小鼠新生儿缺氧缺血性脑损伤模型的神经行为评估

Published 11/24/2017
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Neuroscience

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Summary

我们进行了单侧颈动脉闭塞产后 7-10 CD-1 小鼠幼崽创建一个新生儿缺氧缺血 (hi) 模型和调查的影响, hi 脑损伤。我们研究了这些小鼠的神经行为功能与手术正常小鼠相比。

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Kim, M., Yu, J. H., Seo, J. H., Shin, Y. K., Wi, S., Baek, A., et al. Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury. J. Vis. Exp. (129), e55838, doi:10.3791/55838 (2017).

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Abstract

我们对 CD-1 小鼠进行了单侧颈动脉闭塞, 以建立新生儿缺氧缺血 (hi) 模型, 并通过研究这些小鼠的神经行为功能与手术 (即:正常) 小鼠。在这项研究中, Vannucci 的方法被用来诱导新生儿脑损伤在产后7-10 天 (P7-10) 小鼠。通过单侧颈动脉结扎和暴露于缺氧 (8% O2和 92% N2为 90 min) 对幼犬进行 HI 操作。手术后一周, 受损的大脑用肉眼通过半透明的头骨进行评估, 并根据缺席 ("无皮质损伤" 组) 或皮质损伤的存在 ("皮质损伤" 组) 进行分组。比如右半球的病灶在6周, 进行了以下神经行为测试, 以评估认知和运动功能: 被动回避任务 (PAT), 阶梯行走试验和握力测试。这些行为测试有助于确定新生儿 HI 脑损伤的影响, 并用于其他神经退行性疾病的小鼠模型。在这项研究中, 新生的 HI 脑损伤小鼠显示出与右半球损伤相对应的运动缺陷。行为测试结果与人类新生儿脑瘫或新生儿中风患者出现的缺陷有关。在这项研究中, 建立了一个小鼠脑损伤模型, 并显示了不同程度的运动缺陷和认知障碍相比, 手术的老鼠。这项工作提供了关于 HI 鼠标模型的基本信息。MRI 图像显示不同的表型, 根据严重的大脑损伤的运动和认知测试分开。

Introduction

新生儿 HI 脑损伤发生在幼儿期 (约两个病人每1000儿童)1,2,3,4,5。关于新生儿 hi 脑损伤的研究是重要的, 利用建立的新生儿脑损伤小鼠模型可以促进脑损伤的临床前期研究.

传统的 HI 模型用于成年大鼠6。对于新生儿模型, Vannucci 法是常用的 P7 大鼠7,8。然而, 因为老鼠和老鼠是略有不同的9,10, 即使它们都是啮齿类动物, 我们在 P7-10 上对 CD-1 幼崽进行了改良的大米 Vannucci 方法, 根据先前的研究表明 P7-10 是未成熟的突, 对应于人类术语 P011,12。通过单侧颈动脉结扎和小鼠对 P7-10 幼犬缺氧8% 氧的暴露, 建立新生儿 HI 小鼠模型。

受手术影响的小鼠在右半球的后外侧区域显示出不同程度的脑损伤。为了识别认知和运动缺陷, 进行了基于 PAT、阶梯行走试验和握力测试的神经行为评估。分析了手术 (正常) 和 HI 小鼠之间的差异。这项工作提供了关于 HI 鼠标模型的基本信息。MRI 图像显示不同的表型, 根据脑损害的严重性, 使用运动和认知测试分开。

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Protocol

所有的动物都被安置在一个标准的笼子里 (27 x 22.5 x 14 厘米3) 在实验室动物保育协会 (AAALAC) 的认证和给予食物和水ad 随意在交替 12-h 光/暗周期.作者遵循动物保护条例, 实验程序由世大学医学院 (IACUC No. 2010-0252; 2013-0220) 机构动物保育和使用委员会批准。

