Montering og sporing av mikrobiel samfunnsutvikling innenfor en Microwell Array-plattform

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Utviklingen av mikrobielle samfunn avhenger av en kombinasjon av faktorer, inkludert miljøarkitektur, medlemmelig overflod, egenskaper og interaksjoner. Denne protokollen beskriver et syntetisk, mikrofabrikerte miljø for samtidig sporing av tusenvis av lokalsamfunn som finnes i femtoliter brønner, hvor nøkkelfaktorer som nisjestørrelse og inneslutning kan tilnærmet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform. J. Vis. Exp. (124), e55701, doi:10.3791/55701 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Utviklingen av mikrobielle samfunn avhenger av en kombinasjon av komplekse deterministiske og stokastiske faktorer som kan dramatisk forandre den geografiske fordeling og aktiviteter av fellesskapsmedlemmer. Vi har utviklet en mikrowell array plattform som kan brukes til å raskt samle og spore tusenvis av bakterielle samfunn i parallell. Denne protokollen fremhever bruken av plattformen og beskriver bruken av den for optisk overvåking av utviklingen av enkle, tomedlemsamfunn innenfor et ensemble av arrays innenfor plattformen. Denne demonstrasjonen bruker to mutanter av Pseudomonas aeruginosa , en del av en rekke mutanter utviklet for å studere patogenitet av type VI-sekresjon. Kromosomale innlegg av enten mCherry- eller GFP-gener letter den konstitutive ekspresjonen av fluorescerende proteiner med forskjellige utslippsbølgelengder som kan brukes til å overvåke fellesskapets overflod og plassering i hver mikrowell. Denne protokollen beskriver en detaljert metoD for å samle blandinger av bakterier inn i brønnene i matrisen og ved bruk av tid-lapse-fluorescensbilder og kvantitativ bildeanalyse for å måle den relative veksten av hver medlemsbefolkning over tid. Såing og montering av mikrowellplattformen, bildebehandlingsprosedyrene som er nødvendige for den kvantitative analysen av mikrobielle samfunn i gruppen, og metodene som kan brukes til å avdekke interaksjoner mellom mikrobielle arter som diskuteres.

Introduction

Mikrobielle samfunn er formet av både deterministiske faktorer, som miljøstruktur og stokastiske prosesser, som er forbundet med celledød, divisjon, proteinkonsentrasjon, antall organeller og mutasjon 1 . Innenfor det naturlige miljøet kan det være nesten umulig å analysere den individuelle effekten av disse påvirkningene på samfunnssammensetning og aktivitet. Obscured av naturlige strukturer og begravet i et kjemisk og biologisk miljø, er det svært utfordrende å identifisere samfunnsmedlemmer og videreutvikle deres spatiotemporal fordeling i det naturlige miljøet. Ikke desto mindre har den siste innsatsen understreket betydningen av romlig organisering på fellesskapsfunksjonen og peker på behovet for å redegjøre for både medlemmens overflod og organisasjon i løpende studier 2 , 3 , 4 .

DenDet er klart at det lokale kjemiske miljøet ( dvs. tilgjengeligheten av næringsstoffer og sekundære metabolitter), den fysiske strukturen ( f.eks. Jordarkitektur, planterøtter, havpartikler eller tarmmilvilli), tilstedeværelse eller fravær av oksygen og innføring av Patogene arter har alle innvirkning på sammensetning, arkitektur og funksjon av mikrobielle samfunn 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Likevel fortsetter tradisjonelle teknikker for kulturer som forsømmer å fange disse faktorene seg. Fellesskapssammensetning ( f. Eks. Tilstedeværelse av medavhengige arter), fysisk vedlegg, signalmolekylkonsentrasjon og direkte cellecellekontakt er alle viktige faktorer for å forme et mikrobiell samfunn og kan gå tapt i cUventede kulturbetingelser. Disse egenskapene er vanskelige å replikere i en bulkvæskekultur eller på en agarplate. Tilgjengeligheten av mikrofluidiske, mikropatterings- og nanofabrikasjonsteknikker som tillater replikering av viktige fysiske og kjemiske egenskaper i naturlige miljøer, har imidlertid gjort det mulig for mange forskere å bygge bakteriefællesskaber for å studere deres interaksjoner 12 , 13 , 14 og å utvikle syntetiske miljøer som Etterligne naturlige forhold 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .

Denne protokollen beskriver en metode for å fremstille en mikrowell array-enhet og gir detaljerte eksperimentelle prosedyrer som kan brukes til å fungere som funksjonalitetE brønner i matrisen og å vokse bakterier, både som single-species kolonier og i multi-medlemmiljøer. Dette arbeidet demonstrerer også hvordan bakterier som er modifisert for å produsere fluorescerende reporterproteiner, kan brukes til å overvåke bakteriell vekst i brønner over tid. En lignende matrise ble presentert tidligere og viste at det er mulig å spore veksten av enkeltartskolonier av Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) i mikrobrønner. Ved å modulere brønnstørrelse og seedetthet kan startbetingelsene for tusenvis av veksteksperimenter varieres parallelt for å bestemme hvordan de første inokulasjonsbetingelsene påvirker bakteriens evne til å vokse 21 . Nåværende arbeid bruker en litt modifisert versjon av mikrowell-arrayet som bygger på det forrige arbeidet ved å muliggjøre samtidig sammenligning av flere arrays og ved å bruke en mer robust eksperimentell protokoll. Arrayet som brukes i dette arbeidet inneholder flere undergrupper, eller array ensemBles, som inneholder brønner av forskjellige størrelser, varierer fra 15 til 100 μm i diameter, som er arrangert på tre forskjellige steder ( dvs. 2x, 3x og 4x brønndiameteren). Arrayene er etset i silisium, og veksten av bakteriene som er sådd i silisiumsammensetningene, aktiveres ved å forsegle arrays med en deksel som er belagt med en middelsinfisert agarosegel. P. aeruginosa mutanter designet for å studere type VI sekresjonssystemet benyttes i denne demonstrasjonen.

Resultatene som presenteres her, bygger mot det endelige målet å analysere multimember-fellesskap innenfor mikrowell-arrays, slik at forskere kan overvåke overflod og organisering av bakterier in situ mens de kontrollerer og prober det kjemiske miljøet. Dette skal i siste instans gi innsikt i "reglene" som styrer samfunnsutvikling og suksess.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Silikon Microwell-array Fabrication

  1. Parylene belegg
    1. Deponere mellom 1-1,5 μm parylene N på silisiumplater ved bruk av et kommersielt tilgjengelig parylene beleggsystem i henhold til produsentens spesifikasjoner og instruksjoner (innstillinger: Vaporizer setpunkt = 160 ° C, ovn settpunkt = 650 ° C).
      MERK: Ca. 6 g parylene N lastet inn i et kammer gir belegg 1-1,5 μm tykk.
  2. fotolitografi
    1. Spin-coat de parylene-N-belagte wafers med adhesjonspromotor, 20% heksametyldisilazan (HMDS) og 80% propylenglykolmonometyleteracetat (PGMEA) (se tabell over materialer ) ved 3000 rpm i 45 s. Fyll en 2 ml overføringspipette med adhesjonspromotør og dryss den over hele waferen. La waferen sitte i ca. 10 s før den tørker.
    2. Fyll en 2 ml overføringspipett med positiv-tilNe fotoresist (se Materialebordet ) og dispensere fotoresisten i midten av waferen. Spinn ved 3000 rpm i 45 s for å gi et motstandsbelegg som er ca. 1,5 μm tykt.
    3. Mjukbake prøvene på en kokeplate ved 115 ° C i 1 min.
    4. Bruk en kontaktjustering og fotomask med ønsket brønnmønster for å eksponere prøven til ultrafiolett lys. Utsett den spin-belagte waferen gjennom den mønstrede fotomasken i 6 s, noe som gir en omtrentlig dose på 60-80 mJ / cm 2 målt ved 365 nm.
    5. Utvikle mønsteret ved å nedsenke prøven i utvikler (<3% tetrametylammoniumhydroksyd i vann, se Materialetabell ) i 2 minutter. Skyll med DI vann og tørk med rent, tørt nitrogen.
      MERK: Arealet av fotoresist utsatt for UV bør ryddes under utviklingen.
  3. Reaktiv ionetising
    1. Bruk et oksygenplasmaet å fjerne den eksponerte parylenenHelt til silisiumsubstratet.
      MERK: Oppskriften kan moduleres for å endre etylhastigheten av parylene. For parylentykkelser mellom 1 og 5 μm, bruk en oppskrift med 60 mTorr, 20 ° C, 100 sccm O 2 , 10 W RF og 2000 W ICP på et Reactive Ion Etching (RIE) verktøy. Etter etsning og fjerning av det eksponerte parylene laget, skal det mønstrede området ( dvs. det eksponerte silisiumet) se skinnende ut og sølv.
    2. Bruk en dyb RIE (DRIE, f.eks. Bosch DRIE) etseprosess for å etse inn i silisiumet.
      MERK: Etsraten og varigheten vil bestemme brønndybden. En full syklus av Bosch-prosessen (et 3 s deponeringstrinn: 20 mTorr, 15 ° C, 140 sccm C 4 F 8 , 10 W RF og 1,750 W ICP etterfulgt av en 10 s etch-prosess: 20 mTorr, 15 ° C , 120 sccm SF 6 , 8 W RF og 1,750 W ICP) tilsvarer omtrent 1 μm etsetedybde. Brønnene som brukes i dette demonstrasjonsområdet varierer fra 3 til 3,5 μm dyp.
    3. VErify etch-dybden ved hjelp av fysisk profilometri.
      1. Legg prøven i et fysisk profilometer (se Materialebordet ).
      2. Slå på prøvesvakuumet og trykk på manuell lastknapp.
      3. Fokuser systemet på prøven ved å trykke på "Fokus" -knappen. Sett en passende funksjon for måling på visningsskjermen.
      4. Skann prøven. Nivå profilen og måle funksjonsdybden.
      5. Ta opp etsingsraten og moduler påfølgende etketider for å oppnå ønsket dybde.
        MERK: Målingene vil inkludere dybden av silisiumbrønnen, tykkelsen på avsatt parylene og tykkelsen til fotoresistene. Verifisering av tykkelsen av hvert lag gjennom hele prosedyren er nødvendig for å oppnå nøyaktig brønndybde.

2. Bakteriell kultur og frø ( Figur 1a )

  1. Start kolonier på Luria Broth (LB) agarplater fra glycerollagre og bruk innen to uker. Velg kolonier av de ønskede stammene fra LB-agarplater og start over natten kulturer av P. aeruginosa. Inkubér over natten kulturer i ca. 18 timer ved 37 ° C under risting ved 220 rpm i R2A medium.
    MERK: Kolonier bør plukkes innen to uker med plating for å sikre at mutasjonene og fluorescerende reportergenene blir beholdt. Alle P. aeruginosa arbeid bør gjøres under BSL-2 forhold.
  2. Bruk en diamantskribent til seksjonen av silikonplaten i individuelle sjetonger som inneholder ensembler av forskjellige størrelser og tonehøyde-arrays. Sørg for at hver brikke inneholder hele komplementet til brønnstørrelser og plasser for studien.

Figur 1
Figur 1: Fremstilling og cellesedning. ( A ) Microwell arrays aEtses til silisiumskiver belagt med et tynt lag av parylene (i). For å vaske brønnene og / eller funksjonalisere overflaten, tilsettes en proteinoppløsning i en dråpe på toppen av arraysene (ii). Proteinoppløsningen fjernes, wafene tørkes og en ny oppløsning som inneholder de ønskede bakterier tilsettes (iii). Bakterieoppløsningen fjernes etter en inkubasjonsperiode, og wafene får tørke, etterlater bakterier i brønnene og på overflaten (iv). De overflateassosierte bakteriene fjernes med parylene-løft, og etterlater bakterier som frøes rent i mikrobrønnene og fremdeles levedyktige på grunn av 2% glycerolmediet, som bidrar til å holde brønnene hydrert (v). Silisiumglassene plasseres deretter på forsiden av et agaroseglassbelagt glassdeksel, som gir bakteriell vekst i mikrobrønnene (vi). ( B ) Layout av delarrayer på en enkelt silikonanordning. Hver undergruppe inneholder et sett med identiske brønner. Diameteren av microwells over alle sub-aRrays rekkevidde i diameter fra 5-100 μm og er organisert på 2x, 3x eller 4x brønndiameterhøyden, som er betegnet av de hvite til mørkegråe farger på skjematisk bunnplate. Når brønndypene er grunne (<10 μm), er brønndiametrene 5 og 10 μm sjelden nyttige, vanligvis på grunn av mangel på celler som koloniserer disse svært små brønnene. I dette arbeidet ble bare data fra brønner med 15-100 μm diametre analysert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MERK: Som vist i figur 1b inneholder en fullstendig brikke underarrayer av brønner, med diametre fra 5 til 100 μm, med tre forskjellige stigninger ( dvs. 2x, 3x og 4x diameteren) som gjentar 4 ganger.

  1. Plasser en 150 μl dråpe på 500 μg / ml bovint serumalbumin (BSA) i PBS-oppløsningPå toppen av matrisen for å våte microwells. Inkuber BSA løsningen i 1 time på brikken ved RT i et fuktig kammer.
    1. Opprett kammeret ved å fylle bunnen av en tom pipettespissboks med fosfatbuffert saltvann (PBS).
      MERK: Andre stoffer, som for eksempel spesifikke lektiner, kan brukes i stedet for BSA for å funksjonalisere overflaten av mikrobrønnene.
  2. Mens inkubering av silisiumglass med BSA-løsning, sentrifuger kulturen ved 2500 rpm (tilsvarende et gjennomsnitt på 950 xg) i 5 minutter og resuspender dem deretter i 500 ul friskt R2A medium med 2% glyserol.
    1. Bestem OD av kulturen ved å bruke et UV-vis spektrometer ved 600 nm. Juster den til en OD på 0,02 ved bruk av 2% glycerol R2A medium.
      MERK: Glycerol bidrar til å hindre at brønnene tørker ut under parylene-løft.
  3. Etter inkubering, fjern BSA-løsningen og skyll 3x med PBS ved å fjerne og erstatte væskedråpeneT dekker silikon mikrowell array. Tørk under nitrogen.
  4. Tilsett 150 μl av 0,02 OD kulturer til hver av de tørre arraysene plassert i et fuktig kammer. Inkubér i 1 time ved 4 ° C for å la bakteriene klebe seg til brønnveggene.
    MERK: Kjøling er ikke nødvendig for inkubasjon. 4 ° C inkubasjonstiden kan brukes til å forhindre vekst av bakterier før bildebehandling begynner, slik at man kan visualisere samfunnets geografiske organisasjon før veksten. Rom-temperatur inkubasjon kan også brukes. Begge protokollene gir tilsvarende vekstkurver.

3. Mikroskopoppsett

  1. Før du begynner bakteriell inkubering på silisiumspånene, slå på scenekontrollkammeret (se tabell over materialer) og juster innstillingene på kontrollboksen slik at fuktigheten (~ 100%) og temperaturen (30-32) ° C, se trinn 3.2) kan ekvilibrere før tilsetning av prøver.
  2. Nivå prøveholderen og linje innTerior rundt prøven med PBS- fuktede labservietter (se Materialetabellen ) for å øke luftfuktigheten i kammeret til duggpunkt . Still temperaturen på kammeret til 30 ° C og det for kammerloven til 32 ° C for å redusere kondens på bildeplanet.
    MERK: Glidebryteren passer inn i livcellekammeret med en pakning som er ca. 1 cm tykk. Prøveholderen er utjevnet med hjelp av et boblenivå som er plassert på toppen av prøveholderen. Prøveholderen kan vippes litt og forbli forseglet i pakningen til nivå.
  3. Mens kulturer inkuberer på silisiumspånene, må du slå på strømbryteren for kvikksølvlampen manuelt minst 30 minutter før bildet avbildes. Slå på kameraet og det automatiserte mikroskopetrinnet manuelt. Åpne programvaren som brukes til å kontrollere mikroskop og perifert utstyr, og sørg for at utstyret er gjenkjent av programvaren.
    MERK: Forstørrelse er 10X med NA = 0,3.
  1. Mikrobølgeovn tidligere forberedt agaroseoppløsninger ( dvs. 2% agarose i R2A medium) til en væskestatus er nådd, ca. 60 s.
  2. Våt på baksiden av en 75 mm x 22 mm, # 1,5 glassdeksel med etanol og plasser den i lengderetningen, sentrert over en glideskjerm på 2 x 3 "(50 x 75 mm). Legg to PDMS spacers (tykkelse på ~ 1 mm) Langs dekslipens lange kanter og skift glassdekslet slik at omtrent 1 mm av dekselglasset overhenger kanten av lysbildet.
  3. Hell 5 ml flytende agaroseløsning på toppen av glassdekslet, akkurat nok til å dekke det helt og plasser en andre 2 x 3 "glassdia på toppen av forsamlingen for å" smelte "væskens agar mellom dekselet og glidebryteren.
    MERK: Dette styrer dybden av agarose, noe som gjør den totale tykkelsen på dekselet og herdet agarose lik tykkelse til PDMS-avstandsstykkene.
  4. La glassglass-deksel-agaroseglass-glidelås-sandwich-sandwich settes inntil agaroseoppløsningen begynner å størkne; Deretter overfører du det til et kjøleskap. Etter 15 min, fjern overflødig fast agarose og kutt rundt glassdekselet. Flytt denne til en ren tallerken og legg den i kjøleskap til bruk.

5. Tetting av brønnene med en Agarose-belagt Omslag og Imaging

  1. Etter at bakteriens inkuberingsperiode er fullført, fjern den agarose-belagte dekselglasset fra kjøleskapet og tilbered silisiumglasset som følger.
    1. Dip silisiumpennene i ultrapure vann, en om gangen, i 10 s hver. Sett dem på kantene på en labtørke eller vev til det meste av overflødig væske har drenert fra kantene på flisene.
    2. Klipp et stykke tape for å matche kantlengden på hver silisiumbrikke. Plasser båndet på parylene som dekker silisiumet, og bruk det for raskt å pelle bort parylenebelegget.
    3. immedIvert inverter hver skål og plasser hver brikke slik at microwell-arraysiden vender (og kommer i kontakt med) den agarose-belagte siden av en agarose-belagt deksel. Pass på at du ikke beveger eller skifter brikken etter at den berører agarosen for å hindre veksten av bakterier utenfor brønnene.
  2. Plasser montert mikrowell array / agarose coverlip i glidebryteren på scene-top miljøkontrollkammeret på miscroscope.
    1. Bruk omgivende lys eller styrt lys ( f.eks. En lommelykt) for å finne interessante arrays. Bruk den kommersielle programvaren som styrer den automatiserte scenen for å lagre disse stillingene (se materialetabellen). Slå av omgivende eller styrt lys etter at posisjonene er lagret.
    2. I den kommersielle programvaren, åpne "ND Acquisition" -panelet.
      MERK: Dette panelet inneholder en meny for automatisk lagring i en bestemt katalog, samt programmerbar bildeinnsamling. For disse forsøkene, Menyene "Tid", "XY" og "λ" brukes.
    3. For å lagre plasseringene i programvaren, klikk på "XY-menyen" og merk deretter en tom boks på venstre side for hver posisjon som må lagres. Klikk også på "Inkluder Z" -knappen.
  3. Oppnå bilder over tid ved ønskede bølgelengder og 10 forstørrelse ved hjelp av passende fluorescensfilterbiter (se Materialebordet).
    1. Bruk kontrollprogramvaren og lagrede arrayposisjoner til å flytte til hvert lagret sted og å fokusere på brønnene. Klikk på hvert XY-sted i den lagrede listen, og juster fokuset ved hjelp av GFP-filteret (Green Flourescence Protein). Lagre den nye z-posisjonen ved å klikke på pilen som peker på z-stedet.
      MERK: Denne prosessen kan være tidkrevende. Vurder å ta forholdsregler for å øke gevinsten og bruke nøytralt tetthetsfilter for å redusere lysintensiteten for å forhindre fotoblekking.
    2. Bestem z-aksens avstand mellom brennpunktene for hver bølgelengde ved å merke forskjellen i z-akse-posisjonen når den er fokusert på overflaten av arrayet. Velg 2-3 steder fra gruppen med blandet rød / grønn bakteriepopulasjon og fokus ved hjelp av Røde Fluorescensprotein (RFP) filter.
      1. Trekk avstanden mellom fokalplanene ved hjelp av GFP- og RFP-fluorescensfiltre og legg til den fokalplanjusteringen under "λ" -menyen.
        MERK: Hvis arrayet for eksempel vises fokusert i GFP-kanalen ved en z-plassering på 50 μm, og det samme arrayet vises fokusert i RFP-kanalen ved 55 μm, legger du til +5 ved siden av RFP optisk konfigurasjon i "λ " Meny.
    3. Begynn bildeoppkjøling av time-lapse.
      MERK: For de eksperimentene som vises her, ble RFP- og GFP-bilder kjøpt for hver rekkefølge med 30 minutter mellom bruk av multimediebildeoppkjøp via en kommersiell programvare som styrerKameraet, lukkeren, filterhjulet og motorisert scenen.
      1. Still inn "intervallet" til 30 minutter og "eksperimentets varighet" til 24 timer under "Tid" -menyen. Klikk på "Kjør nå".
        MERK: Når rutene "Tid", "XY" og "X" er merket, vil programmet flytte scenen til bildet hvert sted ( dvs. de lagrede XYZ-stedene), ta et bilde i en bølgelengde, flytte z-stillingen For å ta hensyn til brennpunktsforskjeller ( dvs. lambda- eller bølgelengdekontroll), ta det andre bildet, gå videre til neste rekkefølge (multipunkt), og loop dette med 30 min intervaller (tidsavbrudd).
  4. Hent belysningskontrollbilder.
    MERK: Bruk menyen "ND Acquisition", "Time" og "XY" til å ta bilder av 4 steder, 25x hver.
    1. Ta en serie med 100 "darkfield" -bilder ved å slå av alle lyskilder og taEt "bilde" av et standardbilde. Disse bildene vil ta opp kameraets støy. Bruk den lengste eksponeringstid som ble brukt under tidsplanen (trinn 5.3.3).
    2. Ta en serie med 100 "belysningsfelt" -bilder ved å avbilde et standard lysbilde ( dvs. uniform RFP eller GFP intensitet) på noen forskjellige steder for å fange den ujevne belysningen ved de oppgitte eksperimentelle forholdene. Velg en eksponeringstid som maksimerer signalet uten å oppnå metning.

6. Analyse

  1. Behandle bildestablene ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare ( f.eks. ImageJ).
    1. Konverter de overførte bildene til tiff-filformat ved hjelp av den kommersielle programvaren. Last opp bilder i bildeanalyseprogrammet ved å klikke "File"> "Import"> "Image Sequence."
    2. Opprett et "Korrigeringsbilde" ved å beregne alle "mørke felt" og "belysningsfelt" -bilder. SubtracT det gjennomsnittlige "darkfield" bildet fra det gjennomsnittlige "belysningsfelt" bildet ved å velge "Process"> "Image Calculator." Velg de to bildene, "Image1" og "Image2", og deretter "Subtract" i "Operation" -feltet. Klikk på "OK".
      1. I gjennomsnitt må du laste inn korrigeringsfilene (eller mørkefelt), klikke på "Bilde"> "Stabler"> "Z-prosjekt"> "Gjennomsnittlig projeksjon."
    3. Utfør bilderegistrering om nødvendig. Deretter utfører bakgrunnsuttraksjon ved å klikke på "Prosess"> "Trekk bakgrunn." Skriv inn en radius ( f.eks. 125) i "radius" -feltet og velg "glidende paraboloid".
    4. Utfør belysningskorrigering ved hjelp av "Prosess"> "Kalkulator Plus." Velg følgende parametere: drift, deling; I1, godt bilde; I2, korreksjonsbilde; K1, korreksjonsbilde betyr; Og k2, 0. Klikk på "CreSpiste nytt vindu. "
      MERK: Dette datasettet krever ikke registrering, men i annet arbeid ble ImageJ Plugin StackReg brukt med "Translation" -transformasjonen. For bakgrunnsuttraksjonen, bruk samme glidende paraboloidradius for hvert bildesett. For eksempel, hvis de største brønnene som er avbildet har en pikselradius på 100, bruk en radius større enn 100 ( f.eks. 125) for hvert bildesett.
  2. Bestem veksten av hver stamme i microwells.
    1. Velg region av interesse (ROI) rundt hver mikrobølge i de ønskede arrays ved hjelp av ImageJ "MicroArray" plugin.
      1. I menyen "MAP" klikker du på "Tilbakestill grid." Angi rader, kolonner og diameter (basert på brønnstørrelsen og tallet på arrayet, se figur 1b ). Velg "sirkel" fra "ROI-formen" -menyen.
      2. Hold "Alt" -tasten mens du velger øvre venstre ROI med musen for å flytte tHan ROI-array. Hold "Skift" -tasten mens du velger ROI for nedre venstre for å endre størrelsen på matrisen. Hold "Skift" -tasten mens du velger avkastning fra høyre side av arrayet, men ikke i hjørnene, for å endre avstanden til avkastningene.
      3. Bruk kommandoene ovenfor for å passe avkastningsarrangementet over brønnene i et bilde. Klikk på "Mål RT".
        MERK: Pluginet vil eksportere de ønskede målingene fra hvert avkastning. Bruk tre ROI-størrelser, og skape konsentriske ringer rundt brønnene for å samle lokale bakgrunnssignalet ( dvs. signalet fra den midterste ringen subtraheres fra den ytre ringen) og fluorescensmålinger ( dvs. signalet fra den indre ringen).
    2. Samle dataene i en regnearkprogramvare og beregne bakgrunnssignalet. Importer den til en tilpasset skriptprogramvare for videre analyse.
  3. Data organisering og analyse
    1. Importer dataene og organiser dataeneSamlet i ImageJ i en matrise i følgende rekkefølge for alle tider: kolonne 1, sub-array nummer; Kolonne 2, brønnrad; Kolonne 3, brønnkolonne; Kolonne 4, gjennomsnittlig intensitet; Kolonne 5, bakgrunnsintensitet; Og kolonne 6, gjennomsnittlig intensitet - bakgrunnsintensitet.
      1. Separat resultatene av mCherry og GFP oppkjøpet i forskjellige matriser. Lagre resultatene fra hver undergruppe og hver farge i en annen celle i en cellegruppe.
        MERK: Denne organisasjonen gjør det enklere å flytte frem og tilbake mellom bildedata og måleresultater, rydde dataene og sørge for at målingene nøyaktig representerer dataene.
    2. Juster for autofluorescens av P. aeruginosa .
      MERK: I eksperimenter som involverer samkultur av GFP- og mCherry-stammer, bør en mCherry-only-brikke analyseres for å fastslå forholdet mellom mCherry og grønn autofluorescens.
      1. Plott mCherry-versus-GFP-signalet fra alle mCherry ΔretS &# 916; tse / i1-6 brønner til enhver tid-poeng for å bestemme forholdet mellom mCherry-signalet og autofluorescens i GFP-kanalen. Subtrahere autofluorescenssignalet fra samkulturene.
    3. Plot banene og passe en modifisert logistisk ligning til hver bane for å trekke ut parametere ved å bruke minste firkanter som passer inn i en regnearkprogramvare eller en tilpasset skriptprogramvare.
    4. Se etter korrelasjoner mellom og blant GFP- og mCherry-baneparametere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den eksperimentelle plattformen som presenteres her, er designet for høy gjennomstrømning og høyinnholdsstudier av bakterielle samfunn. Designet gjør at tusenvis av lokalsamfunn, som vokser i brønner i forskjellige størrelser, kan analyseres samtidig. Med denne microwell array-utformingen kan avhengigheten av den endelige samfunnssammensetningen på innledende sådddensiteter, brønnstørrelse og kjemisk miljø bestemmes. Dette arbeidet demonstrerer veksten av et to-medlems fellesskap i mikrowell-arrayet og fremlegger metoder for å analysere fellesskapssammensetning og organisering.

Modellsystemet som ble brukt her, ble designet i Mougous lab for å studere type VI sekresjon i P. aeruginosa . Systemet består av flere mutantstammer, som inneholder enten GFP eller mCherry fluorescerende reportere. I dette arbeidet benyttet 2 forskjellige stammer. Den første er en GFP-merket ΔretS mutant som constitutivelY uttrykker de toksiske effektorproteiner assosiert med type VI-sekresjon, noe som resulterer i høyere nivåer av celledød i mottakelige celler. Den andre er en RFP-merket ΔretSΔtse / i1-6-stamme som er en deletjonsmutant som mangler alle seks kjente effektorproteiner, og som har blitt vist å være mer mottakelig for type VI-patogenesen 22 , 23 , 24 . Vekstbanene til hver art ble sporet individuelt og innenfor to medlemmegrupper ( dvs. samkultur innenfor matriseplattformen).

ΔretS- og ΔretSΔtse / i1-6-mutantene ble sådd på tre arrays, hver for seg og også blandet sammen i et 1: 2-forhold, og deretter avbildet hvert 30. minutt i 20 timer. Bakteriell vekst i brønnene opphørte mellom 6 og 12 timer etter sådd. Eksempler på de fluorescerende bildedata er vist i figurene 2 og 3. Figur 2 viser vekst over tid av ΔretS- og ΔretSΔtse / i1-6-stammene i 45 μm diameterbrønner, og Figur 3 viser tilstanden til de samme tomedlemsamfunnene om 6 h etterfødning (hps) i brønner av forskjellige størrelser.

Figur 2
Figur 2: Prøve bilder fra et tidskurs medkultur veksteksperiment. To mutanter av P. aeruginosa , som uttrykker enten mCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (rød) eller GFP (retretS) (grønn), blir podet sammen i et 2: 1 mCherry: GFP-forhold i mikrowell-arrays. Avbildet her er sammensatte bilder tatt på 3 forskjellige tidspunkter ettersøping i 45 μm diameter brønner. Vennligst klikk her for å se en større versjonAv denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Brønndiameterområde inkludert i Microwell Array-enheten. Representative bilder av to-medlemssamfunn fanget ved 8 h vekst. Vanligvis viser mCherry (ΔretSΔtse / i1-6) (rød) eller GFP (ΔretS) (grønne) kolonier minimal kolokalisering, som gjenstår innenfor forskjellige områder i mikrobrønnene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Før oppkjøpet av målingene ble det utført en glidende parabaloid bakgrunnsintertraksjon. Et belysningskorrigeringstrinn ble benyttet slik at signalet fra hver mikrowell avbildet i et gitt eksperiment kunne sammenlignes kvantitativt. Disse metodene har vært pOmhyggelig beskrevet 25 . Ved hjelp av microarray-pluginet i ImageJ ble gjennomsnittlig intensitet av de røde og grønne bakteriene målt i de korrigerte bildene, sammen med et lokalt bakgrunnssignal. Det lokale bakgrunnssignalet ble subtraheret fra brønnsignalet, og GFP-signalet ble justert for å korrigere for autofluorescensen av P. aeruginosa -samkulturer (autofluorescens bestemt fra mCherry ΔretSΔtse / i1-6-bare arrays) . Når alle disse korreksjonene ble utført, kunne de kvantitative vekstbanene for mCherry- og GFP-uttrykkende bakterier bli plottet. Eksempel vekstbaner fra 20 og 50 μm diameter brønner er vist i figur 4 .

Figur 4
Figur 4: Vekstkurver av mono- og ko -kulturer av P. aeruginosa type VI-sekresjonsmutanter.( A og d ) GFP-ΔretS monokulturvekstkurver i henholdsvis 20 um og 50 μm brønner. ( B og e ) mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 monokultur vekstkurver i henholdsvis 20 og 50 μm brønner. (C og f) Co-kultur av en 1: 2- forholdsblanding av GFP (grønn) og mCherry (rød) P. aeruginosa stammer. Vekstkurver er plottet fra da bildet oppkjøp startet, ca 2 timer etterspising (hps). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vekstbanene fra mono- og samkulturen av P. aeruginosa- stammer indikerer at det er en viss variabilitet i vekst fra brønn til brønn, og at denne variabiliteten økes i brønner med mindre dimensjoner. Imidlertid er den gjennomsnittlige intensiteten ikke signifikant påvirket av vel size. Det ser ikke ut til å være en dramatisk eller klar negativ effekt på veksten av den følsomme stammen (ΔretSΔtse / i1-6) når ΔretS-stammen er tilstede. Den totale intensiteten for hver stamme ble redusert, men dette skyldtes en lavere startkonsentrasjon av hver stamme i brønnene, da den totale OD ble holdt konsistent på tvers av eksperimenter, ikke den enkelte OD av hver stamme. Det er imidlertid vanskelig å avgjøre hvilke faktorer som er viktigst for å forstå veksten av bakterier i disse brønnene, bare ved å se på vekstbaner alene. Derfor var hver bane egnet med en modifisert logistisk funksjon 26 ( figur 5a ) slik at relevante parametere kunne utvinnes og brukes til å analysere bakterievækstdata. Hver bane ble transformert ved å ta signalets naturlige logg dividert med startsignalet. En modifisert logistisk funksjon, med tre parametere som tilsvarer et maksimalt signal (A), maksimaltRate (μ) og en forsinkelsestid (τ), ble brukt til å passe hver bane.

Gitt det kjente samspillet mellom GFP-ΔretS og mCherry-ΔretSΔtse / i1-6-stammene, kan man hypotesere at veksten av mCherry-stammen vil bli hemmet i samkulturer med GFP-ΔretS-stammen 22 , 24 . Ved å bruke de ekstraherte parametrene, er det mulig å se etter positive eller negative sammenhenger mellom parametrene hentet fra GFP og mCherry-baner. Den første parameteranalysen antydet at samkulturen av disse artene hadde en ubetydelig effekt på deres generelle vekst. Variasjonen som ses i vekstkurver er sannsynligvis på grunn av miljøfaktorer, slik som innledende såddtetthet, som blir mer variabel ved mindre brønndiametere ( figur 5b ). Vesentlige negative effekter på mCherry-belastningen på grunn av tilstedeværelsen av GFP-ΔretS ble ikke observert. For eksempel, når det ble tegnet maksimalt mCherry-signal versus forholdet mellom det opprinnelige GFP-til-RFP-signalet, ble det ikke funnet noen reduksjon i mCherry-uttrykk når det var et høyere forhold av GFP-ΔretS i brønnene.

Figur 5
Figur 5: Fluorescerende vekstbaner passer med en modifisert logistisk ligning. ( A ) Eksempelkurven normaliseres og tilpasses med en modifisert logistisk ligning ved å justere tre parametere, en maksimal intensitet (A), en maksimal hastighet (μ) og en forsinkelsestid (τ). ( B ) Initial mCherry-signal mot første GFP-signal i individuelle brønner med forskjellige diametre. ( C ) Det maksimale mCherry-reportersignalet plottet mot forholdet mellom initialintensiteten til GFP-uttrykkende bakterier og de RFP-uttrykkende bakterier.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tidligere arbeid i Mougous-laboratoriet indikerte at virkningene av type VI-sekresjon krever direkte celle-til-cellekontakt mellom utskillende og mottakelige celler, og at en lengre kontaktperiode resulterer i mer cellelys 23 . Derfor tror vi at den eksponensielle veksten av de to mutantene i disse arraysene simpelthen ikke er i kontakt med de kontaktmedierte patogene effektene i dette modellsystemet. I brønner i alle størrelser vokser imidlertid GFP- og mCherry-uttrykkende bakterier i forskjellige flekker ( figur 2 og 3 ). Derfor, i stedet for å fokusere på vekstratene, kan bakterielle samfunn som inneholder kontaktmedierte patogene skuespillere, bedre studeres ved hjelp av romlige analyser. For eksempel, heller enn focusiNg på den integrerte intensiteten, som er representativ for totalt antall røde eller grønne celler i en brønn, tillater dette microwell formatet antall og plassering av røde og / eller grønne piksler som skal telles. Det er mulig å analysere veksten av individuelle kolonier eller flekker i disse brønnene, med fokus på grensene der de røde og grønne signalene overlapper ( figur 6a ). Kvantifiserende samlokaliseringshendelser og nærmeste naboanalyser kan deretter utføres for å se nærmere på egenskaper som patchstørrelse, patchvækstfrekvens og patchoverlapping innenfor individuelle brønner. Romlige analyser vil bli hjulpet av høyere forstørrelse avbildnings- og konfokalmikroskopi ( figur 6b ).

Figur 6
Figur 6: Den romlige organisasjonen av forskjellige arter kan analyseres ved hjelp av epifluorescerende og konfokal mikroskopi. ( B og c ) Konfokale bilder (20X forstørrelse, NA = 0,8) med 15 μm diameter, ~ 7,5 μm dype brønner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen presenterte en mikrowell array-enhet og eksperimentelle protokoller som er utformet for å muliggjøre høy gjennomstrømning og høy innholds-levende celle-bildebasert analyse av bakteriell samfunnsutvikling. Mens demonstrasjonsfokuset her var å studere effekten av kontaktmidlet type VI-sekresjon på samfunnsutvikling, var arrays utformet for å være fleksible og imøtekomme studiet av et bredt spekter av mikrobielle samfunn og mikrobe-mikrobe-interaksjoner. Arbeidet her fokuserer utelukkende på bruk av bakterier som konstitutivt uttrykker fluorescerende markører for å muliggjøre enkel sporing av medlemets overflod og plassering. Imidlertid kunne muligheter til å prøve biologisk materiale fra individuelle brønner etter vekst eller forstyrrelse ved å endre det kjemiske miljøet, i prinsippet brukes til å identifisere samfunnssammensetning og genuttrykk.

Hver silisiumanordning består av dusinvis av arrays som inneholder mikrobølger med forskjellige brønnerDiametre, organisert på enten en 2x, 3x eller 4x diameter tonehøyde, og etset til en dybde mellom 3 og 3,5 μm. Fordi næringsstoffer og sekundære metabolitter kan diffunere fritt gjennom og over agarose-lokket, ble forskjellige tonehøyde-arrays inkludert for å muliggjøre undersøkelse av hvordan signalering mellom mikrobølger eller lokal næringsdepletion påvirker samfunnsutviklingen. I denne demonstrasjonen viste ikke vekst og samfunnsutvikling seg å være påvirket av mikrowellavstand eller plassering innenfor arraysene. Den lave dybden ble valgt for å forenkle bildeanalyse, og begrenser all mikrobiell vekst og utvikling til et enkelt bildeplan. Dypere brønner (20 μm dyp) har imidlertid tidligere vært brukt og kan enkelt moduleres i dybden ved å variere varigheten av silisiumetseprosessen. Øk aspektforholdet mellom brønnene i vesentlig grad endrer graden av inneslutning som oppleves av cellene i det indre av brønnene, og effektivt endrer forholdet mellom det totale brønnvolumTil området gjennom hvilke næringsstoffer diffunderer i toppen av brønnen. Denne rekke array konfigurasjoner kan brukes til å studere effekten av brønn til brønn eller brønn signalering.

En begrensning for bruk av silisium til fremstilling av mikrobrønner er at den er ugjennomsiktig til synlig lys. Følgelig kan rutinemessige analyser som er avhengige av lysoverføring ( f.eks. Lysfelt, fase eller differensial interferenskontrastbilder) ikke brukes til å overvåke vekst. Løpende forskning og utvikling i vår gruppe har fokusert på å tilpasse denne silisiummikrobellkonfigurasjonen og eksperimentell protokoll for arbeid med gjennomsiktige arrays for å tillate høyere oppløsning fluorescens og brightfield-bildebehandling for overvåkning og kvantifisering 27 . Ved å bruke transparente materialer for fabrikasjon, som SU-8 epoxy på glassdeksel, er det mulig å skaffe både lysfelt og fluorescensbilder med mål som opererer på kortere arbeidsavstander.Dette gjør det mulig å oppnå mer optimal oppløsning med vanndypning eller oljemål med ≥40X forstørrelse, uten vanskeligheten ved avbildning gjennom et agarlag, slik det er tilfelle for silisiumsammensetninger.

Som beskrevet i vårt tidligere arbeid, påvirker såddforholdene og brønngeometrien såing av celler i brønnene. Ved lave sådddensiteter eller i små brønner gir høy variasjonsnivå i antall og typer celler som laster inn i individuelle brønner en bred og rask undersøkelse av eksperimentell parameterplass. Høyere sådddensiteter og / eller avbildning større brønner gir mer konsistente forhold av celletyper og totale inokulasjonsnivåer, slik at det kan analyseres stort antall eksperimentelle replikater. En rask titt på bilder i de tidligste stadiene av vekst antyder at cellene fester og vokser hovedsakelig langs kanten av brønnene ( figur 5a ). Det er ikke klart om dette er en artefakt relatert til sOme fordampende tørking under såddprosessen eller foreslår en preferanse for cellefesting til flere kanter. Intensiv endring av topografien eller overflatekjemien av brønnene på en deterministisk måte kan avsløre hvilke faktorer som har størst innvirkning på cellefeste og biofilmdannelse.

Veksten av bakteriene i disse brønnene støttes ved bruk av en agaroseglassbelagt glassdeksel infisert med R2A-medium. Metodene som er beskrevet for å lage denne agarose-belagte dekselglasset, sikrer en jevn tykkelse gjennom hvilken bildet og en forholdsvis konstant z-posisjon, noe som muliggjør samtidig bildering av flere silisiumspåner. Bruken av ultra-ren agarose som geleringsmiddel og et minimalt medium i stedet for et komplett medium resulterer i en renere, mindre autofluorescerende bakgrunn, og øker det generelle signal-støyforholdet. Når du stoler på fluorescens for kvantitativ sporing av mikrobielle samfunn, er det viktig å holde imagiNg forholdene konsekvent og å være akutt oppmerksom på bidrag fra autofluorescens, photobleaching og ikke-uniform belysning. I tillegg, for eksperimenter som krever langvarig bildeoppkjøp, er et tykt lag av agarose, som anvendt her, ønsket. Tynnere lag (~ 100 μm tykk) kan gjøres for å muliggjøre høyere forstørrelsesbilder. Det er imidlertid vanskelig å holde aggregatet fuktig nok til å forhindre at det tynne laget tørker ut.

Selv om den første analysen av vekstparametere og innledende inokulasjonsnivåer ennå ikke har avslørt noen signifikante korrelasjoner for det enkle systemet som beskrives her, viser de viste protokollene og dataene dybden på informasjon som kan trekkes ut fra bilder av samfunnsutvikling over tid. Romlig organisering i brønnene utvikler seg som enkeltartede kolonier utvider fra de første "nucleation" -stedene. Dermed er faktorer knyttet til den innledende festetetthet ( dvs. stemning perhaPs fra den større preferansen til en art for brønnoverflaten sammenlignet med en annen) eller vekstraten av individuelle flekker kan dramatisk påvirke samfunnsutviklingen. Subtler interaksjoner, som de som medieres av kontakt mellom arter (patcher) etablert svært sent i vekstprosessen, kan kreve en mer grundig analyse av bildedataene.

Microwell-arrayplattformen og protokollen som presenteres her, muliggjør rask montering og høyinnholdsanalyse av mikrobiell samfunnsutvikling og mikrobe-mikrobe-interaksjoner. Fremtidig arbeid som muliggjør kontroll av det lokale kjemiske miljøet, ved å endre sammensetningen av medium i agarlokket eller ved direkte modulering og prøvetaking via integrerte mikrofluidika, bør tillate eksperimentelle protokoller som beveger seg utover å etterligne naturlig inneslutning og nisjestørrelse og begynne å Utforske virkningen av dynamisk forandrede miljøer, ligner de som finnes i naturen. Fremtidig arbeid vil økeArray design med integrerte mikrofluidics som kan brukes til å dynamisk modulere det lokale kjemiske miljøet og å prøve væske fra individuelle brønner. Ytterligere arbeid på utviklingen av optisk klare mikrowell-arrays som kan brukes til høyere oppløsning og lysfeltsporing av samfunnsvekst, er beskrevet andre steder 27 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Microwell-arrays ble produsert og karakterisert ved Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Finansiell støtte til dette arbeidet ble gitt gjennom Oak Ridge National Laboratory Director's Research and Development Fund. Forfatterne vil også takke J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) for tilførsel av P. aeruginosa- stammer brukt i disse studiene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Parylene N Specialty Coating Systems CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater Specialty Coating Systems Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010
Silicon Wafer WRS Materials 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>,
adhesion promoter Shin-Etsu Microsci MicroPrime P20 adhesion promoter
postive tone photoresist Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)
Quintel Contact Aligner Neutronix Quintel Corp NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool Oxford Instruments Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher
R2A Broth TEKnova R0005
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Multimode Plate Reader Perkin Elmer Enspire, 2300-0000
Fluorescent Microscope Nikon Eclipse Ti-U
Automated Stage Prior ProScan III
CCD camera Nikon DS-QiMc
Stage-top environmental control chamber In Vivo Scientific STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190144
UltraPure Agarose ThermoFisher Scientific 16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip Nexterion High performance #1.5H coverslips
Fluorescence Reference Slides Ted Pella 2273
Physical Stylus Profilometer KLA Tencor P-6
lab wipes Kimberly Clark Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial software Nikon NIS Elements
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss
filter cubes Nikon Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
  2. Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (10), 4152-4157 (2011).
  3. Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73, (22), 7300-7307 (2007).
  4. Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105, (47), 18188-18193 (2008).
  5. Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
  6. Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
  7. Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72, (1), 212-220 (2006).
  8. Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136, (6), 1989-2002 (2009).
  9. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36, (5), 347-355 (2011).
  10. Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11, (5), 337-348 (2013).
  11. Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14, (2), 93-105 (2015).
  12. Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4, (1), 63-75 (2014).
  13. Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14, (10), 3742-3748 (2013).
  14. Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9, (6), (2015).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (46), 17290-17295 (2006).
  16. Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333, (6050), 1764-1767 (2011).
  17. Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (14), 5624-5629 (2013).
  18. Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4, (2), 1-8 (2013).
  19. van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14, (1), 116 (2014).
  20. Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
  21. Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11, (5), e0155080 (2016).
  22. Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7, (1), 25-37 (2010).
  23. LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109, (48), 19804-19809 (2012).
  24. Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92, (3), 529-542 (2014).
  25. Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11, (1), e0145081 (2016).
  26. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56, (6), 1875-1881 (1990).
  27. Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34, (6), 06KI03 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics