Analyse av c-KIT ligand-promotoren ved bruk av kromatinimmunutfelling

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

DNA-protein-interaksjoner er essensielle for flere biologiske prosesser. Under evalueringen av cellefunksjoner er analysen av DNA-protein-interaksjoner uunnværlig for forståelse av genregulering. Kromatinimmunutfelling (ChIP) er et kraftig verktøy for å analysere slike interaksjoner in vivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Flere cellulære prosesser, inkludert DNA-replikasjon og reparasjon, DNA-rekombination og genuttrykk, krever interaksjoner mellom proteiner og DNA. Derfor regulerer DNA-protein-interaksjoner flere fysiologiske, patofysiologiske og biologiske funksjoner, slik som celledifferensiering, celleproliferasjon, cellecykluskontroll, kromosomstabilitet, epigenetisk genregulering og celletransformasjon. I eukaryote celler interagerer DNA med histon- og nonhistonproteiner og kondenseres til kromatin. Flere tekniske verktøy kan brukes til å analysere DNA-protein-interaksjoner, for eksempel elektrofotografering (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) og DNase I fotavtrykk. Imidlertid analyserer disse teknikkene protein-DNA-interaksjonen in vitro , ikke innenfor den cellulære konteksten. Kromatinimmunutfelling (ChIP) er en teknikk som fanger proteiner på sine spesifikke DNA-bindingssteder, hvorved det blir mulig å identifisere DNA-proteininteraksjonS innenfor deres kromatinkontekst. Det gjøres ved fiksering av DNA-protein-interaksjonen, etterfulgt av immunutfelling av proteinet av interesse. Deretter ble det genomiske området som proteinet ble bundet til karakterisert. Her beskriver og diskuterer vi ChIP og demonstrerer dets analytiske verdi for identifisering av transformasjonsvekstfaktor-p (TGF-p) -inducert binding av transkripsjonsfaktoren SMAD2 til SMAD-bindingselementer (SBE) innenfor promotorregionen av tyrosin- Protein kinase Kit (c-KIT) reseptor ligand stamcellefaktor (SCF).

Introduction

I kjernen av eukaryoter, interagerer DNA med histonproteiner og ikke-histone proteiner og kondenseres til kromatin. I den fysiologiske, patofysiologiske og cellebiologiske konteksten styres cellefunksjoner romlig og midlertidig av kromatinkoordinert genuttrykk. DNA-protein-interaksjoner har en viktig rolle i reguleringen av cellulære prosesser, slik som DNA-replikasjon, rekombination og reparasjon, samt proteinuttrykk. Derfor er analysen av DNA-protein-interaksjoner et uunnværlig verktøy i evalueringen av genuttrykk og cellefunksjon.

Det finnes flere teknikker for å bedømme DNA-protein-interaksjoner in vitro , slik som elektroforese (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) og DNase I fotavtrykk 1 , 2 . Imidlertid analyserer disse teknikkene ikke protein-DNA-interaksjonen innen kromatin og cellulær kontekst. ChIP jegEn teknikk som fanger proteiner bundet til deres spesifikke DNA-bindingssteder og derved letter identifikasjonen av DNA-protein-interaksjoner innenfor kromatinkonteksten. Teknikken ble opprinnelig utviklet av Gimour og Lis for vurdering av RNA-polymerase II-binding til bestemte gener i Escherichia coli og Drosophila melanogaster 3 , 4 . Det gjøres ved fiksering av DNA-proteinkompleksene, etterfulgt av utførelse av kromatinekstraksjon og skjæring av DNA i ~ 200 basepar (bp) -fragmenter. Deretter isoleres det DNA-bundne protein av interesse ved immunutfelling. Etter reversering av DNA-protein-tverrbindingen, blir DNAet renset og analysert. Flere metoder kan anvendes for analysen av proteinbindingssteder og avhenger av nukleinsyresekvensen av proteinbindingsstedet i målgenet 5 . I tilfeller hvor DNA-sekvensen er kjent, er standard PolYmerase Chain Reactions (PCR) kan påføres ved bruk av spesifikke primerpar flankering av det kjente bindingssted. Kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR) kan også brukes 6 . I tilfeller der sekvensen er ukjent, kan ChIP kombineres med DNA-mikroarrays (ChIP-on-chip), DNA-sekvensering (ChIP-seq) eller kloningsteknikker 7 , 8 , 9 .

TGF-β-banen har kraftige svulstundertrykkende funksjoner og er en nøkkelvei i celledifferensiering. Det aktiveres gjennom bindingen av TGF-β1-liganden til dets kognitive reseptorkompleks, hvilket resulterer i serin-fosforylering av SMAD2 / 3-transkripsjonsfaktorer. Etter deres tilknytning til den felles mediatoren, SMAD4, translateres SMAD-komplekset til kjernen og binder seg til SBE innenfor promoterregionen av målgenene, der det regulerer gener som kontrollerer cellecyklusen, apoptosen og celledifferensenpå. Transkripsjonssvaret mot TGF-p-stimulering er celletype- og konteksspesifikke 10 . Nylig beskrev vi en positiv tilbakemeldingsløyfe mellom TGF-p og c-KIT-banen 11 . I denne modellen binder TGF-β1-aktivert SMAD2 til c-KIT ligandpromotoren og fremkaller dens ekspresjon og sekresjon. Deretter aktiverer c-KIT-liganden c-KIT-reseptoren på en auto- og para-krinisk måte. C-KIT reseptor aktivering resulterer i STAT3 Tyr 705- fosforylering via JAK1 / 2. Etter STAT3-aktivering og nukleær translokasjon binder STAT3 til TGF-P1 ligandgenet og regulerer dets ekspresjon.

Her demonstrerer vi den viktige rollen som ChIP-analyse for identifisering av SMAD2-binding til c-KIT-reseptorligandpromotoren og for identifisering av signaltransducer (og) aktivatoren (av) transkripsjon 3 (STAT3-binding til TGF-P1- -genet).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av løsninger

  1. Forbered følgende løsninger friske for hvert eksperiment.
    1. For fikseringsløsningen , lag 37% formaldehyd og lagre den ved RT. Fortynn den i 1x fosfatbuffert saltvann (PBS) til en sluttkonsentrasjon på 1,42%.
      FORSIKTIG: Formaldehyd er klassifisert som irriterende, etsende, mutagent, teratogent og kreftfremkallende. Ikke svelg. Unngå innånding av gass / røyk / damp / spray. Ved utilstrekkelig ventilasjon, bruk egnet åndedrettsvern. Unngå kontakt med hud og øyne. Hold deg unna uforenelige stoffer, som oksidasjonsmidler, reduksjonsmidler, syrer, alkalier og fuktighet.
    2. For glycinoppløsningsoppløsningen, lag 0,125 M glycin i 1x PBS-oppløsning og lagre den ved RT.
    3. For celleskrapløsningen, lag en 1x PBS-løsning i dH20 og lagre den på is. Rett før bruk, legg til proteinaseinhibitoren fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) tEn endelig konsentrasjon på 0,5 mM.
      FORSIKTIG: PMSF er klassifisert som etsende og giftig; Bruk verneutstyr og bruk det i et ventilert område.
    4. Direkte før bruk av cellelysebufferen (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl og 0,5% NP40), tilsett 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; 100X stamløsning i dimetylsulfoksid (DMSO): 104 mM 4- 2-aminoetyl) benzensulfonylfluoridhydroklorid (AEBSF), 80 uM aprotinin, 4 mM bestatin, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptin og 1,5 mM pepstatin A) og 0,5 mM PMSF.
    5. Direkte før bruk av kjernelysebufferen (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og 1% SDS) tilsettes 1X PIC og 0,5 mM PMSF.

2. Cellfixering og skjæring

  1. Vokse cellene til 70-80% sammenflytelse på 10 cm vevskulturplater. Stimulere cellene per eksperimentelle mål.
  2. Fjern vevskulturmediet, tilsett 5 ml fikseringsløsning og inkuberCellene i 10 minutter ved RT på en rystende plattform.
  3. Fjern fikseringsløsningen og vask cellene to ganger med 10 ml iskald 1x PBS.
  4. Fjern 1x PBS, tilsett 5 mL glycine stop-fix løsning, og inkuber cellene i 5 minutter ved RT på en rystende plattform.
  5. Fjern glycine stop-fix-løsningen og vask cellene to ganger med 10 ml iskald 1x PBS.
  6. Fjern 1x PBS, tilsett 2 mL celleskrapløsning, og høst cellene ved hjelp av en celleskraper. Overfør de høstede cellene til et konisk rør på is.
  7. Sentrifuger prøvene i 10 minutter ved 600 xg og 4 ° C.
  8. Fjern supernatanten, resuspender pelleten i 1 ml 1X cellelysebuffer og inkuber på is i 30 minutter. Alternativt kan du fryse pelleten i flytende nitrogen og lagre den ved -80 ° C.
  9. Når pellet er resuspendert i cellelysebufferen, overfør cellesuspensjonen til en iskall dounce-homogenisator og dounce for 10 slag ved bruk av en type B-pestlE for celleforstyrrelser.
  10. Overfør cellesuspensjonen til et mikrocentrifugerør og sentrifuger prøvene i 10 minutter ved 2400 xg og 4 ° C.
  11. Kast supernatanten, resuspender pelleten i 350 ul kjernefordøyelsesbuffer, og inkuber prøvene i 5 minutter ved 37 ° C.
  12. Tilsett mikrokoccal nuklease (1 U / μl) og bland ved vortexing. Inkuber prøvene ved 37 ° C i 5-20 minutter; Bland prøvene hver 2 min ved inversjon.
    MERK: Tids- og enzymkonsentrasjonen varierer mellom cellelinjer og kan kreve optimalisering i tilfeller av suboptimal enzymatisk skjæring.
  13. Alternativt oppnår man kromatisk skjæring ved sonikering ved bruk av kommersielt tilgjengelige sonikatorer.
    MERK: Sonication forholdene krever optimalisering. En optimaliseringseksempel protokoll er gitt nedenfor ved hjelp av et prøvevolum på 300 μL og en prosessbehandlingseffekt på 25%.
    1. Etter trinn 2.10 kasserer du supernatanten og resuspenerer nUklar pellet i 1,0 ml kommersiell skjæringsbuffer.
    2. Aliquot 300 μL av resuspendert kjernepelleten i tre 1,7 ml mikrocentrifugerør. Plasser dem på is.
    3. Skjær de 3 alikvoter av fastkromatin ved 25% strøm ved å bruke 3 forskjellige forhold for å bestemme de optimale sonikasjonsbetingelsene:
      5 pulser på 20 s hver, med 30 s hviler på is mellom hver puls.
      10 pulser på 20 s hver, med 30 s hviler på is mellom hver puls.
      20 pulser på 20 s hver, med 30 s hviler på is mellom hver puls.
    4. Fortsett med trinn 2.15, som beskrevet nedenfor.
  14. Etter inkuberingen med mikrokokukjernasen, tilsett 7 μl iskold 0,5 M EDTA for å stoppe reaksjonen.
  15. Sentrifuger prøvene med skjæret DNA i 10 minutter ved 16.200 xg og 4 ° C.
  16. Overfør den skjærede DNA-holdige supernatanten til et nytt mikrocentrifugerør. Aliquot 50 μL i et separat mikrocentrifugerør for å bekrefte suCcessful skjæring av DNA (seksjon 3). Bruk gjenværende volum umiddelbart for immunutfelling (kapittel 4) eller lagre den ved -80 ° C.

3. Bekreftelse av skjæringseffektiviteten

  1. Tilsett 150 μL nuklease-fri dH20 og 10 μl 5 M NaCl til 50 μl alikvoten av skjærkromatinet fra trinn 2.16.
  2. Inkuber prøvene ved 65 ° C i 4 timer for å reversere tverrbindingene.
  3. Tilsett 2 μL RNase A (10 μg / μl) og inkuber prøvene ved 37 ° C i 15 minutter.
  4. Tilsett 10 μl proteinase K (0,5 μg / μl) og inkuber prøvene ved 42 ° C i 90 minutter.
  5. For rensing av DNA, utfør en fenol / kloroformekstraksjon 12 .
    1. Tilsett nukleasefritt vann til et sluttvolum på 200 ul. Tilsett 200 μl fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til prøven og hvirvel i 20 s.
    2. Sentrifuge ved romtemPeratur i 5 minutter ved 16.000 x g. Fjern forsiktig den øvre vandige fasen og overfør den til et friskt rør. Pass på at du ikke overfører noen fenol under pipetteringen.
    3. Tilsett 0,1 volumer 3 M natriumacetat (NH 4 OAc), pH 5,2, og bland ved å flette røret flere ganger med en finger. Tilsett 2,5 volumer iskald 100% etanol og bland ved vortexing i 5 s. Inkuber prøven O / N ved -20 ° C, eller i minst 1 time ved -80 ° C.
    4. Sentrifuger prøven i 30 minutter ved 4 ° C og 16.000 xg for å pelletere cDNA.
    5. Fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre pelleten. Tilsett 1 ml RT, 70% etanol og omvendt røret flere ganger.
    6. Sentrifuger prøven i 2 minutter ved 4 ° C og 16.000 x g. Fjern forsiktig supernatanten.
    7. Tørk pelleten i 5-10 minutter ved RT. Resuspender pelleten i 30 μl dH20.
  6. Bruk en 5 og 10 μl alikvot av det rensede DNA for gelelektroforese med en 1% TAEAgarosegel.
    MERK: Vellykket kromatinskjæring resulterer i et DNA-mønster på 200-1,500 bp. Hvis skjæringen ikke lykkes, bestemme de optimale skjæringsbetingelsene for de spesifikke cellene ved å modifisere inkubasjonstiden for skjæringstrinnet (trinn 2.12) til 5, 10 og 15 min.
  7. Bruk den gjenværende prøven for å analysere DNA-konsentrasjonen av prøven. Omvendt-beregne DNA-konsentrasjonen i skjærkromatinprøven (trinn 2.16); Bruk de samme DNA-mengdene for hver behandlingsgruppe for immunutfellingen (avsnitt 4).

4. Immunutfelling

  1. Kombiner 10-25 μg av skjæret, tverrbundet kromatin (trinn 2.16) med 25 μl ChIP-grade protein G-magnetiske perler, 10 μl immunprecipitasjonsfortynningsbuffer (stamløsning: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1,2 mM EDTA og 167 mM NaCl) og 1 μl PIC.
  2. Etter 4 timer inkubering, tilsett 1-10 μg antistoff (antistoffkoncentrAtjonen vil variere basert på antistoffets affinitet; Det bør i utgangspunktet brukes per produsentens anbefalinger og eksperimentelt optimalisert om nødvendig) til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og tilsett dH20 til et sluttvolum på 100 ul.
    MERK: I stedet for den ovenfor beskrevne direkte immunpresipitasjonsmetode kan den indirekte immunpresipisjonsmetoden bli brukt ved først å kombinere kromatinet med antistoffene og deretter tilsette protein G magnetiske perler.
  3. Inkuber prøvene på en ende-til-ende rotator i 4-12 timer ved 4 ° C.

5. Eluering

  1. Plasser rørene på et magnetisk stativ. Når magnetkulene aggregat på siden av røret, fjern forsiktig og kassér supernatanten.
  2. Vask perlene tre ganger med 800 μl vaskebuffer 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 og 150 mM NaCl); Bland ved å invertere røret flere ganger. Plasser røret på magnetstativet aNd Fjern forsiktig og kassér vaskebufferen når magnetmagnetene har aggregat på siden av røret.
  3. Vask perlene en gang med 800 μl vaskebuffer 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 og 500 mM NaCl); Bland ved å invertere røret flere ganger. Plasser røret på magnetstativet og fjern forsiktig og kasser vaskebufferen når magnetmagnetene har aggregat på siden av røret.
  4. Resuspender perlene i 50 μl elueringsbuffer (1% SDS og 100 mM NaHCO3) og inkuber prøvene på en ende-til-ende rotator i 15 minutter ved RT.
  5. Plasser rørene på et magnetisk stativ, og når de magnetiske perlene samles på siden av røret, overfør supernatanten til et friskt rør.
  6. Tilsett 6 μl 5 M NaCl for å reversere tverrbindingen og 2 μl proteinase K (0,5 μg / μl). Etter blanding av prøvene inkuberes prøvene i 2 timer ved 65 ° C.
  7. For rensing av DNA, utfør en pheNol / kloroformekstraksjon 12 (trinn 3.5) og deretter resuspendere pelleten i 30 ul dH20.
    MERK: Prøver kan analyseres direkte for proteinbindingssteder (avsnitt 5) eller kan lagres ved -20 ° C.

6. Binding-site Analysis

  1. Utfør en analyse for spesifikke bindingssteder innenfor en kjent nukleinsyresekvens ved bruk av PCR eller qRT-PCR. For primerdesign, følg konvensjonelle PCR- eller qRT-PCR-protokoller. Design primere for å syntetisere et 150-400 bp amplikon som binder proteinbindingsstedet av interesse ( Figur 1 ).
  2. Sette opp PCR ved hjelp av fire forskjellige DNA-maler for å sikre spesifisitet: i) DNA fra ChIP immunutfellet med antistoffet av interesse, ii) DNA fra ChIP immunpresipitert med et uspesifikt IgG-antistoff, iii) input DNA, og iv) H20 som en Negativ kontroll for PCR for å utelukke forurensning. I tilfelle av sti stimulering, Velg en femte mal ved å bruke et annet sett med primere som er spesifikke for et kjent bindingssted for det immunpresipiterte protein.
    MERK: I tilfelle av c-KIT ligandpromotoranalysen, bruk konvensjonell PCR for å demonstrere TGF-p-indusert SMAD-binding ved SBE innenfor c-KIT-ligandpromotorregionen. Som en positiv kontroll, utfør PCR på plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) som et kjent mål for TGF-p-indusert SMAD-binding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bindingen av TGF-P1-liganden til dets kognitive reseptorkompleks resulterer i serin-fosforylering av SMAD2 / 3 transkripsjonsfaktorer, etterfulgt av deres tilknytning til den felles mediator, SMAD4. SMAD-komplekset translokerer til kjernen. TGF-p kan regulere gentranskripsjon, enten direkte via SMAD-binding til SBE'er innenfor regulatoriske regioner av målgenene, eller indirekte gjennom SMAD-regulert ekspresjon av transkriptionelle aktivatorer eller repressorer som deretter regulerer ekspresjonen av genet av interesse 10 . For å teste om c-KIT-liganden SCF er transkriptjonelt regulert av den direkte TGF-β1-indusert binding av SMAD2 til promotoren, analyserte vi SCF-promotorinneholdende, 2,4-kb, 5'-flankerende region av SCF-genet for SMAD2 bindingsmotiv, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . Vi identifiserte 7 formodede SBE-upsTream av SCF startkodon ( figur 1A ). For å bekrefte TGF-β1-indusert binding av SMAD2 til SCF-promotoren ble ChIP-analysen beskrevet her utført. TGF-β1-behandlingen resulterte i SMAD2-binding til SCF-promotoren i humane leverkreftlinjer, HepG2- og Hep3B-celler ( figur 1B ). I fravær av TGF-β1-stimulering ble det ikke registrert noen SMAD-binding. Som en positiv kontroll for TGF-β1-indusert SMAD-aktivering ble ChIP for PAI-1 utført. PAI-1-promotoren er et kjent mål for TGF-p / SMAD 13 . For å bekrefte spesifisiteten av SMAD2-immunpresipitasjonen ble ikke-spesifikke IgG-antistoffer anvendt; Ingen SMAD2-binding til SBE ble notert etter immunutfelling med IgG.

For en annen demonstrasjon av ChIP-teknologien analyserte vi den 5'-flankerende regionen av TGF-p-ligandgenet for STAT3-konsensusbindingsmotivene 5 '-TT (N4) AA-3 'og 5'-TT (N5) AA-3' 15 . Vi identifiserte to formodede STAT3-bindingssteder oppstrøms for TGFB-startkodonet ved posisjonene -4384 / -4373 (STB-1) og -5365 / -5357 (STB-2) ( Figur 2A ). For å bekrefte TGF-β1-indusert binding av STAT3 til TGF-p-ligandgenet, utførte vi ChIP-analyser ved bruk av TGF-β1-behandlede HepG2- og Hep3B-celler. TGF-β1-behandling resulterte i STAT3-binding til det andre formative STAT3-bindingsstedet (STB-2) av TGFB-genet, men ikke til den første (STB-1) ( Figur 2B ). I dette eksemplet tjener den positive STAT3-binding til STB-2 som en intern positiv kontroll. I likhet med det ovenfor angitte ChIP-eksperimentet ble ikke STAT3-binding til STB-2 sett etter immunutfelling ved bruk av IgG.

Figur 1
Figur 1 Ong>: TGF-p-indusert SMAD2-binding til SCF-promotoren. ( A ) Skjematisk representasjon av SCF- promotoren, med formodede SBEer vist som bokser (hvite bokser = AGAC) med deres relative posisjon til startkodonet. ChIP-primerplasseringen er vist nedenfor, med de relative posisjonene til SCF startkodon og PCR-produktstørrelsen. ( B ) ChIP for SMAD2-binding til SCF- promotoren. Kromatin-proteinkomplekser av TGF-β1-behandlede og ubehandlede HepG2- og Hep3B-celler ble immunutfældet med anti-SMAD2-antistoff. PCR ble utført ved anvendelse av SCF-spesifikke primere. Til venstre vises PCR-resultater ved bruk av input-DNA. I midten er PCR-resultater etter immunutfelling med uspesifisert IgG vist for bekreftelse av SMAD2 immunprecipitationspesifikitet. Vist i bunnpanelet ble ChIP for SMAD2-binding til PAI-1 brukt som en positiv kontroll.Ge.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : TGF-p-indusert STAT3-binding til TGF-p-genet. ( A ) Skjematisk av TGF-p-genet, med formodede STAT3-bindingssteder vist som gråbokser med deres relative posisjon til startkodonet. ChIP-primerplasseringer er vist med deres relative posisjoner til TGF-β-startkodonet og PCR-produktstørrelsene angitt nedenfor. ( B ) ChIP for TGF-β1-indusert STAT3-binding til TGF-p-genet. Kromatin-proteinkomplekser av TGF-β1-behandlede og ubehandlede HepG2- og Hep3B-celler ble immunutfældet med anti-STAT3-antistoff. PCR ble utført ved bruk av TGF-p-spesifikke primere. Til venstre vises PCR-resultatene ved hjelp av input-DNA. I midten, PCRResultat etter immunutfelling med uspesifisert IgG er vist for bekreftelse av STAT3 immunprecipitationspesifikiteten. Øverste panel viser PCR-resultatene ved hjelp av primere som er spesifikke for STAT3-bindingssted 1 (STB-1), og det nedre panel viser resultatene for STAT3-binding til STAT3-bindingssted 2 (STB-2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapporten demonstrerer vi TGF-β1-indusert binding av SMAD2 til en SBE i c-KIT ligandpromotoren og TGF-β1-indusert binding av STAT3 til sin gjenkjenningssekvens i TGF-β1-ligandgenet. Vi demonstrerer cytokininducert binding av begge transkripsjonsfaktorer ved anvendelse av kromatinimmunutfelling.

Kromatinimmunutfelling er et kraftig verktøy for å demonstrere direkte binding av et protein av interesse for DNA, for å karakterisere stimuli som induserer proteinbinding til DNA, og for å karakterisere DNA-sekvensen som proteinet binder til. Sistnevnte informasjon kan bidra til å identifisere gener som er regulert av et bestemt protein av interesse, og oppnås ved bruk av ChIP-on-chip, ChIP-seq eller kloningstrategier 7 , 8 , 9 . En av de store fordelene ved ChIP versus andre metoder for å demonstrere DNA-proteinbinding, For eksempel EMSA- eller DNase I-fotavtrykk, er det at i bindings-teknologien blir bindingen innfanget in vivo , mens de andre utføres in vitro . Derfor gir ChIP innblikk i DNA-proteinbinding i den cellulære kontekst, mens de andre teknikkene representerer et isolert system.

ChIP-analysen er imidlertid kompleks, innebærer flere trinn som kan påvirke resultatene, og krever optimalisering og erfaring. Et av de første trinnene som er avgjørende for vellykket ChIP er tverrbindingssteget (trinn 2.2). UV-kryssbinding er irreversibel og derfor uegnet for ChIP. Formaldehyd-tverrbinding er foretrukket, men formaldehydkonsentrasjon og tverrbindingstid kan både påvirke effektiviteten av kromatin-skjæring og antigenutfelling. Generelt foretrekker lavere formaldehydkonsentrasjoner (1% vekt / volum) og kortere tverrbindings-tider (5-10 min), da de forbedrer skjæringseffektiviteten. Imidlertid er formaldehyd ikke effektivVed protein-protein-tverrbinding og er derfor suboptimal for proteiner som ikke direkte binder til DNA 16 . I slike tilfeller kan ChIP gjøres i en to-trinns tilnærming, hvor protein-protein-tverrbinding utføres først ved bruk av tverrbindingsmidler som disuccinimidylglutarat, etterfulgt av formaldehydmediert DNA-protein-tverrbinding 17 .

Det neste kritiske trinnet er kromatinskjæring. I vår studie brukte vi enzymatisk skjæring ved bruk av mikrokokk nuklease. Enzymatisk skjæring er spesielt nyttig for ikke-kryssbundet nativt ChIP (N-ChIP), når sonikering vil forstyrre DNA-proteinbindingen. N-ChIP brukes hovedsakelig for analyse av histon og histon-modifikatorer 18 . Mens mikrokokk nuklease anses som en relativt ikke-spesifikk endo-exonuklease, har det blitt vist å fremkalle sekvensspesifikk spaltning 19 . Dette kan resultere i en sekvensavhengig bias i den resulterende fraGments, med overrepresentasjon av visse gen loci 20 . Sonikering skaper tilfeldig størrelse DNA-fragmenter, uten sekvensforstyrrelser, og er generelt foretrukket for tverrbundet ChIP (X-ChIP). Imidlertid må sonikasjonsbetingelsene bestemmes empirisk for hver celle eller vevstype og sonikatormodell, og resulterende DNA-fragmenter er generelt større enn med enzymatisk skjæring 16 . Over-sonikering eller emulgering av prøven kan også resultere i tap av antistoffepitoper på grunn av protein denaturering og nedbrytning.

Immunprecipitasjonstrinnet er et annet kritisk trinn som i stor grad kan påvirke resultatene av ChIP. Agaroseperler binder DNA ikke-spesifikt, og variasjon i antall tilsatte perler kan påvirke det spesifikke signal-til-bakgrunn-forhold. Derfor er det viktig å holde agarosekulen "slurry" suspendert når den legges til DNA-proteinprøver. I forhold til antistoffet som brukes for iMmunpresipitasjon, generelt bør ChIP-antistoffer brukes, og i tilfeller der disse ikke er tilgjengelige, bør minst immunpresipitasjons-antistoffer foretrekkes. Som spesifikke epitoper kan maskeres under tverrbinding, er polyklonale antistoffer fordelaktige, da de gjenkjenner flere epitoper. Mengden av antistoff tilsatt bør overstige faktoren som utsettes og bør således bestemmes empirisk for hver faktor / antistoff. Også, da kinetikken for å nå likevekten av antistoffbinding, er forskjellig for hvert antistoff, må de optimale inkubasjonsbetingelser bestemmes for hvert antistoff.

Flere kontroller kan og bør inkluderes i forsøksoppsettet. I tilfeller der induksjonen av en spesifikk DNA-proteinbindingsreaksjon er evaluert, er det viktig å inkludere en inngangs-DNA-kontroll for å demonstrere like template DNA-mengder i den endelige analysen ( dvs. PCR eller qRT-PCR). En antistoffkontroll er nødvendig forBekreft spesifisiteten av immunutfellingen av proteinet av interesse. Vanligvis er isotype-matchede immunglobuliner velegnet som negative kontroller, men agarosekuler kan også brukes. Av og til brukes positive kontroller for å bekrefte en funksjonell eksperimentell strøm av ChIP, og anti-histon-antistoffer blir ofte brukt til dette formålet. I stimuleringsforsøk er en foretrukket positiv kontroll immunutfelling av proteinet av interesse, med etterfølgende sekvensanalyse for et kjent DNA-område binder proteinene seg til ved stimulering. I våre representative resultater ble SBE i PAI-1-promotoren brukt som et kjent mål for TGF-β1-indusert SMAD-binding. I eksperimenter uten stimulert proteinbinding kan en DNA-sekvens som ikke er et mål for proteinet av interesse, brukes til den etterfølgende DNA-analyse. I forbindelse med DNA-analysen er det viktig å inkludere en reaksjon uten mal-DNA for å utelukke forurensning.

ChIP er en utmerket teknikk for direkte å demonstrere bindingen av et protein av interesse for et gen. Det er imidlertid ikke en funksjonell studie. I tilfeller der et protein av interesse antas å ha en regulerende rolle, er det avgjørende å også utføre funksjonelle analyser, slik som reportergenbaserte analyser ( f.eks. Luciferase). I disse protokollene klones genet av interesse i en regulatorisk posisjon av et reportergen. Induksjon av genet av interesse resulterer i uttrykket av reportergenet dersom det har en regulerende funksjon. For ytterligere bekreftelse av regulatorisk rolle av det spesifikke protein av interesse, kan enten knock-down eller knock-in-celler genereres der det DNA-bindende proteinet er genetisk stilket. Som en ytterligere kontroll kan proteinbindingsstedet i det regulatoriske genet bli mutert for å forhindre binding av proteinet av interesse. I en av de to siste eksperimentelle designene vil cellestimulering ikke resultere i ekspresjonen av markøren gene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (oppstartsfond, BB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81, (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5, (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13, (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3, (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21, (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16, (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19, (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18, (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94, (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92, (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1, (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9, (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5, (12), 15754 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics