den experimentell gemessenen Bands am 558 nm, 638 nm und 724 nm. Da die vorgefertigten Aluminiummedien fast kreisförmig sind, sollte diese Bands nicht empfindlich auf Polarisation des einfallenden Lichts. Darüber hinaus ermöglicht die COMSOL-Simulation die direkte Visualisierung der Nahfeld-Verteilung dieser Bands, wie sie in einer Elementarzelle der periodischen Struktur (Abbildung 1) auftreten würde. Die Einheit auf der Farbleiste ist die optische Feldverteilung (V/m) in einer logarithmischen Skala ausgedrückt. Die höchste Intensität beobachtet wurde rund 4,7 (50.119 V/m). Im Vergleich zu der Intensität der Inzidenz in der Simulation (4.340 V/m) verwendet, stellt dieser Größenordnung eine 11,5-fach Felderweiterung. Die elektromagnetischen Felder für Bands, die auf der Oberfläche des Glassubstrates I und III lokalisiert wurden. Im Gegensatz dazu Band II wurde überwiegend am oberen Rand der Nanohole lokalisiert und wurde für den Nachweis der Bioanalyte gewählt. Abbildung 1E veranschaulicht die Transmissionsspektren des Nanohole Arrays in Flüssigkeiten von bekannten Brechungsindizes, die von 1,31 bis 1,39 variiert. Drei Getriebe Bands, Bands entspricht, I, II und III, wurden in den Spektralbereich von 400-900 nm beobachtet. Eine Rotverschiebung beobachtet mit einer Änderung in RI. Das Ausmaß der Verschiebung folgt die Sequenz Band II > band ich > band III. Abbildung 1F ist eine Konsolidierung der beobachteten roten Verschiebungen von Bands, I, II und III. Die größte Empfindlichkeit berechnet für Band für Band II war 345 nm/RIU ich war 322 nm/RIU und für Band II wurde 202 nm/RIU.

    Abbildung 2A enthält die schematische Darstellung der Fernerkundung Phänomen in Aktion. Abbildung 2 b zeigt die Veränderung der Transmissionsspektren nachdem die kardiale Troponin Moleküle an funktionalisierten Chip-Oberfläche zu binden. Bei niedrigen Konzentrationen ist eine lineare Verschiebung in der Band mit dem Troponin-Niveau. Die Verschiebung in der Band-Position kann auch eine verbindliche Isotherme mit R2 = 0.995 montiert werden. Bei näherer Betrachtung scheint 30 ng/mL die Konzentration an der die Isotherme den Beginn der Sättigung (Abbildung 2 zeigt).

    Abbildung 3A zeigt die Sensorgram aus dem Zusammenspiel von Serum mit der Chipoberfläche eines modifizierten GLC-Chips in einem XPR36-Setup. Die Erfassung von cTnI wird durch den Anstieg des Signals angezeigt. Danach kann die Dissoziation der cTnI in einem PBST-Medium (1 X PBS, 0,05 % Tween 20) beachtet werden, da das Signal nimmt von 120-660 S. Gatterschalters Glycin (Regenerationslösung) für 1 min das Signal auf 0 reduziert, gibt die Regeneration der Sensorfläche durch den vollständigen Abzug der cTnI. Einschub der Abbildung 3Azeigt die Sensorgram für die spätere Vereinigung der cTnI an die regenerierten Chipoberfläche. Das gleiche Protokoll (d. h. eintauchen in Glycin-Lösung für 1 min) wurde verwendet, um die Nanohole Array Oberfläche zu regenerieren. Abbildung 3 b zeigt, dass sich die Position der Band 2 wieder in seine ursprüngliche Position verschiebt damit bestätigt den Erfolg der Regenerierung Schritt.

    Figure 1
    Abbildung 1 : Charakterisierung des Arrays Nanohole. (A) vereinfachtes Schema des experimentellen Aufbaus. (B) Rasterelektronenmikroskop Bild des Arrays Nanohole. (C) Vergleich zwischen den simulierten Spektrum und die experimentell gemessenen Übertragungsspektrum in einer wässrigen Umgebung. (D) Nahfeld Verteilung wie im COMSOL für Bands, I und III, gesehen in eine Querschnittsansicht simuliert. Rot steht für stärkere Nahfeld-Verteilung. Ist das Gerät in der Farbleiste angezeigt | E |, die Verteilung der optischen Bereich, in logarithmischer Skalierung getroffen. (E) experimentell gemessenen Transmissionsspektren des Nanohole Arrays in Umgebungen mit standard Brechungsindex Flüssigkeiten (1,31 bis 1,39). (F) Bulk Empfindlichkeiten der drei Getriebe Bands (I-III), die Änderungen in RI im sichtbaren, NIR-Bereich gemessen. Schwarzes Quadrat: band I, roter Kreis: band II, blaues Dreieck: band III. Die Figur wurde von Ding Et Al. modifiziert 14 unter einer CC-BY-Lizenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 2
    Abbildung 2 : Das Nanohole-Array als eines Biosensors. (A) schematische Darstellung der Nanohole Array als eines Biosensors zur Erkennung von cTnI verwendet wird. (B) die Änderung bei der Übertragung Spektrum der Biosensor auf Interaktion mit menschlichen cTnI in einer Konzentration von 30 ng/mL in einem Hintergrund des Serums. Blau: vor Interaktion, rot: nach Interaktion. Der gepunktete Kreis zeigt die Band, die verfolgt werden. (C) die Verschiebung der Wellenlänge für Band II bei verschiedenen Konzentrationen von Troponin (2,5 ng/mL, 7,5 ng/mL, 30 ng/mL und 75 ng/mL).Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung unter dem n = 3 Chips für jede Messung verwendet. Die Figur wurde von Ding Et Al. modifiziert 14 unter einer CC-BY-Lizenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 3
    Abbildung 3 : Regeneration der Sensorfläche. (A) eine SPR Sensorgram von XPR36 zeigt die Injektion von Analyten (cTnI) gefolgt von der Injektion von Glycin, die Sensorfläche zu regenerieren. Anschließenden Erkennung Messungen der verschiedenen Konzentrationen von cTnI vor dem Hintergrund der Serum entnehmen Sie bitte der Inset. Die rote Balken repräsentiert den Anfangswert, während der schwarze Balken die Messung nach der Regeneration der Oberfläche mit dem im Text beschriebenen Protokoll zeigt. (B) beobachtet die Veränderung in der Band Wellenlängen nach der Regeneration eines Nanohole-Biosensor-Chips. Σ: Standardabweichung der Verschiebungen in der Wellenlänge der Band Position. Die Figur wurde von Ding Et Al. modifiziert 14 unter einer CC-BY-Lizenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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    Discussion

    Simulation der Interaktion zwischen einfallende Licht und Nanostrukturen macht es möglich, die entsprechenden Spitze (im Übertragungsspektrum), zu identifizieren, deren Verschiebung in Abhängigkeit von der Konzentration des Analyten aufgezeichnet werden kann. Es ist wichtig zu beachten, dass die Lokalisierung der Bands im Hinblick auf die Struktur des Sensors entscheidend für die Wahl der richtigen Band, deren Verschiebung nachverfolgt werden kann, den Analyten zu spüren. Die Visualisierung kann durch Simulationen erreicht werden. Dies ist auch entscheidend für das Design eine optimale Struktur, die die Biosensoren Analyten ermöglicht. Wie hier Bands gesehen, die i und III auf der Glas-Gold-Schnittstelle lokalisiert sind und daher eignen sich nicht für Biosensoren. Eine prominentere LSPR Komponente kann in Band II beobachtet werden. Es zeigt eine kurze Verfall Länge und ist am Rand der Aluminiummedien lokalisiert. So, eignet dies sich gut für für die Abtastung von Analytkonzentrationen verwendet wird. Die Qualität der gefertigten Nanostrukturen über das gesamte Array ist auch wesentlich für die Qualität der Spektren gesammelt. Non-Uniform-Strukturen werden Artefakte vorstellen.

    Streuung und unvermeidbare Absorption Artefakte in einer wässrigen Messung zu schaffen. Die insgesamt Signal-Rausch-Verhältnis wird auch durch die Anwesenheit des wässrigen Mediums gestört. Für den Fall, dass gibt es mehrere geeignete Bands, deren Schichten für Biosensoren überwacht werden können, müssen folgende Punkte berücksichtigt werden. Bei Sub 600 nm Wellenlängen wird die beobachteten Übertragungsspektrum deutlich durch Proteinabsorption und Streuung der Partikel beeinflusst. Auf der anderen Seite verwenden Wellenlängen größer als 900 nm könnte Verwirrung stiften, indem er verschleiert wichtige zugrunde liegende Signale ausgehend von verbindlichen Veranstaltungen, wie in dieser Region, die Absorption von Wasser steigt mit der Wellenlänge. Für die Abtastung von Analyten in einer wässrigen Umgebung, deshalb, Band II in Bezug auf die Wellenlänge optimal gelegen. Eine kleine Abweichung in der Messung der Band Position konnte beobachtet werden. Dies wird durch die große Sensor-Größe verursacht. Während der große Sensor schließlich in kürzeren Erfassungszeiten übersetzt, weil jeder der Erkennung Pixel sehen jetzt ein größer-als-üblichen Flussmittel von Photonen, belastet es auch Lärm. In der Tat kann wenn die Signal-Auflistung nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird und die Daten der Klimaanlage nicht optimal ausgelegt, eine Menge Lärm beobachtet werden. Durch Mittelung der gesammelten Signal über 100 Bildern15, der Geräuschpegel gesenkt werden kann. Zwar gibt es andere Möglichkeiten, LSPR Signale, besonders von gold-Nanopartikeln16, zu produzieren ist das Nanohole-Array viel mehr möglich, in einem portablen Format mit Mikrofluidik zu implementieren. Das ganze Gerät ist wegen der einfachen Automatisierung des gesamten Prozesses und Möglichkeit der Regeneration der Sensorfläche für POC-Anwendungen einsetzbar.

    Dieses experimentelle Protokoll soll experimentellen Fehler zu minimieren, indem Übertragungsmodus anstelle von Reflexion. Dadurch werden mögliche Artefakte aus der Einfallswinkel Änderungen. Es ist auch wichtig zu betonen, die kritische Art der Schritt 3.4, wenn der Antikörper vernetzt, die Sensorfläche ist. Es ist wichtig, die Reaktivität von Sulfo-NHS und EDC zu bewahren. Festgestellt wurde auch, dass der Wechsel von NHS zu Sulfo-NHS für verbesserte Stabilität von entscheidender Bedeutung war. Wenn die Proben wiederverwendet werden sollen, empfiehlt Lagerung unter flüssigem Stickstoff. Die Plattformtechnologie, die hier gezeigt wird kann verwendet werden, um andere klinische Biomarker, mit entsprechenden Oberflächenmodifizierung zu überwachen.

    Bisher wurde das Eindringen von LSPR Sensoren durch die Einschränkungen auf die Fähigkeit zum Erstellen ansprechender Oberflächen über große Flächen mit einer Reproduzierbarkeit ähnlich derjenigen der Halbleiter-Industrie eingeschränkt. Großen Fernerkundung Oberflächen können leicht mit Standard- und kostengünstige Optik angebunden werden. Präzision in der Fertigung vermindern würde auch die Span-zu-Varianz, ein kritischer Engpass bei der Verbesserung der Zuverlässigkeit der Messungen, die in einem klinischen Umfeld kritisch ist. Im Rahmen eines medizinischen Geräts, wo serielle Messungen erforderlich sind, ist die Reproduzierbarkeit der Oberfläche Regeneration auch entscheidend. Es wurde auch nachgewiesen, dass die optimale Protokoll zum Regenerieren der Sensorfläche kann eine handelsübliche SPR-Plattform gegründet und dann erfolgreich, das Nanohole-Array übersetzt. Die Effizienz der Regeneration kann leicht berechnet werden, für das Nanohole-Array und die Eignung der regenerierten Oberfläche für Wiederholungsmessungen beurteilt werden kann. Nach Gründung robuste Oberflächenchemie Modifikation und Regeneration Protokolle, kann LSPR Sensoren eine sensible und dennoch einfache Plattform für Echtzeit-Bioanalyte-Erkennung. Es ist einfach, die erhebliche Auswirkungen auf die Patientenversorgung vorauszusehen. Es ist darauf hinzuweisen, dass die absolute Empfindlichkeit des Sensors den fortschrittlichsten ELISA-basierten Tests nicht mithalten kann. Einige Verstärkung Strategien müssen entworfen werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Sogar in seiner jetzigen Form dieser Technologie stellt eine deutliche Verbesserung im Vergleich zu etablierten Nanoimprinted LSPR Protokolle, wie es definiert eine neue Untergrenze für die markierungsfreie Erkennung von Herz-Kreislauf-Biomarker mit einer Getriebe-basierten optischen Setup. Technologie ist für die Umsetzung der Echtzeit-Überwachung von mehreren klinisch relevanten Biomarkern weiterentwickelt. Weitere Verbesserungen in der Datenerfassung (z. B. Melder mit besserer Auflösung) und anschließende Signalverarbeitung könnte helfen, LSPR-basierte Sensoren, dieses Ziel zu erreichen.

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    Disclosures

    Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

    Acknowledgments

    AP räumt die Unterstützung von Prof T Venkatesan, Direktor, NUS Nanowissenschaft und Nanotechnologie-Initiative und Büro des stellvertretenden Präsidenten (National University of Singapore) (R-398-000-084-646). CLD anerkennt die Unterstützung von Singapur Ministerium der Gesundheit National Medical Research Council unter seiner Kliniker Wissenschaftler Finanzierungsprogramm, NMRC/CSA/035/2012 und der National University of Singapore. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Electron Beam Lithography setup Elionix ELS 700
    o-Xylene Sigma Aldrich 95662
    EB resist Sumitomo NEB-22A2
    Developer reagent Shipley Company Microposit MF 321
    Electroplating machine Technotrans AG RD 50
    Photoresist stripper  Rohm and Haas Electronic Materials LLC Microposit Remover 1165
    Etching System Trion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl)trichlorosilane  Gelest (PA, USA) 78560-44-8
    SAM coater  Sorona Inc. AVC 150M
    Photo-curable NIL resist micro resist technology GmbH mr-UVCur21-300nm
    Light Curing System Dymax  Model 2000 Flood
    E-beam deposition machine Denton Explorer
    UV-visible spectrometer  Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Standard refractive index liquids  Cargill Inc (Cedar Grove, USA) 18032
    Plotting software Origin Origin Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol  Dojindo Laboratories (Japan) C385-10
    1-octanethiol  Sigma-Aldrich, MO, USA 471386
    Sulfo-N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  BioRad (CA, USA) 1762410
    Anti-troponin antibody 560 Hytest (Finland) 4T21
    Ethanolamine-HCl solution BioRad (CA, USA) 1762450
    Surface Plasmon Resonance setup BioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR chip BioRad GLC
    Human cTnI standard Phoenix Pharmaceuticals EK -311-05
    Glycine-HCl BioRad (CA, USA) 1762221

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391, (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200, (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10, (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89, (12), 121106 (2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452, (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4, (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5, (5), 818 (2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29, (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105, (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19, (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13, (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29, (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10, (3), 0120974 (2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84, (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85, (20), 9564-9571 (2013).

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