निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना

Biochemistry

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Summary

यहां, यह दर्शाया जाता है कि कैसे जीनोटॉक्सिक तनाव के संपर्क में निलंबन सेल संस्कृतियों में एटीएम और पी 53 के बीच प्रत्यक्ष प्रोटीन-प्रोटीन की बातचीत का पता लगाने और देखने के लिए स्वस्थानी निकटता बंधन परख (पीएलए) का इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Bahjat, M., Bloedjes, T. A., van der Veen, A., de Wilde, G., Maas, C., Guikema, J. E. Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (124), e55703, doi:10.3791/55703 (2017).

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Abstract

डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया डीएनए घावों की आनुवांशिक रूप से हुई मरम्मत की समीक्षा करती है, जीनोटॉक्सिक तनाव के कारण होती हैं, या लिम्फोसाइटों में प्रोग्राम किए गए डीएनए ब्रेक के संदर्भ में दिखाई देती हैं। एटैक्सिया-तेलैनिगिक्टेसीया म्यूट कैनेज (एटीएम), एटीएम- और राड -3-संबंधित किनेज (एटीआर) और डीएनए-आश्रित प्रोटीन किनेस (डीएनए- पीकेसीएस) की उत्प्रेरक सबयूनेट डीएनए क्षति को शामिल करने पर सक्रिय हैं, और ये हैं एक नेटवर्क के केंद्रीय नियामक जो डीएनए की मरम्मत, एपोपोसिस और सेल अस्तित्व को नियंत्रित करता है। ट्यूमर-दबाने वाला मार्ग के हिस्से के रूप में, एटीएम और एटीआर p53 को फॉस्फोरेलेशन के जरिए सक्रिय करते हैं, जिससे p53 की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को विनियमित करते हैं। डीएनए नुकसान तथाकथित आयनीकरण विकिरण प्रेरित फोसिक (आईआरआईएफ) के गठन में भी परिणाम है जो डीएनए नुकसान संवेदक के परिसरों और डीएनए नुकसान की साइट पर जमा प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जाता है। आईआरआईएफ में प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण, हालांकि, जरूरी नहीं कि डीIrect प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, क्योंकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का रिज़ॉल्यूशन सीमित है।

स्वस्थानी निकटता बंधन परख (पीएलए) एक उपन्यास तकनीक है जो अभूतपूर्व विशिष्टता और संवेदनशीलता वाले कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर संबंधों के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है। यह तकनीक हित के प्रोटीन के लिए बाध्य विशिष्ट एंटीबॉडी के स्थानिक निकटता पर आधारित है। जब पूछताछ की प्रोटीन ~ 40 एनएम के भीतर होते हैं, तो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स द्वारा एम्पलीकरण प्रतिक्रिया उत्पन्न होती है जो एंटीबॉडीज के लिए संयुग्मित होती हैं, और प्रवर्धन उत्पाद को फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा देखा जाता है, जो कि बातचीत करने वाले प्रोटीन के उप-स्थान के अनुरूप होता है। एक उदाहरण के रूप में एटीएम और पी 53 के बीच स्थापित कार्यात्मक बातचीत का प्रयोग करना, यह दर्शाया जाता है कि पीएनए का इस्तेमाल कैसे किया जा सकता है निलंबन सेल संस्कृतियों में प्रोटीन के बीच प्रत्यक्ष बातचीत का अध्ययन करने के लिए जो डीएनए क्षति प्रतिक्रिया के अभिन्न अंग हैं।

Introduction

डीएनए की क्षति प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रियाओं और बाद के अनुवाद-संबंधी संशोधनों से जुड़ी घटनाओं की अत्यधिक विनियमित श्रृंखला को ट्रिगर करती है जो डीएनए की कुशल और तेजी से मरम्मत सुनिश्चित करती है, जिससे जीनोमिक अखंडता 1 की सुरक्षा होती है आमतौर पर, डीएनए की मरम्मत का अध्ययन कोशिकीय कोशिकाओं में किया जाता है जो ionizing विकिरण के संपर्क में तथा तथाकथित ionizing विकिरण प्रेरित foci (आईआरआईएफ) (confocal) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा तैयार किया जाता है। कई डीएनए की मरम्मत और डीएनए क्षति-संवेदन प्रोटीन आईआरआईएफ का निर्माण करते हैं, जो कि प्रोटीन परिसरों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो क्रोमैटिन साइट्स में न्यूक्ल्यूलेट डीएनए नुकसान 2 , 3 बनाए रखते हैं । समय के साथ आईआरआईएफ के स्थान और संकल्प डीएनए की मरम्मत के स्टेटियोटेम्पोरल संगठन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, और विभिन्न डीएनए मरम्मत पथों की भागीदारी का संकेत दे सकता है। डीएनए क्षति और सेल-चक्र चरण की प्रकृति जिसमें क्षति प्राप्त होती है, यह निर्धारित करता है कि डीएनए मरम्मत मार्ग कैसे सक्रिय होता है। फो उदाहरण के लिए, डीएनए प्रतिकृति (एस-चरण) में सक्रिय रूप से सक्रिय कोशिकाओं में, मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर) प्रमुख डीएनए की मरम्मत पथ है, जबकि कक्ष-चक्र के जी -1- या जी 2 / एम-चरण में कोशिकाओं में, गैर- मुताबिक़ समापन-सम्मिलन (एनएचईजे) मरम्मत मार्ग मुख्यतः होता है डीएनए क्षति के बाद जल्द से जल्द घटनाओं में से एक डीएनए क्षति-संवेदन करने वाली एनाटिसिया तेलंगिएकाटासीआ-म्यूटेटेड प्रोटीन (एटीएम) की सक्रियता है, जो सेल-चक्र के जी -20 और जी 2 / एम-चरण में सक्रिय है और एनएचईजे को नियंत्रित करती है, और अत्तासिया तेलंगिएकासिया और राड 3-संबंधित प्रोटीन (एटीआर) है, जो एसआर चरण में मानव संसाधन को सक्रिय करने के द्वारा कार्य करता है। दोनों एटीएम और एटीआर बहुत ही स्नायुपोटिक किनिज हैं जो डीएनए की मरम्मत, कोशिका मृत्यु और अस्तित्व 4 में शामिल कई प्रोटीन फास्फोराइलेट करते हैं। जीनोटॉक्सिक तनाव के संपर्क के बाद दोनों किणों को फास्फोरेट पर दिखाया गया है और ट्यूमर-दमनकारी प्रोटीन पी 53 को सक्रिय कर दिया गया है, यह दर्शाता है कि इन किणियां एक निर्णायक ट्यूमर के दबाने वाला सिग्नलिंग अक्ष के अपस्ट्रीम मध्यस्थ हैं"Xref"> 5 , 6

आईआरआईएफ के गठन और संरचना को आम तौर पर दोहरे रंग की immunofluorescence धुंधला और माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विभिन्न प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण का निर्धारण करके मूल्यांकन किया जाता है, हालांकि, प्रोटीन परिसरों के सभी प्रोटीन आईआरआईएफ के रूप में नहीं होते हैं, जो इस दृष्टिकोण की प्रयोज्यता को सीमित करता है। इसके अलावा, (confocal) immunofluorescence माइक्रोस्कोपी प्रकाश के विवर्तन गुणों के द्वारा सीमित है, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 200-300 एनएम का एक बहुत ही खराब स्थानिक रिज़ॉल्यूशन होता है, जो सबसे अधिक subcellular संरचनाओं के आकार से अधिक है, जो अनिवार्य रूप से प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का प्रत्यक्ष पूछताछ प्रतिबंधित करता है आणविक स्तर जैसे, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (confocal) द्वारा पता लगाए गए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेंसिंग पैटर्न के सह-लोकिकीकरण सीधे प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए आवश्यक नहीं है। हाल ही में, नई सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं, जैसे त्रि-आयामी ढांचानैनो पैमाने पर विस्तार में 53 बीपी 1 और बीआरसीए 1 आईआरआईएफ गठन का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था, जो इन प्रोटीनों के स्थानिक वितरण विशेषताओं का खुलासा करते हैं, जो कि confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी 8 द्वारा पता नहीं लगा सके।

विवो में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए कई अन्य विधियों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि सह-इम्युनोप्रेजिशन, पुल-डाउन विधि और खमीर दो-संकर स्क्रीनिंग दृष्टिकोण। हालांकि, इन तकनीकों को बहुत ही बोझिल होते हैं, बड़ी मात्रा में कोशिकाओं या प्रोटीन की आवश्यकता होती है या प्रोटीनों के अत्यधिक विकर शामिल होते हैं, जो प्रयोगात्मक कलाकृतियों का परिचय देते हैं। हाल ही में, एक उपन्यास तकनीक विकसित की गई है जो प्रोटीन-प्रोटीन की बातचीत के लिए दृश्यता और मात्रात्मकता ( जैसे कि कोशिकाओं और ऊतकों में) की अनुमति देता है, जिसे निकटता लिग्नेशन आक्षेप (पीएलए) 9 , 10 कहा जाता है। पीआरनकली एंटीबॉडी जो हित के दो प्रोटीन को पहचानते हैं उन्हें द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है जो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (तथाकथित पीएलए जांच) से संयुग्मित हैं। यदि प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त प्रोटीन के बीच बातचीत के कारण दो अलग-अलग माध्यमिक एंटीबॉडी पर्याप्त रूप से करीब हैं, संयुग्मित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स संकर और एक बंद परिपत्र डीएनए सब्सट्रेट बनाने के लिए ligated हो सकता है। इस परिपत्र सब्सट्रेट को बाद में रोलिंग सर्कल प्रवर्धन द्वारा प्रवर्धित किया जाता है, और फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित पूरक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ विज़ुअलाइज़ किया गया है। पीएलए का प्रयोग करते हुए, प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का सबसेलुलर स्थानीयकरण को संरक्षित किया जाता है क्योंकि फ्लोरोसेंटली लेबल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन उत्पाद पीएलए जांच से जुड़ा रहता है। इस परख का संकल्प <50 एनएम है, इस शोध के आधार पर कि एंटीबॉडी का व्यास लगभग 7-10 एनएम 11 है रोलिंग सर्कल प्रवर्धन केवल तब ही हो सकता है जब एंटीबॉडी के दो जोड़े (प्राथमिक + सेकंडन)डैरी) परिधि के भीतर शारीरिक रूप से बातचीत करते हैं जो उनके आकार (10 + 10 + 10 + 10 = 40 एनएम) से परिभाषित है। संकेत प्रवर्धन कदम पीएलए परख की संवेदनशीलता को बढ़ाता है और शायद ही व्यक्त प्रोटीन के संपर्कों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। पीएलए बारक्टक्टेट उत्पन्न करता है, फ़ॉसी जैसी सिग्नल पैटर्न, जो कि प्रति सेल आधार पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिसके द्वारा प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में अंतराल और अंतर-सेलुलर भिन्नता का मूल्यांकन किया जा सकता है।

डीएनए रिपेयर कॉम्प्लेक्स और आईआरआईएफ के गठन और संरचना का ज्यादातर ज्यादातर अनुवांशिक सेल लाइनों जैसे मानव हड्डी ओस्टोसरकोमा एपिथेलियल सेल लाइन यू 2 ओएस, मानव भ्रूण गुर्दा सेल लाइन HEK293 और रेटिना वर्णक उपकला सेल लाइन आरपीई 1 में अध्ययन किया जाता है, बढ़ती और ट्रांसफ़ॉर्म करने में आसान सस्पेंशन सेल संस्कृतियों जैसे कि एक लिम्फोइड और मायलोयॉइड सेल लाइनों को कम बार उपयोग किया जाता है, क्योंकि इन्हें अभिकर्मक के लिए कम आसानी से उपयोग किया जाता है और आम तौर पर कवरलेटों का पालन नहीं करते हैं, इस प्रकार अतिरिक्त / वैकल्पिक स्टंट की आवश्यकता होती हैइमेजिंग के लिए ईपीएस हालांकि, डीएनए क्षति का संकल्प लिंफोफाइड और मायलोइड दुर्दम्य के संदर्भ में बहुत ही प्रासंगिक है, क्योंकि डीएनए क्षति की प्रतिक्रिया अक्सर इन ट्यूमरों में जीनोमिक (चालक) के अपवादों से प्रभावित होती है, जो सामान्य लिम्फोइड और माइेलॉइड के घातक परिवर्तन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रही है ( पूर्वज) कोशिकाओं 12 , 13 , 14

इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए क्षति को शामिल करने के बाद पीएलए का इस्तेमाल प्रोटीन-प्रोटीन के अन्तर का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यहां, पीएलए मानव बी सेल ल्यूकेमिया कोशिकाओं में डीएनए नुकसान पर एटीएम और पी 53 के बीच बातचीत को निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए किया जाता है जो एक जी-चरण-चरण सेल-चक्र गिरफ्तारी से गुजरने के लिए प्रेरित होते हैं। नोट, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल G1- गिरफ्तार किए गए ल्यूकेमिया कोशिकाओं में एटीएम और p53 इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए प्रतिबंधित नहीं है, लेकिन इसका उपयोग अन्य प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक को देखने के लिए भी किया जा सकता हैविभिन्न सेल प्रकारों और निलंबन सेल संस्कृतियों में रुझान

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Protocol

1. सेल और डीएनए नुकसान प्रेरण का उपचार

  1. आईएमडीएम में मानव बीसीआर-एबीएल + बी-सेल एसिट लिम्फोब्लास्टिक सेल लाइनों BV173 या एसयूपी-बी 15 में 20% एफसीएस, 50 माइक्रोग्राम β-मेर्केटोटोथानॉल, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ संस्कृति को मानवता 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस 5 मिलीलीटर / अच्छी तरह से 6 कुओं प्लेटों में 2 एक्स 10 6 सेल / एमएल पर कोशिकाओं और प्लेटों की गणना करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, विभिन्न मूल निलंबन सेल लाइनों का उपयोग किया जा सकता है
  2. सेल-चक्र के जी-चरण-चरण में बीसीआर-एबीएल + बी-सभी कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए, इमातिनिब मेथेनसफॉनेट (एसटीआई 571) के 5 माइक्रोन जोड़ें और रातोंरात सेते रहें।
    1. वैकल्पिक रूप से, सेल-चक्र या बीसीआर-एबीएल-नकारात्मक कोशिका प्रकारों में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करते समय इस चरण को छोड़ दें।
  3. संस्कृति में 50 एनजी / एमएल नेकोर्ज़िनोस्टाटिन (एनसीएस) को जोड़कर डीएनए की क्षति उत्पन्न करें, और 2 घंटे के लिए सेवन करें।
    1. वैकल्पिक रूप से,5 Gy की खुराक पर 0.5 Gy / min पर एक रेडियोधर्मी स्रोत [ 137 सीएस] का प्रयोग करके कोशिकाओं को विकिरण करके डीएनए क्षति उत्पन्न करते हैं। विकिरण के बाद, सेल को 2 से 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के वातावरण में पुनर्प्राप्त करें।
  4. वैकल्पिक रूप से, डीएनए क्षति के जवाब में एटीएम कीनेज गतिविधि की भागीदारी का आकलन करने के लिए, एनसीएस या विकिरण उपचार के अलावा पूर्व में एटीएम किनेज अवरोधक केयू 55933 के 5 सुक्ष्ममापी जोड़ें।
  5. एक बीकर या एरलेमेयर फ्लास्क में 50 एमएल 1x पीबीएस के ऊपर 5 ग्राम अंश-वी बीएसए को लेयर करके 1x पीबीएस + 10% बीएसए तैयार करें और बीएसए भंग होने तक आरटी पर बैठें। हिलाओ या हलचल मत करें क्योंकि इससे व्यापक फोम हो जाएगा। धीरे-धीरे 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करें और बर्फ पर रखें।
  6. फसल कोशिकाओं और बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस के साथ दो बार धो लें कोशिकाओं की गणना करें और 1x पीबीएस + 10% बीएसए में 2 x 10 6 / एमएल में पुन: बर्फ पर कोशिकाओं को रखें

2. साइकोसेंट्रिफुगेशन, फिक्सेशन और परमेजीलाइज़ेशन

  1. तैयार करेंताजा तौर पर 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड समाधान पीएफए ​​के 2 ग्राम को 1x पीबीएस के 50 एमएल और 55 डिग्री सेल्सियस तक मिलाते हुए पानी के स्नान में जोड़ें, जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए। एक 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें और आरटी तक का उपयोग करें जब तक उपयोग करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 4% पीएफए ​​लगाने योग्य -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए जमा हो सकते हैं फ्रीजिंग के बाद, उपयोग के लिए केवल एक बार पिघलना। अन्यथा, पीबीएस में 4% पीएफए ​​समाधान सीधे खरीदा जा सकता है।
  2. ध्यान से पॉलिश 76 मिमी x 26 मिमी माइक्रोस्कोपी लिंट मुक्त टिशू के साथ स्लाइड और 5 मिनट के लिए एक Coplin जार में 96% इथेनॉल में रखकर उन्हें degrease। माइक्रोस्कोपी को 10 मिनट के लिए हवा में सूखने दें।
  3. माइक्रोस्कोपी को 6 मिमी के क्षेत्र में साइटोस्पिन / साइटोलॉजी फ़नल में स्लाइड करें। प्रत्येक फ़नल में 50 μL और 1x पीबीएस + 10% बीएसटी को 500 आरपीएम पर 1 मिनट के लिए पिपेट करने से पूर्व कोट स्लाइड्स।
  4. प्रत्येक फ़नल और 500 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित करने के लिए सेल-निलंबन के 100 μL (0.2 x 10 6 कोशिकाओं के बराबर) जोड़ें। प्रत्येक एंटीबॉडी संयोजन के लिए, ले परAst 4 की तैयारी आवश्यक है (दोहरे एंटीबॉडी प्रयोग; दो एकल एंटीबॉडी नियंत्रण; कोई एंटीबॉडी नियंत्रण नहीं)
  5. फ़नल को सावधानी से अलग करें और सुनिश्चित करें कि स्पॉट को छूने न दें। तत्काल नमूना निर्धारण के लिए आगे बढ़ें
    1. वैकल्पिक रूप से, स्लाइड को कम से कम 30 मिनट तक हवा में सूखा दें वायु सुखाने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी में व्यक्तिगत रूप से लपेटें और इस्तेमाल होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। जमे हुए तैयारी का उपयोग करते समय, स्लाइड्स पर अत्यधिक कंडेनसेशन को रोकने के लिए एक कागज़ के तौलिया में लिपटे स्लाइड्स को पिघलना सुनिश्चित करें।
  6. एक पेप पेन तरल ब्लॉकर (5 एमएम टिप) का उपयोग करके स्थान के चारों ओर एक सर्कल (लगभग व्यास 15-20 मिमी) बनाएं।
  7. प्रत्येक स्थान पर 50 μL का 4% पीएफए ​​निर्धारण समाधान जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेवन करें।
  8. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ आरटी पर कोप्लिन जार में 3 बार धोएं।
  9. एक लिंट-फ्री टिशू के साथ स्पॉट्स के चारों ओर स्लाइड्स सूखें और संभवतया एक पाई का उपयोग करके स्पॉट से अधिक तरल निकालेंस्पॉट को छूने के बिना पालतू, या स्लाइड झुकने से। बिना किसी आंदोलन के आरटी पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक स्थान पर 1x पीबीएस में 0.25% ट्राइटन-एक्स के 50 μL जोड़ें और 1x पीबीएस में जोड़ें।
  10. 5 मिनट में 5 मिनट के लिए 5 बार ~ 0.05% टीबीएस (टीबीएस-टी) में 50-60 एमएल के आरटी पर कोप्लिन जार में 3 बार धोएं। 10 स्लाइडों को इस फैशन में एक साथ संसाधित किया जा सकता है।

3. अवरुद्ध और प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. टीबीएस-टी को टैप करें और स्लॉट्स के चारों ओर स्लाइड्स सूखें, जिसमें एक लिंट-फ्री ऊतक होता है। स्थान को छूने के बिना, या स्लाइड को झुकाव करके किसी pipet का उपयोग करके संभव के रूप में स्थान से अधिक तरल निकालें। अवरुद्ध समाधान को संक्षेप में भंवर करें और प्रत्येक स्थान पर एक बूंद (~ 40 μL) जोड़ें। एक पूर्व गर्म आर्द्रीकृत कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  2. एंटीबॉडी कॉकटेल को 1: 1,000 पर बकरी-एंटी-एटीएम मिलाकर और एंटीबॉडी-एटी-फॉस्फो-सीआर 15-पी 53 को 1: 100 पर व्यावसायिक एंटीबॉडी मस्तिष्क में इस्तेमाल करने से पहले भंवर एंटीबॉडी मिक्सर तैयार करें। नियंत्रण अनुभव के लिएटीएस, केवल बकरी-एंटी-एटीएम युक्त एंटीबॉडी dilutions तैयार करें और केवल खरगोश-एटी-फॉस्फो-सीर 15-पी 53 एंटीबॉडी (एकल एंटीबॉडी नियंत्रण)।
  3. ब्लॉकिंग समाधान को टैप करें लेकिन ध्यान रखें कि कोशिकाओं को एंटीबॉडी dilutions जोड़ने से पहले सूखने नहीं दें। प्रत्येक एंटीबॉडी कॉकटेल कमजोर पड़ने के 30 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आर्द्रित कक्ष में सेते रहें
  4. बस्टर ए और बफर बी मिक्स के एक थैली की सामग्री को 1000 एमएल पानी की प्रत्येक मात्रा में भंग करके स्वस्थानी वॉश बफर ए और धो बफर बी में तैयार करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, नाओकल के 8.8 ग्राम, ट्रिस-बेस के 1.2 ग्राम और 800 एमएल पानी में 0.5 एमएल की ट्बिइन -20 भंग करके धो बफर ए तैयार करें। पीएच को एचसीएल का उपयोग करके 7.4 में समायोजित करें और 1,000 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ें।
    2. वैकल्पिक रूप से, 5.84 ग्राम NaCl, 4.24 ट्रिस-बेस और 25.0 ग्राम ट्रिस-एचसीएल 500 मिलीलीटर पानी भंग करके वॉश बफर बी तैयार करें। एचएचएल का प्रयोग करके पीएच को 7.5 में समायोजित करें। 1,000 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें
    3. फ़िल्टरएक 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से दोनों समाधान।
  5. स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए 2 बार धो लें और 1x में सीटू वॉश बफर ए को आरटी पर कोप्लिन जार में कोमल आंदोलन में धो लें।

4. पीएलए जांच, लगीकरण और प्रवर्धन

  1. व्यावसायिक एंटीबॉडी विरक्त में 1: 5 दोनों विरोधी बकरी प्लस और एंटी-खरगोश की मात्रा को कम करके पीएलए जांच तैयार करें। स्लाइड्स से सीटू वॉश बफर ए में 1 एक्स टैप करें और पीएलए जांच-मिश्रण के 30 μL को प्रत्येक स्थान पर जोड़ें। एक पूर्व गर्म आर्द्रीकृत कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा सेते हैं।
    नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी प्लस और मिनस पीएलए जांच के किसी भी संयोजन का इस्तेमाल किया जा सकता है (एंटी माउस, एंटी-खरगोश, एंटी-बकरी), जब तक कि प्रयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न प्रजातियों में उठाए जाते हैं, और पीएलए जांच का संयोजन हमेशा चाहिए एक प्लस जांच और एक MINUS जांच होते हैं।
  2. नरम आंदोलन के साथ आरटी पर एक कॉप्लिन जार में स्वस्थानी धो बफर ए में 50-60 एमएल 1x के साथ 5 मिनट के लिए 2 बार धोएं।/ Li>
  3. Ligase के 1 μL ligase को 39 μL ligation समाधान के साथ जोड़कर बर्फ पर ligation-ligase समाधान तैयार करें और प्रत्येक स्थान के लिए 40 μL ligation-ligase समाधान जोड़ें। एक पूर्व गर्म आर्द्रीकृत कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं।
  4. स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए 2 बार ~ 50-60 एमएल 1x में सीटू वॉश बफर ए में रखें और कोटी आंदोलन के साथ आरटी पर कॉप्लिन जार में रखें।
  5. पानी में प्रवर्धन स्टॉक समाधान 1: 5 को गिराकर बर्फ पर एम्प्लीमेशन-पोलीमरेज मिश्रण तैयार करें। फिर प्रत्येक स्थान के लिए 0.5 μL पॉलीमरेज़ को 1 एक्स एक्सप्लिफिकेशन समाधान के 39.5 μL जोड़ें।
    नोट: प्रवर्धन अभिकर्मक हल्के संवेदनशील होते हैं और प्रकाश के प्रत्यक्ष प्रदर्शन से संरक्षित होना चाहिए। प्रवर्धन अभिकर्मक चार अलग-अलग रंगों में आता है (लाल: उत्तेजना 594 एनएम, उत्सर्जन 624 एनएम; फेराड: उत्तेजना 644 एनएम, उत्सर्जन 669 एनएम; ऑरेंज: उत्तेजना 554 एनएम, उत्सर्जन 576 एनएम; ग्रीन: उत्तेजना 501 एनएम, उत्सर्जन 523 एनएम), सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोपी सेटअप उपलब्ध हैयूटियरी उत्तेशन गुण और इन रंगों को चित्रित करने के लिए फिल्टर।
  6. सीटू वॉश बफर ए में 1 एक्स टैप करें और प्रत्येक स्पॉट पर 40 μL एम्प्लीमेशन-पोलीमरेज़ मिश्रण जोड़ें। एक पूर्व गर्म आर्द्रीकृत कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिनट के लिए सेते हैं।

5. बढ़ते और इमेजिंग

  1. 1 एमएल 1x वॉश बफर बी से 99 एमएल पानी जोड़कर सीटू वॉश बफर बी में 0.01 एक्स तैयार करें।
  2. एम्प्लीफिकेशन-पोलीमरेज मिश्रण को टैप करें और 10 मिनट के लिए 2 बार 2 मिनट के साथ सीटू वॉश बफर बी में आरटी पर कोप्लिन जार में नरम आंदोलन के साथ स्लाइड करें।
  3. स्लाइड 1 मिनट 0.01x वॉश बफर बी में धो लें।
  4. अतिरिक्त 0.01x वॉश बफर बी को टैप करें और स्लॉट्स के चारों ओर स्लॉट्स को सूखें, जिसमें लिंट-फ्री ऊतक होता है। स्थान को छूने के बिना, या स्लाइड को झुकाव करके किसी pipet का उपयोग करके संभव के रूप में स्थान से अधिक तरल निकालें।
  5. नाभिक से अधिक होने से बचने के लिए डीएपीआई के बिना बढ़ते मध्यम 1: 5 में डीएपीआई के बिना बढ़ते माध्यम को पतला।
  6. 1: 5 डीएपीआई युक्त 25-30 μL युक्त माउंटिंग माध्यम को 24 मिमी x 24 मिमी के कंडोली में जोड़ें और स्लाइड के साथ कवर पर्ची उठाएं, यह सुनिश्चित करने के लिए मामूली दबाव लागू करें कि कोई फंसे हुए हवाई बुलबुले न हों। नेल पॉलिश के साथ कंसलिप को सील करें और इमेजिंग से कम से कम 15 मिनट प्रतीक्षा करें।
  7. एक (confocal) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्लाइड्स का विश्लेषण करें
    1. कम से कम 4 अधिग्रहीत छवि क्षेत्रों में प्रति कोशिकाएं पीएलए संकेतों की संख्या की गणना करें (20x उद्देश्य, इलाज की कोशिकाओं में 7 ± 5 सिग्नल के अनुमानित माध्य का उपयोग करके पावर गणना के आधार पर प्रति शर्त या एंटीबॉडी संयोजन में कम से कम 20 कोशिकाओं की गणना करना) और 2 ± 2 सिग्नल अनुपचारित कोशिकाओं में, 0.05 की टाइप-आई त्रुटि की संभावना और 80% की शक्ति, जैसा पहले 15 की सूचना दी गई थी)।
      नोट: सबसे अच्छा रिज़ॉल्यूशन सॉफ्टवेयर पैकेजों का उपयोग करके जेड-स्टैक और डिकोनिवोलन के अधिग्रहण से हासिल किया गया है ( उदाहरण के लिए , इमेजजे, लीका अधिग्रहण सुइट (एलएएस))। साइनाएलएन्स को परमाणु परिधि के भीतर आसानी से देखा जाना चाहिए, जैसा कि डीएपीआई धुंधला द्वारा परिभाषित किया गया है।
    2. उन संकेतों पर भरोसा न करें जो स्पष्ट रूप से नाभिक के बाहर दिखाई देते हैं। आमतौर पर, एनसीएस उपचार या γ- विकिरण परिणाम प्रति सेल लगभग 5-10 phosho-p53 / एटीएम पीएलए संकेतों में होता है। 'एकल एंटीबॉडी' नियंत्रण कुछ पृष्ठभूमि संकेत दे सकते हैं, लेकिन यह प्रत्येक 20 कोशिकाओं में से 1 में 1-2 पीएलए संकेतों से अधिक नहीं होना चाहिए।
    3. प्रकाशन और प्रस्तुति प्रयोजनों के लिए, एक 40X या 63X विसर्जन तेल उद्देश्य का उपयोग कर छवियों पर कब्जा। स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और रोशनी से एक्सपोज़र से सुरक्षित होना चाहिए।

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Representative Results

एसएसआर अवशेष पर पी 53 के फास्फोरेटेशन को एटीएम कीनेज गतिविधि 16 पर निर्भर होना दिखाया गया था। निलंबन सेल संस्कृतियों की साइटोस्पिन की तैयारी पर पीएलए तकनीक की विशिष्टता को प्रदर्शित और पुष्टि करने के लिए, यह दिखाया गया है कि डीसीए की क्षति 2 बी एनसीएस द्वारा बीसीआर-एबीएल + बी-सेल कोशिकाओं के सेल उपचार के जी-चरण चरण में गिरफ्तार कर ली गई। एटीएम और फॉस्फो-सीआर 15-पी 53 के बीच की विशिष्ट बातचीत के परिणामस्वरूप, अपेक्षित Punctate पीएलए संकेतों एनसीएस ( चित्रा 1 बी ) के साथ इलाज कोशिकाओं के न्यूक्लियस में देखा गया था, प्रति सेल के अनुसार 7 पीएलए संकेतों के औसत के साथ, जबकि इन संकेतों कोशिकाओं में नहीं पता था कि एनसीएस ( चित्रा 1 ए ) के साथ इलाज नहीं किया गया था । विशिष्ट एटीएम किनेज अवरोधक KU55933 के साथ कोशिकाओं का पूर्व उपचार डीएनए क्षति को शामिल करने से पहले स्पष्ट रूप से पीएलए सिग्नल की संख्या को कम कर देता है2 पीएलए संकेत / सेल ( चित्रा 1 सी )। एटीएम-फॉस्फो-सीआर 15-पी 53 पीएलए सिग्नल का केवल नाभिक रूप में पता चला था, जैसा कि अपेक्षित था पीएलए प्रयोगों में या तो बकरी-एटीएम-एटीएम या खरगोश-एटी-फॉस्फो-सीआर 15-पी 53 एंटीबॉडी को छोड़ा गया था ('एकल एंटीबॉडी' नियंत्रण) ने किसी भी विशिष्ट पीएलए संकेतों ( आंकड़े 1 डी और 1 ई ) नहीं दिए। इन परिणामों के मात्राकरण और सांख्यिकीय विश्लेषण चित्रा 1 एफ में प्रस्तुत किए गए हैं (ओचोडनीका एट अल जे। इमुनुनोल 2016 से अनुकूलित) 15

आकृति 1
चित्रा 1: बीटी 173 मानव बीसीआर-एबीएल + कोशिकाओं में एटीएम / फॉस्फो-सीआर 15-पी 53 इंटरैक्शन के लिए सीटू पीएलए में। ( ) कोशिकाओं को रात भर 5 माइक्रोग्राम इमटिनीब (विशिष्ट एएलएल किनाज अवरोधक के साथ इलाज किया गया था जो कि जी-चरण-चरण सेल-साइको उत्तेजित करता हैआईसीएटीआईनिब और 50 एनजी / एमएल एनसीएस के साथ डीसीए नुकसान ( बी ), या आईटैटिनिब के साथ और एनसीएस उपचार ( सी ) के पूर्व विशिष्ट एटीएम किनेज अवरोधक केयू 55933 के 5 सुक्ष्ममापी के साथ पूर्व उपचार के साथ, बीसीआर-एबीएल + कोशिकाओं में ई गिरफ्तारी) । बकरी-एंटी-एटीएम (डी) और खरगोश-एटी-फॉस्फो-सीआर 15-पी 53 एंटीबॉडी ( ) के लिए एकल एंटीबॉडी नियंत्रण पीएलए प्रयोग दिखाए जाते हैं। लाल प्रतिदीप्ति punctate संकेत एटएम और phospho-Ser15-p53 प्रोटीन की सीटू प्रोटीन निकटता (<50 एनएम) में प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल सलाखों = 5 सुक्ष्ममापी (सफेद रेखाएं) ( एफ ) विभिन्न प्रायोगिक स्थितियों के तहत कम से कम 20 कोशिकाओं में पीएलए संकेतों की संख्या का मात्रा दिखाया गया है। क्षैतिज रेखाएं साधनों का प्रतिनिधित्व करती हैं; सांख्यिकीय महत्व भिन्नता के एक तरफ़ा विश्लेषण (एनोवा, *** पी <0.001) द्वारा निर्धारित किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इस रिपोर्ट में, यह दर्शाया जाता है कि निलंबन सेल संस्कृतियों में प्रोटीन के बीच विशिष्ट संपर्क को निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए पीएलए का उपयोग किया जा सकता है। नोट, यहां वर्णित प्रोटोकॉल डीएनए रिपेयर कॉम्प्लेक्स के अध्ययन के लिए सीमित नहीं है बल्कि निलंबन सेल संस्कृतियों में अन्य प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को विज़ुअलाइज़ और मात्रा के लिए भी लागू होता है। यह दिखाया जाता है कि डीटीए क्षति-उत्प्रेरण एजेंट के संपर्क में होने पर एटीएम किनाज जी 1-गिरफ्तार बीसीआर-एबीएल + बी-सभी कोशिकाओं में फास्फोरिलेटेड पी 53 के साथ संपर्क करता है। इससे पहले, पीएलए तकनीक हमारे द्वारा एटीएम और एफओएक्सओ 1 ट्रांसक्रिप्शन कारक को बीसीआर-एबीएल + बी-एल्स कोशिकाओं में बातचीत करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, हालांकि, इस इंटरैक्शन की सबसे अधिक संभावना FOXO1 के एटीएम-निर्भर फ़ॉस्फोरायलेशन का परिणाम नहीं था। पीएलए आंकड़ों के समर्थन में, अंतर्जात एटीएम / एटीआर-फास्फोराइलेटेड प्रोटीन के इम्युनोप्रेएजेशन द्वारा पुष्टि की गई थी, जो स्थापित एटीएम सबरेट्रेट्स पी 53 और एनबीएस 1 के विपरीत, एफओएक्सओ 1 डीटी के प्रेरण पर एटीएम द्वारा फॉस्फोराइलेटेड नहीं है।एनए नुकसान 15 इसके अलावा, पीएलए दृष्टिकोण बेमेल मरम्मत परिसरों के निर्माण का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था ( जैसे एमएसएच 2 और एमएसएच 6 के बीच बातचीत) विभिन्न मानव बी सेल लिंफोमा सेल लाइनों (डेटा नहीं दिखाया गया) में बातचीत। इन विशेष संदर्भों में, पीएलए तकनीक ने हमारे निष्कर्षों का समर्थन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण की पेशकश की। यह दिखाया जाता है कि पीएलए प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच प्रोटीन-प्रोटीन की बातचीत के अर्द्ध-मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देती है और इन इंटरैक्शन में सेल-टू-सेल विविधता में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण (विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के संपर्क में) आमतौर पर चुनौतीपूर्ण रहा है और प्रयोगात्मक कलाकृतियों के अधीन है। आम तौर पर, प्रोटीन सह-इम्युनोप्रेजिज़ विकल्प की विधि रही है, लेकिन बड़ी मात्रा में कोशिकाओं और / या प्रोटीन की आवश्यकता होती है, अनिवार्य रूप से दुर्लभ कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण प्रतिबंधित करती हैप्रकार या प्रोटीन के बीच जो निम्न स्तर पर व्यक्त होते हैं। इसके अलावा, (अप्रासंगिक) सेल लाइन मॉडल में प्रोटीन के अत्यधिक विषमता अक्सर अजीब एक्सपेरेशन कलाकृतियों की ओर जाता है, और परिणाम vivo में पुष्टि / मान्य करने के लिए या प्रासंगिक सेल प्रकारों में बहुत मुश्किल हो सकता है इसके अलावा, सह-इम्युनोपेरेबैग को कोशिकाओं और प्रोटीन के सोल्यूबिलाइज़ेशन की आवश्यकता होती है, जो प्रोटीन-प्रोटीन की बातचीत कमजोर होने पर सिग्नल के नुकसान में पड़ सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, प्रोटीन सह-इम्युनोपेरेजिशन और खमीर-दो-हाइब्रिड दृष्टिकोण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में अंतर-और अंतर सेलुलर भिन्नता का पता लगाने में असमर्थ हैं। पीएलए तकनीक इन तकनीकों के लिए एक आकर्षक और आसान विकल्प प्रदान करती है, और महत्वपूर्ण अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। पीएलए का उपयोग एक मानक (निदान) प्रयोगशाला सेटिंग में किया जा सकता है क्योंकि इसमें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के प्रदर्शन की क्षमता से परे अत्यधिक विशिष्ट कौशल की जरूरत नहीं होती है।

सुपर-रेज़ोल्यूशन माइक्रोस्कोपी के विकास ने गहराई से अनुमति दी हैप्रोटीन परिसरों के आणविक वास्तुकला का विश्लेषण हालांकि, यह तकनीक आसानी से उपलब्ध नहीं है और इसमें एक समर्पित अनुसंधान बुनियादी ढांचा शामिल है। पीएलए एक तुलनात्मक संकल्प के साथ प्रोटीन जटिल संरचना के अध्ययन के लिए एक सुलभ, सरल और सस्ता वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है। पीएलए तकनीक की एक स्पष्ट सीमा विभिन्न प्रजातियों में उठाए गए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी की उपलब्धता है। हालांकि, कई कंपनियां अब समर्पित (और मान्य) एंटीबॉडी संयोजन पेश करती हैं जो पीएलए तकनीक के उपयोग को सरल करती हैं।

डीएनए क्षति की मरम्मत में प्रोटीन की भागीदारी पर अध्ययन और डीएनए क्षति की प्रतिक्रिया आईआरआईएफ गठन और संरचना के विश्लेषण पर भारी निर्भर करती है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आईआरआईएफ में प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण में जरूरी नहीं कि सीधी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन होता है। पीएलए तकनीक डीएनए की मरम्मत प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए और अधिक विस्तार से मरम्मत परिसरों के निर्माण का एक अनूठा अवसर प्रदान करती है। एसपीपीएएलए का उपयोग करके इस तरह के कॉम्प्लेक्सों के गठन पर एटिटेमपोराल विश्लेषण को मैप किया जा सकता है। इसके अलावा, यह शोधकर्ताओं को मरीजों के ऊतकों और नैदानिक ​​नमूनों में मरम्मत परिसरों के निर्माण का आकलन करने की इजाजत देगी, जिनका इलाज डीएनए हानिकारक एजेंटों या उपचारों के साथ किया गया है, जो इन उपचार विधियों की प्रभावकारिता में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं और चयन में सहायता भी कर सकते हैं। ऐसे रोगियों में से जो इन उपचारों से अधिक लाभान्वित होंगे

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

गुइकेमा प्रयोगशाला में रिसर्च ने नेशनल ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (वीआईडीआई अनुदान 016126355) और 'स्टीचिंग केंडेरेन कंकर्विज' केकेए (प्रोजेक्ट 252) से अभिनव अनुसंधान प्रोत्साहन योजना द्वारा वित्त पोषित किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV173 cell line DSMZ AC-20 BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line DSMZ ACC-389 BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco (Life Technologies) 21980-032
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich F7524 lot #: 064M3396
L-glutamine Gibco (Life Technologies) 25030-024
penicillin/streptomycin Gibco (Life Technologies) 15140-122
imatinib methanesulfonate LC Laboratories I-5508 Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin Sigma Aldrich N9162 Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933 Selleckchem S1092 Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides Waldemar Knittel VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker Sigma Aldrich Z377821-1EA
Cytospin funnel Q Path Labonord SAS 003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit Sigma Aldrich DUO92105 Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM Bethyl Laboratories A300-136A PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 Cell Signaling Technology 9284 We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Vectashield antifading mounting medium Vector Labs H-1000
4% paraformaldehyde in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Also available from various other vendors

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References

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