Сборка и отслеживание развития микробного сообщества в рамках платформы массивов микролистов

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Развитие микробных сообществ зависит от сочетания факторов, включая экологическую архитектуру, численность членов, черты и взаимодействия. В этом протоколе описывается синтетическая микроструктурированная среда для одновременного отслеживания тысяч сообществ, содержащихся в ямах фемтолитера, где могут быть аппроксимированы ключевые факторы, такие как размер ниши и ограничение.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform. J. Vis. Exp. (124), e55701, doi:10.3791/55701 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Развитие микробных сообществ зависит от сочетания сложных детерминированных и стохастических факторов, которые могут кардинально изменить пространственное распределение и деятельность членов сообщества. Мы разработали платформу массива microwell, которая может использоваться для быстрой сборки и отслеживания тысяч бактериальных сообществ параллельно. В этом протоколе подчеркивается полезность платформы и описывается ее использование для оптического мониторинга развития простых сообществ из двух членов в составе массивов в рамках платформы. Эта демонстрация использует два мутанта Pseudomonas aeruginosa , часть серии мутантов, разработанных для изучения патогенности секреции типа VI. Хромосомные вставки генов mCherry или GFP облегчают конститутивную экспрессию флуоресцентных белков с четкими длинами волн излучения, которые могут использоваться для мониторинга численности и местоположения членов сообщества в каждом микролухе. Этот протокол описывает подробный методD для сборки смесей бактерий в лунки массива и использования временной флуоресцентной визуализации и количественного анализа изображений для измерения относительного роста популяции каждого члена с течением времени. Посев и сборка платформы microwell, процедуры визуализации, необходимые для количественного анализа микробных сообществ внутри массива, и методы, которые могут быть использованы для выявления взаимодействий между областью микробных видов, обсуждались.

Introduction

Микробные сообщества формируются как детерминированными факторами, такими как структура окружающей среды, так и стохастическими процессами, которые связаны с гибелью клеток, делением, концентрацией белка, количеством органелл и мутацией 1 . В естественной среде практически невозможно проанализировать индивидуальное воздействие этих влияний на состав и деятельность сообщества. Замаскированные естественными структурами и погребенные в химической и биологической среде, выявление членов сообщества и дальнейшее разрешение их пространственно-временного распределения в естественной среде чрезвычайно сложны. Тем не менее, недавние усилия подчеркнули важность пространственной организации для функционирования сообщества и указывают на необходимость учета как численности, так и организации в текущих исследованиях 2 , 3 , 4 .

ЭтоЯсно, что локальная химическая среда ( то есть доступность питательных веществ и вторичных метаболитов), физическая структура ( например, почвенная архитектура, корни растений, частицы океана или кишечные микроворсинки), наличие или отсутствие кислорода и введение Патогенные виды влияют на состав, архитектуру и функцию микробных сообществ 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Тем не менее традиционные методы для культур, которые пренебрегают этим фактором, продолжают преобладать. Состав сообщества ( например, наличие со-зависимых видов), физическое прикрепление, концентрация сигнальной молекулы и прямой контакт клеток-клеток являются важными факторами формирования микробного сообщества и могут быть потеряны в cОбщепринятые условия культивирования. Эти свойства трудно реплицировать в объемной жидкой культуре или на агаровой пластине. Тем не менее, наличие микрофлюидных, микронапряжений и технологий нанообработки, которые позволяют реплицировать ключевые физические и химические свойства природных сред, позволило многим исследователям построить сообщества бактерий для изучения их взаимодействий 12 , 13 , 14 и разработать синтетические среды, которые Имитировать природные условия 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .

В этом протоколе описан способ изготовления устройства массива микроволн и подробные экспериментальные процедуры, которые могут быть использованы для функционализацииE колодцев в массиве и выращивать бактерии, как колонии одного вида, так и в сообществах с несколькими членами. Эта работа также демонстрирует, как бактерии, модифицированные для получения флуоресцентных репортерных белков, могут использоваться для мониторинга роста бактерий в лунках с течением времени. Аналогичный массив был представлен ранее и показал, что можно отслеживать рост одновидовых колоний Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) в микролунках. Путем модуляции плотности и плотности посева начальные условия тысяч экспериментов по росту могут варьироваться параллельно, чтобы определить, как исходные условия инокуляции влияют на способность бактерий расти 21 . Текущая работа использует слегка измененную версию массива микроячейки, которая основывается на предыдущей работе, позволяя одновременное сравнение нескольких массивов и используя более надежный экспериментальный протокол. Массив, используемый в этой работе, содержит несколько подмассивов или массивСодержащие лунки разного размера, от 15 до 100 мкм в диаметре, которые расположены на трех разных смолах ( т.е. 2x, 3x и 4x диаметр скважины). Массивы выгравированы в кремнии, а рост бактерий, засеянных в кремниевых массивах, обеспечивается запечатыванием массивов с покровным стеклом, покрытым агарозным гелем с средней интенсивностью. В этой демонстрации используются мутанты P. aeruginosa, предназначенные для изучения системы секреции типа VI.

Представленные здесь результаты направлены на достижение конечной цели анализа сообществ многочленов в массивах матриц микроволн, что позволяет исследователям контролировать численность и организацию бактерий in situ , контролируя и исследуя химическую среду. Это должно в конечном итоге дать представление о «правилах», которые регулируют развитие и преемственность сообщества.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление матрицы из микроволнового кремния

  1. Париленовое покрытие
    1. Депозит между 1-1,5 мкм парилена N на кремниевых пластинах с использованием имеющейся в продаже системы покрытия парилена в соответствии с техническими условиями и инструкциями производителя (настройки: заданное значение испарителя = 160 ° C, заданное значение печи = 650 ° C).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Приблизительно 6 г парилена N, загруженного в камеру, дает покрытия толщиной 1-1,5 мкм.
  2. фотолитография
    1. Спиновое покрытие париленовых N-покрытых пластин с адгезионным промотором, 20% гексаметилдисилазаном (HMDS) и 80% ацетатом монометилового эфира пропиленгликоля (PGMEA) (см. Таблицу материалов ) при 3000 об / мин в течение 45 с. Заполните 2 мл переносной пипетки промотором адгезии и посыпьте ее по всей пластине. Дайте вафельной плите сидеть в течение приблизительно 10 с, прежде чем высушить ее.
    2. Заполните 2 мл пипетки с положительнымNe фоторезист (см. Таблицу материалов ) и распределите фоторезист в центре пластины. Спин при 3000 об / мин в течение 45 с, чтобы получить покрытие сопротивлением, которое составляет приблизительно 1,5 мкм.
    3. Мягко выпекать образцы на конфорке при 115 ° C в течение 1 мин.
    4. Используйте контактный выравниватель и фотомаску с желаемым рисунком лунки, чтобы подвергнуть образец ультрафиолетовому излучению. Экспонируйте спин-покрытую пластину через узорчатую фотомаску в течение 6 с, давая приблизительную дозу 60-80 мДж / см 2, измеренную при 365 нм.
    5. Разработайте образец, погрузив образец в проявитель (<3% гидроксид тетраметиламмония в воде, см. Таблицу материалов ) в течение 2 мин. Промыть водой DI и сушить чистым сухим азотом.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Области фоторезиста, подвергающиеся воздействию УФ, должны быть очищены во время разработки.
  3. Реактивное ионное травление
    1. Используйте плазменную травление кислородной плазмы для удаления обнаженного париленаВплоть до кремниевой подложки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рецепт можно модулировать, чтобы изменить скорость травления парилена. Для толщины парилена от 1 до 5 мкм используйте рецепт с 60 мТорр, 20 ° C, 100 сccm O 2 , 10 W RF и 2000 Вт ICP на инструменте реактивного ионного травления (RIE). После травления и удаления открытого слоя парилена узорчатая область ( то есть облученный кремний) должна выглядеть блестящей и серебристой.
    2. Используйте глубокий процесс RIE (DRIE, например, Bosch DRIE) для травления в кремнии.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Скорость и продолжительность травления определяют глубину скважины. Один полный цикл процесса Bosch (шаг осаждения 3 с: 20 мТорр, 15 ° С, 140 см 3 C 4 F 8 , 10 Вт RF и 1750 Вт ICP с последующим 10-летним процессом травления: 20 мТорр, 15 ° C , 120 sccm SF 6 , 8 W RF и 1 750 W ICP) соответствует приблизительно 1 мкм глубины травления. Колодцы, используемые в этой демонстрации, составляют от 3 до 3,5 мкм.
    3. ВУточнить глубину травления, используя физическую профилометрию.
      1. Загрузите образец в физический профилометр (см. Таблицу материалов ).
      2. Включите вакуум образца и нажмите кнопку ручной загрузки.
      3. Сфокусируйте систему на образце, нажав кнопку «Фокус». Расположите соответствующую функцию для измерения на экране просмотра.
      4. Сканирование образца. Выровняйте профиль и измерьте глубину функции.
      5. Запишите скорость травления и модулируйте последующие времена травления для достижения желаемой глубины.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Измерения будут включать глубину кремниевой скважины, толщину осажденного парилена и толщину фоторезиста. Проверка толщины каждого слоя в течение всей процедуры необходима для достижения точной глубины скважины.

2. Бактериальная культура и сеяние ( рис. 1а )

  1. Начинайте колонии на Лурийском бульоне (LB) агаровые пластины из глицериновых запасов и использовать в течение двух недель. Выбирайте колонии желаемых штаммов из пластин агара LB и начинайте ночные культуры P. aeruginosa. Инкубируйте ночные культуры в течение приблизительно 18 ч при 37 ° С при встряхивании со скоростью 220 об / мин в среде R2A.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Колонии следует собирать в течение двух недель после нанесения покрытия, чтобы гарантировать, что мутации и флуоресцентные репортерные гены сохранены. Все работы P. aeruginosa должны выполняться в условиях BSL-2.
  2. Используйте алмазный писец, чтобы разрезать кремниевую пластину на отдельные чипы, содержащие ансамбли разных размеров и массивы высоты тона. Убедитесь, что каждый чип содержит полный набор размеров и смол для исследования.

Рисунок 1
Рисунок 1: Процесс изготовления и сортировки ячеек. ( A ) Массивы MicrowellРектифицированных в кремниевые пластины, покрытые тонким слоем парилена (i). Для смачивания лунок и / или функционализации поверхности раствор белка добавляется в каплю поверх массивов (ii). Раствор белка удаляют, вафли сушат и добавляют новый раствор, содержащий искомые бактерии (iii). Бактериальный раствор удаляют после инкубационного периода, и вафли дают высохнуть, оставляя бактерии в лунках и на поверхности (iv). Поверхностно-ассоциированные бактерии удаляются с выделением парилена, оставляя позади бактерии, засеянные чисто в микролунках, и все еще жизнеспособны из-за 2% -ной глицериновой среды, что помогает удерживать лунки гидратированными (v). Затем кремниевые чипы размещают на стороне массива на покрытом агарозным гелеобразным стеклянным покровным стеклом, который питает бактериальный рост в микролунах (vi). ( Б ) Макет поддиапазонов на одном кремниевом устройстве. Каждый суб-массив содержит набор одинаковых скважин. Диаметр микролунков по всем суб-аДиапазоны в диапазоне от 5 до 100 мкм и организованы в 2x, 3x или 4x шаг диаметра скважины, который обозначен белым или темно-серым цветом на нижней панели. Когда глубина скважины неглубокая (<10 мкм), диаметры отверстий 5 и 10 мкм редко используются, как правило, из-за отсутствия клеток, колонизирующих эти очень маленькие лунки. В этой работе были проанализированы только данные из скважин диаметром 15-100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПРИМЕЧАНИЕ. Как показано на рисунке 1b , полный чип содержит подвалы колодцев с диаметром от 5 до 100 мкм с тремя разными смолами ( т.е. 2x, 3x и 4x диаметр), повторяющимися 4 раза.

  1. Поместите 150 мкл капли 500 мкг / мл альбумина бычьей сыворотки (BSA) в раствор PBSНа верхней части массива, чтобы намочить микролунки. Инкубируйте раствор BSA в течение 1 часа на чипе при комнатной температуре во влажной камере.
    1. Создайте камеру, заполнив дно пустого наконечника пипетки с помощью фосфатного буферного раствора (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Другие вещества, такие как конкретные лектины, могут использоваться вместо BSA для функционализации поверхности микролунов.
  2. При инкубации кремниевых чипов с раствором BSA центрифугируйте культуры при 2500 об / мин (что соответствует среднему значению 950 × g) в течение 5 мин, а затем ресуспендируют их в 500 мкл свежей среды R2A с 2% глицерином.
    1. Определите OD культуры с использованием УФ-пористого спектрометра при 600 нм. Отрегулируйте его до OD 0,02, используя 2% глицерин R2A.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Глицерин помогает предотвратить высыхание колодцев во время отрыва парилена.
  3. После инкубации удалите раствор BSA и промойте 3 раза с помощью PBS, удалив и заменив каплю жидкостиT, покрывающий массив кремниевых микроячейков. Высушивают в атмосфере азота.
  4. Добавьте 150 мкл 0.02 OD культур в каждый сухой массив, расположенный во влажной камере. Инкубируйте в течение 1 часа при 4 ° C, чтобы бактерии могли прилипать к стенкам колодца.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для инкубации охлаждения не требуется. Время инкубации 4 ° C можно использовать для предотвращения роста бактерий до начала изображения, чтобы можно было визуализировать пространственную организацию сообществ до роста. Также можно использовать инкубацию при комнатной температуре. Оба протокола приводят к аналогичным кривым роста.

3. Настройка микроскопа

  1. Перед началом бактериальной инкубации на кремниевых чипах включите верхнюю камеру контроля окружающей среды (см. Таблицу материалов) и отрегулируйте настройки на блоке управления так, чтобы влажность (~ 100%) и температура (30-32 ° C, см. Шаг 3.2) может уравновешиваться перед добавлением образцов.
  2. Выровняйте держатель образца иTerior вокруг образца с пропитанными PBS лабораторными салфетками (см. Таблицу материалов ) для увеличения влажности в камере до точки росы. Установите температуру камеры на 30 ° C и температуру крышки камеры до 32 ° C, чтобы уменьшить конденсацию на плоскости формирования изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Держатель слайда входит в камеру с жидкими ячейками с прокладкой толщиной около 1 см. Держатель образца выравнивается с помощью уровня пузырьков, который помещается поверх держателя образца. Держатель образца может слегка наклоняться и оставаться герметичным в прокладке до уровня.
  3. В то время как культуры инкубируются на кремниевых чипах, вручную включите выключатель питания для ртутной лампы по крайней мере за 30 минут до изображения. Вручную включите камеру и станцию ​​микроскопа. Откройте программное обеспечение, используемое для управления микроскопом и периферийным оборудованием, и убедитесь, что оборудование распознано программным обеспечением.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Увеличение составляет 10X с NA = 0,3.
  1. Микроволновые предварительно приготовленные растворы агарозы ( т.е. 2% агарозы в среде R2A) до достижения жидкого состояния примерно 60 с.
  2. Намочите заднюю часть стеклянного покровного стекла размером 75 мм x 22 мм, 1,5 дюйма с этанолом и поместите его по длине, по центру, через стеклянный слайд размером 2 х 3 дюйма (50 х 75 мм). Поместите две прокладки PDMS (толщина ~ 1 мм) По длинным краям покровного стекла и сдвиньте покровное стекло, чтобы примерно 1 мм покровного стекла нависало над краем слайда.
  3. Налейте 5 мл жидкого раствора агарозы поверх покровного стекла, достаточно, чтобы полностью покрыть его, и поместите второй стеклянный слайд 2 x 3 дюйма сверху сборки в «сэндвич» жидкого агара между покровным и скользким.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это контролирует глубину агарозы, при этом общая толщина покровного стекла и упрочненной агарозы равна толщине прокладок PDMS.
  4. Дать стеклянному слайд-покровно-агарозному гелеобразному стеклянному сэндвичу установить до тех пор, пока раствор агарозы не начнет затвердевать; Затем переведите его в холодильник. Через 15 мин удалите избыток твердой агарозы и обрезайте покровное стекло. Переместите это на чистую посуду и поместите ее в холодильник до использования.

5. Уплотнение колодцев покрытием с агарозным покрытием и визуализацией

  1. После завершения периода инкубации бактерий удалите покрытое агарозой покровное стекло из холодильника и подготовьте кремниевую стружку следующим образом.
    1. Окуните кремниевые чипы в сверхчистую воду, по одной за раз, по 10 с каждый. Установите их по краям на протирание или ткань в лаборатории до тех пор, пока большая часть избыточной жидкости не будет слита с краев стружки.
    2. Отрежьте кусок ленты, чтобы она соответствовала длине края каждого кремниевого чипа. Поместите ленту на парилену, покрывающую кремний, и используйте ее для быстрого отслаивания париленового покрытия.
    3. IMMEDIally инвертируйте каждый очищенный чип и помещайте каждый чип таким образом, чтобы сторона сопел микроисточника обращена (и контактирует) с покрытой агарозой стороной покрытого агарозой покровного стекла. Старайтесь не перемещать или перемещать чип после того, как он касается агарозы, чтобы предотвратить рост бактерий за пределами колодцев.
  2. Поместите собранное покровное покрытие микролинии / агарозы в держатель слайдов камеры контроля окружающей среды на микроскопе.
    1. Используйте окружающий свет или направленный свет ( например, фонарик), чтобы найти интересующие массивы. Используйте коммерческое программное обеспечение, управляющее автоматическим этапом, чтобы сохранить эти позиции (см. Таблицу материалов). Выключите окружающий или направленный свет после сохранения позиций.
    2. В коммерческом программном обеспечении откройте панель «ND Acquisition».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эта панель содержит меню для автоматического сохранения в конкретном каталоге, а также программируемое получение изображения. Для этих экспериментов, Используются меню «Время», «XY» и «λ».
    3. Чтобы сохранить места в программном обеспечении, щелкните «XY menu», а затем проверьте пустое поле с левой стороны для каждой позиции, которую необходимо сохранить. Также нажмите кнопку «Включить Z».
  3. Приобретайте изображения со временем на требуемых длинах волн и 10 увеличения с использованием соответствующих кубиков фильтра флуоресценции (см. Таблицу материалов).
    1. Используйте программное обеспечение управления и сохраненные позиции массива для перемещения в каждое сохраненное место и для фокусировки на скважинах. Нажмите на каждое место XY в сохраненном списке и отрегулируйте фокус с помощью фильтра Green Flourescence Protein (GFP). Сохраните новую позицию z, щелкнув стрелку, указывающую на местоположение z.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот процесс может занять много времени. Попробуйте принять меры предосторожности для увеличения коэффициента усиления и использования фильтра нейтральной плотности, чтобы уменьшить интенсивность света, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.
    2. Определите расстояние по оси z между фокальными плоскостями для каждой длины волны, отметив разницу в поведении оси z при фокусировке на поверхности массива. Выберите 2-3 места из массива со смешанной популяцией красных / зеленых бактерий и сфокусируйтесь с помощью фильтра Red Fluorescence Protein (RFP).
      1. Вычтите расстояние между фокальными плоскостями с помощью флуоресцентных фильтров GFP и RFP и добавьте настройку фокальной плоскости в меню «λ».
        ПРИМЕЧАНИЕ. Например, если массив выглядит сфокусированным в канале GFP в z-месте 50 мкм, и тот же массив отображается сфокусированным в канале RFP на уровне 55 мкм, добавьте +5 рядом с оптической конфигурацией RFP в «λ ".
    3. Начните поиск изображений с задержкой по времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для экспериментов, показанных здесь, изображения RFP и GFP были получены для каждой позиции массива с интервалом 30 минут с использованием многомерного захвата изображения с помощью коммерческого программного обеспечения, которое контролируетКамера, затвор, колесо фильтров и моторизованная ступень.
      1. Установите «интервал» на 30 минут, а «продолжительность эксперимента» - на 24 часа в меню «Время». Нажмите «Запустить сейчас».
        ПРИМЕЧАНИЕ. Когда флажки «Время», «XY» и «λ» проверены, запуск программы приведет к перемещению сцены для изображения каждого местоположения ( т.е. сохраненных местоположений XYZ), возьмите изображение на одной длине волны, переместите z-позицию Для учета различий фокальной плоскости ( т. Е. Управления длиной лямбда или длины волны), возьмите второе изображение, перейдите к следующему местоположению массива (многоточечный) и зациклируйте его с интервалом 30 минут (с течением времени).
  4. Приобретите изображения управления освещением.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте меню «ND Acquisition», «Time» и «XY» для получения изображений из 4-х мест, по 25 раз.
    1. Возьмите серию из 100 изображений «темного поля», отключив все источники света и«Образ» стандартного слайда. Эти изображения будут снимать шум камеры. Используйте наибольшее время экспозиции, используемое во время временной шкалы (шаг 5.3.3).
    2. Возьмите серию изображений «поля освещенности 100» путем визуализации стандартного слайда ( т. Е. Равномерной интенсивности RFP или GFP) в нескольких разных местах для захвата неравномерного освещения в заданных условиях эксперимента. Выберите время экспозиции, которое максимизирует сигнал без насыщения.

6. Анализ

  1. Обработка стеков изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений ( например, ImageJ).
    1. Конвертируйте полученные изображения в формат файла tiff с помощью коммерческого программного обеспечения. Загрузите изображения в программное обеспечение для анализа изображений, нажав «Файл»> «Импорт»> «Последовательность изображений».
    2. Создайте «Корректирующее изображение», усреднив все изображения «темного поля» и «поля освещенности». SubtracT среднее изображение «темного поля» из среднего изображения «поля освещенности», выбрав «Процесс»> «Калькулятор изображений». Выберите два изображения: «Image1» и «Image2», а затем «Subtract» в поле «Operation». Нажмите «ОК».
      1. Для усреднения загрузите изображения коррекции (или темного поля), нажмите «Изображение»> «Стеки»> «Проект Z»> «Средняя проекция».
    3. При необходимости выполните регистрацию изображений. Затем выполните вычитание фона, нажав «Процесс»> «Вычесть фон». Введите радиус ( например, 125) в поле «радиус» и выберите «скользящий параболоид».
    4. Выполните коррекцию освещенности с помощью «Процесс»> «Калькулятор плюс». Выберите следующие параметры: операция, деление; I1, образ скважины; I2, коррекционное изображение; K1, среднее значение коррекции; И k2, 0. Нажмите «CreСъели новое окно ».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот набор данных не требовал регистрации, но в другой работе ImageJ Plugin StackReg использовался с преобразованием «Перевод». Для вычитания фона используйте один и тот же скользящий радиус параболоида для каждого набора изображений. Например, если изображения с наибольшими лунками имеют радиус пикселя 100, используйте радиус больше 100 ( например, 125) для каждого набора изображений.
  2. Определите рост каждого штамма в микролунках.
    1. Выберите области интереса (ROI) вокруг каждого микрошара в желаемых массивах с помощью модуля ImageJ «MicroArray».
      1. В меню «MAP» нажмите «Сбросить сетку». Укажите строки, столбцы и диаметр (в зависимости от размера и количества скважины в массиве, см . Рисунок 1b ). Выберите «круг» в меню «Форма ROI».
      2. Удерживая клавишу «Alt», выбирая верхний левый ROI с помощью мыши, чтобы переместить tОн ROI. Удерживая клавишу «shift», выбирая нижний левый ROI, чтобы изменить размер массива. Удерживайте клавишу «shift» при выборе ROI с правой стороны массива, но не в углах, чтобы изменить интервал ROI.
      3. Используйте приведенные выше команды для соответствия массиву ROI над лунками изображения. Нажмите «Measure RT».
        ПРИМЕЧАНИЕ. Плагин будет экспортировать требуемые измерения из каждого ROI. Используйте три размера ROI, создавая концентрические кольца вокруг колодцев, чтобы собрать локальный фоновый сигнал ( т. Е. Сигнал от среднего кольца, вычитаемого из внешнего кольца) и измерения флуоресценции ( т. Е. Сигнал от внутреннего кольца).
    2. Соберите данные в программном обеспечении для работы с электронными таблицами и вычислите фоновый сигнал. Импортируйте его в специальное программное обеспечение для создания сценариев для дальнейшего анализа.
  3. Организация и анализ данных
    1. Импорт данных и организация данныхСобранные в ImageJ в матрицу в следующем порядке для всех времен: столбец 1, номер поддиапазона; Столбец 2, ряд скважин; Столбец 3, колонка скважины; Столбец 4, средняя интенсивность; Столбец 5, интенсивность фона; И столбец 6, средняя интенсивность - интенсивность фона.
      1. Отделите результаты получения mCherry и GFP в разных матрицах. Сохраняйте результаты из каждого подматрица и каждого цвета в другой ячейке в массиве ячеек.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Эта организация упрощает перемещение между данными изображения и результатами измерений, очисткой данных и гарантированием того, что измерения точно представляют данные.
    2. Отрегулируйте для автофлуоресценции P. aeruginosa .
      ПРИМЕЧАНИЕ. В экспериментах, связанных с совместной культурой штаммов GFP и mCherry, необходимо проанализировать только чип mCherry, чтобы выяснить взаимосвязь между mCherry и зеленой автофлуоресценцией.
      1. Постройте сигнал mCherry-versus-GFP от всех mCherry ΔretS &# 916; tse / i1-6 лунок во всех временных точках для определения взаимосвязи между сигналом mCherry и автофлуоресценцией в канале GFP. Вычтите сигнал аутофлуоресценции из сокультур.
    3. Постройте траектории и установите модифицированное логистическое уравнение на каждую траекторию для извлечения параметров с использованием меток наименьших квадратов в программном обеспечении электронной таблицы или пользовательском скриптовом программном обеспечении.
    4. Найдите корреляции между параметрами траектории GFP и mCherry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представленная здесь экспериментальная платформа предназначена для высокопроизводительных и высококонцентрированных исследований бактериальных сообществ. Этот проект позволяет одновременно анализировать тысячи сообществ, растущих в лунках разного размера. При таком дизайне массива микролинии может быть определена зависимость конечного состава сообщества от начальных плотностей посева, размера скважины и химической среды. Эта работа демонстрирует рост сообщества из двух человек в массиве микросхем и предлагает методы для анализа состава и организации сообщества.

Модельная система, используемая здесь, была разработана в лаборатории Mougous для изучения секреции типа VI у P. aeruginosa . Система состоит из нескольких мутантных штаммов, содержащих флуоресцентные репортеры GFP или mCherry. В этой работе использовались 2 разных штамма. Первый - мутант ΔretS, помеченный GFP, который является составнымY выражает токсические эффекторные белки, связанные с секрецией Типа VI, что приводит к более высоким уровням гибели клеток в восприимчивых клетках. Второй - это RFP-меченный штамм ΔretSΔtse / i1-6, который является мутантом делеции, пропускающим все шесть известных эффекторных белков, и, как было показано, он более восприимчив к патогенезу типа VI 22 , 23 , 24 . Траектории роста каждого вида отслеживались индивидуально и в пределах двух сообществ-членов ( т . Е. Со-культура внутри платформы массива).

Мутанты ΔretS и ΔretSΔtse / i1-6 высевали на три массива, каждый отдельно и также смешивали вместе в соотношении 1: 2, а затем отображали каждые 30 мин в течение 20 часов. Бактериальный рост в лунках прекратился между 6 и 12 часами после семян. Примеры данных флуоресцентного изображения показаны на рисунках 2 и 3, На рисунке 2 показан рост с течением времени штаммов ΔretS и ΔretSΔtse / i1-6 в лунках диаметром 45 мкм, а на рисунке 3 показано состояние этих же двухчленных сообществ около 6 ч после обработки (hps) в лунках разных размеров.

фигура 2
Рисунок 2: Образцы изображений из Эксперимента по выращиванию культуры со временем. Два мутанта P. aeruginosa , выражающие либо mCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (красный), либо GFP (ΔretS) (зеленый), засеяны вместе в соотношении 2: 1 mCherry: GFP в массивах микроячейки. На снимке представлены композитные изображения, сделанные в 3 раза постобработки в лунках диаметром 45 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версиюЭтой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Диапазон диаметров скважин, включенных в устройство микроволнового массива. Репрезентативные изображения сообществ из двух членов, захваченных в 8 часов роста. Как правило, колонии mCherry (ΔretSΔtse / i1-6) (красный) или GFP (ΔretS) (зеленый) имеют минимальную колокализацию, остающуюся в отдельных областях в микролунках. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

До получения измерений выполнялось скользящее параболическое вычитание фона. Был применен шаг коррекции освещенности, чтобы можно было количественно сравнить сигнал от каждой микроволны, изображенной в данном эксперименте. Этими методами были pОписанным выше. Используя плагин микрочипов в ImageJ, средняя интенсивность красных и зеленых бактерий была измерена в исправленных изображениях вместе с локальным фоновым сигналом. Локальный фоновый сигнал вычитали из сигнала скважины, а сигнал GFP корректировали для коррекции автофлуоресценции со-культур P. aeruginosa (автофлуоресценция, определенная из массивов mCherry ΔretSΔtse / i1-6-only) . После того, как все эти исправления были выполнены, можно было бы построить количественные траектории роста бактерий, экспрессирующих mCherry- и GFP. Примерные траектории роста скважин диаметром 20 и 50 мкм показаны на рисунке 4 .

Рисунок 4
Рисунок 4: Кривые роста моно- и со-культур сортов P. aeruginosa типа VI.( A и d ) кривых роста монокультуры GFP-ΔretS в лунках 20 мкм и 50 мкм соответственно. ( B и e ) mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 кривых роста монокультуры в лунках 20 и 50 мкм соответственно. (C и f) Co-культивирование смеси соотношений 1: 2 штаммов GFP (зеленый) и mCherry (красный) P. aeruginosa . Кривые роста строятся с момента начала сбора изображений, примерно через 2 часа после обработки (hps). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Траектории роста от моно- и ко-культуры штаммов P. aeruginosa указывают на то, что существует определенная изменчивость роста от скважины к скважине и что эта изменчивость увеличивается в скважинах меньших размеров. Тем не менее, средняя интенсивность существенно не зависит от скважины siзе. По-видимому, не наблюдается драматического или явного отрицательного влияния на рост восприимчивого штамма (ΔretSΔtse / i1-6) при наличии штамма ΔretS. Общая интенсивность каждого штамма уменьшалась, но это было связано с более низкой начальной концентрацией каждого штамма в лунках, так как общее ОД поддерживалось согласованным в экспериментах, а не индивидуальным ОД каждого штамма. Однако трудно определить, какие факторы наиболее важны для понимания роста бактерий в этих лунках, просто взглянув только на траектории роста. Поэтому каждая траектория соответствовала модифицированной логистической функции 26 ( рис. 5а ), так что соответствующие параметры могли быть извлечены и использованы для анализа данных о росте бактерий. Каждая траектория была преобразована путем принятия естественного логарифма сигнала, деленного на начальный сигнал. Измененная логистическая функция с тремя параметрами, соответствующими максимальному сигналу (A), максимальнаяСкорость (μ) и время запаздывания (τ) использовались для каждой траектории.

Учитывая известное взаимодействие между штаммами GFP-ΔretS и mCherry-ΔretSΔtse / i1-6, можно предположить, что рост штамма mCherry будет ингибироваться в со-культурах с штаммом 22 , 24 GFP-ΔretS. Используя извлеченные параметры, можно искать положительные или отрицательные корреляции между параметрами, выделенными из GFP и mCherry trajectories. Первоначальный анализ параметров показал, что совместная культура этих видов оказывает незначительное влияние на их общий рост. Изменчивость, наблюдаемая в кривых роста, вероятно, обусловлена ​​факторами окружающей среды, такими как начальная плотность посева, которая становится более переменной при меньших диаметрах скважины ( рис. 5b ). Значительное отрицательное влияние на штамм mCherry в связи с наличием GFP-ΔretS не наблюдались. Например, при построении максимального сигнала mCherry в сравнении с отношением исходного сигнала GFP-RFP, уменьшение mcherry-экспрессии было обнаружено при более высоком отношении GFP-ΔretS в лунках.

Рисунок 5
Рисунок 5: Траектории флуоресцентного роста подходят с модифицированным логическим уравнением. ( A ) Примерная кривая нормируется, а затем соответствует модифицированному логистическому уравнению, настраивая три параметра, максимальную интенсивность (A), максимальную скорость (μ) и время запаздывания (τ). ( B ) Первоначальный сигнал mCherry по сравнению с начальным сигналом GFP в отдельных лунках различного диаметра. ( C ) Максимальный сигнал репортера mCherry, построенный по сравнению с отношением начальной интенсивности GFP-экспрессирующих бактерий к RFP-экспрессирующим бактериям.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Предыдущие работы в лаборатории Mougous показали, что эффекты секреции типа VI требуют прямого контакта между клетками между секретирующими и восприимчивыми клетками и что более длительный период контакта приводит к большему лизису клеток 23 . Поэтому мы полагаем, что в этих массивах экспоненциальный рост двух мутантов просто нарушает опосредованные контактом патогенные эффекты в этой модели. Однако в лунках всех размеров бактерии, экспрессирующие GFP- и mCherry, растут в отдельных участках ( рис. 2 и 3 ). Поэтому, вместо того, чтобы сосредоточиться на темпах роста, бактериальные сообщества, содержащие контактно-опосредованные патогенные субъекты, могут быть лучше изучены с использованием пространственных анализов. Например, вместо фокусаНг по интегрированной интенсивности, которая представляет собой общее количество красных или зеленых ячеек в колодце, этот формат микроволн позволяет подсчитывать количество и расположение красных и / или зеленых пикселей. Можно проанализировать рост отдельных колоний или патчей в этих лунках, сосредоточив внимание на границах, где красные и зеленые сигналы перекрываются ( рис. 6а ). Затем можно выполнить количественную оценку событий совместной локализации и анализа ближайших соседей, чтобы более внимательно изучить такие свойства, как размер патча, скорость роста патча и перекрытие патчей в отдельных лунках. Пространственным анализам будет помогать изображение с высокой степенью увеличения и конфокальная микроскопия ( рис. 6b ).

Рисунок 6
Рисунок 6: Пространственная организация различных видов может быть проанализирована с использованием эпифлуоресцентной и конфокальной микроскопии. ( B и c ) Конфокальные изображения (20-кратное увеличение, NA = 0,8) диаметром 15 мкм, глубиной ~ 7,5 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье представлено устройство с микроволновыми решетками и экспериментальные протоколы, предназначенные для высокопроизводительного и высокоточного анализа изображений на основе живых клеток на основе бактериальных сообществ. В то время как в центре внимания демонстрации было изучение влияния контактной опосредованной секреции типа VI на развитие сообщества, массивы были разработаны с учетом гибкости и учета изучения широкого круга микробных сообществ и взаимодействий микробов и микробов. Работа здесь сосредоточена исключительно на использовании бактерий, которые конститутивно выражают флуоресцентные маркеры, чтобы обеспечить легкое отслеживание численности и местоположения члена. Однако возможности отбора биологического материала из отдельных колодцев после роста или возмущения путем изменения химической среды могли бы, в принципе, использоваться для определения состава сообщества и экспрессии генов.

Каждое кремниевое устройство состоит из десятков массивов, содержащих микролуны с различной скважинойДиаметры, организованные на шаге 2x, 3x или 4x диаметра и вытравленные на глубину между 3 и 3,5 мкм. Поскольку питательные вещества и вторичные метаболиты могут свободно диффундировать через и через агарозную крышку, были включены разные субмассивные тангажи для изучения того, как сообщается о распространении сигналов между микролунками или локальным истощением питательных веществ. На этой демонстрации рост и развитие сообществ, по-видимому, не были затронуты расстоянием между микроволнами или местоположением внутри массивов. Неглубокая глубина была выбрана для упрощения анализа изображений, ограничивая весь рост и развитие микроорганизмов на единую плоскость изображения. Однако более глубокие скважины (глубина 20 мкм) использовались ранее и могут быть легко модулированы по глубине путем изменения продолжительности процесса травления кремния. Увеличение соотношения сторон скважин существенно изменяет степень удержания, наблюдаемую клетками внутри скважин, эффективно изменяя отношение общего объема объемаК области, через которую питательные вещества диффундируют в верхнюю часть лунки. Это разнообразие конфигураций массивов может быть использовано для изучения эффектов передачи сигналов «хорошо хорошо» или «внутри скважины».

Одно ограничение использования кремния для изготовления микролунов заключается в том, что он непрозрачен для видимого света. Следовательно, рутинные анализы, основанные на передаче света ( например, яркое поле, фаза или дифференциальное изображение контрастной контрастности), не могут использоваться для мониторинга роста. Текущие исследования и разработки в нашей группе были сосредоточены на адаптации этой конфигурации кремниевых микроисточников и экспериментального протокола для работы с прозрачными массивами для обеспечения возможности флуоресценции с высоким разрешением и яркого поля для мониторинга и количественной оценки 27 . Используя прозрачные материалы для изготовления, такие как эпоксидная смола SU-8 на стеклянном покровном покрытии, можно приобретать как яркие, так и флуоресцентные изображения с целями, работающими на более коротких рабочих расстояниях.Это позволяет получить более оптимальное разрешение при погружении с водой или масляных объектах с увеличением ≥40X без затруднения с визуализацией через слой агара, как это имеет место для кремниевых массивов.

Как описано в нашей предыдущей работе, условия посева и геометрия скважины влияют на посев ячеек в массивах скважин. При низких плотностях посева или в небольших скважинах высокие уровни изменения количества и типов клеток, которые загружаются в отдельные скважины, позволяют широко и быстро исследовать пространство экспериментальных параметров. Более высокая плотность посева и / или визуализация больших скважин дает более согласованные соотношения типов клеток и общих уровней посевного материала, что позволяет анализировать большое количество экспериментальных репликатов. Быстрый просмотр изображений на самых ранних этапах роста предполагает, что клетки прикрепляются и растут в основном вдоль краев колодцев ( рис. 5а ). Неясно, является ли это артефактом, связанным с sOme испарительной сушки во время процесса посева или предполагает предпочтение прикрепления клеток к нескольким краям. Преднамеренное изменение топографии или поверхностной химии колодцев детерминированным образом может выявить, какие факторы оказывают наибольшее влияние на клеточную привязанность и образование биопленки.

Рост бактерий в этих лунках подтверждается использованием покрытого агарозным гелем стеклянного покровного стекла, наполненного средой R2A. Способы, описанные для создания этого покрытого агарозным покровным покрытием, обеспечивают равномерную толщину, благодаря которой изображение и довольно постоянное положение z, что позволяет одновременно отображать несколько кремниевых микросхем. Использование ультрачистой агарозы в качестве гелеобразующего агента и минимальной среды, а не полной среды приводит к более чистым, менее автофлуоресцентным фоном, увеличивая общее отношение сигнал-шум. Если полагаться на флуоресценцию для количественного отслеживания микробных сообществ, важно сохранитьNg условия согласуются и должны быть четко осведомлены о вкладах от автофлуоресценции, фотообесцвечивания и неравномерного освещения. Кроме того, для экспериментов, требующих долговременного захвата изображения, требуется толстый слой агарозы, такой как используемый здесь. Более тонкие слои (толщиной ~ 100 мкм) могут быть сделаны для обеспечения изображения с более высоким увеличением. Тем не менее, трудно удержать агрегат достаточно влажно, чтобы предотвратить высыхание тонкого слоя.

Хотя первоначальный анализ параметров роста и начальных уровней посевного материала пока не выявил каких-либо существенных корреляций для простой системы, описанной здесь, в приведенных протоколах и данных подчеркивается глубина информации, которая может быть извлечена из изображений развития сообщества с течением времени. Пространственная организация в пределах скважин развивается по мере того, как колонии одного вида расширяются от исходных «зародышевых» участков. Таким образом, факторы, связанные с начальной плотностью прикрепления ( т.е.Ps от большего предпочтения одного вида для поверхности скважины по сравнению с другим) или темпы роста отдельных участков могут существенно влиять на развитие сообщества. Взаимодействия субметров, такие как те, которые опосредованы контактом между видами (патчами), установленными очень поздно в процессе роста, могут потребовать более глубокого анализа данных изображения.

Представленная здесь матрица массивов микросхем облегчает быструю сборку и высококонтентный анализ развития микробного сообщества и взаимодействия микробов и микробов. Будущая работа, которая позволяет контролировать местную химическую среду, путем изменения состава среды в крышке агара или путем прямого модуляции и отбора проб с помощью интегрированных микрофлюидических препаратов, должна предусматривать экспериментальные протоколы, которые выходят за рамки имитации естественного удержания и размера ниши и начинают Исследовать влияние динамически меняющихся сред, подобных тем, которые встречаются в природе. Будущая работа будет дополнятьКонструкция массива с интегрированными микрожидкостями, которые могут использоваться для динамической модуляции местной химической среды и для отбора жидкости из отдельных скважин. Дополнительная работа по разработке оптически прозрачных массивов микроячейки, которые можно использовать для более высокого разрешения и яркого отслеживания роста сообщества, была описана в других разделах 27 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Массивы Microwell были сфабрикованы и охарактеризованы в Отделе пользовательских услуг Центра нанофазных материалов, Управление по основным энергетическим наукам Министерства энергетики США. Финансовая поддержка этой работы была оказана через Фонд исследований и развития директора Национальной библиотеки Оук-Ридж. Авторы также хотели бы поблагодарить лабораторию J. Mougous (Вашингтонский университет, Сиэтл, штат Вашингтон) за поставку штаммов P. aeruginosa, используемых в этих исследованиях .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Parylene N Specialty Coating Systems CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater Specialty Coating Systems Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010
Silicon Wafer WRS Materials 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>,
adhesion promoter Shin-Etsu Microsci MicroPrime P20 adhesion promoter
postive tone photoresist Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)
Quintel Contact Aligner Neutronix Quintel Corp NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool Oxford Instruments Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher
R2A Broth TEKnova R0005
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Multimode Plate Reader Perkin Elmer Enspire, 2300-0000
Fluorescent Microscope Nikon Eclipse Ti-U
Automated Stage Prior ProScan III
CCD camera Nikon DS-QiMc
Stage-top environmental control chamber In Vivo Scientific STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190144
UltraPure Agarose ThermoFisher Scientific 16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip Nexterion High performance #1.5H coverslips
Fluorescence Reference Slides Ted Pella 2273
Physical Stylus Profilometer KLA Tencor P-6
lab wipes Kimberly Clark Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial software Nikon NIS Elements
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss
filter cubes Nikon Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
  2. Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (10), 4152-4157 (2011).
  3. Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73, (22), 7300-7307 (2007).
  4. Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105, (47), 18188-18193 (2008).
  5. Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
  6. Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
  7. Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72, (1), 212-220 (2006).
  8. Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136, (6), 1989-2002 (2009).
  9. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36, (5), 347-355 (2011).
  10. Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11, (5), 337-348 (2013).
  11. Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14, (2), 93-105 (2015).
  12. Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4, (1), 63-75 (2014).
  13. Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14, (10), 3742-3748 (2013).
  14. Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9, (6), (2015).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (46), 17290-17295 (2006).
  16. Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333, (6050), 1764-1767 (2011).
  17. Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (14), 5624-5629 (2013).
  18. Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4, (2), 1-8 (2013).
  19. van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14, (1), 116 (2014).
  20. Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
  21. Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11, (5), e0155080 (2016).
  22. Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7, (1), 25-37 (2010).
  23. LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109, (48), 19804-19809 (2012).
  24. Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92, (3), 529-542 (2014).
  25. Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11, (1), e0145081 (2016).
  26. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56, (6), 1875-1881 (1990).
  27. Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34, (6), 06KI03 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics