Analys av c-KIT-ligand-promotorn med användning av kromatinimmunfällning

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

DNA-protein interaktioner är väsentliga för flera biologiska processer. Under utvärderingen av cellulära funktioner är analysen av DNA-protein interaktioner oumbärlig för att förstå genreglering. Kromatinimmunutfällning (ChIP) är ett kraftfullt verktyg för att analysera sådana interaktioner in vivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multipla cellulära processer, inklusive DNA-replikation och reparation, DNA-rekombination och genuttryck, kräver interaktioner mellan proteiner och DNA. Därför reglerar DNA-proteininteraktioner multipla fysiologiska, patofysiologiska och biologiska funktioner, såsom celldifferentiering, cellproliferation, cellcykelstyrning, kromosomstabilitet, epigenetisk genreglering och celltransformation. I eukaryota celler interagerar DNA med histon- och nonhistonproteiner och kondenseras till kromatin. Flera tekniska verktyg kan användas för att analysera DNA-proteininteraktioner, såsom elektrofotografi (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) och DNase I-fotavtryck. Dessa tekniker analyserar emellertid protein-DNA-interaktionen in vitro , inte inom det cellulära sammanhanget. Kromatinimmunutfällning (ChIP) är en teknik som fångar proteiner vid deras specifika DNA-bindningsställen, vilket möjliggör identifiering av DNA-proteininteraktionS inom deras kromatinkontext. Det görs genom fixering av DNA-proteininteraktionen, följt av immunutfällning av proteinet av intresse. Därefter karakteriserades den genomiska platsen som proteinet var bunden till. Här beskriver och diskuterar vi ChIP och demonstrerar dess analytiska värde för identifieringen av transformerande tillväxtfaktor-p (TGF-p) -inducerad bindning av transkriptionsfaktorn SMAD2 till SMAD-bindande element (SBE) inom promotorområdet hos tyrosin- Proteinkinas (c-KIT) -receptorligandstamcellsfaktor (SCF).

Introduction

I kärnan av eukaryoter interagerar DNA med histonproteiner och nonhistonproteiner och kondenseras till kromatin. I det fysiologiska, patofysiologiska och cellbiologiska sammanhanget kontrolleras cellfunktionerna rumligt och temporärt av kromatinkoordinerat genuttryck. DNA-protein-interaktioner har en väsentlig roll vid reglering av cellulära processer, såsom DNA-replikation, rekombination och reparation, såväl som proteinuttryck. Därför är analysen av DNA-protein-interaktioner ett oumbärligt verktyg vid utvärderingen av genuttryck och cellfunktion.

Flera tekniker existerar för att bedöma DNA-protein-interaktioner in vitro , såsom elektrofiles (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) och DNase I fotavtryck 1 , 2 . Emellertid analyserar dessa tekniker inte protein-DNA-interaktionen inom kromatin och cellulärt sammanhang. ChIP iEn teknik som fångar proteiner bundna till deras specifika DNA-bindningsställen och därmed underlättar identifieringen av DNA-protein-interaktioner inom kromatinkontexten. Tekniken var ursprungligen utvecklad av Gimour och Lis för bedömningen av RNA-polymeras II-bindning till specifika gener i Escherichia coli och Drosophila melanogaster 3 , 4 . Det görs genom fixering av DNA-proteinkomplexen, följt av utmatning av kromatin och skjuvning av DNA i ~ 200 baspar (bp) -fragment. Därefter isoleras det DNA-bundna proteinet av intresse genom immunutfällning. Efter reversering av DNA-proteintvärbindningen renas och analyseras DNA. Flera metoder kan användas för analys av proteinbindningsställena och beror på nukleinsyrasekvensen hos proteinbindningsstället inom målgenen 5 . I fall där DNA-sekvensen är känd, standardpolYmeras kedjereaktioner (PCR) kan appliceras, med användning av specifika primerpar som flankerar det kända bindningsstället. Kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR) kan också användas 6 . I fall där sekvensen är okänd kan ChIP kombineras med DNA-mikroarrays (ChIP-on-chip), DNA-sekvensering (ChIP-seq) eller kloningsteknik 7 , 8 , 9 .

TGF-P-vägen har kraftiga tumörundertryckande funktioner och är en nyckelväg i celldifferentiering. Det aktiveras genom bindning av TGF-P1-liganden till dess kognitiva receptorkomplex, vilket resulterar i serin-fosforylering av SMAD2 / 3-transkriptionsfaktorer. Efter deras förening med den gemensamma mediatorn, SMAD4, translaterar SMAD-komplexet till kärnan och binder till SBE inom promotorregionen hos målgenerna, där det reglerar gener som kontrollerar cellcykeln, apoptos och celldifferentieringenpå. Det transkriptionella svaret på TGF-p-stimulering är celltyp- och kontextspecifik 10 . Nyligen har vi beskrivit en positiv återkopplingsslinga mellan TGF-p och c-KIT-vägen 11 . I denna modell binder TGF-p1-aktiverad SMAD2 till c-KIT ligandpromotorn och inducerar dess uttryck och utsöndring. Därefter aktiverar c-KIT-liganden c-KIT-receptorn på ett auto-och para-kriniskt sätt. C-KIT-receptoraktivering resulterar i STAT3 Tyr 705- fosforylering via JAKl / 2. Efter STAT3-aktivering och nukleär translokation binds STAT3 till TGF-P1 ligandgenen och reglerar dess uttryck.

Här demonstrerar vi den väsentliga rollen av ChIP-analys för identifiering av SMAD2-bindning till c-KIT-receptorligandpromotorn och för identifiering av signaltransducer (och) aktivator (av) transkription 3 (STAT3-bindning till TGF-P1- gen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av lösningar

  1. Förbered följande lösningar färskt för varje experiment.
    1. För fixeringslösningen , förbered 37% formaldehyd och förvara den vid RT. Späd det i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig koncentration av 1,42%.
      VARNING: Formaldehyd klassificeras som irriterande, frätande, mutagena, teratogena och cancerframkallande. Förtär inte. Andas inte in gas / ånga / ånga / spray. Vid otillräcklig ventilation, använd lämplig andningsutrustning. Undvik kontakt med hud och ögon. Förvaras borta från inkompatibla ämnen, såsom oxidationsmedel, reduktionsmedel, syror, alkalier och fukt.
    2. För glycinupplösningslösningen, bereda 0,125 M glycin i 1x PBS-lösning och förvara den vid RT.
    3. För cellskraplösningen, bereda en 1x PBS-lösning i dH2O och förvara den på is. Direkt före användning, tillsätt proteinasinhibitoren fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) tEn slutkoncentration av 0,5 mM.
      VARNING: PMSF klassificeras som frätande och giftigt; Använd skyddskläder och använd det i ett ventilerat utrymme.
    4. Direkt innan du använder celllysbufferten (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl och 0,5% NP40), tillsätt 1X proteashämmare Cocktail (PIC; 100X stamlösning i dimetylsulfoxid (DMSO): 104 mM 4- 2-aminoetyl) bensensulfonylfluoridhydroklorid (AEBSF), 80 | iM aprotinin, 4 mM bestatin, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptin och 1,5 mM pepstatin A) och 0,5 mM PMSF.
    5. Direkt innan man använder kärnljusbufferten (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och 1% SDS) tillsättes 1X PIC och 0,5 mM PMSF.

2. Cellfixering och skärning

  1. Växa cellerna till 70-80% sammanflöde på 10 cm vävnadsodlingsplattor. Stimulera cellerna enligt försöksmålen.
  2. Ta bort vävnadsodlingsmediet, tillsätt 5 ml fixeringslösning och inkuberaCellerna i 10 minuter vid RT på en skakplattform.
  3. Ta bort fixeringslösningen och tvätta cellerna två gånger med 10 ml iskall 1x PBS.
  4. Ta bort 1x PBS, tillsätt 5 ml glycin stoppfixeringslösning och inkubera cellerna i 5 minuter vid RT på en skakplattform.
  5. Ta bort glycine stoppfixeringslösningen och tvätta cellerna två gånger med 10 ml iskall 1x PBS.
  6. Ta bort 1x PBS, tillsätt 2 ml cellskraplösning och skörda cellerna med hjälp av en cellskrapa. Överför de skörda cellerna till ett koniskt rör på is.
  7. Centrifugera proverna i 10 minuter vid 600 xg och 4 ° C.
  8. Ta bort supernatanten, resuspendera pelleten i 1 ml 1X celllysbuffert och inkubera på is i 30 minuter. Alternativt, frossa pelleten i flytande kväve och förvara den vid -80 ° C.
  9. När pelleten har återuppslammats i celllysbufferten överför celmisuspensionen till en iskall dämpningshomogenisator och dounce för 10 slag genom att använda en typ B-pestlE för cellstörning.
  10. Överför cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör och centrifugera proverna i 10 minuter vid 2400 xg och 4 ° C.
  11. Kassera supernatanten, resuspendera pelleten i 350 pi kärnfördelningsbuffert och inkubera proverna i 5 minuter vid 37 ° C.
  12. Tillsätt mikrokocknukleas (1 U / μl) och blanda genom virvelbildning. Inkubera proven vid 37 ° C under 5-20 min; Blanda provet varannan minut genom inversion.
    OBS: Tids- och enzymkoncentrationen skiljer sig mellan cellinjer och kan kräva optimering vid suboptimal enzymatisk skjuvning.
  13. Alternativt uppnår man kromatisk skjuvning genom sonikering med användning av kommersiellt tillgängliga sonikatorer.
    OBS! Sonication vill kräva optimering. Ett optimeringsexempelprotokoll tillhandahålls nedan med användning av en provvolym av 300 pl och en provbehandlingseffekt på 25%.
    1. Efter steg 2.10 kasseras supernatanten och resuspenderar nUclear pellet i 1,0 ml kommersiell skjuvningsbuffert.
    2. Aliquot 300 μL av den resuspenderade kärnpelleten i tre 1,7 ml mikrocentrifugrör. Placera dem på is.
    3. Skär de 3 alikvoter av fixerat kromatin vid 25% effekt med 3 olika förhållanden för att bestämma de optimala ljudbildningsförhållandena:
      5 pulser av 20 s vardera, med en 30 s vila på is mellan varje puls.
      10 pulser av 20 s vardera, med en 30 s vila på is mellan varje puls.
      20 pulser av 20 s vardera, med en 30 s vila på is mellan varje puls.
    4. Fortsätt med steg 2.15, som beskrivs nedan.
  14. Efter inkubationen med mikrokocknukleaset tillsättes 7 μl iskall 0,5 M EDTA för att stoppa reaktionen.
  15. Centrifugera proverna med det skjuvade DNA i 10 minuter vid 16 200 xg och 4 ° C.
  16. Överför den skjuvade DNA-innehållande supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör. Aliquot 50 μL i ett separat mikrocentrifugrör för att bekräfta suCcessful klippning av DNA (avsnitt 3). Använd återstående volym omedelbart för immunutfällning (avsnitt 4) eller förvara den vid -80 ° C.

3. Bekräftelse av skärningseffektiviteten

  1. Tillsätt 150 μL nukleasfri dH20 och 10 μl 5 M NaCl till 50 μl alikvoten av det skjuvade kromatinet från steg 2.16.
  2. Inkubera proven vid 65 ° C i 4 h för att vända tvärbindningarna.
  3. Tillsätt 2 μl RNase A (10 μg / μl) och inkubera proven vid 37 ° C under 15 minuter.
  4. Tillsätt 10 μl proteinas K (0,5 μg / μl) och inkubera proven vid 42 ° C under 90 minuter.
  5. För rening av DNA: n utförs en fenol / kloroform extraktion 12 .
    1. Tillsätt nukleasfritt vatten till en slutlig volym av 200 pl. Tillsätt 200 μl fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) till provet och virvel i 20 s.
    2. Centrifugera vid rumstemperaturPeratur i 5 min vid 16 000 x g. Ta försiktigt bort den övre vattenfasen och överför den till ett nytt rör. Var noga med att inte överföra någon fenol under pipetteringen.
    3. Tillsätt 0,1 volymer 3 M natriumacetat (NH 4 OAc), pH 5,2 och blanda genom att flicka röret flera gånger med ett finger. Tillsätt 2,5 volymer iskall 100% etanol och blanda genom vortexning i 5 s. Inkubera provet O / N vid -20 ° C eller i minst 1 h vid -80 ° C.
    4. Centrifugera provet i 30 min vid 4 ° C och 16 000 xg för att pelletsera cDNA.
    5. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten. Tillsätt 1 ml RT, 70% etanol och invertera röret flera gånger.
    6. Centrifugera provet i 2 min vid 4 ° C och 16 000 x g. Ta försiktigt bort supernatanten.
    7. Torka pelleten i 5-10 minuter vid RT. Resuspendera pelleten i 30 pl dH20.
  6. Använd en 5 och 10 μl alikvot av det renade DNA för gelelektrofores med en 1% TAEAgarosgel.
    OBS! Framgångsrik kromatinskärning resulterar i ett DNA-mönster på 200-1,500 bp. Om skjuvningen misslyckas, bestämma de optimala skjuvningsbetingelserna för de specifika cellerna genom att modifiera inkubationstiden för skjuvningssteget (steg 2.12) till 5, 10 och 15 min.
  7. Använd det kvarvarande provet för att analysera DNA-koncentrationen i provet. Omvänd-beräkna DNA-koncentrationen i det skjuvade kromatinprovet (steg 2.16); Använd samma DNA-mängder för varje behandlingsgrupp för immunutfällningen (avsnitt 4).

4. Immunutfällning

  1. Kombinera 10-25 μg av det skjuvade, tvärbundna kromatinet (steg 2.16) med 25 pl av magnetiska pärlor av ChIP-kvalitet, G, 10 μl immunprecipitationsutspädningsbuffert (stamlösning: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 mM EDTA och 167 mM NaCl) och 1 pl av PIC.
  2. Efter 4 timmars inkubering tillsätt 1-10 μg antikropp (antikroppskoncentrAtionen kommer att variera baserat på antikroppens affinitet; Det bör initialt användas per tillverkarens rekommendationer och experimentellt optimeras om det behövs) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt dH20 till en slutvolym av 100 | il.
    OBS: Istället för den ovan beskrivna direkta immunutfällningsmetoden kan den indirekta immunutfällningsmetoden användas genom att först kombinera kromatinet med antikropparna och därefter tillsätta protein G magnetiska pärlor.
  3. Inkubera proven på en roterande ände till slutet i 4-12 h vid 4 ° C.

5. Eluering

  1. Placera rören på ett magnetiskt stativ. När magnetmagnetpärlaggregatet på rörets sida avlägsnas försiktigt och kassera supernatanten.
  2. Tvätta pärlorna tre gånger med 800 pi tvättbuffert 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 och 150 mM NaCl); Blanda genom att invertera röret flera gånger. Placera röret på magnetstativet aOch försiktigt avlägsna och kassera tvättbufferten när magnetpärlorna aggregat på rörets sida.
  3. Tvätta pärlorna en gång med 800 μl tvättbuffert 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 och 500 mM NaCl); Blanda genom att invertera röret flera gånger. Placera röret på magnetstativet och försiktigt avlägsna och kassera tvättbufferten när magnetpärlorna aggregat på sidan av röret.
  4. Resuspendera pärlorna i 50 | il av elueringsbuffert (1% SDS och 100 mM NaHCOs) och inkubera proven på en end-to-end rotator under 15 minuter vid RT.
  5. Placera rören på ett magnetiskt stativ, och när magnetpärlorna samlar vid sidan av röret, överför supernatanten till ett nytt rör.
  6. Tillsätt 6 μl 5 M NaCl för att vända tvärbindningen och 2 μl proteinas K (0,5 μg / μl). Efter blandning av proven inkuberas proven i 2 timmar vid 65 ° C.
  7. För rening av DNA, utför en pheNol / kloroformutvinning 12 (steg 3.5) och därefter resuspenderar pelleten i 30 pl dH20.
    OBS: Proven kan analyseras direkt för proteinbindningsställen (avsnitt 5) eller kan lagras vid -20 ° C.

6. Bindningsanalys

  1. Utför en analys för specifika bindningsställen inom en känd nukleinsyrasekvens med användning av PCR eller qRT-PCR. För primerdesign, följ konventionella PCR- eller qRT-PCR-protokoll. Design primrarna för att syntetisera ett 150-400 bp amplicon som överbryggar proteinbindningsstället av intresse ( Figur 1 ).
  2. Ställ in PCR med hjälp av fyra olika DNA-mallar för att försäkra specificitet: i) DNA från ChIP immunutfällt med antikroppen av intresse, ii) DNA från ChIP immunutfällt med en ospecifik IgG-antikropp, iii) inmatning av DNA och iv) H2O som en Negativ kontroll för PCR för att utesluta förorening. I fallet med stimulering av vägen, Välj en femte mall med hjälp av en annan uppsättning primers specifika för en känd bindningsplats för det immunprecipiterade proteinet.
    OBS! I fallet med c-KIT-ligandpromotoranalysen använd konventionell PCR för att demonstrera TGF-p-inducerad SMAD-bindning vid SBE inom c-KIT-ligandpromotorområdet. Som en positiv kontroll, utför PCR på plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) som ett känt mål för TGF-p-inducerad SMAD-bindning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bindningen av TGF-P1-liganden till dess kognitiva receptorkomplex resulterar i serin-fosforylering av SMAD2 / 3-transkriptionsfaktorer, följt av deras association med den gemensamma mediatorn, SMAD4. SMAD-komplexet translokerar till kärnan. TGF-p kan reglera gentranskription, antingen direkt via SMAD-bindning till SBE i inriktningsregioner hos målgenerna eller indirekt genom SMAD-reglerat uttryck av transkriptionella aktivatorer eller repressorer som därefter reglerar uttrycket av genen av intresse 10 . För att testa om c-KIT-liganden SCF är transkriptionellt reglerad av den direkta TGF-P1-inducerad bindningen av SMAD2 till dess promotor analyserade vi den SCF-promotorinnehållande, 2,4-kb, 5'-flankerande regionen hos SCF-genen för SMAD2-bindningsmotiv, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . Vi identifierade 7 förmodade SBE-upsTrumma av SCF-startkodonet ( Figur 1A ). För att bekräfta TGF-β1-inducerad bindning av SMAD2 till SCF-promotorn utfördes ChIP-analysen som beskrivs här. TGF-p1-behandlingen resulterade i SMAD2-bindning till SCF-promotorn i humana levercancerlinjer, HepG2- och Hep3B-celler ( Figur 1B ). I frånvaro av TGF-β1-stimulering noterades ingen SMAD-bindning. Som en positiv kontroll för TGF-β1-inducerad SMAD-aktivering utfördes ChIP för PAI-1. PAI-1-promotorn är ett känt mål för TGF-p / SMAD 13 . För att bekräfta specificiteten av SMAD2-immunutfällningen användes ospecifika IgG-antikroppar; Ingen SMAD2-bindning till SBE noterades efter immunutfällning med IgG.

För en annan demonstration av ChIP-tekniken analyserade vi den 5'-flankerande regionen av TGF-p-ligandgenen för STAT3-konsensusbindningsmotiven 5 '-TT (N4) AA-3 'och 5'-TT (N5) AA-3' 15 . Vi identifierade två förmodade STAT3-bindningsställen uppströms TGFB-startkodonet vid positionerna -4384 / -4373 (STB-1) och -5365 / -5357 (STB-2) ( Figur 2A ). För att bekräfta TGF-β1-inducerad bindning av STAT3 till TGF-p-ligandgenen utförde vi ChIP-analyser med användning av TGF-β1-behandlade HepG2- och Hep3B-celler. TGF-β1-behandling resulterade i STAT3-bindning till TGFB-genens andra förmodade STAT3-bindningsställe (STB-2), men inte till den första (STB-1) ( Figur 2B ). I detta exempel tjänar den positiva STAT3-bindningen till STB-2 som en intern positiv kontroll. På liknande sätt som ovanstående ChIP-experiment sågs inte STAT3-bindning till STB-2 efter immunutfällning med användning av IgG.

Figur 1
Figur 1 Ong>: TGF-p-inducerad SMAD2-bindning till SCF-promotorn. ( A ) Schematisk representation av SCF- promotorn, med förmodade SBE som visas som lådor (vita lådor = AGAC) med deras relativa position till startkodonet. ChIP-primerplatsen visas nedan med de relativa positionerna till SCF- startkodon och PCR-produktstorleken. ( B ) ChIP för SMAD2-bindning till SCF- promotorn. Kromatin-proteinkomplex av TGF-P1-behandlade och obehandlade HepG2- och Hep3B-celler immunpresipiterades med anti-SMAD2-antikropp. PCR utfördes med användning av SCF-specifika primrar. Till vänster visas PCR-resultat med inmatat DNA. I mitten visas PCR-resultat efter immunutfällning med ospecifik IgG för bekräftelse av SMAD2 immunprecipitationsspecificitet. Visad i bottenpanelen användes ChIP för SMAD2-bindning till PAI-1 som en positiv kontroll.Ge.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2 : TGF-p-inducerad STAT3-bindning till TGF-p-genen. ( A ) Schematisk av TGF-p-genen, med förmodade STAT3-bindningsställen som visas som gråboxar med deras relativa position till startkodonet. ChIP-primerplaceringar visas med deras relativa positioner till TGF-p-startkodonet och PCR-produktstorlekarna som anges nedan. ( B ) ChIP för TGF-β1-inducerad STAT3-bindning till TGF-p-genen. Kromatin-proteinkomplex av TGF-β1-behandlade och obehandlade HepG2- och Hep3B-celler immunpresipiterades med anti-STAT3-antikropp. PCR utfördes med användning av TGF-p-specifika primrar. Till vänster visas PCR-resultaten med ingående DNA. I mitten, PCRResultat efter immunutfällning med ospecifik IgG visas för bekräftelse av STAT3-immunprecipitationsspecificiteten. Den övre panelen visar PCR-resultaten med användning av primers specifika för STAT3-bindningsställe 1 (STB-1), och den nedre panelen visar resultaten för STAT3-bindning till STAT3-bindningsställe 2 (STB-2). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna rapport demonstrerar vi den TGF-β1-inducerade bindningen av SMAD2 till en SBE inom c-KIT ligandpromotorn och TGF-P1-inducerad bindning av STAT3 till dess igenkänningssekvens inom TGF-P1-ligandgenen. Vi demonstrerar cytokininducerad bindning av båda transkriptionsfaktorerna genom användning av kromatinimmunutfällning.

Kromatinimmunutfällning är ett kraftfullt verktyg för att demonstrera direkt bindning av ett protein av intresse för DNA, för att karakterisera stimuli som inducerar proteinbindning till DNA och att karakterisera DNA-sekvensen till vilken proteinet binder. Den senare informationen kan hjälpa till vid identifiering av gener som regleras av ett specifikt protein av intresse och uppnås genom användning av ChIP-on-chip-, ChIP-seq- eller kloningsstrategierna 7 , 8 , 9 . En av de stora fördelarna med ChIP jämfört med andra metoder för att demonstrera DNA-proteinbindning, Såsom EMSA eller DNase I-fotavtryck, är det att i ChIP-tekniken infångas bindningen in vivo , medan den med andra utföres in vitro . Därför ger ChIP inblick i DNA-proteinbindning inom det cellulära sammanhanget, medan de andra teknikerna representerar ett isolerat system.

ChIP-analysen är dock komplex, innebär flera steg som kan påverka resultaten och kräver optimering och erfarenhet. Ett av de första stegen som är avgörande för framgångsrik ChIP är tvärbindningssteget (steg 2.2). UV-tvärbindning är irreversibel och därför olämplig för ChIP. Formaldehydförnätning är föredragen, men formaldehydkoncentration och tvärbindningstid kan båda påverka effektiviteten av kromatinskärning och antigenutfällning. I allmänhet föredras lägre formaldehydkoncentrationer (1% vikt / volym) och kortare tvärbindningstider (5-10 min), eftersom de förbättrar skärningseffektiviteten. Formaldehyd är emellertid inte effektivVid protein-protein-tvärbindning och är därför suboptimal för proteiner som inte direkt binder till DNA 16 . För sådana fall kan ChIP utföras i ett tvåstegsförfarande där protein-tvärbindning sker först med användning av tvärbindningsmedel, såsom disuccinimidylglutarat, följt av formaldehydmedierad DNA-proteintvärbindning 17 .

Nästa kritiska steg är kromatisk skjuvning. I vår studie använde vi enzymatisk skjuvning med hjälp av mikrokocknukleas. Enzymatisk skjuvning är speciellt användbar för icke-tvärbunden nativ ChIP (N-ChIP), då sonikering skulle störa DNA-proteinbindningen. N-ChIP används huvudsakligen för analys av histoner och histon-modifierare 18 . Medan mikrokocknukleas anses vara ett relativt icke-specifikt endo-exonukleas har det visat sig framkalla sekvensspecifik klyvning 19 . Detta kan resultera i en sekvensberoende bias i den resulterande fraktionenGment, med överrepresentation av vissa genlokaler 20 . Sonikering skapar slumpmässigt dimensionerade DNA-fragment, utan sekvensförspänning, och är generellt föredragen för tvärbunden ChIP (X-ChIP). Dock måste sonikeringsbetingelser bestämmas empiriskt för varje cell- eller vävnadstyp och sonikatormodell, och resulterande DNA-fragment är i allmänhet större än med enzymatisk skjuvning 16 . Överkonsekvensering eller emulgering av provet kan också resultera i förlust av antikroppspitoper på grund av proteindetaturering och nedbrytning.

Immunprecipitationssteget är ett annat kritiskt steg som i hög grad kan påverka resultaten från ChIP. Agaros-pärlor binder DNA icke-specifikt och variation i antalet tillsatta pärlor kan påverka det specifika förhållandet mellan signal och bakgrund. Därför är det viktigt att hålla agarospärlan "uppslamning" väl suspenderad när den läggs till DNA-proteinproverna. Med avseende på antikroppen som används för iMmunopfällning, i allmänhet bör antibiotika av ChIP-klass användas och i fall där dessa inte är tillgängliga bör minst antikroppar av immunutfällning vara att föredra. Eftersom specifika epitoper kan maskeras under tvärbindning är polyklonala antikroppar fördelaktiga, eftersom de känner igen flera epitoper. Mängden tillsatt antikropp bör överstiga den faktor som utfälles och bör således bestämmas empiriskt för varje faktor / antikropp. Eftersom kinetiken för att nå jämvikt av antikroppsbindning skiljer sig åt för varje antikropp, måste de optimala inkubationsbetingelserna bestämmas för varje antikropp.

Flera kontroller kan och bör ingå i experimentinställningen. I fall där induktionen av en specifik DNA-proteinbindningsreaktion utvärderas är det viktigt att inkludera en ingångs-DNA-kontroll för att visa lika mall-DNA-mängder i den slutliga analysen ( dvs PCR eller qRT-PCR). En antikroppskontroll krävs för attBekräfta specificiteten av immunutfällningen av proteinet av intresse. Vanligtvis är isotyp-matchade immunglobuliner lämpliga som negativa kontroller, men agaroskulor kan också användas. Ibland används positiva kontroller för att bekräfta ett funktionellt experimentellt flöde av ChIP, och anti-histon-antikroppar används ofta för detta ändamål. Vid stimuleringsexperiment är en föredragen positiv kontroll immunutfällning av proteinet av intresse, med efterföljande sekvensanalys för ett känt DNA-område binder proteinerna vid stimulering. I våra representativa resultat användes SBE inom PAI-1-promotorn som ett känt mål för TGF-β1-inducerad SMAD-bindning. I experiment utan stimulerad proteinbindning kan en DNA-sekvens som är känd att inte vara ett mål för proteinet av intresse användas för den efterföljande DNA-analysen. När det gäller DNA-analysen är det viktigt att inkludera en reaktion utan mall-DNA för att utesluta förorening.

ChIP är en utmärkt teknik för att direkt demonstrera bindningen av ett protein av intresse för en gen. Det är dock inte en funktionell studie. I fall där ett protein av intresse anses ha en reglerande roll är det nödvändigt att även utföra funktionella analyser, såsom reportergenbaserade analyser ( t.ex. luciferas). I dessa protokoll klonas genen av intresse i en reglerande position hos en reportergen. Induktion av genen av intresse resulterar i uttrycket av reportergenen om den har en reglerande funktion. För ytterligare bekräftelse av den reglerande rollen hos det specifika proteinet av intresse kan antingen knock-down eller knock-in-celler alstras, i vilka det DNA-bindande proteinet är genstartat. Som en ytterligare kontroll kan proteinbindningsstället i den regulatoriska genen muteras för att förhindra bindning av proteinet av intresse. I någon av de senare två experimentella mönster kommer cellstimulering inte att resultera i expression av markören gen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (startfonder, BB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81, (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5, (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13, (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3, (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21, (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16, (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19, (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18, (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94, (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92, (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1, (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9, (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5, (12), 15754 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics