Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

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Genetics

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Summary

As interações DNA-proteína são essenciais para múltiplos processos biológicos. Durante a avaliação das funções celulares, a análise das interações DNA-proteína é indispensável para a compreensão da regulação gênica. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta para analisar essas interações in vivo.

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Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

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Abstract

Múltiplos processos celulares, incluindo replicação e reparo de DNA, recombinação de DNA e expressão gênica, requerem interações entre proteínas e DNA. Portanto, as interações DNA-proteína regulam diversas funções fisiológicas, fisiopatológicas e biológicas, como a diferenciação celular, proliferação celular, controle do ciclo celular, estabilidade cromossômica, regulação de genes epigenéticos e transformação celular. Em células eucarióticas, o DNA interage com proteínas de histonas e não-histonas e é condensado em cromatina. Várias ferramentas técnicas podem ser usadas para analisar as interações DNA-proteína, como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I. No entanto, essas técnicas analisam a interação proteína-DNA in vitro , não dentro do contexto celular. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma técnica que captura proteínas em seus locais específicos de ligação ao DNA, permitindo assim a identificação da interação DNA-proteínaS dentro do contexto da cromatina. É feito por fixação da interação DNA-proteína, seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse. Posteriormente, o sítio genômico com o qual a proteína estava ligada caracteriza-se. Aqui, descrevemos e discutimos ChIP e demonstram seu valor analítico para a identificação da ligação induzida pelo Fator de Crescimento Transformante-β (TGF-p) do fator de transcrição SMAD2 para elementos de ligação SMAD (SBE) dentro da região promotora da proteína tirosina- Fator de células-tronco do ligando do receptor de proteína quinase Kit (c-KIT) (SCF).

Introduction

No núcleo de eucariotas, o DNA interage com proteínas histonas e proteínas não-histônicas e é condensado em cromatina. No contexto fisiológico, fisiopatológico e biológico, as funções celulares são controladas espacialmente e temporariamente pela expressão de genes coordenados com cromatina. As interações DNA-proteína têm um papel essencial na regulação dos processos celulares, como a replicação, recombinação e reparo do DNA, bem como a expressão protéica. Portanto, a análise das interações DNA-proteína é uma ferramenta indispensável na avaliação da expressão gênica e da função celular.

Existem várias técnicas para avaliar as interações DNA-proteína in vitro , como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I 1 , 2 . No entanto, essas técnicas não analisam a interação proteína-DNA dentro da cromatina e do contexto celular. ChIP iUma técnica que captura proteínas ligadas aos seus locais de ligação de ADN específicos e, assim, facilita a identificação de interações DNA-proteína dentro do contexto da cromatina. A técnica foi originalmente desenvolvida por Gimour e Lis para avaliação da ligação da ARN polimerase II a genes específicos em Escherichia coli e Drosophila melanogaster 3 , 4 . É feito por fixação dos complexos DNA-proteína, seguido de extração de cromatina e corte do DNA em ~ 200 fragmentos de pares de bases (pb). Posteriormente, a proteína de interesse do DNA de interesse é isolada por imunoprecipitação. Após a reversão da reticulação de proteína de DNA, o DNA é purificado e analisado. Podem ser utilizados vários métodos para a análise dos sítios de ligação à proteína e dependem da sequência de ácido nucleico do sítio de ligação à proteína dentro do gene alvo 5 . Nos casos em que a sequência de DNA é conhecida, Pol padrãoReações de cadeia de imerase (PCR) podem ser aplicadas, utilizando pares de iniciadores específicos que flanqueiam o site de ligação conhecido. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) também pode ser usada 6 . Nos casos em que a seqüência é desconhecida, o ChIP pode ser combinado com microarrays de DNA (ChIP-on-chip), sequenciação de DNA (ChIP-seq) ou técnicas de clonagem 7 , 8 , 9 .

A via TGF-β possui potentes funções de supressão de tumores e é uma via chave na diferenciação celular. É ativado através da ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptores cognatos, resultando na fosforilação de serina de fatores de transcrição SMAD2 / 3. Após a sua associação com o mediador comum, SMAD4, o complexo SMAD se transloca para o núcleo e se liga ao SBE dentro da região promotora dos genes alvo, onde regula os genes que controlam o ciclo celular, a apoptose e a diferenciação celular.em. A resposta transcricional à estimulação de TGF-β é de tipo celular e específica do contexto 10 . Recentemente, descrevemos um loop de feedback positivo entre TGF-β e a via C-KIT 11 . Neste modelo, o SMAD2 activado por TGF-β1 liga-se ao promotor do ligando c-KIT e induz a sua expressão e secreção. Posteriormente, o ligando c-KIT activa o receptor c-KIT de forma auto-para-crinica. A ativação do receptor c-KIT resulta em STAT3 Tyr 705 -fosforilação via JAK1 / 2. Após a ativação STAT3 e a translocação nuclear, STAT3 se liga ao gene do ligando TGF-β1 e regula sua expressão.

Aqui, demonstramos o papel essencial da análise de ChIP para a identificação da ligação de SMAD2 ao promotor do ligando do receptor c-KIT e para a identificação do Transdutor de sinal (e) Activador (da) Transcrição 3 (ligação de STAT3 ao TGF-β1- gene).

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Protocol

1. Preparação de soluções

  1. Prepare as seguintes soluções frescas para cada experiência.
    1. Para a solução de fixação , prepare 37% de formaldeído e guarde-o à RT. Dilúcle-o em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 1,42%.
      CUIDADO: O formaldeído é classificado como irritante, corrosivo, mutagênico, teratogênico e cancerígeno. Não ingerir. Não respire gases / fumaça / vapor / spray. Em caso de ventilação insuficiente, use equipamento respiratório adequado. Evitar o contato com a pele e os olhos. Mantenha longe de incompatibilidades, como agentes oxidantes, agentes redutores, ácidos, álcalis e umidade.
    2. Para a solução de fixação de glicina, prepare glicina 0,125 M em 1x solução de PBS e guarde-a à TA.
    3. Para a solução de raspagem celular, prepare uma solução 1x PBS em dH 2 O e guarde-a em gelo. Diretamente antes do uso, adicione inibidor de proteinase fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) tUma concentração final de 0,5 mM.
      CUIDADO: PMSF é classificado como corrosivo e tóxico; Use roupas de proteção e use-a em uma área ventilada.
    4. Diretamente antes de usar o tampão de lise celular (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 85 mM e NP40 a 0,5%), adicione 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; Solução de estoque 100X em dimetilsulfóxido (DMSO): 104 mM 4- ( Cloridrato de fluoreto de 2-aminoetil) benzenossulfonilo (AEBSF), aprotinina 80 uM, bestatina 4 mM, E-64 1,4 mM, leupeptina 2 mM e pepstatina A 1,5 mM e PMSF 0,5 mM.
    5. Diretamente antes de usar o tampão de lise de núcleos (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA) e 1% de SDS), adicione PIC 1X e PMSF 0,5 mM.

2. Fixação e cisalhamento celular

  1. Cresça as células para uma confluência de 70-80% em placas de cultura de tecidos de 10 cm. Estimule as células pelos objetivos experimentais.
  2. Remova o meio de cultura de tecido, adicione 5 mL de solução de fixação e incubaAs células por 10 min na RT em uma plataforma de agitação.
  3. Remova a solução de fixação e lave as células duas vezes com 10 mL de 1x PBS gelado.
  4. Remova o 1x PBS, adicione 5 mL de solução de solução de retenção de glicina e incube as células por 5 minutos à TA em uma plataforma de agitação.
  5. Remova a solução de retenção de glicina e lave as células duas vezes com 10 mL de 1x PBS gelado.
  6. Remova o 1x PBS, adicione 2 mL de solução de raspagem celular e colhe as células usando um raspador de células. Transfira as células colhidas para um tubo cônico no gelo.
  7. Centrifugue as amostras por 10 min a 600 xg e 4 ° C.
  8. Remova o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 1 mL de tampão de lise celular 1X e incube em gelo durante 30 min. Alternativamente, congele o sedimento em nitrogênio líquido e guarde-o a -80 ° C.
  9. Uma vez que o sedimento é ressuspenso no tampão de lise celular, transfira a suspensão celular para um homogeneizador de densa gelado e dente por 10 golpes usando um pestl de tipo BE para a interrupção celular.
  10. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga e centrifugue as amostras por 10 min a 2.400 xg e 4 ° C.
  11. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 350 μL de tampão de digestão de núcleos e incube as amostras durante 5 min a 37 ° C.
  12. Adicione nuclease microcócica (1 U / μL) e misture por vortex. Incubar as amostras a 37 ° C durante 5-20 min; Misture as amostras a cada 2 min por inversão.
    NOTA: O tempo e a concentração da enzima diferem entre as linhas celulares e podem exigir otimização em casos de cárie enzimática sub-ótima.
  13. Alternativamente, obtenha o cisalhamento de cromatina por sonicação usando sondas sonoras comercialmente disponíveis.
    NOTA: As condições de sonicação exigirão otimização. Um protocolo de exemplo de otimização é fornecido abaixo usando um volume de amostra de 300 μL e uma potência de processamento de amostra de 25%.
    1. Seguindo o passo 2.10, descarte o sobrenadante e ressuspenda o nPílula de uclear em 1,0 mL de tampão de cisalhamento comercial.
    2. Alíquota 300 μL do sedimento nuclear ressuspenso em três tubos de microcentrífuga de 1,7 mL. Coloque-os no gelo.
    3. Corte as 3 alíquotas de cromatina fixa com 25% de potência usando 3 condições diferentes para determinar as condições ideais de sonicação:
      5 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 s no gelo entre cada pulso.
      10 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 s no gelo entre cada pulso.
      20 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 segundos no gelo entre cada pulso.
    4. Continue com a Etapa 2.15, conforme descrito abaixo.
  14. Após a incubação com a nuclease microcócica, adicione 7 μL de EDTA 0,5 M gelado para parar a reação.
  15. Centrifugue as amostras com o DNA cortado por 10 min a 16.200 xg e 4 ° C.
  16. Transfira o sobrenadante que contém o DNA cortado para um tubo de microcentrífuga fresco. Alíquota 50 μL em um tubo separado de microcentrífuga para confirmar o suCessão excessiva do DNA (seção 3). Use o volume restante imediatamente para imunoprecipitação (seção 4) ou guarde-o a -80 ° C.

3. Confirmação da Eficiência de Cisalha

  1. Adicionar 150 μL de dH2O livre de nuclease e 10 μL de NaCl 5 M até a alíquota de 50 μL da cromatina cortada a partir do passo 2.16.
  2. Incubar as amostras a 65 ° C durante 4 h para reverter as reticências.
  3. Adicionar 2 μL de RNase A (10 μg / μL) e incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min.
  4. Adicionar 10 μL de proteinase K (0,5 μg / μL) e incubar as amostras a 42 ° C durante 90 min.
  5. Para a purificação do DNA, realize uma extração de fenol / clorofórmio 12 .
    1. Adicione água livre de nuclease a um volume final de 200 μL. Adicione 200 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) à amostra e vortex por 20 s.
    2. Centrífuga no quartoPor 5 min a 16 000 x g. Retire cuidadosamente a fase aquosa superior e transfira-a para um tubo fresco. Certifique-se de não transportar qualquer fenol durante a pipetagem.
    3. Adicione 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M (NH 4 OAc), pH 5,2 e misture movendo várias vezes o tubo com um dedo. Adicione 2,5 volumes de etanol a 100% gelado e misture com vortex por 5 s. Incubar a amostra O / N a -20 ° C, ou durante pelo menos 1 h a -80 ° C.
    4. Centrifugar a amostra por 30 min a 4 ° C e 16.000 xg para sedimentar o cDNA.
    5. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem interromper a pelotização. Adicione 1 mL de RT, 70% de etanol e inverta o tubo várias vezes.
    6. Centrifugar a amostra por 2 minutos a 4 ° C e 16.000 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
    7. Secar o grânulo por 5-10 minutos à TA. Ressuspender o grânulo em 30 μL de dH2O.
  6. Use uma alíquota de 5 e 10 μL do DNA purificado para eletroforese em gel com TAE a 1%Gel de agarose.
    NOTA: O sucesso do corte de cromatina resulta em um padrão de DNA de 200-1.500 pb. Se o corte não for bem sucedido, determine as condições de corte ideal para as células específicas, modificando o tempo de incubação do passo de corte (etapa 2.12) para 5, 10 e 15 min.
  7. Use a amostra restante para analisar a concentração de DNA da amostra. Calcular de forma inversa a concentração de DNA na amostra de cromatina cortada (etapa 2.16); Use as mesmas quantidades de DNA para cada grupo de tratamento para a imunoprecipitação (seção 4).

4. Imunoprecipitação

  1. Combine 10-25 μg da cromatina cortada e reticulada (passo 2.16) com 25 μL de pérolas magnéticas de proteína G de grau ChIP, 10 μL de tampão de diluição de imunoprecipitação (solução de reserva: 0,01% de SDS, 1,9% de Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1,2 mM e NaCl 167 mM) e 1 μL de PIC.
  2. Após 4 h de incubação, adicione 1-10 μg de anticorpo (o concentrador de anticorpoAção variará com base na afinidade do anticorpo; Deve ser inicialmente usado por recomendações do fabricante e otimizado experimentalmente se necessário) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicionar dH2O até um volume final de 100 μL.
    NOTA: Em vez do método de imunoprecipitação direta descrito acima, o método de imunoprecipação indireta pode ser usado pela primeira combinação da cromatina com os anticorpos e subsequentemente adicionando grânulos magnéticos de proteína G.
  3. Incubar as amostras em um rotador de ponta a ponta durante 4-12 h a 4 ° C.

5. Eluição

  1. Coloque os tubos em um suporte magnético. Uma vez que os grânulos magnéticos se agregam no lado do tubo, remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante.
  2. Lavar as esferas três vezes com 800 μL de tampão de lavagem 1 (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 2 mM de EDTA pH 8, 20 mM de Tris-HCl, pH 8 e 150 mM de NaCl); Misture invando o tubo várias vezes. Coloque o tubo no suporte magnético aE retire cuidadosamente e descarte o tampão de lavagem uma vez que as pérolas magnéticas se agregam no lado do tubo.
  3. Lavar as esferas uma vez com 800 μL de tampão de lavagem 2 (SDS a 0,1%, Triton X-100 a 1%, EDTA 2 mM, pH 8, Tris-HCl 20 mM pH 8 e NaCl 500 mM); Misture invando o tubo várias vezes. Coloque o tubo no suporte magnético e remova cuidadosamente e descarte o tampão de lavagem uma vez que as pérolas magnéticas se agregam no lado do tubo.
  4. Ressuspender as esferas em 50 μL de tampão de eluição (SDS a 1% e NaHCO3 100 mM) e incubar as amostras em um rotador de ponta a ponta durante 15 minutos à TA.
  5. Coloque os tubos em um suporte magnético, e uma vez que os grânulos magnéticos se acumulam no lado do tubo, transfira o sobrenadante para um tubo fresco.
  6. Adicione 6 μL de NaCl 5 M, para reverter a reticulação e 2 μL de proteinase K (0,5 μg / μL). Depois de misturar as amostras, incubar as amostras durante 2 h a 65 ° C.
  7. Para a purificação do DNA, execute um pheExtracção nol / clorofórmio 12 (passo 3.5) e subsequentemente ressuspender o grânulo em 30 μL de dH2O.
    NOTA: As amostras podem ser analisadas diretamente para locais de ligação de proteínas (seção 5) ou podem ser armazenadas a -20 ° C.

6. Análise do site de ligação

  1. Realizar uma análise para locais de ligação específicos dentro de uma sequência conhecida de ácido nucleico usando PCR ou qRT-PCR. Para o projeto do primer, siga os protocolos convencionais de PCR ou qRT-PCR. Desenhe os iniciadores para sintetizar um amplicon de 150-400 pb que faz uma ponte sobre o local de ligação da proteína de interesse ( Figura 1 ).
  2. Configure a PCR usando quatro modelos de DNA diferentes para assegurar a especificidade: i) DNA de ChIP imunoprecipitado com o anticorpo de interesse, ii) DNA de ChIP imunoprecipitado com um anticorpo IgG não específico, iii) DNA de entrada e iv) H2O como um Controle negativo para o PCR para excluir a contaminação. No caso da estimulação do caminho, Escolha um quinto modelo usando um conjunto diferente de primers específicos para um site de ligação conhecido da proteína imunoprecipitada.
    NOTA: No caso da análise do promotor do ligando c-KIT, use PCR convencional para demonstrar a ligação SMAD induzida por TGF-β no SBE dentro da região promotora do ligando c-KIT. Como um controlo positivo, realizar PCR no inibidor-1 do activador do plasminogénio (PAI-1) como um alvo conhecido da ligação de SMAD induzida por TGF-p.

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Representative Results

A ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptor cognato resulta na fosforilação de serina de fatores de transcrição de SMAD2 / 3, seguidos de sua associação com o mediador comum, SMAD4. O complexo SMAD se transloca para o núcleo. O TGF-p pode regular a transcrição do gene, quer directamente através da ligação do SMAD aos SBEs dentro das regiões reguladoras dos genes alvo, quer indirectamente através da expressão regulada por SMAD de activadores transcricionais ou repressores que subsequentemente regulam a expressão do gene de interesse 10 . Para testar se o ligando c-KIT SCF é regulado transcriptionally pela ligação induzida por TGF-β1 direta de SMAD2 ao seu promotor, analisamos a região flanqueadora de 2,4 kb, 5 partes do promotor do SCF do gene SCF para o Motivo de ligação SMAD2, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . Identificamos 7 supostos SBEs upsTream do codão de início SCF ( Figura 1A ). Para confirmar a ligação induzida por TGF-β1 de SMAD2 ao promotor SCF, o ensaio ChIP aqui descrito foi realizado. O tratamento com TGF-β1 resultou em ligação de SMAD2 ao promotor de SCF em linhas de câncer de fígado humano, HepG2 e Hep3B, células ( Figura 1B ). Na ausência de estimulação com TGF-β1, não foi observada ligação de SMAD. Como um controle positivo para a ativação de SMAD induzida por TGF-β1, ChIP para PAI-1 foi realizado. O promotor PAI-1 é um alvo conhecido de TGF-β / SMAD 13 . Para confirmar a especificidade da imunoprecipitação com SMAD2, utilizaram-se anticorpos IgG inespecíficos; Não se observou ligação de SMAD2 ao SBE após imunoprecipitação com IgG.

Para outra demonstração da tecnologia ChIP, analisamos a região flanqueadora 5 'do gene do ligando TGF-p para os motivos de ligação de consenso STAT3 5'-TT (N4) AA-3 'e 5'-TT (N5) AA-3' 15 . Identificamos dois locais de ligação STAT3 putativos a montante do codão de início do TGFB nas posições -4384 / -4373 (STB-1) e -5365 / -5357 (STB-2) ( Figura 2A ). Para confirmar a ligação induzida por TGF-β1 de STAT3 ao gene do ligando TGF-β, realizamos ensaios ChIP utilizando células HepG2 e Hep3B tratadas com TGF-β1. O tratamento com TGF-β1 resultou na ligação de STAT3 ao segundo local de ligação de STAT3 putativo (STB-2) do gene de TGFB, mas não ao primeiro (STB-1) ( Figura 2B ). Neste exemplo, a ligação STAT3 positiva ao STB-2 serve como um controle positivo interno. Semelhante ao experimento CHIP acima, a ligação de STAT3 ao STB-2 não foi observada após a imunoprecipitação usando IgG.

figura 1
figura 1 Ong>: Ligação SMAD2 induzida por TGF-β ao Promotor SCF. ( A ) Representação esquemática do promotor SCF , com SBEs putativos mostrados como caixas (caixas brancas = AGAC) com sua posição relativa ao codão de início. A localização do primário ChIP é mostrada abaixo, com as posições relativas ao codão de partida SCF e ao tamanho do produto PCR. ( B ) ChIP para ligação SMAD2 ao promotor SCF . Os complexos de cromatina-proteína das células HepG2 e Hep3B tratadas com TGF-β1 e não tratadas foram imunoprecipitados com anticorpo anti-SMAD2. A PCR foi realizada utilizando iniciadores específicos de SCF. À esquerda, são mostrados os resultados de PCR que utilizam DNA de entrada. No meio, os resultados de PCR após imunoprecipitação com IgG inespecífica são mostrados para a confirmação da especificidade de imunoprecipitação de SMAD2. Mostrado no painel inferior, a ligação ChIP para SMAD2 ao PAI-1 foi utilizada como um controle positivo.Ge.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2
Figura 2 : Ligação STAT3 induzida por TGF-β ao gene TGF-β. ( A ) Esquema do gene TGF-β, com locais de ligação STAT3 putativos mostrados como caixas cinzentas com a sua posição relativa ao codão de início. As localizações de iniciadores de ChIP são mostradas com suas posições relativas ao codão de início de TGF-β e os tamanhos de produtos de PCR indicados abaixo. ( B ) ChIP para a ligação STAT3 induzida por TGF-β1 ao gene TGF-β. Os complexos de cromatina-proteína de células HepG2 e Hep3B tratadas com TGF-β1 e não tratadas foram imunoprecipitados com anticorpo anti-STAT3. O PCR foi realizado utilizando iniciadores específicos de TGF-p. À esquerda, são mostrados os resultados de PCR que utilizam DNA de entrada. No meio, o PCRResultados após imunoprecipitação com IgG inespecífica são mostrados para confirmação da especificidade de imunoprecipitação STAT3. O painel superior mostra os resultados da PCR usando primers específicos para o local de ligação STAT3 1 (STB-1) e o painel inferior mostra os resultados para a ligação STAT3 ao site de ligação STAT3 2 (STB-2). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Discussion

Neste relatório, demonstramos a ligação induzida por TGF-β1 de SMAD2 a um SBE dentro do promotor do ligando c-KIT e à ligação induzida por TGF-p1 de STAT3 à sua sequência de reconhecimento dentro do gene do ligando TGF-β1. Demonstamos ligação induzida por citocinas de ambos os fatores de transcrição usando imunoprecipitação com cromatina.

A imunoprecipitação da cromatina é uma ferramenta poderosa para demonstrar a ligação direta de uma proteína de interesse para o DNA, para caracterizar os estímulos que induzem a ligação das proteínas ao DNA e caracterizar a seqüência de DNA à qual a proteína se liga. A última informação pode ajudar na identificação de genes regulados por uma proteína específica de interesse e é alcançada pelo uso de ChIP-on-chip, ChIP-seq, ou estratégias de clonagem 7 , 8 , 9 . Uma das principais vantagens do ChIP versus outros métodos de demonstração da ligação DNA-proteína, Como a pegada EMSA ou DNase I, é que, na tecnologia ChIP, a ligação é capturada in vivo , enquanto com outras, é realizada in vitro . Assim, o ChIP fornece informações sobre a ligação da proteína do DNA no contexto celular, enquanto as outras técnicas representam um sistema isolado.

No entanto, a análise ChIP é complexa, envolve várias etapas que podem afetar os resultados e requer otimização e experiência. Uma das primeiras etapas que é crítica para o sucesso do ChIP é a etapa de reticulação (passo 2.2). A reticulação UV é irreversível e, portanto, inadequada para ChIP. É preferida a reticulação de formaldeído, mas a concentração de formaldeído e o tempo de reticulação podem influenciar a eficiência do cisalhamento da cromatina e a precipitação do antígeno. Em geral, são preferíveis concentrações mais baixas de formaldeído (1% p / v) e tempos de reticulação mais curtos (5-10 min), pois melhoram a eficiência de corte. No entanto, o formaldeído não é eficienteNa reticulação proteína-proteína e, portanto, é subóptima para proteínas que não se ligam diretamente ao DNA 16 . Para tais casos, o ChIP pode ser feito em uma abordagem de dois passos, em que a reticulação proteína-proteína é feita primeiro usando reticulantes tais como glutarato de disuccinimidilo, seguido de reticulação de proteína de DNA mediada por formaldeído 17 .

O próximo passo crítico é o corte por cromatina. Em nosso estudo, utilizamos cisalhamento enzimático usando nuclease microcócica. O cisalhamento enzimático é especialmente útil para o ChIP nativo não reticulado (N-ChIP), quando a sonicação interromperia a ligação da proteína do DNA. N-ChIP é predominantemente utilizado para análise de histonas e modificadores de histonas 18 . Embora a nuclease microcócica seja considerada uma endo-exonuclease relativamente não específica, demonstrou-se que provoca a clivagem específica da sequência 19 . Isso pode resultar em um viés dependente da sequência no fra resultanteGmentes, com uma representação excessiva de certos loci dos genes 20 . A sonicação cria fragmentos de DNA de tamanho aleatório, sem tendência de sequência, e é geralmente preferido para ChIP (X-ChIP) reticulado. No entanto, as condições de sonicação devem ser determinadas empiricamente para cada modelo de célula ou tecido e sonicador, e os fragmentos de DNA resultantes são geralmente maiores do que com o corte por enzimas 16 . Além disso, a sobre-sonicação ou emulsificação da amostra pode resultar na perda de epítopos de anticorpos devido à desnaturação e degradação de proteínas.

O passo de imunoprecipitação é outro passo crítico que pode influenciar muito os resultados do ChIP. Os grânulos de agarose ligam o DNA de forma não específica, e a variação no número de pérolas adicionadas pode afetar a relação sinal-fundo específico. Por isso, é importante manter a "pasta" de grânulos de agarose bem suspensa quando é adicionada às amostras de proteína de DNA. Em relação ao anticorpo utilizado para o iEm geral, os anticorpos de grau ChIP devem ser usados ​​e, nos casos em que estes não estejam disponíveis, pelo menos os anticorpos de grau de imunoprecipitação devem ser preferidos. Como epitopos específicos podem ser mascarados durante a reticulação, os anticorpos policlonais são vantajosos, pois reconhecem vários epítopos. A quantidade de anticorpo adicionado deve ser superior ao fator que está sendo precipitado e, portanto, deve ser determinado empiricamente para cada fator / anticorpo. Além disso, como a cinética para atingir o equilíbrio da ligação do anticorpo é diferente para cada anticorpo, as condições de incubação ótimas devem ser determinadas para cada anticorpo.

Vários controles podem e devem ser incluídos na configuração experimental. Nos casos em que a indução de uma reação especifica de ligação à proteína de DNA é avaliada, é importante incluir um controle de DNA de entrada para demonstrar quantidades de DNA de modelo iguais na análise final ( ou seja, PCR ou qRT-PCR). É necessário um controle de anticorpos paraConfirmar a especificidade da imunoprecipitação da proteína de interesse. Normalmente, as imunoglobulinas compatíveis com isotipo são bem adequadas como controles negativos, mas também podem ser usadas grânulos de agarose. Ocasionalmente, controles positivos são usados ​​para confirmar um fluxo experimental funcional do ChIP, e os anticorpos anti-histona são freqüentemente usados ​​para este propósito. Em experimentos de estimulação, um controle positivo preferível é a imunoprecipitação da proteína de interesse, com análise subsequente de seqüência para uma região de DNA conhecida, as proteínas se ligam após a estimulação. Em nossos resultados representativos, o SBE dentro do promotor PAI-1 foi utilizado como um alvo conhecido para a ligação SMAD induzida por TGF-β1. Em experimentos sem ligação de proteína estimulada, uma sequência de DNA conhecida por não ser um alvo para a proteína de interesse pode ser usada para análise de DNA subsequente. Em relação à análise de DNA, é importante incluir uma reação sem modelo de DNA para descartar a contaminação.

ChIP é uma excelente técnica para demonstrar diretamente a ligação de uma proteína de interesse para um gene. No entanto, não é um estudo funcional. Nos casos em que uma proteína de interesse é pensada para ter um papel regulador, é imperativo também realizar ensaios funcionais, como ensaios baseados em genes repórter ( por exemplo, luciferase). Nestes protocolos, o gene de interesse é clonado numa posição reguladora de um gene repórter. A indução do gene de interesse resulta na expressão do gene repórter se tiver uma função reguladora. Para uma confirmação adicional do papel regulador da proteína específica de interesse, podem ser geradas células knock-down ou knock-in em que a proteína de ligação ao DNA é geneticamente silenciada. Como um controlo adicional, o sítio de ligação à proteína no gene regulador pode ser mutado para prevenir a ligação da proteína de interesse. Em qualquer um dos dois últimos desenhos experimentais, a estimulação celular não resultará na expressão do marcador gEne.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (Startup Funds, BB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

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References

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