क्रोमैटिन इम्युनोपर्रेबिज़ का उपयोग करने वाली सी-केट लिगेंड प्रमोटर का विश्लेषण

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Genetics

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Summary

कई जैविक प्रक्रियाओं के लिए डीएनए प्रोटीन बातचीत आवश्यक होती है। सेलुलर कार्यों के मूल्यांकन के दौरान डीएनए प्रोटीन के विश्लेषण का विश्लेषण जीन विनियमन को समझने के लिए अनिवार्य है। क्रोमेटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चीप) विवो में ऐसे इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है

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Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

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Abstract

डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत, डीएनए पुनर्संयोजन, और जीन अभिव्यक्ति सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं, प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत की आवश्यकता होती है। इसलिए, डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन कई शारीरिक, पथोफिज़ीयोलॉजिकल और जैविक कार्यों को विनियमित करते हैं, जैसे कि सेल भेदभाव, सेल प्रसार, सेल चक्र नियंत्रण, गुणसूत्र स्थिरता, एपीजीनेटिक जीन विनियमन और सेल परिवर्तन। यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, डीएनए हिस्टोन और नॉनहिस्टोन प्रोटीन से संपर्क करता है और इसे क्रोमैटिन में सघन होता है। डीएएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए कई तकनीकी टूल का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि इलैपीओफोरेसिस (जेल) मोबिलिटी शिफ्ट आफ़े (ईएमएसए) और डीएनएस आई फुटप्रिंग। हालांकि, ये तकनीक इन विट्रो में प्रोटीन-डीएनए बातचीत का विश्लेषण करती हैं, सेलुलर संदर्भ में नहीं हैं। क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चीप) एक तकनीक है जो प्रोटीनों को अपने विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी साइटों पर कैप्चर करता है, जिससे डीएनए प्रोटीन बातचीत की पहचान करने की अनुमति मिलती हैउनके क्रोमैटिन संदर्भ में है यह डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन के निर्धारण के द्वारा किया जाता है, इसके बाद ब्याज की प्रोटीन की प्रतिरक्षा प्रवर्तन होता है। इसके बाद, जीनोमिक साइट जो प्रोटीन के लिए बाध्य थी, उसकी विशेषता है। यहाँ, हम चिप का वर्णन करते हैं और चर्चा करते हैं और ट्रान्सफ़ोर्डिंग ग्रोथ फैक्टर-बी बी (टीजीएफ-बी) की पहचान के लिए विश्लेषणात्मक मूल्य का प्रदर्शन करते हैं, प्रतिरूपण कारक एसएएमएडी 2 से एसएमएडी 2 को टायरोसाइन के प्रमोटर क्षेत्र के भीतर SMAD बाध्यकारी तत्वों (एसबीई) प्रोटीन किनेज किट (सी-केआईटी) रिसेप्टर लैगंड स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ)।

Introduction

यूकेरियोट्स के न्यूक्लियस में, डीएनए हिस्टोन प्रोटीन और नॉनहिस्टोन प्रोटीन से संपर्क करता है और इसे क्रोमैटिन में सघन होता है। शारीरिक, रोगप्रतिकारक, और कोशिका जैविक संदर्भ में, सेलुलर फ़ंक्शंस अलग-अलग होते हैं और अस्थायी रूप से क्रोमैटिन-समन्वित जीन अभिव्यक्ति द्वारा नियंत्रित होते हैं। डीएनए प्रतिकृति, पुनर्संयोजन, और मरम्मत, साथ ही साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं के विनियमन में डीएनए-प्रोटीन बातचीत की एक महत्वपूर्ण भूमिका है। इसलिए, डीएनए प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति और सेल फ़ंक्शन के मूल्यांकन में एक अनिवार्य उपकरण है।

इन विट्रो में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए कई तकनीकें होती हैं, जैसे कि इलेक्ट्रोफोरेसिस (जेल) मोबिलिटी शिफ्ट आफ़े (ईएमएसए) और डीएनएस 1 फुटपिंग 1 , 2 । हालांकि, ये तकनीक क्रोमेटिन और सेलुलर संदर्भ में प्रोटीन-डीएनए बातचीत का विश्लेषण नहीं करती हैं। चिप Iएक तकनीक जो प्रोटीन को अपने विशिष्ट डीएनए बाध्य करने वाली साइटों से बन्द करती है और जिससे क्रोमैटिन संदर्भ के भीतर डीएनए प्रोटीन बातचीत की पहचान की सुविधा प्रदान की जाती है। यह तकनीक मूल रूप से एशरचीशिया कोली और ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर 3 , 4 में विशिष्ट जीन के लिए बाध्यकारी आरएनए पोलीमरेज़ II के आकलन के लिए जिमर और लिस द्वारा विकसित की गई थी। यह डीएनए-प्रोटीन परिसरों के निर्धारण के द्वारा किया जाता है, इसके बाद क्रोमैटिन निष्कर्षण प्रदर्शन और डीएनए को ~ 200 बेस जोड़ी (बीपी) के टुकड़ों में कटा हुआ। इसके बाद, डीएनए-ब्याज प्रोटीन की ब्याज immunoprecipitation द्वारा अलग है। डीएनए प्रोटीन क्रॉस्लिंक के उत्क्रमण के बाद, डीएनए शुद्ध और विश्लेषण किया जाता है। प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के विश्लेषण के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है और लक्ष्य जीन 5 के भीतर प्रोटीन बाइंडिंग साइट के न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम पर निर्भर करते हैं। ऐसे मामलों में जहां डीएनए अनुक्रम जाना जाता है, मानक पोलज्ञात बाध्यकारी साइट flanking विशिष्ट प्राइमर जोड़े का उपयोग कर, ymerase चेन प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) लागू किया जा सकता है। मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (qRT-PCR) भी 6 का इस्तेमाल किया जा सकता है जिन मामलों में अनुक्रम अज्ञात है, चिप को डीएनए माइक्रोएरेज़ (चिप-ऑन-चिप), डीएनए अनुक्रमण (चिप-सेक), या क्लोनिंग तकनीक 7 , 8 , 9 के साथ जोड़ा जा सकता है।

टीजीएफ-बीओ मार्ग में शक्तिशाली ट्यूमर को दबाने वाला कार्य है और सेल भेदभाव में एक महत्वपूर्ण मार्ग है। यह TGF-β1 ligand के बंधन के माध्यम से अपने संगत रिसेप्टर परिसर में सक्रिय है, जिसके परिणामस्वरूप एसएडीएडी 2/3 प्रतिलेखन कारकों की सीरीन-फॉस्फोरायलेशन होती है। सामान्य मध्यस्थ, एसएमएडी 4, एसएएमएडी 4 के साथ उनके सहयोग के बाद, नाभिक के लिए ट्रांसकैकेट और लक्ष्य जीन के प्रमोटर क्षेत्र के भीतर एसबीई से बांधता है, जहां यह सेल चक्र, एपप्टोसिस और कोशिका अलग-अलग को नियंत्रित करने वाले जीन को नियंत्रित करता हैपर। टीजीएफ-बीओ उत्तेजना के लिए ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया सेल प्रकार और संदर्भ-विशिष्ट 10 है । हाल ही में, हमने TGF-β और c-KIT मार्ग 11 के बीच एक सकारात्मक प्रतिक्रिया लूप का वर्णन किया है। इस मॉडल में, टीजीएफ-β1- सक्रिय एसएएमएडी 2 सी-केट लिगेंड प्रमोटर को बांधता है और अपनी अभिव्यक्ति और स्राव को प्रेरित करता है। इसके बाद, सी-केट लिगेंड स्वत: और पैरा-क्रिनिक फैशन में सी-केट रिसेप्टर को सक्रिय करता है सीएटी रिसेप्टर सक्रियण परिणाम STAT3 Tyr 705 -phosphorylation JAK1 / 2 के माध्यम से STAT3- सक्रियण और परमाणु हस्तांतरण के बाद, STAT3 टीजीएफ- β1 लीगैंड जीन से बांधता है और इसकी अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है

यहां, हम एसएपीएडी 2 की सी-केआईटी रिसेप्टर लैगेंड प्रमोटर के लिए बाध्यकारी और सिग्नल ट्रांन्सड्यूसर (और) उत्प्रेरक (प्रति) ट्रांसक्रिप्शन 3 (एसटीएटी 3 को टीजीएफ-बी 1-बी -1 के लिए बाध्यकारी) की पहचान के लिए चिप विश्लेषण की अनिवार्य भूमिका को प्रदर्शित करते हैं। जीन)।

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Protocol

1. समाधान की तैयारी

  1. प्रत्येक प्रयोग के लिए निम्नलिखित समाधानों को तैयार करें
    1. निर्धारण समाधान के लिए , 37% फॉर्मलाडिहाइड तैयार करें और आरटी पर इसे स्टोर करें। 1.4x% की अंतिम एकाग्रता के लिए 1x फॉस्फेट-बफर्ड सलाईन (पीबीएस) में इसे पतला।
      सावधानी: फार्मलाडेहाइड को अड़चन, संक्षारक, उत्परिवर्तनीय, टेराटोजेनिक और कार्सिनोजेनिक के रूप में वर्गीकृत किया गया है। निगलें नहीं। गैस / धुएं / वाष्प / स्प्रे में साँस नहीं लें। अपर्याप्त वेंटिलेशन के मामले में, उपयुक्त श्वसन उपकरण पहनें। त्वचा और आंखों के संपर्क से बचाएं। इनकॉपरिबल्स से दूर रहें, जैसे ऑक्सीकरण एजेंट, एजेंटों को कम करने, एसिड, क्षार और नमी
    2. ग्लाइसीन स्टॉप-फिक्स समाधान के लिए, 0.125 एम ग्लाइसिन को 1x पीबीएस समाधान में तैयार करें और आरटी पर स्टोर करें।
    3. सेल स्क्रैपिंग समाधान के लिए, डीएच 2 ओ में 1x पीबीएस समाधान तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें उपयोग करने से पहले सीधे प्रोटीनस इनहिबिटर फ़ेंनिमेथिलसफॉलिक फ्लोराइड (पीएमएसएफ) टी जोड़ेंओएएम की अंतिम एकाग्रता 0.5 एमएम
      सावधानी: पीएमएसएफ को संक्षारक और जहरीले रूप में वर्गीकृत किया गया है; सुरक्षात्मक वस्त्र पहनें और इसे एक हवादार क्षेत्र में उपयोग करें।
    4. सेल लिसन बफर (20 मिमी त्रि-एचसीएल; पीएच 8.0, 85 एमएम केसीएल और 0.5% एनपी 40) का उपयोग करने से पहले, 1 एक्स प्रोटेस अवरोधक कॉकटेल (पीआईसी) डाइमिथाइल सल्फाक्सिड (डीएमएसओ) में 100 एक्स स्टॉक समाधान: 104 एमएम 4- ( 2-एमिनोइथाइल) बेंजेन्सोफोनील फ्लोराइड हाइड्रोक्लोराइड (एईबीएसएफ), 80 माइक्रोन एप्रोटीनिन, 4 एमएम बेस्टेटिन, 1.4 एमएम ई -64, 2 एमएम लियूप्टीन, और 1.5 एमएम पेर्स्टैटिन ए) और 0.5 एमएम पीएमएसएफ।
    5. नाभिक lysis बफर (50 एमएम ट्रिस-सीएल, पीएच 8.0, 10 एमएम एथिलीनएमेनेटेटेट्रैटेसेट एसिड (ईडीटीए) और 1% एसडीएस) का उपयोग करने से पहले, 1 एक्स पीआईसी और 0.5 एमएम पीएमएसएफ जोड़ें।

2. सेल निर्धारण और बाल काटना

  1. कोशिकाओं को 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट्स पर 70-80% संगम तक बढ़ाएं। प्रयोगात्मक लक्ष्यों के अनुसार कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
  2. टिशू कल्चर मिडिया को निकालें, 5 एमएल फिक्सेशन सॉल्यूशन जोड़ें, और सेतेएक थरथरानवाला मंच पर आरटी पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं।
  3. निर्धारण समाधान निकालें और 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें।
  4. 1x पीबीएस निकालें, ग्लाइसीन स्टॉप-फिक्स समाधान के 5 एमएल जोड़ें, और आरटी पर 5 मिनट के लिए थरथरिंग प्लेटफार्म पर सेब को सेते हैं।
  5. ग्लाइसीन स्टॉप-फिक्स समाधान निकालें और 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें।
  6. 1x पीबीएस निकालें, 2 एमएल सेल स्क्रैपिंग सॉल्यूशन जोड़ें, और एक सेल खुरचनी का उपयोग करके कोशिकाओं को फसल डालें। कटाई कोशिकाओं को बर्फ पर एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. नमूनों को 600 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
  8. सतह पर तैरनेवाला निकालें, गोली को 1 एमएल 1 एक्स सेल लसीस बफर में पुन: resuspend, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, तरल नाइट्रोजन में गोली को रोकें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  9. एक बार सेल lysis बफर में गोली resuspended एक बार, एक बर्फ ठंडा dounce homogenizer के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण और एक टाइप-बी पेस्ट का उपयोग कर 10 स्ट्रोक के लिए डरसेल व्यवधान के लिए ई
  10. सेल निलंबन को एक सूक्ष्मदर्शी ट्यूब में स्थानांतरित करें और नमूनों को 2,400 xg और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित करें।
  11. सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें, 350 μL नाभिक पाचन बफर में गोली को फिर से खोलें और नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  12. माइक्रोकोकल न्युकेलीज (1 यू / μ एल) जोड़ें और भंवर से मिश्रण करें। 5-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं; व्युत्क्रम द्वारा प्रत्येक 2 मिनट के नमूनों को मिलाएं।
    नोट: समय और एंजाइम एकाग्रता सेल लाइनों के बीच भिन्न होती है और उप-ऊर्ध्वाधर एंजाइमिक कर्तन के मामलों में अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
  13. वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ध्वनिकारों का इस्तेमाल करते हुए सोनिकेशन द्वारा क्रोमैटिन कर्तन प्राप्त करना।
    नोट: Sonication शर्तों अनुकूलन की आवश्यकता होगी एक अनुकूलन उदाहरण प्रोटोकॉल 300 μL के एक नमूना मात्रा और 25% की एक नमूना प्रसंस्करण शक्ति का उपयोग कर नीचे दिया गया है।
    1. चरण 2.10 के बाद, सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और n को पुन: resppend करें1.0 एमएल वाणिज्यिक कर्तन बफर में परमाणु गोली।
    2. रिसाइज्ड परमाणु प्लेट के 300 μL को तीन 1.7 एमएल माइक्रोसॉसिटिव्यू ट्यूब में विभाजित किया गया। उन्हें बर्फ पर रखें
    3. इष्टतम दोमितीय परिस्थितियों का निर्धारण करने के लिए 3 अलग-अलग स्थितियों का उपयोग करके 25% शक्ति पर निश्चित क्रोमेटिन के 3 अल्कोट्स को कतरें:
      प्रत्येक दाग के बीच बर्फ पर एक 30 एस बाकी के साथ 20 एस प्रत्येक के 5 दालों।
      प्रत्येक 10 पल्स के 10 दालों, प्रत्येक 30 पल्स के बीच बर्फ पर 30 सेकंड के बाकी के साथ।
      प्रत्येक 20 पल्स के 20 दालों, प्रत्येक 30 पल्स के बीच बर्फ पर 30 सेकंड्स बाकी है।
    4. चरण 2.15 के साथ जारी रखें, जैसा कि नीचे उल्लिखित है।
  14. माइक्रोकोकल नुकले के साथ ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 7 μL बर्फ-ठंडा 0.5 एम EDTA जोड़ें।
  15. 10 मिनट के लिए 16,200 xg और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए शेड डीएनए वाले नमूनों को अपकेंद्रित करें
  16. तैरनेवाला डीएनए युक्त एक नए सूक्ष्मदर्शी ट्यूब में स्थानांतरण। सुकुमार की पुष्टि करने के लिए एक अलग microcentrifuge ट्यूब में 50 μL विभाज्यडीएनए (खंड 3) के सीढ़ीदार कर्तन इम्यूनोपेरेग्रेशन (अनुभाग 4) के लिए तुरंत शेष मात्रा का प्रयोग करें या इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें

3. कंधे की दक्षता की पुष्टि

  1. चरण 2.16 से शेर क्रोमेटिन के 50 μL विभाज्य को 150 μL न्युकली-फ्री डी एच 2 ओ और 10 μ एल 5 एम NaCl में जोड़ें।
  2. नमूनों को 65 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए क्रॉस्लिंक्स उलटने के लिए सेते हैं।
  3. 2 μL आरएनज़ ए (10 माइक्रोग्राम / μL) जोड़ें और नमूनों को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से लें।
  4. प्रोटीन के 10 μL (0.5 μg / μL) जोड़ें और नमूने को 42 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट तक सेवन करें।
  5. डीएनए की शुद्धि के लिए, फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण 12 प्रदर्शन करें
    1. 200 μL की अंतिम मात्रा में न्युकले-मुक्त पानी जोड़ें। 200 μL फिनोल: क्लोरोफॉर्म जोड़ें: 20 एस के लिए नमूना और भंवर में isoamyl शराब (25: 24: 1)
    2. कमरा मंदिर में अपकेंद्रित्र5 मिनट के लिए प्रति व्यक्ति 16,000 x जी ऊपरी जलीय चरण को सावधानीपूर्वक हटा दें और उसे एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें। पिपेटिंग के दौरान किसी भी फिनोल को जारी नहीं रखना सुनिश्चित करें।
    3. 3 एम सोडियम एसीटेट (NH 4 OAc), पीएच 5.2 की 0.1 मात्रा जोड़ें और एक उंगली से ट्यूब को कई बार फ्लिक करके मिश्रण करें। बर्फ के ठंडे 100% इथेनॉल के 2.5 संस्करण जोड़ें और 5 एस के लिए भंवर द्वारा मिलाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना ओ / एन सेते हैं, या कम से कम 1 घंटे -80 डिग्री सेल्सियस तक।
    4. सीडीएनए को गोली के लिए नमूना 4 डिग्री सेल्सियस और 16,000 XG के लिए 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. गोली को खारिज किए बिना सतह पर तैरने वाले को ध्यान से हटा दें। 1 एमएल आरटी, 70% इथेनॉल जोड़ें और ट्यूब को कई बार उलटाएं।
    6. नमूना को 4 डिग्री सेल्सियस और 16,000 x ग्राम में 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें सतह पर तैरने वाले को ध्यान से हटा दें
    7. आरटी पर 5-10 मिनट के लिए गोली सूखी 30 μL डीएच 2 ओ में गोली resuspend
  6. एक 1% TAE के साथ जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए शुद्ध डीएनए के 5 और 10 μL विभाज्य प्रयोग करेंAgarose जेल
    नोट: 200-1,500 बीपी डीएनए पैटर्न में सफल क्रोमेटिन बाल काटना परिणाम। यदि ऊष्मायन असफल हो, तो ऊष्मायन चरण (चरण 2.12) 5, 10, और 15 मिनट के ऊष्मायन समय को संशोधित करके विशिष्ट कोशिकाओं के लिए इष्टतम कर्तन की स्थिति निर्धारित करें।
  7. नमूना के डीएनए एकाग्रता का विश्लेषण करने के लिए शेष नमूना का उपयोग करें। शेर क्रोमेटिन नमूना (चरण 2.16) में डीएनए एकाग्रता की उल्टी-गणना; Immunoprecipitation (खंड 4) के लिए प्रत्येक उपचार समूह के लिए एक ही डीएनए मात्रा का उपयोग करें।

4. Immunoprecipitation

  1. चिप-ग्रेड प्रोटीन जी चुंबकीय मोती के 25 μL, अनियिनिप्रेज डिलीमुने बफर (स्टॉक समाधान: 0.01% एसडीएस, 1.1% ट्राइटन एक्स -100, 16.7 एमएम) की 10 μg जुदाई, क्रॉसलेम्क्स्ड क्रोमैटिन (चरण 2.16) का मिश्रण करें। ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0, 1.2 मिमी ईडीटीए, और 167 एमएम नाओकल), और पीआईसी के 1 माइक्रोन।
  2. ऊष्मायन के 4 घंटे के बाद, एंटीबॉडी के 1-10 माइक्रोग्राम (एंटीबॉडी केंद्रित) जोड़ेंएटीन्यून एंटीबॉडी के संबंध के आधार पर अलग-अलग होंगे; यह प्रारंभिक रूप से प्रति निर्माता की सिफारिशों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और यदि आवश्यक हो तो प्रयोगात्मक रूप से अनुकूलित किया गया हो) 1.5 मिलीलीटर माइक्रोप्रतिविज ट्यूब के लिए और 100 μL की अंतिम मात्रा में डीएच 2 ओ जोड़ने।
    नोट: उपरोक्त वर्णित प्रत्यक्ष इम्युनोपेरेएबिस विधि के बजाय, अप्रत्यक्ष immunoprecipiation विधि का उपयोग एंटीबॉडी के साथ पहले क्रोमैटिन के संयोजन से किया जा सकता है और बाद में प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों को जोड़ता है।
  3. नमूने 4 से 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अंत-टू-एंड रोटेटर पर सेते हैं।

5. एल्यूशन

  1. एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें एक बार ट्यूब के किनारे पर चुंबकीय मोती एकत्रित करने के बाद, सतह पर तैरने वाले को ध्यानपूर्वक हटाकर त्याग दें।
  2. 800 μL धोने बफर 1 (0.1% एसडीएस, 1% ट्राइटन एक्स -100, 2 एमएम ईडीटीए पीएच 8, 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8, और 150 एमएम नाओक) के साथ मोती तीन बार धोएं; ट्यूब को कई बार उलटा कर मिलाएं चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस करेंनोड ध्यानपूर्वक हटाने और धोने के बफर को हटाने के बाद एक बार ट्यूब के किनारे पर चुंबकीय मोती एकत्रित करें।
  3. 800 μL धोने वाले बफर 2 (0.1% एसडीएस, 1% ट्राइटन एक्स -100, 2 एमएम ईडीटीए, पीएच 8, 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 8 और 500 एमएम नाओक) के साथ मोती धो लें; ट्यूब को कई बार उलटा कर मिलाएं ट्यूब को चुंबकीय खड़े पर रखें और ट्यूब के किनारे पर चुंबकीय मोती एकत्रित करने के बाद सावधानी से हटाने और धोने के बफर को त्याग दें।
  4. एल्यूशन बफर (1% एसडीएस और 100 एमएम NaHCO 3 ) के 50 μL में मोतियों को फिर से फिर से फिर से और आरटी पर 15 मिनट के लिए एक अंत से एंड रोटेटर पर नमूने सेते हैं।
  5. ट्यूबों को चुंबकीय स्टैंड पर रखें, और एक बार जब चुंबकीय मोतियों ट्यूब के किनारे इकट्ठा हो जाते हैं, तो सतह पर तैरनेवाला को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. क्रॉसलिंकिंग को उलट करने के लिए 6 एमएल 5 एमएएलएल और प्रोटीनेस के 2 μ एल (0.5 माइक्रोग्राम / μL) जोड़ें। नमूनों के मिश्रण के बाद, 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के नमूनों को सेते हैं।
  7. डीएनए की शुद्धिकरण के लिए, एक फीह करेंनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण 12 (चरण 3.5) और बाद में 30 μL डीएच 2 ओ में गोली को फिर से खोलें।
    नोट: नमूने प्रोटीन बाध्यकारी साइटों (अनुभाग 5) के लिए सीधे विश्लेषण किया जा सकता है या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है

6. बाध्यकारी साइट विश्लेषण

  1. PCR या qRT-PCR का उपयोग करते हुए ज्ञात न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम के भीतर विशिष्ट बाध्यकारी साइटों के लिए एक विश्लेषण करें प्राइमर डिजाइन के लिए, पारंपरिक पीसीआर या QRT-PCR प्रोटोकॉल का पालन करें। प्राइमरों को 150-400 बीपी एम्पलिसन को संश्लेषित करने के लिए डिज़ाइन करें जो ब्याज की प्रोटीन बाध्यकारी साइट पुल करता है ( चित्रा 1 )।
  2. विशिष्टता को आश्वस्त करने के लिए चार विभिन्न डीएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करके पीसीआर को सेट करें: i) चिप से डीएनए ब्याज की एंटीबॉडी के साथ अनियंत्रित हो जाता है, ii) चिप से डीएनए एक अनिर्दिष्ट आईजीजी एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitated, iii) इनपुट डीएनए, और iv) एच 2 ओ के रूप में पीसीआर के लिए नकारात्मक नियंत्रण प्रदूषण से बाहर निकलना है। मार्ग उत्तेजना के मामले में, प्रतिरक्षा प्रोटीन के ज्ञात बाध्यकारी स्थल के लिए विशिष्ट प्राइमरों के एक अलग सेट का उपयोग करके पांचवां टेम्पलेट चुनें।
    नोट: सी-केट लिगेंड प्रमोटर विश्लेषण के मामले में, सी-केट लिगैंड प्रमोटर क्षेत्र में एसबीई पर टीजीएफ-बीओ प्रेरित एसएमएडी बंधन को प्रदर्शित करने के लिए पारंपरिक पीसीआर का उपयोग करें। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, पीसीआर को प्लसमिनोज़ एक्टिवेटर इनिबिटर -1 (पीएआई -1) को टीजीएफ-बीओ-प्रेरित एसएएमएडी बाइंडिंग के ज्ञात लक्ष्य के रूप में दिखाएं।

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Representative Results

एसजीएडी 2/3 प्रतिलेखन कारकों की सीरीन-फॉस्फोरेलेशन के परिणामस्वरूप टीजीएफ-β1 लिगैंड को इसके संगत रिसेप्टर जटिल परिणामों के लिए बंधन, सामान्य मध्यस्थ, एसएमएडी 4 के साथ उनके सहयोग के बाद। एसएमएडी परिसर नाभिक को अनुवाद करता है। टीजीएफ-बीओ जीन ट्रांसक्रिप्शन को विनियमित कर सकते हैं, या तो एसएमई के माध्यम से लक्ष्य जीनों के नियामक क्षेत्रों में एसबीई के लिए बाध्यकारी या अप्रत्यक्ष रूप से ट्रांस्क्रिप्शनल एक्टिवेटर्स या दमनकारी के एसएएमएडी-विनियमित अभिव्यक्ति के माध्यम से, जो बाद में ब्याज 10 के जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं। सी-केआईटी लिगंड एससीएफ को ट्रांसमीटर से नियंत्रित किया जाता है, तो यह जांचने के लिए कि एसएमएडी 2 के प्रवर्तक को प्रत्यक्ष टीजीएफ-बीटा-प्रेरित बंधन द्वारा नियंत्रित किया गया है, हमने एससीएफ प्रमोटर युक्त, 2.4-केबी, एससीएफ जीन के 5'-फ्लैंकिंग क्षेत्र का विश्लेषण किया है। एसएमएडी 2 बाइंडिंग आकृति, 5'-एजीएसी -3 '(एसबीई) 13 , 14 हमने 7 ब्योरे एसबीई अप की पहचान की हैएससीएफ के आरंभिक कोडन ( चित्रा 1 ए ) का ट्रिम एससीएफ प्रमोटर को टीजीएफ-β1- प्रेरित बाध्यकारी की पुष्टि करने के लिए, यहां वर्णित चिप परख किया गया था। TGF-β1 उपचार एसएमएडी 2 में एससीएफ प्रमोटर के लिए मानव यकृत कैंसर लाइनों, हेपजी 2 और हेप 3 बी , कोशिकाओं ( चित्रा 1 बी ) में बाध्य हुई। टीजीएफ-बी 1-उत्तेजना की अनुपस्थिति में, कोई एसएमएडी बाइंडिंग नहीं किया गया था। टीजीएफ-β1- प्रेरित एसएमएडी सक्रियण के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, पीएआई -1 के लिए चिप का प्रदर्शन किया गया था। पीएआई -1 प्रमोटर टीजीएफ-बीओ / एसएमएडी 13 के एक ज्ञात लक्ष्य है। SMAD2 immunoprecipitation की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, अनिर्दिष्ट आईजीजी एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया; एसजीई के लिए बाध्यकारी नहीं SMAD2 आईजीजी के साथ immunoprecipitation के बाद नोट किया गया था।

चिप प्रौद्योगिकी के एक और प्रदर्शन के लिए, हमने STAT3 सर्वसम्मति बाध्यकारी रूपांकनों 5 के लिए टीजीएफ-बी लिगैंड जीन के 5 'फ़्लैंकिंग क्षेत्र का विश्लेषण किया है।-टीटी (एन 4) एए -3 और 5'-टीटी (एन 5) एए -3 '15 हमने दो मूलभूत STAT3 बाध्यकारी साइटों को टीजीएफबी के प्रारंभ कोडन की स्थिति -4384 / -4373 (एसटीबी -1) और -5365 / -5357 (एसटीबी -2) ( चित्रा 2 ए ) पर अपस्ट्रीम की पहचान की है। TGF-β1- प्रेरित बाध्यकारी की पुष्टि करने के लिए TGF-β ligand जीन को STAT3, हमने टीजीएफ-बी बी 1-उपचार HepG2 और Hep3B कोशिकाओं का उपयोग कर चिप आर्चियां की हैं। टीजीएफ- β1 उपचार के परिणामस्वरूप टीजीएफबी जीन के दूसरे मनोहर STAT3 बाइंडिंग साइट (एसटीबी -2) के लिए एसटीएटी 3 बाध्यकारी है, लेकिन पहले एक (एसटीबी -1) ( चित्रा 2 बी ) नहीं है। इस उदाहरण में, STB-2 के लिए बाध्यकारी सकारात्मक STAT3 एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। उपरोक्त चिप प्रयोग के समान, एसटीबी -2 के लिए बाध्यकारी एसटीएटी 3 आईजीजी का उपयोग कर immunoprecipitation के बाद नहीं देखा गया था।

आकृति 1
आकृति 1 ओजी>: टीजीएफ-बीओ-प्रेरित एसएएमएडी 2 एससीएफ प्रमोटर को बाध्यकारी। ( ) शुरूआती कोडन के लिए उनकी सापेक्ष स्थिति के साथ ब्योरे (सफेद बक्से = एएएसीसी) के रूप में दिखाए जाने वाले एसटीएफ के साथ एससीएफ प्रमोटर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। चिप प्राइमर का स्थान एससीएफ के प्रारंभिक कोडन और पीसीआर उत्पाद के आकार के रिश्तेदार पदों के साथ नीचे दिखाया गया है। एसपीएफ प्रमोटर के लिए एसएमएडी 2 बाइंडिंग के लिए ( बी ) चिप। टीजीएफ-β1-उपचार और अनुपचारित HepG2 और Hep3B कोशिकाओं के क्रोमैटिन-प्रोटीन परिसरों, विरोधी SMAD2 एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitated थे। पीसीआर एससीएफ-विशिष्ट प्राइमरों का प्रयोग करके किया गया। बाईं ओर, इनपुट डीएनए का उपयोग करते हुए पीसीआर परिणाम दिखाए जाते हैं। बीच में, अनिश्चित आईजीजी के साथ immunoprecipitation के बाद पीसीआर परिणाम एसएमएडी 2 immunoprecipitation विशिष्टता की पुष्टि के लिए दिखाए जाते हैं। नीचे पैनल में दिखाया गया, पीएआई-1 के लिए बाध्यकारी एसएएमएडी 2 के लिए चिप एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।Ge.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 : टीजीएफ-बीओ-प्रेरित STAT3 टीजीएफ-बीओ जीन के लिए बाध्य है। ( ) प्रारंभिक कोडन के लिए उनकी सापेक्ष स्थिति के साथ ग्रे बक्से के रूप में दिखाए जाने वाले STAT3 बाध्यकारी साइटों के साथ टीजीएफ-बीओ जीन की योजनाबद्ध। चिप प्राइमर स्थानों को उनके रिश्तेदार पदों के साथ TGF-β प्रारंभ कोडन और पीसीआर उत्पाद आकार नीचे दिखाए गए हैं। ( बी ) टीजीएफ-β1- प्रेरित STAT3 टीजीएफ-बी जीन के लिए बंधन के लिए चिप। टीजीएफ-क्रोएटिन-प्रोटीन परिसरों के टीजीएफ-बी 1-उपचार और अनुपचारित HepG2 और Hep3B कोशिकाओं को विरोधी STAT3 एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitated थे। पीसीआर टीजीएफ-बीटा-विशिष्ट प्राइमरों के प्रयोग से किया गया था। बाईं ओर, इनपुट डीएनए का उपयोग करते हुए पीसीआर परिणाम दिखाए जाते हैं। बीच में, पीसीआरअनिश्चित आईजीजी के साथ immunoprecipitation के बाद परिणाम STAT3 immunoprecipitation विशिष्टता की पुष्टि के लिए दिखाए जाते हैं। ऊपरी पैनल एसटीएटी 3 बाध्यकारी साइट 1 (एसटीबी -1) के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करते हुए पीसीआर परिणाम दिखाता है, और निचले पैनल एसटीएटी 3 बाध्यकारी साइट 2 (एसटीबी -2) के लिए बाध्यकारी के परिणाम दिखाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इस रिपोर्ट में, हम टीजीएफ-β1 लिगैंड जीन के भीतर अपनी मान्यता अनुक्रम के लिए एसएटीए के सी-केट लिगेंड प्रमोटर और टीजीएफ-बी 1-प्रेरित बाध्यकारी के भीतर एसएबीई के टीजीएफ-बी 1-प्रेरित बंधन को प्रदर्शित करते हैं। हम क्रोमैटिन इम्युनोपर्रेबिप का प्रयोग करते हुए दोनों प्रतिलेखन कारकों के साइटोकिन-प्रेरित बंधन को प्रदर्शित करते हैं।

क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन डीएनए के लिए प्रोटीन बाध्य करने वाली उत्तेजनाओं को चिह्नित करने के लिए डीएनए के लिए ब्याज की एक प्रोटीन की प्रत्यक्ष बाध्यता का प्रदर्शन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, और डीएनए अनुक्रम को दर्शाने के लिए जो प्रोटीन बांधता है। बाद की जानकारी ब्याज की विशिष्ट प्रोटीन द्वारा नियंत्रित जीन की पहचान में मदद कर सकती है और चिप-ऑन-चिप, चिप-सेक, या क्लोनिंग रणनीतियों 7 , 8 , 9 के प्रयोग से हासिल की जा सकती है । डीएनए प्रोटीन बाइंडिंग के प्रदर्शन के अन्य तरीकों की तुलना में चिप के प्रमुख फायदे में से एक, जैसे कि ईएमएसए या डीएनस आई फुटप्रिंग, यह है कि, चिप प्रौद्योगिकी में, बंधन को vivo में कैप्चर किया जाता है , जबकि अन्य के साथ, यह इन विट्रो में किया जाता है इसलिए, चिप सेल्युलर प्रसंग के भीतर डीएनए प्रोटीन बाध्यकारी में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जबकि अन्य तकनीकों एक अलग प्रणाली का प्रतिनिधित्व करती हैं।

हालांकि, चिप विश्लेषण जटिल है, इसमें कई कदम शामिल हैं, जो परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, और अनुकूलन और अनुभव की आवश्यकता है। सफल चिप के लिए महत्वपूर्ण है पहला कदम है एक crosslink कदम (कदम 2.2)। यूवी क्रॉटलिंकिंग अपरिवर्तनीय है और इसलिए चिप के लिए अनुपयुक्त है फार्मलाडेहाइड क्रॉटलिंकिंग को प्राथमिकता दी जाती है, लेकिन फार्मलाडहाइड एकाग्रता और क्रॉसलिंकिंग समय क्रोमेटिन कर्तन और एंटीजन वर्षा की दक्षता को प्रभावित कर सकता है। सामान्य रूप से, कम फार्मलाडहाइड सांद्रता (1% वाय / वी) और छोटे क्रॉटलिंकिंग टाइम्स (5-10 मिनट) बेहतर होती हैं, क्योंकि वे ऊष्मायन दक्षता में सुधार करते हैं। हालांकि, फार्मलाडहाइड प्रभावी नहीं हैप्रोटीन-प्रोटीन क्रॉस्लिंकिंग पर और इसलिए प्रोटीन के लिए उप-पूरक है जो सीधे डीएनए 16 से बाँध नहीं करते हैं। ऐसे मामलों के लिए, चीप को दो-चरण के दृष्टिकोण में किया जा सकता है, जिसमें प्रोटीन-प्रोटीन क्रॉस्लिंकिंग पहले क्रॉसलिंकर्स जैसे कि डिसुक्किनिमिड ग्लूटरेट के द्वारा किया जाता है, जिसके बाद फॉर्मलाडहाइड-मध्यस्थता डीएनए-प्रोटीन क्रॉस्लिंकिंग 17

अगला महत्वपूर्ण चरण क्रोमैटिन कर्तन है। हमारे अध्ययन में, हमने एनकोइमैटिक बाल काटना का उपयोग माइक्रोकोक्कल न्युकेली का उपयोग किया था। एन्जाइमेटिक कर्तन सामान्यतः गैर-क्रास्लिंकित देशी चिप (एन-चिप) के लिए उपयोगी है, जब डीएनए-प्रोटीन बंधन बाधित होने पर sonication हो जाएगा। एन-चिप मुख्यतः हिस्टोन्स और हिस्टोन मॉडिफायर 18 के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। जबकि माइक्रोकोकल न्युकेली को एक अपेक्षाकृत गैर-विशिष्ट एंडो-एक्सोन्युक्लाइज माना जाता है, यह अनुक्रम-विशिष्ट क्लीवलज 1 को प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है। परिणामस्वरूप फ्रे में अनुक्रम-आश्रित पक्षपात हो सकता हैकुछ जीन लोकी 20 की अधिकता के साथ, गैट्स अनुक्रिया पूर्वाग्रह के बिना, sonication बेतरतीब ढंग से आकार के डीएनए टुकड़े बनाता है, और आमतौर पर क्रोस लिंक्ड चिप (एक्स-चिप) के लिए पसंद किया जाता है। हालांकि, प्रत्येक कोशिका या ऊतक प्रकार और सोनिकेटर मॉडल के लिए प्रजनन की स्थिति का पता लगाया जाना चाहिए, और डीएनए के टुकड़े आम तौर पर एंजाइमेटिक कर्तन 16 से अधिक होते हैं। इसके अलावा, नमूना के अधिक-बायोमेसन या पायसीकरण से प्रोटीन विकृति और गिरावट के कारण एंटीबॉडी एपिटॉप्स के नुकसान में कमी आ सकती है।

इम्युनोपास्रेजेशन चरण एक और महत्वपूर्ण कदम है जो चिप्स के परिणामों को बहुत प्रभावित कर सकता है। अग्रोसे मोती डीएनए को गैर-विशिष्ट रूप से बाँधते हैं, और जोड़ा मोतियों की संख्या में भिन्नता विशिष्ट सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात को प्रभावित कर सकती हैं। इसलिए, यह डीएनए प्रोटीन नमूनों में जोड़ा जाने पर agarose bead "slurry" को अच्छी तरह निलंबित रखने के लिए महत्वपूर्ण है। I के लिए इस्तेमाल एंटीबॉडी के संबंध मेंमिमीनोप्रेडिज, सामान्य रूप में, चिप-ग्रेड एंटीबॉडी का उपयोग किया जाना चाहिए और, जहां यह उपलब्ध नहीं हैं, कम से कम इम्यूनोपोपैकेज-ग्रेड एंटीबॉडी को प्राथमिकता दी जानी चाहिए। चूंकि विशिष्ट एपोटोप्स को क्रॉस्लिंकिंग के दौरान नकाबपोषित किया जा सकता है, पॉलिकक्लोनल एंटीबॉडी फायदेमंद होते हैं, क्योंकि वे कई एपिटॉप पहचानते हैं। जोड़ा गया एंटीबॉडी की मात्रा कारक से अधिक होनी चाहिए और इस प्रकार प्रत्येक कारक / एंटीबॉडी के लिए अनुभवपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एंटीबॉडी बाध्यकारी के संतुलन तक पहुंचने के लिए कैनेटीक्स प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अलग होता है, इष्टतम ऊष्मायन शर्तों को प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।

प्रायोगिक सेटअप में कई नियंत्रण और शामिल किए जा सकते हैं। ऐसे मामलों में जहां एक विशिष्ट डीएनए प्रोटीन बाध्यकारी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन किया जाता है, अंतिम विश्लेषण ( यानी पीसीआर या qRT-PCR) में समान टेम्पलेट डीएनए मात्रा प्रदर्शित करने के लिए इनपुट डीएनए नियंत्रण शामिल करना महत्वपूर्ण है। एक एंटीबॉडी नियंत्रण के लिए आवश्यक हैब्याज की प्रोटीन के immunoprecipitation की विशिष्टता की पुष्टि करें आम तौर पर आइसोटाइप-मिलान इम्युनोग्लोबुलिन नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से अनुकूल होते हैं, लेकिन agarose मोतियों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। कभी-कभी, चिप के एक कार्यात्मक प्रयोगात्मक प्रवाह की पुष्टि के लिए सकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग किया जाता है, और इस उद्देश्य के लिए एंटी-हिस्टोन एंटीबॉडी का उपयोग अक्सर किया जाता है। उत्तेजना प्रयोगों में, एक बेहतर सकारात्मक नियंत्रण, ब्याज की प्रोटीन का अनियंत्रण है, प्रोटीन उत्तेजना पर बाध्य होने वाले एक ज्ञात डीएनए क्षेत्र के बाद के अनुक्रम विश्लेषण के साथ। हमारे प्रतिनिधि परिणामों में, पीएआई -1 प्रमोटर के भीतर एसबीई को टीजीएफ-β1- प्रेरित एसएमएडी बाइंडिंग के लिए एक ज्ञात लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया गया था। बिना प्रोटीन बाध्यकारी उत्तेजित किए जाने वाले प्रयोगों में, एक डीएनए अनुक्रम जिसे ब्याज की प्रोटीन के लिए लक्ष्य नहीं माना जाता है, बाद में डीएनए विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। डीएनए विश्लेषण के संबंध में, प्रदूषण से इनकार करने के लिए टेम्पलेट डीएनए के बिना कोई प्रतिक्रिया शामिल करना महत्वपूर्ण है।

चिप एक जीन के लिए ब्याज की एक प्रोटीन की बाध्यकारी को सीधे प्रदर्शित करने के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक है। हालांकि, यह एक कार्यात्मक अध्ययन नहीं है जिन मामलों में एक प्रोटीन की रुचि एक विनियामक भूमिका के बारे में सोचा है, यह भी कार्यात्मक assays, जैसे रिपोर्टर जीन-आधारित assays ( जैसे, luciferase) प्रदर्शन जरूरी है। इन प्रोटोकॉल में, ब्याज की जीन एक रिपोर्टर जीन की नियामक स्थिति में क्लोन है। रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति में ब्याज के जीन का प्रवर्तन अगर उसके पास एक विनियामक कार्य होता है। विशिष्ट प्रोटीन की ब्याज की विनियामक भूमिका की पुष्टि के लिए, या तो दस्तक या दस्तक की कोशिकाओं को उत्पन्न किया जा सकता है जिसमें डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन आनुवंशिक रूप से चुप हो रहा है। एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, ब्याज की प्रोटीन के बंधन को रोकने के लिए नियामक जीन में प्रोटीन बाध्यकारी साइट को बदल दिया जा सकता है। उत्तरार्द्ध दो प्रयोगात्मक डिजाइनों में से, सेल उत्तेजना मार्कर जी की अभिव्यक्ति में न पड़ेगीene।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

यह काम टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर, ह्यूस्टन, टेक्सास (स्टार्टअप फंड, बीबी) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

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References

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