Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l'immunoprecipitazione cromatina

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Genetics

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Summary

Le interazioni tra proteine ​​del DNA sono essenziali per processi biologici multipli. Durante la valutazione delle funzioni cellulari, l'analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è indispensabile per comprendere la regolazione del gene. L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un potente strumento per analizzare in vivo tali interazioni .

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Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

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Abstract

Molti processi cellulari, compresa la replicazione e la riparazione del DNA, la ricombinazione del DNA e l'espressione genica, richiedono interazioni tra proteine ​​e DNA. Pertanto, le interazioni proteine ​​del DNA regolano molteplici funzioni fisiologiche, patofisiologiche e biologiche, come la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la stabilità del cromosoma, la regolazione epigenetica dei geni e la trasformazione cellulare. Nelle cellule eucariotiche, il DNA interagisce con proteine ​​istone e non-istone e viene condensato in cromatina. Diversi strumenti tecnici possono essere utilizzati per analizzare le interazioni tra proteine ​​del DNA, come l'EMSS (Electrophoresis (Gel)) e DNase I (footprinting). Tuttavia, queste tecniche analizzano l'interazione proteina-DNA in vitro , non all'interno del contesto cellulare. L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è una tecnica che cattura le proteine ​​nei loro siti specifici di legame del DNA, consentendo così l'identificazione dell'interazione tra proteine ​​del DNAAll'interno del loro contesto cromatico. Viene fatta con la fissazione dell'interazione tra proteine ​​del DNA, seguita da immunoprecipitazione della proteina di interesse. Successivamente, si caratterizza il sito genomico cui è legata la proteina. Qui descriviamo e discutiamo il ChIP e dimostriamo il suo valore analitico per l'identificazione del legame di trasformazione Factor-β (TGF-β) del fattore di trascrizione SMAD2 a SMAD Binding Elements (SBE) all'interno della regione promotore della tirosina- Proteina chinasi Kit (c-KIT) del recettore del fattore cellule staminali (SCF).

Introduction

Nel nucleo degli eucarioti, il DNA interagisce con proteine ​​dell'istone e proteine ​​non-istone ed è condensato in cromatina. Nel contesto fisiologico, patofisiologico e biologico delle cellule, le funzioni cellulari sono controllate spazialmente e temporaneamente dall'espressione genica coordinata con cromatina. Le interazioni tra proteine ​​del DNA hanno un ruolo essenziale nella regolazione dei processi cellulari, come la replicazione del DNA, la ricombinazione e la riparazione, così come l'espressione di proteine. Pertanto, l'analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è uno strumento indispensabile nella valutazione dell'espressione genica e della funzione cellulare.

Esistono diverse tecniche per valutare le interazioni proteiche del DNA in vitro , come l'EMPE (Electrophoresis (Gel)) e DNase I footprinting 1 , 2 . Tuttavia, queste tecniche non analizzano l'interazione proteina-DNA all'interno del contesto cromatina e cellulare. ChIP iTecnica che cattura le proteine ​​legate ai loro specifici siti di legame del DNA e quindi facilita l'identificazione delle interazioni tra proteine ​​del DNA all'interno del contesto cromatico. La tecnica è stata originariamente sviluppata da Gimour e Lis per la valutazione della RNA polimerasi II legata a geni specifici in Escherichia coli e Drosophila melanogaster 3 , 4 . Viene effettuata mediante la fissazione dei complessi proteici del DNA, seguita dall'estrazione di cromatina e tagliando il DNA in frammenti di 200 paia di base (bp). Successivamente, la proteina di interesse legata al DNA viene isolata mediante immunoprecipitazione. Dopo l'inversione del DNA-protein crosslink, il DNA viene purificato e analizzato. Diversi metodi possono essere utilizzati per l'analisi dei siti di legame delle proteine ​​e dipendono dalla sequenza di acido nucleico del sito di legame della proteina all'interno del gene bersaglio 5 . Nei casi in cui è nota la sequenza del DNA, standard PolPossono essere applicate reazioni a catena ymerase (PCR), utilizzando coppie di primer specifiche che fiancheggiano il noto sito di legame. È possibile utilizzare anche il PCR quantitativo in tempo reale (qRT-PCR) 6 . Nei casi in cui la sequenza è sconosciuta, ChIP può essere combinato con microarray di DNA (ChIP-on-chip), sequenza di DNA (ChIP-seq) o tecniche di clonazione 7 , 8 , 9 .

Il percorso TGF-β ha potenti funzioni di soppressione del tumore ed è un percorso chiave nella differenziazione cellulare. Viene attivato attraverso il legame del legante TGF-β1 al suo complesso recettore cognato, con conseguente fosforilazione della serina dei fattori di trascrizione SMAD2 / 3. Dopo la loro associazione con il mediatore comune, SMAD4, il complesso SMAD trasloca al nucleo e si lega all'SBE all'interno della regione promotore dei geni bersaglio, dove regola i geni che controllano il ciclo cellulare, l'apoptosi e le cellule differenziatesopra. La risposta trascrizionale alla stimolazione TGF-β è tipologia di cellule e contesto-specifico 10 . Recentemente abbiamo descritto un ciclo di feedback positivo tra TGF-β e il percorso c-KIT 11 . In questo modello, SMAD2 attivato da TGF-β1 si lega al promotore di ligandi del c-KIT e induce la sua espressione e secrezione. Successivamente, il ligando c-KIT attiva il recettore c-KIT in modo auto- e para-crinico. L'attivazione del recettore del c-KIT determina la presenza di STAT3 Tyr 705- fosforilazione tramite JAK1 / 2. A seguito dell'attivazione STAT3 e della traslocazione nucleare, STAT3 si lega al gene ligand TGF-β1 e regola la sua espressione.

Qui dimostriamo il ruolo essenziale dell'analisi ChIP per l'identificazione della legame SMAD2 al promotore del ligando del recettore c-KIT e per l'identificazione del trasduttore del segnale (e) attivatore (di) della trascrizione 3 (legame STAT3 al TGF-β1- gene).

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Protocol

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparare le seguenti soluzioni fresche per ogni esperimento.
    1. Per la soluzione di fissazione , preparare la formaldeide al 37% e conservarla a RT. Diluire in 1x salina fosfata-bufferizzata (PBS) ad una concentrazione finale di 1,42%.
      ATTENZIONE: La formaldeide è classificata come irritante, corrosiva, mutagena, teratogena e cancerogena. Non ingerire. Non respirare gas / fumo / vapore / spray. In caso di ventilazione insufficiente, indossare apparecchiature respiratori adeguate. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Tenere lontano da incompatibili, come agenti ossidanti, agenti riducenti, acidi, alcali e umidità.
    2. Per la soluzione di stop-fix della glicina, preparare 0.125 M glicina in soluzione 1x PBS e conservarla a RT.
    3. Per la soluzione di raschiatura cellulare, preparare una soluzione 1x PBS in dH 2 O e conservarla su ghiaccio. Direttamente prima dell'uso, aggiungere fenilmetilsolfonilfluoruro (PMSF) inibitore della proteinaO una concentrazione finale di 0,5 mM.
      ATTENZIONE: PMSF è classificato come corrosivo e tossico; Indossare indumenti protettivi e utilizzarlo in un'area ventilata.
    4. Prima di utilizzare il tampone di lisi di cellule (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl e 0,5% NP40), aggiungere 1 x Protease Inhibitor Cocktail (PIC; 100X soluzione in dimetilsolfossido (DMSO): 104 mM 4- 2-amminoetil) benzensolfonil fluoruro di cloruro (AEBSF), 80 μM aprotinina, 4 mM bestatin, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptina e 1,5 mM peprostatin A) e 0,5 mM PMSF.
    5. Direttamente prima di utilizzare il tampone di lisi nucleare (50 mM di Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA) e 1% di SDS), aggiungere 1X PIC e 0,5 mM PMSF.

2. Fissazione e strappo delle celle

  1. Crescere le cellule alla confluenza del 70-80% su piastre di coltura tissutale da 10 cm. Stimolare le cellule per gli scopi sperimentali.
  2. Rimuovere il mezzo di coltura tissutale, aggiungere 5 ml di soluzione di fissazione e incubareLe cellule per 10 minuti a RT su una piattaforma di agitazione.
  3. Rimuovere la soluzione di fissazione e lavare due volte le cellule con 10 ml di PBS 1x gelato.
  4. Rimuovere il 1x PBS, aggiungere 5 mL di soluzione di stop-fix della glicina e incubare le cellule per 5 minuti a RT su una piattaforma di agitazione.
  5. Rimuovere la soluzione di stop-fix della glicina e lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS 1x ghiaccio freddo.
  6. Rimuovere il 1x PBS, aggiungere 2 ml di soluzione di raschiamento cellulare e raccogliere le cellule utilizzando un raschiatore di cellule. Trasferire le cellule raccolte in un tubo conico su ghiaccio.
  7. Centrifugare i campioni per 10 minuti a 600 xg e 4 ° C.
  8. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi di cellule 1X e incubare su ghiaccio per 30 minuti. In alternativa, congelare il pellet in azoto liquido e conservarlo a -80 ° C.
  9. Una volta che il pellet viene risospeso nel tampone di lisi delle cellule, trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore di riflusso ghiaccio e sfilare per 10 colpi utilizzando un pestl di tipo BE per la distruzione delle cellule.
  10. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga e centrifugare i campioni per 10 minuti a 2.400 xg e 4 ° C.
  11. Scartare il surnatante, risospendere il pellet in 350 μL di tampone di digestione del nucleo e incubare i campioni per 5 minuti a 37 ° C.
  12. Aggiungere la nuclease micrococcica (1 U / μL) e mescolare per vortexing. Incubare i campioni a 37 ° C per 5-20 min; Mescolare i campioni ogni 2 minuti per inversione.
    NOTA: la concentrazione di tempo e enzima differisce tra linee cellulari e potrebbe richiedere l'ottimizzazione in caso di taglio enzimatico non ottimale.
  13. In alternativa, ottenere la cricatura di cromatina per ultrasuoni utilizzando sonicatori disponibili in commercio.
    NOTA: Le condizioni di sonicazione richiedono l'ottimizzazione. Di seguito viene fornito un protocollo di esempio di ottimizzazione utilizzando un volume di campionamento di 300 μL e una potenza di elaborazione del campione del 25%.
    1. Seguire il punto 2.10, scartare il surnatante e risospendere il nPellicola uclear in 1,0 mL di tampone commerciale.
    2. Aliquota 300 μL del pellet nucleare risospeso in tre tubi di microcentrifuga da 1,7 ml. Posizionarli su ghiaccio.
    3. Scorri le 3 aliquote di cromatina fissa al 25% di potenza utilizzando 3 condizioni diverse per determinare le condizioni ottimali di sonicazione:
      5 impulsi di 20 s ciascuno, con 30 secondi di riposo su ghiaccio tra ogni impulso.
      10 impulsi di 20 s ciascuno, con 30 secondi di riposo su ghiaccio tra ogni impulso.
      20 impulsi di 20 s ciascuno, con 30 secondi di riposo su ghiaccio tra ogni impulso.
    4. Continuare con il passo 2.15 come descritto di seguito.
  14. Dopo l'incubazione con la nucleasi micrococcica, aggiungere 7 μl di 0.5 M EDTA ghiacciata per fermare la reazione.
  15. Centrifugare i campioni con il DNA triturato per 10 min a 16.200 xg e 4 ° C.
  16. Trasferire il surnatante contenente DNA in un tubo di microcentrifuga fresco. Aliquota 50 μL in un tubo di microcentrifuga separato per confermare la suTaglio ccesso del DNA (sezione 3). Usare immediatamente il residuo volume per l'immunoprecipitazione (sezione 4) o conservarlo a -80 ° C.

3. Conferma dell'efficienza di taglio

  1. Aggiungere 150 μL di dH2O senza nucleasi e 10 μL di 5 M NaCl alla aliquota di 50 μl della cromatina tagliata dalla fase 2.16.
  2. Incubare i campioni a 65 ° C per 4 ore per invertire i collegamenti incrociati.
  3. Aggiungere 2 μL di RNasi A (10 μg / μL) e incubare i campioni a 37 ° C per 15 min.
  4. Aggiungere 10 μL di proteinasi K (0,5 μg / μL) e incubare i campioni a 42 ° C per 90 min.
  5. Per la purificazione del DNA, eseguire un'estrazione di fenolo / cloroformio 12 .
    1. Aggiungere acqua senza nucleasi a un volume finale di 200 μL. Aggiungere 200 μl di fenolo: cloroformio: isoamilico (25: 24: 1) al campione e vortexare per 20 sec.
    2. Centrifugare in camera temPerature per 5 min a 16.000 x g. Rimuovere con cautela la fase acquosa superiore e trasferirla in un tubo fresco. Assicurarsi di non portare alcun fenolo durante la pipettazione.
    3. Aggiungere 0,1 volumi di 3 M di sodio acetato (NH 4 OAc), pH 5,2 e mescolare agitando il tubo più volte con un dito. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100% di ghiaccio e mescolare per vortice per 5 s. Incubare il campione O / N a -20 ° C o per almeno 1 h a -80 ° C.
    4. Centrifugare il campione per 30 minuti a 4 ° C e 16.000 xg per il pellet di cDNA.
    5. Rimuovere con cautela il surnatante senza interrompere il pellet. Aggiungere 1 ml di RT, il 70% di etanolo e invertire il tubo più volte.
    6. Centrifugare il campione per 2 min a 4 ° C e 16.000 x g. Rimuovere con cautela il surnatante.
    7. Asciugare il pellet per 5-10 minuti a RT. Resuspendere il pellet in 30 μl di dH 2 O.
  6. Utilizzare un' aliquota di 5 e 10 μl del DNA purificato per l'elettroforesi con gel con un TAE dell'1%Gel agarosio.
    NOTA: La successiva cottura di cromatina provoca un DNA pattern di 200-1.500 bp. Se la tranciatura non è riuscita, determinare le condizioni di taglio ottimali per le celle specifiche modificando il tempo di incubazione della fase di taglio (passo 2.12) a 5, 10 e 15 min.
  7. Utilizzare il campione rimanente per analizzare la concentrazione del DNA del campione. Calcola invertire la concentrazione del DNA nel campione di cromatina tritato (punto 2.16); Utilizzare gli stessi valori di DNA per ogni gruppo di trattamento per l'immunoprecipitazione (sezione 4).

4. Immunoprecipitazione

  1. Combinare 10-25 μg di cromatina triturata e incrociata (passo 2.16) con 25 μL di branchi magnetici di proteina ChIP-grado G, 10 μl di tampone di diluizione immunoprecipitanti (soluzione di riserva: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 mM EDTA e 167 mM NaCl) e 1 μl di PIC.
  2. Dopo 4 ore di incubazione, aggiungere 1-10 μg di anticorpo (il concentrato anticorpaleVariazione in base all'affinità dell'anticorpo; Si dovrebbe inizialmente essere utilizzato per raccomandazioni del produttore e ottimizzato sperimentalmente se necessario) ad un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere dH 2 O ad un volume finale di 100 μL.
    NOTA: Invece del metodo di immunoprecipitazione diretta sopra descritto, il metodo immunoprecipiation indiretto può essere utilizzato combinando prima la cromatina con gli anticorpi e successivamente aggiungendo branchi magnetici della proteina G.
  3. Incubare i campioni su un rotatore end-to-end per 4-12 h a 4 ° C.

5. Eluzione

  1. Posizionare i tubi su un supporto magnetico. Una volta che le perle magnetiche si aggregano sul lato del tubo, rimuovono attentamente e scartano il surnatante.
  2. Lavare le perle tre volte con 800 μL di tampone di lavaggio 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 e 150 mM NaCl); Mescolare invertendo il tubo diverse volte. Mettere il tubo sul supporto magnetico aEliminare con cura e scartare il tampone di lavaggio una volta che le perle magnetiche si aggregano sul lato del tubo.
  3. Lavare le perle una volta con 800 μl di tampone di lavaggio 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 e 500 mM NaCl); Mescolare invertendo il tubo diverse volte. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e rimuovere accuratamente e scartare il tampone di lavaggio dopo che le perle magnetiche si aggregano sul lato del tubo.
  4. Resuspendere le perle in 50 μl di tampone di eluizione (1% SDS e 100 mM NaHCO3) e incubare i campioni su un rotatore end-to-end per 15 minuti a RT.
  5. Posizionare i tubi su un supporto magnetico, e una volta che le perle magnetiche si raccolgono sul lato del tubo, trasferire il surnatante su un tubo fresco.
  6. Aggiungere 6 μl di 5 M NaCl, per invertire il reticolazione e 2 μL di proteinasi K (0,5 μg / μL). Dopo aver mescolato i campioni, incubare i campioni per 2 ore a 65 ° C.
  7. Per la purificazione del DNA, eseguire un pheNol / cloroformio 12 (fase 3.5) e successivamente risospendere il pellet in 30 μl di dH2O.
    NOTA: i campioni possono essere analizzati direttamente per siti di legame proteico (sezione 5) o possono essere conservati a -20 ° C.

6. Analisi del sito di rilegatura

  1. Eseguire un'analisi per specifici siti di legame all'interno di una sequenza acido nucleico noto usando PCR o qRT-PCR. Per la progettazione primer, seguire protocolli PCR o qRT-PCR convenzionali. Progettare i primers per sintetizzare un amplicone da 150-400 bp che si unisce al sito di interesse legato alla proteina ( Figura 1 ).
  2. Impostare il PCR usando quattro diversi modelli di DNA per assicurare la specificità: i) DNA da ChIP immunoprecipitato con l'anticorpo interessato, ii) DNA da ChIP immunoprecipitato con un anticorpo IgG non specifico, iii) DNA in ingresso e iv) H 2 O come un Controllo negativo per il PCR per escludere la contaminazione. Nel caso della stimolazione del percorso, Scegliere una quinta maschera usando un set diverso di primer specifici per un sito di legame noto della proteina immunoprecipitata.
    NOTA: Nel caso dell'analisi del promotore di ligandi del c-KIT, utilizzare il PCR convenzionale per dimostrare l'associazione di SMAD indotta da TGF-β all'SBE all'interno della regione promotore del ligand di c-KIT. Come controllo positivo, eseguire PCR sull'inhibitor-1 (PAI-1) dell'attivatore di plasminogeno come un bersaglio noto del legame SMAD indotto da TGF-β.

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Representative Results

Il legame del TGF-β1 ligando al suo complesso recettore cognato determina la fosforilazione della serina dei fattori di trascrizione SMAD2 / 3, seguita dalla loro associazione con il mediatore comune, SMAD4. Il complesso SMAD trasloca al nucleo. TGF-β può regolare la trascrizione genica, direttamente tramite SMAD, legame a SBE all'interno di regioni di regolazione dei geni bersaglio, oppure indirettamente attraverso l'espressione regolata da SMAD di attivatori o repressori trascrizionali che regolano successivamente l'espressione del gene di interesse 10 . Per verificare se il legame SCF di c-KIT è regolato trascrittivamente dal legame TGF-β1 indotto da SMAD2 al suo promotore, abbiamo analizzato la regione SCF contenente il 2,4-kb, 5'-flanking del gene SCF Motivo di legame SMAD2, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . Abbiamo identificato 7 SBE ups propostiTream del codone d'inizio SCF ( Figura 1A ). Per confermare il legame TGF-β1-indotto di SMAD2 al promotore SCF, è stato eseguito il test ChIP qui descritto. Il trattamento TGF-β1 ha determinato l'associazione SMAD2 al promotore SCF nelle linee di cancro del fegato umano, HepG2 e Hep3B, ( Figura 1B ). In assenza di stimolazione TGF-β1, non è stata osservata nessuna associazione SMAD. Come controllo positivo per l'attivazione SMAD indotta da TGF-β1, è stata eseguita la ChIP per PAI-1. Il promotore PAI-1 è un bersaglio noto di TGF-β / SMAD 13 . Per confermare la specificità dell'immunoprecipitazione SMAD2, sono stati utilizzati anticorpi IgG non specifici; Nessun SMAD2 legame all'SBE è stato osservato dopo immunoprecipitazione con IgG.

Per un'altra dimostrazione della tecnologia ChIP, abbiamo analizzato la regione 5'-flanking del gene del ligand TGF-β per i motivi di legame STAT3 di legame 5 '-TT (N4) AA-3 'e 5'-TT (N5) AA-3' 15 . Abbiamo identificato due siti di legame STAT3 a monte del codone di inizio TGFB in posizioni -4384 / -4373 (STB-1) e -5365 / -5357 (STB-2) ( Figura 2A ). Per confermare il legame TGF-β1-indotto di STAT3 sul gene ligand TGF-β, abbiamo eseguito test ChIP utilizzando cellule HepG2 e Hep3B trattate con TGF-β1. Il trattamento con TGF-β1 ha determinato il legame STAT3 al secondo sito di legame STAT3 (STB-2) del gene TGFB, ma non al primo (STB-1) ( Figura 2B ). In questo esempio, il legame STAT3 positivo a STB-2 serve come un controllo positivo interno. Simile al precedente esperimento ChIP, il legame STAT3 con STB-2 non è stato osservato dopo l'immunoprecipitazione usando IgG.

Figura 1
Figura 1 Ong>: SMAD2 indotta da TGF-β-binding al promotore SCF. ( A ) Rappresentazione schematica del promotore SCF , con SBE putativi mostrati come scatole (caselle bianche = AGAC) con la loro posizione relativa al codone iniziale. La posizione del primer ChIP è mostrata sotto, con le posizioni relative al codone di inizio SCF e la dimensione del prodotto PCR. ( B ) ChIP per SMAD2 legato al promotore SCF . I complessi di proteine ​​cromatiniche delle cellule HepG2 e Hep3B trattate con TGF-β1 e non trattate sono state immunoprecipitate con anticorpo anti-SMAD2. PCR è stata eseguita usando primers specifici SCF. Sulla sinistra vengono mostrati risultati PCR utilizzando il DNA di input. Nel mezzo, risultati PCR dopo immunoprecipitazione con IgG non specifico sono mostrati per la conferma della specificità immunoprecipitazione SMAD2. Nello schermo inferiore, ChIP per SMAD2 è stato utilizzato come controllo positivo.Ge.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2 : legame STAT3 indotto da TGF-β per il gene TGF-β. ( A ) Schema del gene TGF-β, con siti di binding STAT3 indicati come scatole grigie con la loro posizione relativa al codone iniziale. Le posizioni dei primer ChIP sono mostrate con le loro posizioni relative al codone di inizio TGF-β e le dimensioni dei prodotti PCR indicati di seguito. ( B ) ChIP per il legame STAT3 indotto da TGF-β1 al gene TGF-β. I complessi di proteine ​​cromatiniche delle cellule HepG2 e Hep3B trattate e non trattate con TGF-β1 sono state immunoprecipitate con anticorpo anti-STAT3. La PCR è stata eseguita usando primers specifici TGF-β. A sinistra, vengono visualizzati i risultati del PCR utilizzando il DNA di input. Al centro, il PCRI risultati dopo immunoprecipitazione con IgG non specifico sono mostrati per confermare la specificità di immunoprecipitazione STAT3. Il pannello superiore mostra i risultati del PCR utilizzando primer specifici per il sito di legame STAT3 (STB-1) e il pannello inferiore mostra i risultati per il legame STAT3 al sito di legame STAT3 (STB-2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo rapporto dimostriamo il legame di SMAD2 indotto da TGF-β1 a un SBE all'interno del promotore di ligandi del c-KIT e del legame di STAT3 indotto da TGF-β1 alla sua sequenza di riconoscimento all'interno del gene ligand TGF-β1. Abbiamo dimostrato la legame di entrambi i fattori di trascrizione con citocina indotta da immunoprecipitazione cromatina.

L'immunoprecipitazione di cromatina è un potente strumento per dimostrare il legame diretto di una proteina di interesse per il DNA, per caratterizzare gli stimoli che inducono la legame delle proteine ​​al DNA e per caratterizzare la sequenza di DNA a cui la proteina si lega. Queste ultime informazioni possono aiutare nell'identificazione di geni regolati da una proteina specifica di interesse e si ottiene utilizzando ChIP-on-chip, ChIP-seq, o strategie di clonazione 7 , 8 , 9 . Uno dei principali vantaggi della ChIP rispetto ad altri metodi di dimostrazione della legame delle proteine ​​del DNA, Come EMSA o DNase I, è che, nella tecnologia ChIP, il legame viene catturato in vivo , mentre con gli altri viene eseguito in vitro . Quindi, ChIP fornisce una visione della legame di proteine ​​del DNA all'interno del contesto cellulare, mentre le altre tecniche rappresentano un sistema isolato.

Tuttavia, l'analisi ChIP è complessa, comporta passaggi multipli che possono influenzare i risultati e richiede ottimizzazione ed esperienza. Uno dei primi passi critici per il successo di ChIP è il passaggio crosslink (passaggio 2.2). Il reticolazione UV è irreversibile e pertanto inadatto per il ChIP. È preferibile la reticolazione di formaldeide, ma la concentrazione di formaldeide e il tempo di reticolazione possono influire sia sull'efficienza della cottura di cromatina e sulle precipitazioni di antigene. In generale, sono preferibili concentrazioni di formaldeide inferiori (1% w / v) e tempi di reticolazione più brevi (5-10 minuti), poiché migliorano l'efficienza di taglio. Tuttavia, la formaldeide non è efficienteA crosslinking proteina-proteina e pertanto è poco ottimale per le proteine ​​che non si legano direttamente al DNA 16 . Per questi casi, ChIP può essere fatta in un approccio a due fasi, in cui la reticolazione proteico-proteica viene fatta prima utilizzando crosslinkers come il glucutato disuccinimidilico, seguito da reticolazione di DNA-proteina mediata da formaldeide 17 .

Il prossimo passo critico è la cricatura di cromatina. Nel nostro studio abbiamo utilizzato tagli enzimatici utilizzando la nucleasi micrococcica. La cimatura enzimatica è particolarmente utile per il ChIP nativo non collegato (N-ChIP), quando la sonicazione interromperà la legame delle proteine ​​del DNA. N-ChIP è prevalentemente utilizzato per l'analisi di istoni e modificatori istoni 18 . Mentre la nucleasi micrococcica è considerata una endo-esonucleasi relativamente non specifica, è stato dimostrato che elimina la scissione sequenziale-specifica 19 . Ciò può provocare una polarizzazione dipendente dalla sequenza nella frazione risultante, Con sovrapresentazione di determinati gene loci 20 . La sonicazione crea frammenti di DNA casuali, senza bias di sequenza, ed è generalmente preferibile per ChIP reticolato (X-ChIP). Tuttavia, le condizioni di sonicazione devono essere determinate empiricamente per ogni modello di cellule o tipo di tessuto e del sonicatore e i frammenti di DNA risultanti sono generalmente più grandi che con la tranciatura enzimatica 16 . Inoltre, la sovra-sonicazione o l'emulsionazione del campione può provocare la perdita di epitopi anticorpali a causa della denaturazione e del degrado della proteina.

La fase di immunoprecipitazione è un altro passo critico che può influenzare notevolmente i risultati di ChIP. Le perle di agarosio legano il DNA in modo non specifico e la variazione del numero di brani aggiunti può influire sul rapporto specifico tra segnale e background. Quindi, è importante mantenere sospesa la "slurry" del grano agarosio quando viene aggiunta ai campioni di proteine ​​del DNA. Per quanto riguarda l'anticorpo utilizzato per iIn genere, le precipitazioni, in generale, devono essere utilizzate anticorpi ChIP-grade e, nel caso in cui questi non siano disponibili, almeno l'anticorpo di immunoprecipitazione deve essere preferito. Come epitopi specifici possono essere mascherati durante il reticolazione, gli anticorpi policlonali sono vantaggiosi, in quanto riconoscono diversi epitopi. La quantità di anticorpo aggiunto dovrebbe essere superiore al fattore precipitato e quindi deve essere determinato empiricamente per ogni fattore / anticorpo. Inoltre, poiché la cinetica per raggiungere l'equilibrio del legame degli anticorpi si differenzia per ogni anticorpo, occorre determinare le condizioni ottimali di incubazione per ciascun anticorpo.

Diversi controlli possono e devono essere inclusi nella configurazione sperimentale. Nei casi in cui viene valutata l'induzione di una specifica reazione di legame con la DNA, è importante includere un controllo del DNA di input per dimostrare l'equivalente di DNA di template nell'analisi finale ( vale a dire PCR o qRT-PCR). È necessario un controllo anticorpaleConfermano la specificità dell'immunoprecipitazione della proteina di interesse. Normalmente le immunoglobuline corrispondenti all'isotipo sono ben adattate come controlli negativi, ma possono essere utilizzati anche branchi di agarosio. Occasionalmente, controlli positivi vengono utilizzati per confermare un flusso sperimentale funzionale del ChIP, e spesso vengono utilizzati anticorpi anti-istone a questo scopo. Negli esperimenti di stimolazione, un preferibile controllo positivo è l'immunoprecipitazione della proteina di interesse, con successiva analisi di sequenza per una regione di DNA nota le proteine ​​si legano alla stimolazione. Nei nostri risultati rappresentativi, l'SBE all'interno del promotore PAI-1 è stato usato come un bersaglio noto per il legame SMAD indotto da TGF-β1. Negli esperimenti senza legame proteico stimolato, una sequenza DNA nota per non essere un bersaglio per la proteina di interesse può essere utilizzata per la successiva analisi del DNA. Per quanto riguarda l'analisi del DNA, è importante includere una reazione senza template DNA per escludere la contaminazione.

ChIP è una tecnica eccellente per dimostrare direttamente il legame di una proteina di interesse a un gene. Tuttavia, non è uno studio funzionale. Nei casi in cui una proteina di interesse si pensa di avere un ruolo regolatore, è indispensabile eseguire anche test funzionali, come i test reporter a base di gene ( ad es. Luciferasi). In questi protocolli, il gene di interesse è clonato in una posizione regolatoria di un gene reporter. L'induzione del gene di interesse provoca l'espressione del gene reporter se ha una funzione regolatoria. Per ulteriore conferma del ruolo di regolamentazione della proteina specifica di interesse, si possono generare cellule di abbattimento o di colpi in cui la proteina legante del DNA viene geneticamente tacitata. Come un ulteriore controllo, il sito di legame delle proteine ​​nel gene regolatore può essere mutato per impedire il legame della proteina di interesse. In uno dei due ultimi progetti sperimentali, la stimolazione cellulare non determinerà l'espressione del marcatore gene.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università del Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (fondi di avvio, BB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

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References

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