1. 小鼠新生儿脑损伤模型

  1. 用异氟醚麻醉幼崽。
    1. 将幼崽 (少于 5) 放入麻醉盒中, 并关上盖子。
    2. 打开麻醉系统约15分钟;用台式麻醉机调节气体和异氟醚。调整氧气流量计为1.5 升/分, 调整的异氟醚蒸发器到3-5% 的诱导麻醉。
    3. 15分钟后, 将异氟醚蒸发器调整到 1-2%, 用于麻醉的维护。
  2. 在解剖显微镜下放置一个完全麻醉的幼崽 (面向研究员的腹部) 并用胶带固定。
  3. 用消毒剪刀在颈部做一个0.7 毫米的切口。
  4. 用灭菌钳将脂肪组织小心取出, 并暴露一侧右颈动脉。
  5. 结扎5-0 可吸收缝合的单侧右颈动脉。
  6. 用5-0 缝线缝合颈部的切口。
  7. 将每只幼崽放在一个37° c 温暖的缺氧室中, 用于1小时的恢复。请勿关闭室盖。
  8. 手术后1小时, 当幼崽完全清醒时, 关闭缺氧室盖, 降低气体水平以建立缺氧状态 (8% O2和 92% N2)。
  9. 90分钟的缺氧后, 将幼崽返回笼子。
  10. 脑损伤后一周, 重复步骤1。
    1. 麻醉后, 用无菌剪刀和镊子在头皮上做一个切口, 以确定右半球后外侧的脑损伤。
      注意: 这种疗法能诱导幼崽缺氧。所有小鼠脑损伤的存在和程度, 通过肉眼观察, 通过半透明的头骨进行目测评估。根据皮肤变色的大小或体积 (即脑部病变), 幼崽被分为组。如果没有明显的皮质损伤, 则将小鼠分为 "无皮质损伤" 组。如果有明显的皮质损伤 (即右半球的病灶), 则将小鼠分为 "皮质损伤" 组。由于对小鼠的分类是在手术后一周完成的, 所以当大脑样本的形态在牺牲时123中明确定义时, 可以对分组进行修改. 4

Figure 1
图 1: 对小鼠脑损伤进行建模。
(a) 一只七天大的小鼠接受了手术, 一侧右颈动脉结扎。(B) 幼崽被放在缺氧室中90分钟, 8% O2和 92% N2。(C、D 和 E)新生儿 HI 损伤的脑部表现出不同程度的损伤, 并根据损伤程度进行分类。在14周, 大脑得到了, 病变是可视化的。(C) 被归类为 "无皮质损伤" 的大脑的图像。(D) 和 (E) 分为 "皮质损伤" 组。(F、G 和 H)分别对 (C)、(D) 和 (E) 小鼠进行有代表性的 MRI 检查。(F) 海马的损伤用黄色箭头表示, 右半球的病灶也用黄色箭头 (G 和 H) 表示。缩放栏 = 1 mm请单击此处查看此图的较大版本.

2. 新生儿行为测试

注意: 在这里, 行为测试是在6周的年龄进行的。

  1. 被动回避任务。
    注意: 为了评估基于学习和避免厌恶刺激的记忆功能, 两个隔间步进拍应进行13,14,15,16
    1. 将一只小鼠放入有机玻璃梭箱 (41.5 x 21 x 35 cm3) 的明亮车厢中。
    2. 三十年代以后, 打开断头台门并且记录延迟时间为老鼠移动入黑暗的隔间 (由 300s)。
    3. 关闭断头台门时, 所有的鼠标四四肢完全在黑暗的车厢内。
    4. 管理电动脚休克 (0.5 毫安) 为2秒, 并将鼠标返回到它的笼子。
    5. 在电动脚休克后, 在明亮的隔间中更换鼠标24小时。
    6. 十年代把老鼠完全放在明亮的车厢里后打开断头台的大门, 并记录下鼠标进入黑暗车厢的等待时间 (高达 300s)。
  2. 阶梯行走试验。
    注意: 阶梯梯级步行任务允许通过结合定性和定量分析熟练的步行17,18来区分运动功能的细微干扰。
    1. 打开摄像机。
    2. 将鼠标放在梯子的开始板上, 然后立即开始录制。
    3. 录制视频, 重点放在鼠标的四肢。
    4. 当鼠标触及梯子的最后一个面板时停止录制。重复来回旅行四次。
    5. 分析视频记录, 并手动计算每个前肢的单张数, 如下所示:
      1. 在计算机上以慢速 (0.1x) 播放视频记录, 并手动计算步骤。
  3. 握杆强度试验。
    注: 握力测试采用握力计, 包括推拉式应变计。
    1. 将握杆强度装置固定在压克力板上。
    2. 将鼠标放在亚克力面板上, 并按住它的尾部。
      1. 移动握着尾巴的手, 这样鼠标就能到达并握住仪器的金属线。
    3. 允许多次试验, 直到鼠标握住三角形的金属丝 (直径2毫米);该仪器自动在克中登记峰值力。
      注: 使用三试验的平均峰值力进行分析19,20,21

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Representative Results

所有数据都被表示为平均±标准误差 (SEM)。通过对 SPSS 统计软件进行独立或配对的t测试, 对两个组之间的变量进行比较。p值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

新生儿 HI 损伤的大脑表现出不同程度的损伤, 并据此分类 (图 1C-E)。大脑是在14周获得的, 病变是可视化的。图 1C显示一个大脑被归类为 "无皮质损伤" 的大脑,图 1D显示一个被归类为轻度损伤的大脑,图 1E显示严重受损的大脑。(D) 轻度和 (E) 严重损伤分为 "皮质损伤" 组。在 HI 手术后, 13 周大的小鼠使用 MRI 成像, 结果 (图 1F-H) 分别是 (C)、(D) 和 (E) 损伤的典型图像。尽管在大脑的形态学上没有明显的损伤, 但 MRI 图像显示海马损伤 (图 1F)。海马体损伤 (图 1F, 用黄色箭头表示) 在轻度损伤的大脑中略显明显。在严重受损的大脑中, 鼠标失去了大部分右半球 (图 1G和 H, 用黄色箭头表示)。

由于高损伤的大脑显示海马损伤 (图 1FH), 与正常小鼠相比, hi 损伤的小鼠表现出记忆力减退。PAT 性能与海马损伤密切相关13,15,16,19图 2显示, HI 损伤的小鼠比正常的小鼠有更多的认知缺陷13(正常 n = 10;你好 n = 9)。在正常小鼠的基线和24小时记忆测试之间有统计学意义的差异, 如图 2A (*p = 0.003 基于配对的t测试) 所示。图 2B显示了与正常小鼠相比, 高伤害小鼠认知功能的变化 (δ) 是基线和 24-h 测试之间的差异)13

由于只有右半球受损, 新生儿 HI 脑损伤小鼠表现为偏瘫运动功能。相对于每个前肢所采取的步骤的总数, 阶梯横阶上的滑动百分比的差异是用来比较正常小鼠与新生儿 HI 脑损伤小鼠17,19图 3显示高脑损伤小鼠对侧前肢的滑移率明显高于正常小鼠 (正常 n = 19;喜 n = 18;*p = 0.010 基于独立的t测试)22, 但在同侧前肢(p = 0.798 基于独立的t测试) 中没有观察到差异。

此外, 由于握力涉及大脑中的运动皮层, 正常和皮质损伤组显示握力的差异。虽然握力试验结果显示正常和无皮质损伤小鼠 (图 4A; 正常的 n = 4; 没有皮质损伤 n = 12), 图显示对侧前肢的握力显著皮质损伤小鼠比正常小鼠弱 (图 4B; 正常 n = 4; 皮质损伤 n = 36; *p = 0.036 基于独立的t测试)21,22,23

Figure 2
图 2: 轻拍新生儿 HI 脑损伤和正常小鼠。
(A) 在明亮的车厢内测量和比较新生儿 HI 脑损伤与正常小鼠之间的潜伏期时间 (n = 9 和 n = 10, 分别)。(B) 电子电击时的测量被认为是基线, 在电击后24小时内对长期记忆进行了评估。Delta (Δ) 24 h 滞后时间是在 24 h 和基线下计算的函数之间的差异。*p< 0.05;所有数据均以平均± SEM 表示. 请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 阶梯行走试验中的前肢滑移率。
对正常和 HI 脑损伤小鼠的对侧和同侧前肢滑移率进行了评价 (n = 19 和 n = 18, 分别)。*p< 0.05;所有数据均以平均± SEM 表示.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 新生儿 HI 脑损伤和正常小鼠握力试验。
对侧前肢的握力进行了评估, 并比较了(A)正常, 无皮质损伤和 (B) 皮质损伤小鼠 (n = 4, n = 12, n = 36)。*p< 0.05;所有数据均以平均± SEM 表示.请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

在这项研究中, 我们诱发 HI 脑损伤的新生儿 P7-10 CD-1 小鼠, 并确定了脑损害的相关认知和运动缺陷。在这个过程中, 闭塞的单侧右颈动脉是至关重要的。在这一步, 动脉可能被破坏和撕裂。大多数经历过动脉撕裂的幼崽都死了。反之, 如果研究人员结扎了另一条血管而不是单侧右颈动脉, 小狗的大脑只轻度受损, 没有明显的表型可观察到24

在这项研究中, 由于小鼠和病变体积的变化, 大脑被分为几个组 (图 1 c-H)。一些轻度脑损伤的小鼠只在海马区受损, 而不损伤皮质区域 (图 1F)13。相反, 一些严重受损大脑的老鼠失去了大部分右半球, 皮质严重受损 (图1G 和 H)。因此, 研究人员应在程序19,25之后的一周内确定病灶的大小。由于使用 MRI 扫描对大脑进行评估, 因此对病灶体积和大小的测定更加可靠。因此, 我们建议研究人员用 MRI 来评价大脑, 尽管肉眼检查也是可行的。

脑瘫通常发生在幼儿期, 每1000名儿童的发病率约为两个病人5。由于新生儿 HI 小鼠模型可能是脑瘫或新生儿中风的典型模型4,11,26, 本研究的基线信息可用于脑瘫的临床前研究或新生儿中风

神经行为评估有助于识别认知和运动缺陷的表型13。本研究中引入的神经行为评估也适用于其他神经退行性疾病, 如亨廷顿氏症、帕金森病等。研究人员应该意识到, 在 PAT 期间, 受试者会受到电击。因此, PAT 应该最后执行, 所以电击不会影响其他行为评估。

为了进一步研究, 研究人员需要研究一个假手术组与 HI 组比较。对于一个特定的对照组, 研究人员可以在颈部进行切口, 并在没有任何动脉结扎的情况下闭合切口。为了模仿 hi 的操作, 这些幼崽应该放进缺氧室, 但没有缺氧, 在回到笼子之前, 它们的时间和 hi 组一样多。

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Disclosures

作者没有竞争利益。

Acknowledgements

这项研究得到了国家研究基金会 (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068)、大韩民国科学技术部、韩国健康技术研发 & 开发项目 (HI16C1012)、卫生部 & 的资助。福利, 大韩民国, 和世大学医学院的 "Dongwha" 教职员研究援助计划 (6-2016-0126)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hypoxic chamber Jeung Do Bio & Plant Co Experimental Builder
PAT apparatus Jeung Do Bio & Plant Co Experimental Builder
The ladder rung walking Jeung Do Bio & Plant Co Experimental Builder
SDI Grip Strength System San Diego Instruments Inc.
Grip-Strength Meter Ugo Basile 47200
Harvard Apparatus Fluovac anesthetizing system  Harvard Apparatus
Anesthetizing box acryl box
I-Fran Liquid (Isofluorane) Hana Pharm. Co., Ltd. General Anesthetics ( isoflurane 100ml)
CD-1 mice Orient Co., Ltd.
Blue Nylon Mono Non-Absorbbable suture 5-0 50cm Ailee Co., Ltd. NB 521
IBM SPSS Statistics IBM Ver. 23

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