Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

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Genetics

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Summary

Las interacciones ADN-proteína son esenciales para múltiples procesos biológicos. Durante la evaluación de las funciones celulares, el análisis de las interacciones ADN-proteína es indispensable para la comprensión de la regulación de genes. La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para analizar tales interacciones in vivo.

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Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

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Abstract

Los múltiples procesos celulares, incluyendo la replicación y reparación del ADN, la recombinación del ADN y la expresión génica, requieren interacciones entre las proteínas y el ADN. Por lo tanto, las interacciones ADN-proteína regulan múltiples funciones fisiológicas, fisiopatológicas y biológicas, tales como la diferenciación celular, la proliferación celular, el control del ciclo celular, la estabilidad cromosómica, la regulación genética epigenética y la transformación celular. En las células eucariotas, el ADN interactúa con las proteínas histonas y no histonas y se condensa en cromatina. Varias herramientas técnicas se pueden utilizar para analizar las interacciones ADN-proteína, tales como el Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) y DNase I footprinting. Sin embargo, estas técnicas analizan la interacción proteína-ADN in vitro , no dentro del contexto celular. La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es una técnica que captura las proteínas en sus sitios específicos de unión al ADN, permitiendo así la identificación de la interacción ADN-proteínaS dentro de su contexto de cromatina. Se realiza mediante fijación de la interacción ADN-proteína, seguido por inmunoprecipitación de la proteína de interés. Posteriormente, se caracteriza el sitio genómico al que estaba ligada la proteína. Aquí, describir y discutir ChIP y demostrar su valor analítico para la identificación de la transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) inducida por la unión de la transcripción factor SMAD2 a SMAD Elementos de Unión (SBE) dentro de la región promotora de la tirosina- Proteína cinasa Kit (c-KIT) receptor ligando Stem Cell Factor (SCF).

Introduction

En el núcleo de eucariotas, el ADN interactúa con las proteínas histonas y las proteínas nonhistone y se condensa en cromatina. En el contexto fisiológico, fisiopatológico y de biología celular, las funciones celulares se controlan espacial y temporalmente mediante la expresión de genes coordinados con la cromatina. Las interacciones ADN-proteína tienen un papel esencial en la regulación de los procesos celulares, como la replicación, recombinación y reparación del ADN, así como la expresión de proteínas. Por lo tanto, el análisis de las interacciones ADN-proteína es una herramienta indispensable en la evaluación de la expresión génica y la función celular.

Existen varias técnicas para evaluar las interacciones ADN-proteína in vitro , tales como el Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) y DNase I footprinting 1 , 2 . Sin embargo, estas técnicas no analizan la interacción proteína-ADN dentro de la cromatina y el contexto celular. ChIP iSa que captura proteínas unidas a sus sitios de unión de ADN específicos y facilita de este modo la identificación de interacciones ADN-proteína dentro del contexto de la cromatina. La técnica fue desarrollada originalmente por Gimour y Lis para la evaluación de ARN polimerasa II vinculante a genes específicos en Escherichia coli y Drosophila melanogaster [ 3 , 4] . Se realiza mediante la fijación de los complejos de ADN-proteína, seguido de la extracción de cromatina y cizallamiento del ADN en fragmentos de aproximadamente 200 pares de bases (pb). Posteriormente, la proteína de interés unida al ADN se aísla por inmunoprecipitación. Después de la inversión de la reticulación ADN-proteína, el ADN se purifica y analiza. Pueden usarse varios métodos para el análisis de los sitios de unión a proteínas y dependen de la secuencia de ácido nucleico del sitio de unión a proteínas dentro del gen diana 5 . En los casos en que se conoce la secuencia de ADN, la norma PolYmerase Chain Reactions (PCR), usando pares de cebadores específicos flanqueando el sitio de unión conocido. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) también puede ser utilizado [ 6] . En los casos en que la secuencia es desconocida, ChIP puede combinarse con microarrays de ADN (ChIP-on-chip), secuenciación de ADN (ChIP-seq) o técnicas de clonación 7 , 8 , 9 .

La vía TGF-β tiene potentes funciones supresoras de tumores y es una vía clave en la diferenciación celular. Se activa a través de la unión del ligando TGF-β1 a su complejo receptor cognato, resultando en la fosforilación serina de factores de transcripción SMAD2 / 3. Tras su asociación con el mediador común SMAD4, el complejo SMAD se trasloca al núcleo y se une al SBE dentro de la región promotora de los genes diana, donde regula los genes que controlan el ciclo celular, la apoptosis y la diferenciación celularen. La respuesta transcripcional a la estimulación de TGF-β es de tipo celular y de contexto específico [ 10] . Recientemente, se describe un lazo de retroalimentación positiva entre TGF-β y el c-KIT vía 11 . En este modelo, el SMAD2 activado por TGF-β1 se une al promotor del ligando c-KIT e induce su expresión y secreción. Posteriormente, el ligando c-KIT activa el receptor c-KIT de una manera auto- y para-crínica. C-KIT activación del receptor en STAT3 Tyr 705- fosforilación a través de JAK1 / 2. Tras la activación de STAT3 y la translocación nuclear, STAT3 se une al gen del ligando TGF-β1 y regula su expresión.

Aquí, se demuestra el papel esencial del análisis de ChIP para la identificación de SMAD2 vinculante a la c-KIT receptor ligando promotor y para la identificación del transductor de señal (y) Activador (de) Transcripción 3 (STAT3 vinculante a la TGF-β1- gene).

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Protocol

1. Preparación de Soluciones

  1. Prepare las siguientes soluciones frescas para cada experimento.
    1. Para la solución de fijación , se prepara 37% formaldehído y se almacena a temperatura ambiente. Diluir en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) hasta una concentración final de 1,42%.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído se clasifica como irritante, corrosivo, mutagénico, teratogénico y carcinógeno. No ingerir. No respirar los gases / humos / vapores / aerosoles. en caso de falta de ventilación, lleve equipo de respiración adecuado. Evite el contacto con la piel y los ojos. Mantener alejado de sustancias incompatibles, tales como agentes oxidantes, agentes reductores, ácidos, álcalis y humedad.
    2. Para la solución de fijación de glicina, preparar glicina 0,125 M en solución de 1x PBS y almacenarla a TA.
    3. Para la solución de raspado de células, preparar una solución 1x PBS en dH2O y almacenarla en hielo. Directamente antes de su uso, añada el inhibidor de la proteinasa fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) tOa una concentración final de 0,5 mM.
      PRECAUCIÓN: El PMSF se clasifica como corrosivo y tóxico; Use ropa protectora y úsela en un área ventilada.
    4. Directamente antes de usar el tampón de lisis celular (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 85 mM y NP40 al 0,5%), añadir 1X Coqueta de Inhibidores de Proteasa (PIC; 100x solución madre en dimetilsulfóxido (DMSO) Hidrocloruro de fluoruro de 2-aminoetil) bencenosulfonilo (AEBSF), aprotinina 80 mu M, bestatina 4 mM, E-64 1,4 mM, leupeptina 2 mM y pepstatina A 1,5 mM) y PMSF 0,5 mM.
    5. Directamente antes de usar el tampón de lisis de núcleos (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, ácido etilendiaminotetraacético 10 mM (EDTA) y SDS al 1%), añadir PIC 1X y PMSF 0,5 mM.

2. Fijación y Cizallamiento de la Célula

  1. Crecer las células a 70-80% de confluencia en 10 cm placas de cultivo de tejidos. Estimular las células por los objetivos experimentales.
  2. Eliminar el medio de cultivo de tejido, añadir 5 ml de solución de fijación e incubarLas células durante 10 min a RT en una plataforma de agitación.
  3. Se retira la solución de fijación y se lavan las células dos veces con 10 ml de PBS 1x helado.
  4. Eliminar el PBS 1x, añadir 5 ml de solución de glicina stop-fix, e incubar las células durante 5 min a RT en una plataforma de agitación.
  5. Se retira la solución de fijación de glicina y se lavan las células dos veces con 10 ml de PBS 1x helado.
  6. Retire el 1x PBS, agregue 2 mL de solución de raspado de células y recoja las células usando un raspador de células. Transferir las células cosechadas a un tubo cónico sobre hielo.
  7. Centrifugar las muestras durante 10 min a 600 xg y 4 ° C.
  8. Se retira el sobrenadante, se vuelve a suspender el sedimento en 1 ml de tampón de lisis celular 1X y se incuba en hielo durante 30 min. Alternativamente, se puede congelar a presión el gránulo en nitrógeno líquido y almacenarlo a -80ºC.
  9. Una vez que el sedimento se resuspendió en el tampón de lisis celular, transferir la suspensión de células a un homogeneizador de dounce helado y dounce durante 10 carreras usando un pestl de tipo BE para la disrupción celular.
  10. Transferir la suspensión de células a un tubo de microcentrífuga y centrifugar las muestras durante 10 min a 2.400 xg y 4 ° C.
  11. Desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento en 350 μL de tampón de digestión de núcleos e incubar las muestras durante 5 minutos a 37 ° C.
  12. Añadir nuclease micrococcal (1 U / μL) y mezclar por vórtex. Incubar las muestras a 37 ° C durante 5-20 min; Mezclar las muestras cada 2 min por inversión.
    NOTA: El tiempo y la concentración enzimática difieren entre líneas celulares y pueden requerir optimización en casos de cizallamiento enzimático subóptimo.
  13. Alternativamente, lograr el cizallamiento de la cromatina por sonicación usando sonicadores comercialmente disponibles.
    NOTA: Las condiciones de sonicación requerirán optimización. A continuación se proporciona un protocolo de ejemplo de optimización usando un volumen de muestra de 300 μl y una potencia de procesamiento de muestra de 25%.
    1. Después de la etapa 2.10, desechar el sobrenadante y resuspender el nUclear en 1,0 ml de tampón de cizallamiento comercial.
    2. Alícuota de 300 μl del sedimento nuclear resuspendido en tres tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Colóquelos en el hielo.
    3. Cizallar las 3 alícuotas de cromatina fija al 25% de potencia utilizando 3 condiciones diferentes para determinar las condiciones óptimas de sonicación:
      5 pulsos de 20 s cada uno, con un descanso de 30 s sobre hielo entre cada pulso.
      10 pulsos de 20 s cada uno, con un reposo de 30 s sobre hielo entre cada pulso.
      20 pulsos de 20 s cada uno, con un descanso de 30 s sobre hielo entre cada pulso.
    4. Continúe con el Paso 2.15, como se describe a continuación.
  14. Después de la incubación con la nuclease micrococcal, añadir 7 μl de EDTA 0,5 M enfriado con hielo para detener la reacción.
  15. Centrifugar las muestras con el ADN cortado durante 10 min a 16.200 xg y 4 ° C.
  16. Transferir el sobrenadante que contiene ADN cortado a un tubo de microcentrífuga fresco. Alícuota de 50 μl en un tubo de microcentrífuga separado para confirmar el suCizallamiento excesivo del ADN (sección 3). Utilice el volumen restante inmediatamente para inmunoprecipitación (sección 4) o guárdelo a -80 ° C.

3. Confirmación de la Eficiencia de Corte

  1. Añadir 150 μL de dH2O libre de nucleasa y 10 μL de NaCl 5 M a la alícuota de 50 μl de la cromatina cortada de la etapa 2.16.
  2. Incubar las muestras a 65 ° C durante 4 h para invertir los enlaces cruzados.
  3. Añadir 2 μl de RNasa A (10 μg / μl) e incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min.
  4. Añadir 10 μL de proteinasa K (0,5 μg / μl) e incubar las muestras a 42 ° C durante 90 minutos.
  5. Para la purificación del ADN, realizar una extracción de fenol / cloroformo 12 .
    1. Añadir agua libre de nucleasa hasta un volumen final de 200 μl. Añadir 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) a la muestra y agitar durante 20 s.
    2. Centrifugar a temperatura ambienteDurante 5 min a 16.000 x g. Quitar cuidadosamente la fase acuosa superior y transferirla a un tubo nuevo. Asegúrese de no transportar ningún fenol durante la pipeta.
    3. Añadir 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M (NH4OAc), pH 5,2, y mezclar agitando varias veces el tubo con un dedo. Añadir 2,5 volúmenes de etanol 100% enfriado con hielo y mezclar por vórtex durante 5 s. Incubar la muestra O / N a -20 ° C, o durante al menos 1 h a -80 ° C.
    4. Centrifugar la muestra durante 30 min a 4 ° C y 16.000 xg para sedimentar el cDNA.
    5. Retirar con cuidado el sobrenadante sin interrumpir el gránulo. Añadir 1 mL de RT, etanol al 70% e invertir el tubo varias veces.
    6. Centrifugar la muestra durante 2 min a 4 ° C y 16.000 x g. Retire cuidadosamente el sobrenadante.
    7. Se seca el gránulo durante 5-10 minutos a TA. Resuspender el sedimento en 30 μl de dH $ $ O.
  6. Utilizar una alícuota de 5 y 10 μl del ADN purificado para electroforesis en gel con un 1% de TAEGel de agarosa.
    NOTA: El exitoso corte de la cromatina da como resultado un patrón de ADN de 200-1.500 pb. Si el cizallamiento no tiene éxito, determine las condiciones de cizallamiento óptimas para las células específicas modificando el tiempo de incubación de la etapa de cizallamiento (etapa 2.12) a 5, 10 y 15 min.
  7. Utilice la muestra restante para analizar la concentración de ADN de la muestra. Reverse-calcule la concentración de ADN en la muestra de cromatina cortada (paso 2.16); Utilizar las mismas cantidades de ADN para cada grupo de tratamiento para la inmunoprecipitación (sección 4).

4. Inmunoprecipitación

  1. Combinar 10-25 μg de la cromatina reticulada cortada (etapa 2.16) con 25 μL de perlas magnéticas de proteína G de grado ChIP, 10 μl de tampón de dilución de inmunoprecipitación (solución madre: SDS al 0,01%, Triton X-100 al 1,1%, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1,2 mM y NaCl 167 mM) y 1 μl de PIC.
  2. Después de 4 h de incubación, se a~naden 1-10 μg de anticuerpo (el anticuerpo concentradoLa variación dependerá de la afinidad del anticuerpo; Debe utilizarse inicialmente según las recomendaciones del fabricante y optimizado experimentalmente si es necesario) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir dH 2 O a un volumen final de 100 μl.
    NOTA: En lugar del método de inmunoprecipitación directa descrito anteriormente, se puede usar el método de inmunoprecipiación indirecta combinando primero la cromatina con los anticuerpos y añadiendo posteriormente perlas magnéticas de proteína G.
  3. Incubar las muestras en un rotador de extremo a extremo durante 4-12 horas a 4 ° C.

5. Elución

  1. Coloque los tubos en un soporte magnético. Una vez que las perlas magnéticas se agregan en el lado del tubo, retire cuidadosamente y deseche el sobrenadante.
  2. Lavar las perlas tres veces con 800 μl de tampón de lavado 1 (SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM pH 8, Tris-HCl 20 mM, pH 8 y NaCl 150 mM); Mezcle invirtiendo el tubo varias veces. Coloque el tubo en el soporte magnético aY retirar cuidadosamente el tampón de lavado una vez que las bolas magnéticas se agregan en el lado del tubo.
  3. Lavar las perlas una vez con 800 μl de tampón de lavado 2 (SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM, pH 8, Tris-HCl 20 mM pH 8 y NaCl 500 mM); Mezcle invirtiendo el tubo varias veces. Coloque el tubo en el soporte magnético y retire con cuidado y deseche el tampón de lavado una vez que las perlas magnéticas se agregan en el lado del tubo.
  4. Resuspender las perlas en 50 μl de tampón de elución (SDS al 1% y NaHCO3 100 mM) e incubar las muestras en un rotador de extremo a extremo durante 15 minutos a TA.
  5. Coloque los tubos sobre un soporte magnético, y una vez que las bolas magnéticas se acumulan en el lado del tubo, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
  6. Añadir 6 μl de NaCl 5 M, para invertir la reticulación, y 2 μL de proteinasa K (0,5 μg / μl). Después de mezclar las muestras, incubar las muestras durante 2 h a 65 ° C.
  7. Para la purificación del ADN, realizar un pheNol / cloroformo 12 (etapa 3.5) y posteriormente resuspender el sedimento en 30 μl de dH2O.
    NOTA: Las muestras se pueden analizar directamente en cuanto a sitios de unión a proteínas (sección 5) o pueden almacenarse a -20ºC.

6. Análisis del sitio de enlace

  1. Realice un análisis para sitios de unión específicos dentro de una secuencia de ácido nucleico conocida usando PCR o qRT-PCR. Para el diseño del cebador, siga protocolos convencionales de PCR o qRT-PCR. Diseñe los cebadores para sintetizar un amplicón de 150-400 pb que puentee el sitio de unión a proteínas de interés ( Figura 1 ).
  2. Preparar la PCR usando cuatro plantillas de ADN diferentes para asegurar la especificidad: i) ADN de ChIP inmunoprecipitado con el anticuerpo de interés, ii) ADN de ChIP inmunoprecipitado con un anticuerpo IgG no específico, iii) ADN de entrada, e iv) H 2 O como Negativo para la PCR para descartar la contaminación. En el caso de la estimulación de la vía, Elija una quinta plantilla utilizando un conjunto diferente de cebadores específicos para un sitio de unión conocido de la proteína inmunoprecipitada.
    NOTA: En el caso del análisis del promotor de ligando c-KIT, use PCR convencional para demostrar la unión SMAD inducida por TGF-β en el SBE dentro de la región promotora del ligando c-KIT. Como control positivo, realizar la PCR sobre el inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) como un objetivo conocido de unión a SMAD inducida por TGF-β.

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Representative Results

La unión del ligando de TGF-β1 a su complejo de receptor afín resulta en la fosforilación de serina de factores de transcripción de SMAD2 / 3, seguida por su asociación con el mediador común, SMAD4. El complejo SMAD se transloca al núcleo. TGF-β puede regular la transcripción de genes, ya sea directamente a través SMAD vinculante a SBEs dentro de las regiones reguladoras de los genes objetivo, o indirectamente a través de la expresión regulada por SMAD de activadores transcripcionales o represores que posteriormente regulan la expresión del gen de interés [ 10] . Para probar si el ligando c-KIT SCF se regula transcripcionalmente por la unión directa de SMAD2 inducida por TGF-β1 a su promotor, se analizó la región flanqueante 5'-2,4-kb, que contiene el promotor SCF del gen SCF para el gen SMAD2 motivo de unión, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . Hemos identificado 7 putativo SBEs upsDel codón de inicio del SCF ( Figura 1A ). Para confirmar la unión inducida por TGF-β1 de SMAD2 al promotor SCF, se realizó el ensayo ChIP descrito aquí. El TGF-β1 tratamiento dio lugar a SMAD2 vinculante a la SCF promotor en cáncer de hígado humano líneas, HepG2 y Hep3B, las células ( Figura 1B ]. En ausencia de estimulación con TGF-β1, no se observó unión de SMAD. Como control positivo para la activación de SMAD inducida por TGF-β1, se realizó ChIP para PAI-1. El promotor PAI-1 es un objetivo conocido de TGF-β / SMAD [ 13] . Para confirmar la especificidad de la inmunoprecipitación SMAD2, se utilizaron anticuerpos IgG no específicos; No se observó unión SMAD2 al SBE después de la inmunoprecipitación con IgG.

Para otra demostración de la tecnología ChIP, analizamos la región flanqueante 5 'del gen del ligando TGF-β para los motivos de unión al consenso STAT3 5'-TT (N4) AA-3 'y 5'-TT (N5) AA-3' 15 . Hemos identificado dos putativo STAT3 sitios de unión aguas arriba de la TGFB inicio codon en las posiciones -4384 / -4373 (STB-1) y -5365 / -5357 (STB-2) ( Figura 2A ]. Para confirmar la unión inducida por TGF-β1 de STAT3 al gen del ligando TGF-β, se realizaron ensayos ChIP usando células HepG2 y Hep3B tratadas con TGF-β1. TGF-β1 tratamiento resultó en STAT3 vinculante a la segunda putativo STAT3 sitio de unión (STB-2) del TGFB gen, pero no a la primera (STB-1) ( Figura 2B ]. En este ejemplo, la unión STAT3 positiva a STB-2 sirve como un control positivo interno. Similar al experimento ChIP anterior, STAT3 unión a la STB-2 no se observó después de immunoprecipitation utilizando IgG.

Figura 1
Figura 1 Ong>: TGF-β-inducida SMAD2 Unión al Promotor SCF. ( A ) Representación esquemática del promotor SCF , con SBEs putativas mostradas como cajas (cajas blancas = AGAC) con su posición relativa con respecto al codón de inicio. La ubicación del cebador ChIP se muestra a continuación, con las posiciones relativas al codón de inicio del SCF y al tamaño del producto PCR. ( B ) ChIP para SMAD2 que se une al promotor SCF . Se inmunoprecipitaron complejos de cromatina-proteína de células HepG2 y Hep3B tratadas con TGF-β1 y no tratadas con anticuerpo anti-SMAD2. La PCR se realizó usando cebadores específicos de SCF. A la izquierda, se muestran los resultados de la PCR usando ADN de entrada. En el medio, los resultados de la PCR después de la inmunoprecipitación con IgG inespecífica se muestran para la confirmación de la especificidad de inmunoprecipitación SMAD2. En el panel inferior, se usó ChIP para unión de SMAD2 a PAI-1 como un control positivo.Ge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2 : Unión de STAT3 inducida por TGF-β al gen TGF-β. ( A ) Esquema del gen TGF-β, con sitios de unión STAT3 putativos mostrados como cajas grises con su posición relativa con respecto al codón de inicio. Las ubicaciones de los cebadores de CHIP se muestran con sus posiciones relativas con respecto al codón de inicio de TGF-β y los tamaños del producto de PCR indicados a continuación. ( B ) CHIP para la unión de STAT3 inducida por TGF-β1 al gen TGF-β. Los complejos cromatina-proteína de células HepG2 y Hep3B tratadas con TGF-β1 y no tratadas se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-STAT3. La PCR se realizó usando cebadores específicos de TGF-β. A la izquierda, se muestran los resultados de PCR usando ADN de entrada. En el medio, la PCRSe muestran los resultados después de la inmunoprecipitación con IgG inespecífica para confirmar la especificidad de inmunoprecipitación STAT3. El panel superior muestra los resultados de la PCR utilizando cebadores específicos para el sitio de unión a STAT3 1 (STB-1), y el panel inferior muestra los resultados para la unión de STAT3 al sitio de unión a STAT3 2 (STB-2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este informe, demostramos la unión inducida por TGF-β1 de SMAD2 a un SBE dentro del promotor del ligando c-KIT y la unión inducida por TGF-β1 de STAT3 a su secuencia de reconocimiento dentro del gen del ligando TGF-β1. Demostramos citoquina inducida por la unión de ambos factores de transcripción utilizando cromatina immunoprecipitation.

La inmunoprecipitación de cromatina es una poderosa herramienta para demostrar la unión directa de una proteína de interés al ADN, para caracterizar los estímulos que inducen la unión de proteínas al ADN y para caracterizar la secuencia de ADN a la que se une la proteína. Esta última información puede ayudar en la identificación de genes regulados por una proteína específica de interés y se logra mediante el uso de ChIP-on-chip, ChIP-seq, o estrategias de clonación [ 7 , 8 , 9] . Una de las principales ventajas de ChIP frente a otros métodos de demostrar ADN-proteína vinculante, Tal como EMSA o DNasa I footprinting, es que, en la tecnología ChIP, la unión se captura in vivo , mientras que con las otras, se realiza in vitro . Por lo tanto, ChIP proporciona una visión de ADN-proteína vinculante dentro del contexto celular, mientras que las otras técnicas representan un sistema aislado.

Sin embargo, el análisis de ChIP es complejo, implica múltiples pasos que pueden afectar los resultados, y requiere optimización y experiencia. Uno de los primeros pasos que es crítico para el éxito de ChIP es el paso de reticulación (paso 2.2). La reticulación UV es irreversible y, por tanto, inadecuada para ChIP. Se prefiere la reticulación con formaldehído, pero la concentración de formaldehído y el tiempo de reticulación pueden influir tanto en la eficiencia de la cizalladura de la cromatina como en la precipitación del antígeno. En general, son preferibles menores concentraciones de formaldehído (1% p / v) y tiempos de reticulación más cortos (5-10 min), ya que mejoran la eficiencia de cizallamiento. Sin embargo, el formaldehído no es eficienteEn la reticulación proteína-proteína y por lo tanto es subóptima para las proteínas que no se unen directamente al ADN [ 16] . Para estos casos, ChIP se puede hacer en un enfoque de dos pasos, en el que la proteína-proteína reticulación se realiza en primer lugar utilizando reticulantes como disuccinimidyl glutarato, seguido de formaldehído mediada por ADN-proteína reticulación [ 17] .

El siguiente paso crítico es el cizallamiento de la cromatina. En nuestro estudio, se utilizó el cizallamiento enzimático utilizando nuclease micrococcal. El cizallamiento enzimático es especialmente útil para ChIP nativo no reticulado (N-ChIP), cuando la sonicación alteraría la unión ADN-proteína. N-ChIP se utiliza principalmente para el análisis de histonas y modificadores de histonas [ 18] . Mientras que la nuclease micrococcal se considera una endo-exonucleasa relativamente no específica, se ha demostrado que provoca la secuencia específica de escisión [ 19] . Esto puede resultar en un sesgo dependiente de la secuencia en el resultado fraCon una representación excesiva de ciertos loci genéticos 20 . La sonicación crea fragmentos de ADN de tamaño aleatorio, sin sesgo de secuencia, y se prefiere generalmente para ChIP reticulado (X-ChIP). Sin embargo, las condiciones de sonicación deben determinarse empíricamente para cada tipo de célula o tejido y modelo de sonicador, y los fragmentos de ADN resultantes son generalmente mayores que con el cizallamiento enzimático 16 . Además, la sonicación excesiva o la emulsión de la muestra puede dar como resultado la pérdida de epítopos de anticuerpo debido a la desnaturalización y degradación de la proteína.

La etapa de inmunoprecipitación es otro paso crítico que puede influir en gran medida en los resultados de ChIP. Las perlas de agarosa se unen de forma no específica al ADN, y la variación en el número de perlas añadidas puede afectar la relación señal / fondo específica. Por lo tanto, es importante mantener la suspensión de perlas de agarosa bien suspendida cuando se añade a las muestras de ADN-proteína. Con respecto al anticuerpo utilizado para el iMmunoprecipitación, en general, deben usarse anticuerpos de grado ChIP y, en los casos en que no están disponibles, se deben preferir al menos anticuerpos de grado inmunoprecipitación. Como epítopos específicos pueden ser enmascarados durante la reticulación, los anticuerpos policlonales son ventajosos, ya que reconocen varios epítopos. La cantidad de anticuerpo añadido debe estar en exceso del factor que se precipita y por lo tanto debe determinarse empíricamente para cada factor / anticuerpo. Además, como la cinética para alcanzar el equilibrio de la unión del anticuerpo difieren para cada anticuerpo, las condiciones óptimas de incubación deben determinarse para cada anticuerpo.

Varios controles pueden y deben ser incluidos en la configuración experimental. En los casos en los que se evalúa la inducción de una reacción de unión a ADN-proteína específica, es importante incluir un control de ADN de entrada para demostrar cantidades de DNA de molde iguales en el análisis final ( es decir, PCR o qRT-PCR). Se requiere un control de anticuerpos paraConfirman la especificidad de la inmunoprecipitación de la proteína de interés. Habitualmente, las inmunoglobulinas de tipo isotipo son adecuadas como controles negativos, pero también se pueden usar perlas de agarosa. Ocasionalmente, los controles positivos se utilizan para confirmar un flujo experimental funcional del ChIP, y anticuerpos anti-histona se utilizan con frecuencia para este propósito. En experimentos de estimulación, un control positivo preferible es la inmunoprecipitación de la proteína de interés, con análisis de secuencia subsiguiente para una región de ADN conocida a la que las proteínas se unen tras la estimulación. En nuestros resultados representativos, el SBE dentro de la PAI-1 promotor se utilizó como un objetivo conocido de TGF-β1 inducida SMAD vinculante. En experimentos sin unión estimulada a proteínas, se puede usar una secuencia de ADN que no se conoce como diana para la proteína de interés para el posterior análisis de ADN. Con respecto al análisis de ADN, es importante incluir una reacción sin ADN molde para descartar la contaminación.

ChIP es una excelente técnica para demostrar directamente la unión de una proteína de interés a un gen. Sin embargo, no es un estudio funcional. En los casos en los que se piensa que una proteína de interés tiene un papel regulador, es imprescindible realizar también ensayos funcionales, tales como ensayos basados ​​en genes informadores ( por ejemplo, luciferasa). En estos protocolos, el gen de interés se clona en una posición reguladora de un gen informador. La inducción del gen de interés da lugar a la expresión del gen informador si tiene una función reguladora. Para la confirmación adicional del papel regulador de la proteína específica de interés, se pueden generar células knock-down o knock-in en las que la proteína de unión al ADN se silencia genéticamente. Como control adicional, el sitio de unión a proteínas en el gen regulador puede ser mutado para evitar la unión de la proteína de interés. En cualquiera de los dos últimos diseños experimentales, la estimulación celular no dará lugar a la expresión del marcador gEno

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (fondos de inicio, BB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

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References

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