ثلاثي الأبعاد الأنسجة المهندسة الانحياز شبكات Astrocyte الخص الآليات الإنمائية وتيسير التجدد العصبي

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

نحن عرض تطوير حزم تجميعها ذاتيا، ثلاثية الأبعاد سوماتى أستروسيتيك الانحياز طوليا والعمليات داخل انكاسيمينت مادة بيولوجية رواية. هذه المهندسة "السقالات الحية"، نستعرض ميكرون على نطاق القطر بعد تمديد سنتيمتر في الطول، وتكون بمثابة اختبار-أسرة لدراسة الآليات العصبية النمائية أو تيسير نيوروريجينيريشن بتوجيه الهجرة العصبية و/أو محواري اﻻستطﻻعية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Katiyar, K. S., Winter, C. C., Gordián-Vélez, W. J., O'Donnell, J. C., Song, Y. J., Hernandez, N. S., Struzyna, L. A., Cullen, D. K. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (131), e55848, doi:10.3791/55848 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وكثيراً ما تسفر الأمراض نيوروتراوما والأعصاب دائم العجز العصبي بسبب القدرة المحدودة للجهاز العصبي المركزي (CNS) لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة وإعادة إنشاء مسارات محواري. ومع ذلك، أثناء تطوير الجهاز العصبي والهجرة العصبية وامتداد محواري غالباً ما تحدث على طول الممرات التي شكلتها الخلايا الأخرى، يشار إليه بوصفه "السقالات المعيشة". تسعى إلى محاكاة هذه الآليات، وتصميم استراتيجية التي تلتف البيئة المثبطة للجهاز العصبي المركزي، ويعرض هذه المخطوطة بروتوكولا لاختلاق الأنسجة المهندسة المستندة إلى أستروسيتي "السقالات المعيشة". لإنشاء هذه الثوابت، استخدمنا مخطط انكاسيمينت مادة بيولوجية جديدة للحث على أستروسيتيس لتجميع ذاتي إلى حزم ثلاثي الأبعاد الكثيفة من القطبين سوماتى الانحياز طوليا والعمليات. المائية أولاً، جوفاء الصغرى-أعمدة تم تجميعها، والتجويف الداخلي كانت مغطاة بطبقة الكولاجين خارج الخلية-مصفوفة. ثم تم تسليم astrocytes القشرية الدماغية منفصلان في التجويف الصغرى-عمود أسطواني، وقطرها داخلي حاسمة < 350 ميكرون، عفوية الانحياز الذاتي وتعاقدت على إنتاج كابلات الألياف مثل فترة طويلة تتكون من حزم كثيفة عمليات astrocyte وييفات الكولاجين قياس < 150 ميكرومتر في القطر بعد توسيع عدة سم في الطول. هذه المهندسة السقالات المعيشة أظهرت > خلية بقاء 97% و بشكل حصري تقريبا تتألف من أستروسيتيس التعبير عن مزيج من خيوط متوسطة البروتينات الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني)، فيمنتين، ونيستين. وهذه محاذاة astrocyte شبكات وجد أن توفر الركازة متساهلة لمرفق الخلايا العصبية والانحياز التمديد نورت. وعلاوة على ذلك، هذه الثوابت الحفاظ على سلامتها والمحاذاة عند استخراج من انكاسيمينت المائية، يجعلها مناسبة لزرع الجهاز العصبي المركزي. تحاكي هذه الثوابت بريفورميد هيكلياً العناصر الرئيسية سيتوارتشيتيكتورال التي تقع بشكل طبيعي فيفو في"العيش السقالات" المستندة إلى الدبقية. على هذا النحو، قد هذه السقالات الحية المحورة بمثابة اختبار-أسرة للدراسة النمائية الآليات في المختبر أو تيسير نيوروريجينيريشن بتوجيه الهجرة العصبية و/أو اﻻستطﻻعية محواري عقب تدهور الجهاز العصبي المركزي الحية .

Introduction

الجهاز العصبي المركزي (CNS) لديها قدرة محدودة لمواجهة الخسائر و/أو خلل وظيفي للخلايا العصبية ومسالك محواري التي تصاحب ظروف مثل إصابات الدماغ الرضية (تبي)، السكتة الدماغية، مرض إصابة (العلوم)، والأعصاب النخاع الشوكي1 ،،من23،،من45. الخلايا في الجهاز العصبي المركزي يقتصر على عدد محدود من المناطق في الدماغ، وتعوق استعادة الخلايا العصبية المفقودة6،7. بالإضافة إلى ذلك، يتم التجديد لمسارات محواري المفقودة في الجهاز العصبي المركزي غير كافية بسبب الافتقار إلى التوجيه الموجه، ووجود مثبطات ثمرة، ورد الفعل أستروجليوسيس في أعقاب الضرر للأنسجة العصبية2،8، 9،10. عادة ما يكون astrocytes وظائف متنوعة في مساعدة الخلايا العصبية مع أيون التوازن وإزالة العصبي وتشكيل المشبك و neurovascular اقتران11. ومع ذلك، بعد حتى خفيفة الضرر للأنسجة العصبية، astrocytes قد تغيرات الجزيئية والهيكلية والوظيفية كما أنهم الانتقال إلى دولة الضخامي11. ردا على نيوروتروما شديدة، تؤدي هذه التغييرات في تشكيل ندبة مع غبش التي تحتوي على أستروسيتيس رد الفعل ترحيل ونواة آفة يحتوي على الكريات البيضاء التي تسربت من تمزق حاجز الدم في الدماغ (BBB)، ميكروجليا، oligodendrocytes، والخلايا الليفية11،،من1213. هذه أستروسيتيس رد الفعل بلوغ مورفولوجيا العمليات الخيطية، وغير منظم ويحمل التعبير زيادة البروتينات الشعيرة المتوسطة وكبريتات شوندروتن بروتيوجليكانس (كسبجس)، التي تعيق تجديد العصبية12. على الرغم من أن يساعد ندبة الدبقية في البداية استعادة سلامة BBB وتجنب انتقال العدوى الاستجابة الالتهابية للأنسجة السليمة المحيطة، هو بمثابة حاجز الفيزيائية والكيميائية الحيوية ضد إكسون التجديد12،14 ،،من1516. على سبيل المثال، محاور عصبية التي تواجهها ندبة الدبقية عرض النمو تندب منتفخة والأقماع وتوقف نمو12. وعلاوة على ذلك، يعوق الفوضى العمليات أستروسيتيك بعد إصابة تمديد تجديد محاور عصبية17. وتتجلى نتائج هذه الخصائص المثبطة في العاهات الجسدية والعصبية الدائمة غالباً أن المرضى الذين يعانون بعد نيوروتروما شديدة، بما في ذلك تبي وعشر

بغض النظر عن التحديات الخارجية التي تواجه التجدد وظيفية في الجهاز العصبي المركزي، أظهرت محاور عصبية لامتلاك قدرة الذاتية على تجديد. على سبيل المثال، الطابع الدينامي الأقماع النمو تندب على اتصال بندبة الدبقية يوحي بأن هذه النهايات تحتفظ بقدرتها على توسيع12. ونتيجة لذلك، فإنه يعتقد أن عقبة رئيسية أمام محواري إعادة نمو البيئة المثبطة CNS ما بعد الإصابة، وأن توفير بيئة متساهلة أكثر عن طريق تقليل الدبقية تندب و/أو توفير جسور التجدد عبر الندبة ستكون فائدة. وفي الواقع، أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي كانت قادرة على توسيع محاور عصبية من خلال آفة باستخدام الطعوم الأعصاب الطرفية كالجسور، والتي تشكل بيئة مواتية أكثر لمحور عصبي التجديد12،18، 19. واتبعت عدة استراتيجيات أخرى لاستغلال هذه القدرات التجديدية رمزي. على سبيل المثال، أدى التلاعب بالخلية نمو مسارات الإشارات في نماذج مختلفة من الإصابة محواري التجدد وندبة الدبقية الحد10،،من2021. بالإضافة إلى ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن العلاج مع تشوندرويتيناسي أي بي سي، الذي كليافيس معظم سلاسل السكر في كسبجس، يقلل من تأثير المثبطة كسبجس يفرزها astrocytes رد الفعل22. على الرغم من تشجيع النتائج، لا توفر هذه النهج الموجهة توجيها الأقماع النمو، الذي يحتمل أن يؤدي إلى التجديد المنحرف12، وأيضا لا تراعي لفقدان الخلايا العصبية. وقد استخدمت نهج يستند إلى الخلية في محاولات للتغلب على آثار ندبة الدبقية وتجديد الخلايا المفقودة، وخاصة الخلايا العصبية. بعض المجموعات قد ديديفيرينتياتيد أستروسيتيس رد الفعل في الخلايا العصبية، في حين أن البعض الآخر قد زرع الخلايا العصبية السلف إلى آفات الجهاز العصبي المركزي إعادة ملء منطقة الإصابة وتعزيز إكسون التجدد23،24، 25-ومع ذلك، يقتصر زرع الخلايا الجذعية وحدها بمعدلات بقاء منخفضة، وإدماج الفقراء، واستبقاء متواضعة في الأنسجة التالفة5. وعلاوة على ذلك، تفشل هذه الاستراتيجيات المستندة إلى خلية لاستعادة مساحات محواري مسافات طويلة، لا سيما في طريقة يمكن التحكم بها. ولذلك، يجري استكشاف المواد الحيوية في تركيبة مع النهج الأخرى كوسائل إيصال مختلفة العصبية وخلايا السلف ونمو عوامل26. النهج القائم على أساس مادة بيولوجية تتميز بدرجة عالية من التحكم التصميم لإنتاج بنيات التي تحاكي هابتوتاكسيك المادية، محددة، والعظة تشيموتاكسيك الموجودة في المكروية (3D) ثلاثي الأبعاد للهدف المضيف الأنسجة27، ،من 2829،30،31،32،،من3334. استنساخ هذه الإشارات البيئية أمر بالغ الأهمية للخلايا المزروعة مورفولوجيا أصلي مثل وانتشار، والهجرة، ويشير، من بين سائر الخصائص العصبية الحيوية29. وعلى الرغم من هذه الخصائص مفيدة، النهوض خارج الخلية التقليدية المصنف مادة بيولوجية السقالات المطلوبة تعزيز التجديد محواري مسافات طويلة الموجه وتحل محل الخلايا العصبية المفقودة في الوقت نفسه.

واعدة نهج بديل يستند إلى الأنسجة العصبية المهندسة "السقالات الحية"، التي تختلف عن الأخرى النهج المستندة إلى الخلية بسبب وجود الخلايا العصبية الحية مع سيتوارتشيتيكتوري بريفورميد الذي يضاهي التشريح الأصلية و/أو الإنمائية آليات لتسهيل استبدال المستهدفة، والتعمير، وتجديد الدوائر العصبية4،35. اعتبارات تصميم السقالات المعيشة تشمل تعمل ومصادر للخلايا العصبية، فضلا عن الخصائص الميكانيكية/الفيزيائية والإشارات البيوكيميائية التي تمليها تكوين أي الحيوية المصاحبة35. بعد تلفيق في المختبر، يمكن أن تكون هذه السقالات المعيشة مزروع في فيفو إلى جزيئات التصاق الخلية الحالية وتشيموتاكتيك ونيوروتروفيك إشارات لنشاط تنظيم الهجرة الخلية العصبية وثمرة إكسون تبعاً للدولة و تطور عمليات التجدد35. الخلايا الدبقية يمكن اعتبارها أساسا سيتوارتشيتيكتوري هندسيا للسقالات المعيشة منذ هذه الخلايا التوسط الآليات الإنمائية المختلفة في فيفو. خلال نمو الدماغ، والخلايا العصبية الجديدة تعتمد على القاعدية العمليات الموسعة بإطلاق شعاعي من منطقة البطين صوب لوحة القشرية النامية السقالات الحية لتوجيه الهجرة36،37. وعلاوة على ذلك، يقترح توسيع النمو الأقماع تظهر لتوجيه أنفسهم بالاستشعار إشارات جذابة وطارد بالخلايا الدبقية تنطوي، وما يسمى "رائدة" محاور عصبية للوصول إلى الأهداف الصحيحة التي تمتد على طول قبل منقوشة الدبقية السقالات35،،من3839. وهكذا، الخلايا الدبقية ضرورية لتوجيه الرائد محاور عصبية، الذي يخدم في وقت لاحق أساس إكسون "السقالات الحية" لتوجيه التوقعات من "اتباع" محاور عصبية. وعلاوة على ذلك، أظهرت آليات وساطة إطلاق النمو مستمرة وأرزان ارتباط المستقبلات، كما اتبع neuroblasts تيار الهجرة روسترال (RMS) للتنقل من منطقة سوبفينتريكولار (SVZ)، أحد المجالات القليلة المتبقية من الخلايا في الدماغ الكبار، إلى شمي لمبة (OB)40. هذه نيوروبلاستس في جمهورية مالوكو الجنوبية تهاجر داخل الأنبوب الدبقية (الشكل 1A-1)، التي تتألف من العمليات أستروسيتيك الانحياز طوليا، عبر الالتصاقات الخلية الخلية مباشرة ومترجمة العوامل القابلة للذوبان37، 41-أخيرا، بينما تلف الجهاز العصبي المركزي في الثدييات أسباب تعطل ترتيب عملية أستروسيتيك تشكيل ندبة الدبقية فعلياً يحول دون تجديد محواري17، تفتقر العديد من الثدييات غير نظم تشكيل ندبة الدبقية ضارة. بدلاً من ذلك، الحفاظ على الخلايا الدبقية من الأنواع غير الثدييات أكثر نظم، والانحياز الأنماط التي تستخدم كأدلة من خلال42،،من17المنطقة المضرورة43. على سبيل المثال، في نماذج علوم غير الثدييات، تظهر محاور عصبية تنمو في ارتباط وثيق مع الدبقية جسور عبور الآفة، مما يوحي بدور هام للسقالات الدبقية المنظمة كركائز تيسير محواري التجدد والانتعاش وظيفية ( الشكل 1A -2) 42 , 44 , 45-خلاصة من ميزات نيورواناتوميكال والآليات الإنمائية/التجدد الموصوفة أعلاه قد تسفر عن فئة جديدة من السقالات هندسيا المعيشة المستندة إلى الدبقية التي يمكن أن تدفع في الوقت نفسه الهجرة العصبية غير ناضجة ومحواري اﻻستطﻻعية من خلال بيئات غير المتساهلة في خلاف ذلك، وبالتالي يحتمل أن التخفيف من آثار العصبية وانحطاط المسالك إكسون المرتبطة بإصابات الجهاز العصبي المركزي والمرض.

لدينا فريق البحث صمم سابقا أنواع متعددة من السقالات الحية لإعادة إعمار وتجديد محواري مساحات في الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) عبر الأنسجة الدقيقة هندسة الشبكات العصبية (الصغرى-مزح) والأنسجة إجراء هندسة عكسية ترقيع العصب (تينجس)، على التوالي27،46،،من4748. كلتا الاستراتيجيتين تستند أصلاً إلى بيوميميكري. مزح الصغرى هياكل مستوحاة تشريحيا مصممة هيكلياً ووظيفيا الاستعاضة عن مساحات محواري الاتصال متميزة السكان الخلايا العصبية في الدماغ. تينجس استغلال الآلية التنموية التجدد محواري إكسون-ويسرت، يتجلى في "اتباع" إكسون النمو على طول محاور عصبية "رائدة"، لتحقيق المضيفة المستهدفة التجدد محواري35،،من4648. نحن رسملة مؤخرا على براعة سقالة المعيشة تقنية استخدام نظام انكاسيمينت مماثلة الجزئي-مزح والتماس الإلهام من الآليات المستندة إلى إطلاق الحالية في التنمية. هنا، قمنا بوضع ثوابت تتكون من حزم أستروسيتيك متحاذية تمتد collagenous التجويف العمود الصغير المائية49. وتوضع هذه السقالات المعيشة أستروسيتيك بملء أول تجمع إبرة أنبوبة شعرية-الوخز بالإبر مع سائل [اغروس] لإنشاء أجوف هيدروجيل أسطواني مع القطر الخارجي (OD) والقطر الداخلي (ID) المقابلة للأقطار الأنبوب والإبرة، على التوالي. بعد جيليشن [اغروس] واستخراج المائية الصغيرة-العمود من الأنبوبة الشعرية، الداخلية جوفاء مطلية بنوع الكولاجين لتوفير بيئة متساهلة للالتصاق astrocyte والانحياز تشكيل حزمة (الشكل 1B -1). وبعد ذلك، هو المصنف التجويف مع astrocytes القشرية الدماغية المعزولة من الفئران بعد الولادة الجراء (الشكل 1 باء-2). عكس المحاذاة ثنائي الأبعاد (2D) التقنيات التي تعتمد على تطبيق المجالات الكهربائية والاخاديد ميكروباتيرنيد، والمصفوفة خارج الخلية البروتين (ECM) الزخرفة، astrocyte المحاذاة في سقالة المعيشة تقنية تعتمد على التجميع الذاتي ووفقا للمتغيرات يمكن السيطرة عليها مثل انحناء الركازة (معرف العمود) وكثافة الخلايا والكولاجين تركيز50،،من5152. أستروسيتيس العقد ويعيد الكولاجين، والحصول على مورفولوجيا القطبين، والانحياز طوليا يناظر السقالات الطبيعية التي لوحظت في فيفو (الشكل 1-3). في الواقع، ونحن نواصل بنشاط استخدام هذه الهياكل الشبيهة بالكابل كركائز المادية لتوجيهات تستهدف ترحيل الخلايا العصبية غير ناضجة، فضلا عن تيسير تجديد محواري من خلال البيئة غير المواتية للجهاز العصبي المركزي تلف، لا سيما ندبة الدبقية الثدييات (الشكل 1). هذه المادة سوف يقدم طريقة تصنيع مفصلة أستروسيتيك الصغرى-الأعمدة، والمرحلة الصور الفلورة وعلى النقيض من سيتوارتشيتيكتوري المتوقعة، وإجراء مناقشة شاملة حول القيود الحالية والاتجاهات المستقبلية تقنية.

Figure 1
رقم 1: الإلهام، وبروتوكول تلفيق، والتطبيقات المقترحة لشبكات أستروسيتيك تمت محاذاته. (أ) الإلهام العصبية الحيوية: نيوروبلاستس (1) التي تنشأ من منطقة سوبفينتريكولار العصبية (SVZ) تستخدم أنبوب الدبقية الانحياز طوليا في تيار الهجرة روسترال (RMS) للهجرة الموجهة نحو لمبة شمي (OB)؛ (2) عدم-الثدييات مثل البرمائيات والأسماك يمكن إدامة التجديد بعد الأنسجة العصبية الضرر جزئيا بسبب تشكيل جسر الدبقية الذي يربط طرفي الآفة (مثلاً بحف الحبل الشوكي) ويعمل سقالة لإرشاد تجديد محاور عصبية. (ب) نظرة عامة على تلفيق: (1) بناء المائية جوفاء، ميكرون الحجم الصغير-عمود مع التجويف المغلفة مع إدارة المحتوى في المؤسسة، (2) البذر من الابتدائي أستروسيتيس القشرية معزولة عن الجراء الفئران بعد الولادة، (3) التجميع الذاتي للتوجه طوليا حزم في الثقافة، واستخراج الحزمة (4) من انكاسيمينت مادة بيولوجية للدراسات غرس المستقبل. (ج) التطبيقات في فيفو : (1) هذه السقالات المعيشة تكون بمثابة أنابيب الدبقية هندسيا للهجرة الموجهة العصبية من المراكز العصبية إعادة ملء المناطق تفتقر إلى الخلايا العصبية؛ (2) خلاصة إليه إنمائية رائدة الإرشاد إكسون وآلية التجدد جسور الدبقية في غير الثدييات قد تضفي هذه السقالات أستروسيتيك مع القدرة على توجيه إكسون التجديد عبر غير المتساهلة بيئة ندبة الدبقية الثدييات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

جميع الإجراءات المعتمدة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجان في جامعة بنسلفانيا والمركز الطبي شؤون قدامى المحاربين مايكل ج. كريسسينز والتقيد بالمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في "سياسة خدمة الصحة العامة في المعاهد الوطنية للصحة" في إنسانية رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (2015).

1-التنمية المائية الصغيرة [اغروس]-الأعمدة

  1. جعل حلاً حجم/وزن (w/v) 3% [اغروس] بوزن 3 غرام من [اغروس] ونقلها إلى كوب عقيمة التي تحتوي على 100 مل من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس). إضافة شريط مغناطيسي عقيمة للكأس، ووضعه على سطح صفيحة/محرض. الاحتفاظ بالكأس تغطية لمنع تبخر محتوياته في الخطوة التالية.
  2. الحرارة [اغروس] ودببس عند درجة حرارة 100 درجة مئوية، ويقلب 60-120 لفة في الدقيقة. ضبط هذه الإعدادات حسب الضرورة، ورصد تطور عملية انحلال باستمرار كما يتغير الحل في البداية من معتم إلى مظهر واضح يدل على أن [اغروس] قد حلت تماما.
    تنبيه: كوب ساخن والحل ساخنة!
  3. كما هو الحل [اغروس] يسخن وحركت، استرداد أربعة أطباق بيتري فارغة 10 سم وإضافة 20 مل دببس إلى اثنين منهم. مكان العلاج بوخز الإبر (القطر: 300 ميكرون، وطول: 40 مم)، زجاج الأنابيب الشعرية ميكروليتير (القطر: 701.04 ميكرومتر، وطول: 65 مم، القدرات: 25.0 ميليلتر)، وموزع لمبة داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. عند مسح الحل السائل [اغروس]، الحفاظ على التدفئة في حوالي 50 درجة مئوية ثابتة وآثاره لتجنب جيليشن [اغروس].
  4. إدخال إبرة الوخز بالإبر فتح أسفل موزع لمبة. إدراج أنبوب شعري عبر الإبرة يتعرض إلى الخارج. تأمين الأنبوبة الشعرية بإدخال جزء منه في المقطع المطاط اسطوانة موزع لمبة.
  5. نقل 1 مل من سائل [اغروس] مع ميكروبيبيتي على السطح طبق بيتري فارغة، ومكان واحدة من نهاية الأنبوبة الشعرية رأسياً (مع إبرة تدخل) على اتصال مع [اغروس]، بينما هو يجري مقروص كاب المطاط من موزع لمبة إلى الداخل. ببطء الإفراج عن الضغط على الغطاء موزع لمبة لرسم [اغروس] إلى الأنبوبة الشعرية.
    ملاحظة: يجب إجراء النقل [اغروس] السائل في الأنابيب الشعرية سريعاً. إذا تركت [اغروس] السائل لتبريد على سطح طبق بيتري لوقت كاف (حوالي 60 s)، يبدأ لجل، منع المص ملائمة من [اغروس] على طول الأنبوبة الشعرية.
  6. مكان كل تجميع لمبة-أنبوب-إبرة في طبق بتري مجاناً، واسمحوا [اغروس] هلام داخل الأنابيب الشعرية ترسيخ للحد الأدنى 5 بعناية سحب الأنبوبة الشعرية بيديك من سداده المطاط في الاسطوانة موزع لمبة، ترك الإبرة [اغروس] هلام في مكان داخل الأنبوب.
  7. استخراج إبرة الوخز بالإبر يدوياً بسحب ببطء الأنبوبة الشعرية؛ اسطوانة طدت حديثا [اغروس] أيضا الشرائح خارج الأنبوب في هذا الإجراء، لا تزال تحيط بالإبرة. دفع بلطف العمود الصغير على طول إبرة الوخز بالإبر بطرف الملقط المعقم لنقلها إلى النهاية. ضع الإبرة على صحن بيتري المحتوية على دببس مفتوح، ودفع العمود الصغير إلى دببس مع الملقط.
    ملاحظة: إذا كان لا يزال العمود الصغير [اغروس] داخل زجاج الأنبوبة الشعرية عند إزالة إبرة الوخز بالإبر، ببطء دفع العمود الصغير [اغروس] خارج الأنبوبة الشعرية بإبرة قياس 25 مم، وفي الطبق مع دببس.
  8. تعقيم ميكروسكالبيلس أو الملقط استخدام معقم حار حبة. جعل 4% w/v [اغروس] التي تزن 4 غرام من [اغروس]، ونقل ذلك إلى 100 مل دببس. حرارة وآثاره كما هو موضح في الخطوة 1، 2 للحصول على حل سائل [اغروس] 4% واضحة. الحفاظ على التدفئة وآثاره من الحل في الخطوات التالية.
  9. نقل أطباق بيتري الذي يحتوي على الأعمدة-الجزئي لغطاء تشريح، ونقل الصغير-عمود مع الملقط غرامة طبق بيتري فارغة. استخدام ستيريوسكوبي للإرشادات المرئية ومن ميكروسكالبيل قطع الصغيرة-الأعمدة إلى الطول المطلوب. تقليم كلا طرفي لينتهي شكل مشطوف الزواياس 45 من أفقي لتسهيل المناولة الصغرى-الأعمدة أثناء إضافة خلية وإدارة المحتوى في المؤسسة.
  10. تكرار الخطوة ثلاثة المزيد من الأعمدة الدقيقة في طبق بتري نفس السابقة وحتى بنيات الأربعة بالتوازي مع فصل بين خط < 3 ملم بين كل من الاسطوانات. تحميل 50 ميليلتر من 4% [اغروس] الحل مع ميكروبيبيتي وصب متواصلة/خط السائل على الصفيف العمود الدقيقة للاتصال وحزمة بنيات إلى مجموعات من أربعة (الآخرة تسمى "القوارب الصغيرة-العمود"). تجنب حركة [اغروس] 4% إلى نهايات الأعمدة الدقيقة، التي قد تسد الداخلية، بتقليل المسافة بين بنيات وإضافة [اغروس] بسرعة في خط رفيع.
    ملاحظة: ترتيب المجموعات الأربع الصغيرة-الأعمدة في "مراكب" غير مطلوب لاختلاق السقالات أستروسيتيك. ومع ذلك، خدمة القوارب للتعجيل بعملية التصنيع، وأن توفر طريقة أكثر أمنا للتحرك والتعامل مع الأعمدة الدقيقة في خطوات لاحقة.
  11. السماح لتبرد القارب الصغير-العمود لمدة 1-2 دقيقة للسماح جيلاتيون إضافة 4% [اغروس]. التقاط القارب الصغير-العمود مع الملقط غرامة قبل يربط 4% [اغروس]، ونقل الصغير-الأعمدة إلى الأخرى المحتوية على دببس بيتري الطبق أعد الخطوة 1-1-3. اختﻻق قوارب أكثر مع الأعمدة الصغيرة المتبقية كما هو مطلوب.
  12. نقل أطباق بيتري الذي يحتوي على الأعمدة الصغيرة و/أو قوارب للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء وتعقيم مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) خفيفة لمدة 30 دقيقة.
    تنبيه: ارتداء الحماية المناسبة لمنع التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
  13. تخزين الأطباق بالقوارب الصغيرة-العمود في دببس في 4 درجات مئوية، إذا إضافة إدارة المحتوى في المؤسسة، وطلاء الخلية لن يحدث فورا بعد ذلك، حتى 1 الأسبوع. كرر الخطوات تلفيق العمود الصغير إذا لم يتم استخدام بنيات خلال هذا الإطار الزمني.

2-الخلية الابتدائية الثقافة وعزله

  1. أستروسيتي القشرية في معزل عن الجراء الفئران
    1. في إطار التحضير للخطوات التالية، إضافة 20 مل هانك لموازنة الحل الملح (حبس) إلى أربعة أطباق بيتري 10 سم التي ستكون بمثابة خزانات لتشريح الأنسجة. إبقاء جميع الأطباق على الجليد. تعقيم المقصات الجراحية نظيفة والملقط وملعقة صغيرة والمشارط الصغيرة في التعقيم حبة ساخنة.
    2. بريوارم التربسين 0.25% مع حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) و 0.15 مغ/مل ديوكسيريبونوكليسي (الدناز) في حبس عند 37 درجة مئوية. وبالإضافة إلى ذلك، بريوارم المتوسطة الثقافة astrocyte على 37 درجة مئوية، والتي تتألف من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع "خليط المغذيات" F-12 في لحم الخنزير و 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
    3. تخدير الولادة اليوم 0 أو الجراء الفئران سبراغ داولي يوم 1 بتعريضها لظروف باردا، و euthanize بقطع الرأس. قياس دبوس الرأس إلى مرحلة استخدام 19 مم إبرة توضع في الآنف عرفت العينين.
    4. جعل شق مع مشرط أسفل الوسط الخلفي إلى الأمامي، من قاعدة العنق حتى مجرد وراء العينين. القيام بشق آخر تسير أفقياً من مباشرة خلف العيون أسفل، تشكيل شكل T. استخدام الملقط غرامة لسحب الجلد/الجمجمة الجمجمة قبالة إلى الجانب.
    5. عقد الرئيس بالأنف (مواجهة) بوضع الشق واحد الملقط في فم الحيوان وأخرى على السطح الخارجي. إزالة الدماغ مع مايكرو-ملعقة معقمة ووضعه في واحدة من أطباق بيتري مليئة بحبس مبردة. مكان هذا طبق بيتري على الجليد بعد ذلك فورا، وفي جميع الأوقات ما عدا عندما تكون قيد الاستخدام.
    6. يوضع كتلة جرانيت مسبقاً بتخزينها في-20 درجة مئوية أدناه ستيريوسكوبي داخل غطاء تشريح. ضع طبق بيتري مع أنسجة المخ على سطح كتلة الجرانيت للحفاظ على درجة الحرارة المنخفضة أثناء إجراء تشريح. استخدام ستيريوسكوبي كالتوجيه البصرية في جميع أنحاء الخطوات التالية.
    7. إذا المصابيح شمي تظل على حالها، استخراجها بالقطع مع الملقط أو ميكروسكالبيلس. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم ميكروسكالبيل لإزالة المخيخ وجعل شق خط الوسط الذي يفصل نصفي الدماغي. نقل في نصفي الكرة الأرضية مع الملقط إلى طبق بتري يحتوي على حبس الطازجة والمثلجة.
    8. تشريح هياكل midbrain من الداخل من نصفي الكرة الأرضية مع ميكروسكالبيل للحصول على فقط كورتيسيس المنفصلين عن ذويهم. استخدام الملقط غرامة تقشر السحايا، بنية تشبه ورقة، من الأنسجة القشرية ونقل كورتيسيس معزولة إلى طبق بتري جديد مع حبس الباردة. استخدم في ميكروسكالبيل فرم النسيج من أجل زيادة المساحة السطحية لعمل التربسين في الخطوة التالية.
    9. استخدام ماصة باستور نقل كورتيسيس إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل يحتوي على 4 مل بريوارميد التربسين-يدتا (كورتيسيس 8 في كل أنبوبة). تعرض الأنسجة القشرية إلى التربسين-يدتا لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    10. مع ماصة باستور، بعناية إزالة التربسين-يدتا وإضافة 400 ميليلتر من 0.15 مغ/مل الدناز أنا الحل إلى أنبوب الطرد المركزي. تحرض على أنبوب أو دوامة حتى يتم فصل جميع الأنسجة وليست هناك أي قطع الأنسجة المتبقية في السائل. إذا كان من غير الممكن حل تماما في الأنسجة، إزالة الأجزاء المتبقية بطرف ماصة باستور.
    11. إزالة أجهزة الطرد المركزي على أنبوب يحتوي على الحل خلية معزولة في 200 غ س للحد الأدنى 3 المادة طافية مع ماصة باستور دون إزعاج الخلايا. أضف 1 مل من أستروسيتي الثقافة المتوسطة (المحدد في الخطوة 2.1.2) إلى الأنبوب مع ميكروبيبيتي وتحرض على ريسوسبيند وإيجاد حل للمشكلة متجانسة.
    12. نقل 10 مل من أستروسيتي الثقافة المتوسطة مع ماصة مصلية قارورة T-75. إضافة 250 ميليلتر من الحل خلية 1 مل (أعد الخطوة 2.1.11) مع ميكروبيبيتي بقارورة لوحة الدماغ ألجرو واحد يستحق كل الخلايا في قارورة. توزيع حل الخلية خرجوا بالتساوي عبر المتوسط الثقافة وتحرض قارورة لمواصلة تعزيز توزيعاً حتى بلطف.
    13. الثقافة قوارير مطلي في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2. بعد أن وصلت إلى 24 و 72 ساعة في الثقافة، ميكانيكيا تحرض قارورة لفصل أنواع الخلايا غير ملتصقة، مثل الخلايا العصبية و oligodendrocytes.
    14. بعد ذلك، في كل من هذه تيميبوينتس، إجراء تغيير وسائط. عقد قارورة عمودياً حتى وسائل الإعلام الثقافة يكمن في الجزء السفلي لقارورة، لا تغطي الخلايا التقيد بها. نضح المتوسطة الثقافة مع ماصة باستور، الضغط على طرف الماصة ضد الزاوية السفلي لقارورة لتجنب استخراج الخلايا. وضع في قارورة في الموضع الأفقي الأصلي وإضافة 10 مل متوسطة أستروسيتي بلطف فوق الخلايا مع ماصة مصلية.
    15. العودة قوارير للحاضنة بعد كل تغيير الوسائط. بعد تحقيق 90% كونفلوينسي، ميكانيكيا تحرض قارورة مرة أخرى لإزالة أي الخلايا المتبقية غير المنضمة.
    16. ممر في أستروسيتيس بإخراج المتوسطة الثقافة مع فراغ وماصة باستور. إضافة 5 مل من 0.25% التربسين-يدتا مع ماصة مصلية أكثر من الخلايا التقيد بها. بلطف تحرض قارورة لضمان التربسين يغطي كافة الخلايا، واحتضان قارورة لمدة 5-7 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    17. آرو التربسين بإضافة 1 مل من أستروسيتي المتوسطة للخلايا مع ماصة مصلية. استخراج الحل خلية من قارورة مع ماصة مصلية وتحويلها إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل عقيمة. الطرد المركزي الأنبوب في 200 غ س لمدة 3 دقائق.
    18. إزالة المادة طافية مع ماصة مصلية وريسوسبيند أنه في 1 مل من أستروسيتي الثقافة المتوسطة. تحرض أنبوب لضمان الحل خلية يكون متجانساً. حساب عدد الخلايا في الحل مع هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
      ملاحظة: غلة قارورة التي روافد 90% عادة ما يقرب من 3 مليون أستروسيتيس.
    19. إضافة 10 مل من أستروسيتي الثقافة المتوسطة إلى قارورة T-75. إجراء تخفيف 1:4 بنقل 250 ميليلتر من الحل خلية (الخطوة 2.1.18) مع ميكروبيبيتي إلى قارورة T-75 الفعل الذي يتضمن الثقافة المتوسطة. تحرض بلطف لضمان توزيع خلية متجانسة في جميع أنحاء السطح قارورة.
    20. كرر الخطوات 2.1.16-2.1.19 في كل مرة يتحقق كونفلوينسي 90% المرور الخلايا.
  2. عزل الخلايا العصبية القشرية من أجنة الفئران
    1. متابعة استعدادات مماثلة كخطوات 2.1.1 و 2.1.2، باستثناء أن بريوارميد وسائل الإعلام هي وسائل الإعلام ثقافة المشارك، تتألف من المتوسطة نيوروباسال + 0.25% 2% B-27 الملحق (للخلايا العصبية) + + 1% G-5 خالية من المصل ملحق (astrocytes) ل الجلوتامين.
    2. Euthanize الفئران سبراغ داولي يوم الجنينية في الوقت المناسب-الحوامل 18 بالخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون، وتأكيد الإعدام بقطع الرأس.
    3. استخراج أجنة الجرذان وتشريح كورتيسيس عن باقي الأنسجة الدماغية في أطباق بتري تحتوي على حبس على سطح كتلة الجرانيت المثلجة، استخدام ستيريوسكوبي للتوجيه البصرية ومقص معقم وميكروسكالبيل والملقط53 . بعد تشريح المتعاقبة من رؤساء والعقول ونصفي الكرة الدماغي، وكورتيسيس، نقل كل الأنسجة إلى طبق بتري مملوءة بحبس جديدة.
    4. فرم الأنسجة القشرية إلى أجزاء أصغر لزيادة المساحة السطحية التربسين. نقل كورتيسيس 4-6 مع باستور "الماصة؛" لأنبوب مع 5 مل يدتا التربسين بريوارميد والحفاظ على 37 درجة مئوية ننأى بالانسجة. في 5-7 دقيقة يدوياً تحرض على أنبوب لخلط ومنع التثاقل من الأنسجة.
    5. إزالة الأنبوب من 37 درجة مئوية بعد 10 دقائق. كما هو موضح مسبقاً في الخطوة 2، 1، استخراج التربسين-يدتا واستبدال مع 1.8 مل 0.15 مغ/مل الدناز الحل. وبعد ذلك، دوامة الأنسجة حتى الحل يظهر متجانسة، مع لا أجزاء الأنسجة العائمة في السائل.
    6. الطرد المركزي حل الأنسجة منفصلان في 200 غ س لمدة 3 دقائق. بعد إزالة المادة طافية، ريسوسبيند في 2 مل متوسطة الثقافة المشتركة. حساب عدد الخلايا في هذا الحل مع هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
      ملاحظة: هو المحصول المعتاد 3.0-5.0 × 106 خلايا/القشرية نصف الكرة الأرضية.
    7. تعد حلاً خلية جديدة بكثافة 2.0-4.0 × 105 خلايا/مل في وسائل الإعلام ثقافة المشاركة المحددة أعلاه.

3-وضع الكابلات أستروسيتيك داخل الجزئي-الأعمدة

  1. إدارة المحتوى في المؤسسة الأساسية تلفيق
    ملاحظة: إدارة المحتوى في المؤسسة قد تضاف إلى الداخلية المائية الصغيرة-الأعمدة في نفس اليوم الذي سيتم تنفيذ البذر الخلية.
    1. داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، تعد من 1 ملغ/مل حل ذيل الفئران النوع الأول من الكولاجين في مستنبت المشارك في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة. الحفاظ على أنبوب ميكروسينتريفوجي مع حلول إدارة المحتوى في المؤسسة على الجليد في جميع الأوقات ما عدا عند الاستخدام.
    2. 1-2 ميليلتر من حل إدارة المحتوى في المؤسسة مع ميكروبيبيتي على قطاع من ورقة عباد الشمس لتقدير درجة الحموضة في نقل. أضف 1 ميليلتر من 1 هيدروكسيد الصوديوم N (هيدروكسيد الصوديوم) أو حمض الهيدروكلوريك (HCl) مع ميكروبيبيتي لزيادة أو تقليل درجة حموضة حل إدارة المحتوى في المؤسسة، على التوالي، و "الماصة؛" صعودا ونزولاً مجانسة. التحقق من الرقم الهيدروجيني جديدة مع قطاع ورقة عباد الشمس، وإضافة المزيد من حمض أو قاعدة، حسب الحاجة، حتى تصبح مستقرة في حدود 7.2-7.4 درجة الحموضة.
    3. نقل أطباق بيتري من الخطوة 1، 2 إلى غطاء تشريح، ونقل 4-5 مايكرو-أعمدة أو قارب مع الملقط غرامة العقيمة فارغ, عقيمة 35 أو 60 ملم بيتري طبق. استخدام في ستيريوسكوبي للتوجيه، يوضع طرف 10 ميليلتر ميكروبيبيتي في واحدة من نهاية كل العمود الصغير والشفط لإفراغ التجويف فقاعات دببس والهواء. التأكد من عدم وجود فقاعات الهواء مع ستيريوسكوبي لضمان أن المحتوى إضافة في الخطوة التالية يمكن أن تتدفق بحرية عبر التجويف.
    4. رسوم ميكروبيبيتي P10 مع حل إدارة المحتوى في المؤسسة، ومكان ميليلتر 10 تلميح ضد واحدة من نهاية الدقيقة-الأعمدة المائية، وتقديم حل ما يكفي لملء التجويف (حوالي 3-5 ميليلتر)، مراقبة دخول إدارة المحتوى في المؤسسة ستيريوسكوبي. "الماصة؛" خزان صغير (2-4 ميليلتر) لإدارة المحتوى في المؤسسة الحل على حد سواء الصغرى-العمود.
      ملاحظة: دائماً إدارة 4-5 مايكرو-أعمدة أو قارب واحد في وقت واحد لمنع إطالة التجفيف بني، كما قد يؤدي هذا إلى كرومبلينج بنية العمود الصغير. إيمانا راسخا إرفاق الأعمدة الصغيرة المجففة تماما على السطح من أطباق بيتري، مما يحول دون الاستفادة منها لبذر الخلية. لا يمكن إضافة كميات مفرطة من وسائط الثقافة المشتركة (كتدبير الماء) إلى الصغرى-الأعمدة لأن هذا قد يسبب ECM تتدفق خلال فترة الحضانة هو موضح أدناه.
    5. ماصة وسائط ثقافة المشارك في حلقة حول صحن بيتري لتوفير مصدر رطوبة لمنع الأعمدة من الجفاف خلال الاحتضان. احتضان طبق بتري يحتوي على المحتوى التي تحتوي على الأعمدة الصغرى في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 1 لتعزيز البلمرة الكولاجين قبل إضافة الخلايا العصبية و/أو أستروسيتيس.
      ملاحظة: إدارة المحتوى في المؤسسة ينبغي أن تشكل طبقة طلاء السطح الداخلي التجويف جوفاء، بدلاً من نواة إدارة المحتوى في المؤسسة صلبة تشمل الداخلية، اللذين يمكن ملاحظتها ستيريوسكوبي باستخدام. إذا ECM تشكل نواة، تستمر فترة الحضانة حتى يتم ترك الطبقة فقط. مع هذه الطبقة التي شكلت، يمكن ملء الحل خلية أستروسيتي الداخلية للعمود الصغير في خطوات الطلاء.
    6. وخلال فترة الحضانة، إعداد الحل خلية أستروسيتي (كما هو موضح أدناه).
  2. Astrocyte والعصبية البذر في الدقيقة-الأعمدة
    1. ممر astrocytes مطلي (بين سن الرابعة والثانية عشرة) كما هو موضح في الخطوات 2.1.16-2.1.19. بعد إحصاء عدد الخلايا في قارورة، إعداد حل الخلية في كثافة 9.0-12.0 x 105 خلايا/مل حل تعليق في خلية ثقافة وسائل الإعلام.
    2. استخدام ستيريوسكوبي، ضع طرف ميكروبيبيتي P10 في واحدة من نهاية الدقيقة-الأعمدة، ونقل حل خلية كاف (~ 5 ميليلتر) في التجويف ملئه تماما. كما فعلت أعلاه مع إدارة المحتوى في المؤسسة، إضافة الخزانات الصغيرة لحل الخلية إلى طرفي كل عمود الصغرى.
    3. احتضان مطلي الصغرى-الأعمدة على أطباق بيتري في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 1 تعزيز تمسك أستروسيتيس بإدارة المحتوى في المؤسسة. إذا لن يتم إضافة الخلايا العصبية للأعمدة الدقيقة، تابع إلى الخطوة 3.2.5.
    4. بعد انتهاء فترة الحضانة الأولى، إضافة 1-2 ميليلتر من الحل العصبية القشرية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.7 في كلا طرفي الصغرى-الأعمدة مع ميكروبيبيتي، مع التقيد بإطار ستيريوسكوبي. تأكد من أن وسائل الإعلام كافية موجودة في الأطباق تجنب التجفيف، واحتضان مرة أخرى لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 للسماح لالتصاق الخلايا العصبية.
      ملاحظة: حل العصبية القشرية يمكن أيضا إضافة 1-2 أيام بعد تشكيل حزمة، تنفيذ الخطوة 3.2.4 بعد إزالة الوسائط الثقافة بعناية من طبق بيتري مع ميكروبيبيتي.
    5. وبعد التفريخ ملء الفترة، بعناية أطباق بتري يحتوي على مايكرو-الأعمدة مطلي مع 3 أو 6 مل من وسائل الإعلام ثقافة المشارك لاطباق بيتري مم 35 أو 60، على التوالي. المحافظة على الصغير-الأعمدة مطلي في الثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لتعزيز التجميع الذاتي لحزم أستروسيتيك تمت محاذاته، التي ينبغي أن تشكل بنية المجمعة، مثل كبل بعد ح 6-10.
  3. تحقيق الاستقرار في العمارة كبل أستروسيتي
    ملاحظة: بعد تكوين حزم، حوالي 6-12 ح لاستزراع بنيات، نفذ الخطوات التالية لمنع انهيار الهيكل تمت محاذاته للسقالات أستروسيتيك.
    1. في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة، تعد الكولاجين ذيل الفئران 3 مغ/مل أنا الحل في وسائل الإعلام ثقافة المشارك. ضبط الأس الهيدروجيني للحل إلى 7.2-7.4 اتباع الإجراء الوارد في الخطوة 3.1.2. الحفاظ على الكولاجين الأسهم وثقافة المشارك وسائط الإعلام على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال، ووضع الحل الكولاجين مستعدة على الجليد في جميع الأوقات.
    2. قم بإزالة الوسائط من أطباق بتري تحتوي على السقالات أستروسيتيك مع ميكروبيبيتي، تاركة بعض وسائل الإعلام على جانبي الطبق لإنشاء بالوعة رطوبة أن يضمن ترطيب مايكرو-الأعمدة. ضع الطبق تحت ستيريوسكوبي المعونة في التصور.
    3. مع ميكروبيبيتي، تأخذ 2-3 ميليلتر لحل الكولاجين والتفريغ لكل نهاية من الأعمدة-الجزئي، استخدام في ستيريوسكوبي للتوجيه البصرية. تأكد من وجود وسائط كافية حول الجانبين العمل كبالوعة رطوبة حول حواف الطبق في الطبق. احتضان أطباق بيتري مع الدقيقة-الأعمدة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد لتعزيز جيليشن الكولاجين المضافة حديثا.
    4. إضافة 3 أو 6 مل من وسائط الثقافة المشارك ببطء (35 أو 60 ملم بيتري الأطباق، على التوالي) إلى بيتري أطباق مع ماصة، وثقافة الأطباق في حاضنة هوميديفيد في 37 سج و 5% أول أكسيد الكربون2.

4-استخراج حزم أستروسيتيك من المائية الداخلية

  1. تعقيم الزجاج كوفيرسليبس في اﻷوتوكﻻف. تعد حلاً ميكروغرام/مل 20 من بولي-L-يسين (PLL) في الخلية العقيمة ثقافة الصف المياه.
  2. داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، يدوياً نقل كوفيرسليبس زجاج معقمة إلى 10 سم معقم طبق بيتري، وإضافة حل PLL كافية لتغطية كوفيرسليبس.
  3. احتضان كوفيرسليبس، مغطاة بالحل PLL، مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية معطف السطح. إزالة الحل PLL مع ماصة باستير بعد 30 دقيقة يشطف ثلاث مرات بإضافة خلية ثقافة الصف المياه إلى ساترة وإزالتها بواسطة ماصة باستور.
  4. بعد تشكيل حزمة الدبقية تمت محاذاته، نقل العمود الصغير حساسا إلى طبق بتري معقم مع الملقط غرامة العقيمة، وإضافة مجموعة صغيرة من 10 ميليلتر من وسائط الثقافة المشارك مع ميكروبيبيتي منع الجفاف والتأكد من صحة الحزمة. استخراج حزمة أستروسيتيك من العمود الصغير المائية عن طريق سحب بلطف من طرف واحد مع العقيمة الملقط الجراحي، استخدام ستيريوسكوبي للتوجيه البصرية.
  5. عقد حزمة أستروسيتيك مع الملقط، جبل على ساترة المغلفة PLL. فيكس ووصمة عار لبروتوكول أدناه.

5-إيمونوسيتوتشيميستري للدراسات في المختبر

ملاحظة: هذه الدراسة، كانت الأجسام المضادة الأولية أرنب مكافحة الدبقية البروتين فيبريلاري الحمضية (توصيني) (1: 500)، الماوس المضادة-β-tubulin الثالث (1: 500)، أرنب الكولاجين المضادة الأولى (1: 500) والماوس نيستين المضادة (1: 200) وارنب المضادة-فيمنتين (1: 100). وكانت الأجسام المضادة الثانوية حمار 568 الماوس لمكافحة وحمار 568 أرنب المضادة، حمار المضادة أرنب 488 وحمار المضادة الماوس 568 (1: 500 للجميع). وفي جميع الحالات، إضافة إلى حجم ما يكفي كل حل لتغطية الصغرى-الأعمدة تماما.

  1. تعد حلاً 4% فورمالدهايد حجم/حجم (v/v) في x DPBS 1 داخل غطاء الأبخرة كيميائية.
    تنبيه: فورمالدهايد مركب سامة المعروفة لتكون مسببة للسرطان، ويجب التخلص منها في حاوية منفصلة. دائماً التعامل مع هذا المركب داخل غطاء الأبخرة كيميائية واستخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) مثل معطف المختبر وسلامة النظارات والقفازات.
  2. في حالة الصغير-الأعمدة، تجاهل وسائل الإعلام ثقافة من أطباق بتري تحتوي على بنيات مع ماصة باستور دون قصد المص اسطوانات المائية. إضافة حل فورمالدهايد كاف لتغطية الصغرى-الأعمدة أو كوفيرسليبس المحملة (التي تبقى على أطباق بيتري) واحتضانها لمدة 35 دقيقة في 18-24 درجة مئوية.
  3. استخراج الحل فورمالدهايد 4.0% من مايكرو-الأعمدة الثابتة أو كوفيرسليبس مع ماصة مصلية. شطف الصغرى-الأعمدة الثابتة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني بسرعة إضافة وإزالة برنامج تلفزيوني مرتين وثم السماح لهم نقع للمرة الثالثة 10 دقيقة.
  4. حل مصل الحصان العادي (NHS) في برنامج تلفزيوني لتركيز 4% v/خامسا-تحضير حلاً مع المنظفات غير الأيونية بتركيز 0.3% v/v استخدام الحل الصحي المذيب.
  5. قم بإزالة برنامج تلفزيوني من أطباق بتري تحتوي على الصغير-الأعمدة أو كوفيرسليبس مع ماصة. إضافة حل المنظفات 0.3% كاف لتغطية الصغرى-الأعمدة/كوفيرسليبس لمدة 60 دقيقة في 18-24 درجة مئوية إلى بيرميبيليزي الخلايا.
  6. إخراج الحل المنظفات، وشطف مرتين بسرعة مع برنامج تلفزيوني وثلاث مرات مغطس لأدنى 5 حساب حجم المطلوبة من المستشفيات العامة 4% وكل من الأجسام المضادة الأولية لإعداد حل مع تركيزات جسم المطلوب.
  7. إزالة برنامج تلفزيوني من أطباق بتري وإضافة ما يكفي من جسم الأولية (مخففة في 4% دائرة الصحة الوطنية--دببس) الحل لتغطية الصغرى-الأعمدة أو حزم أستروسيتيك المستخرج. تبني بين عشية وضحاها (12-16 ح) في 4 درجات مئوية.
  8. إخراج الحل جسم الأولية وشطف مرتين بسرعة مع برنامج تلفزيوني وثلاث مرات مغطس لمدة 5 دقائق. إعداد الحل جسم الثانوية، في الظلام، ومع كل الأجسام المضادة موجودة في إضعاف 1: 500 في الحل الصحي 4.0%.
  9. احتضان الخلايا مع الحل جسم الثانوية ح 2 في 18-24 درجة مئوية. في جميع أنحاء طوال الوقت للحضانة، تغطي أطباق بتري يحتوي على مايكرو-الأعمدة مع رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء.
  10. إزالة الحل جسم الثانوي وإضافة حل هويشت (01:10، 000) لمدة 10 دقيقة في 18-24 درجة مئوية إلى وصمة عار الأنوية.
    تنبيه: هو هويشت مطفر معروفة التي ينبغي أن يعامل كمسرطن. ولذلك، فإنه يجب التخلص من حاوية منفصلة وينبغي أن تستخدم معدات الوقاية الشخصية في جميع الأوقات عند التعامل مع هذا الوكيل.
  11. شطف مع برنامج تلفزيوني خمس مرات، في كل مرة للحد الأدنى 5-10 وبعد ذلك، وتخزين الأعمدة الصغير الملون في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني، وتغطي برقائق الألومنيوم. في حالة الحزم أستروسيتيك المحملة، إضافة قطره من تصاعد مائي المتوسطة للحزمة، مكان آخر الزجاج ساترة فوق الحزمة الثابتة، وختم كلا كوفيرسليبس بطلاء الأظافر للتخزين على المدى الطويل وتصوير اللاحقة.

6-صلاحية المقايسة مع ميت لايف (كالسين-صباحا/اثيديوم هوموديمير) ستينينج

  1. إعداد الحل كاشف عن طريق إضافة 5 ميكروليتر كالسين صباحا (4 مم في اللامائى ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) و 20 ميكروليتر اثيديوم هوموديمير 1 (اتهد-1) (2 مم في [دمس]/ح2س 1:4 v/v) إلى 10 مل 1 x DPBS. تغطية الحل مع رقائق الألومنيوم أو تخزينها في الظلام لحمايتها من الضوء.
  2. نضح وسائل الإعلام من طبق بتري يحتوي على الأعمدة الدقيقة مطلي مع ماصة باستور، وإضافة حل ما يكفي (إعداد أعلاه) لتغطية بنيات. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2، الحفاظ على طبق بيتري مشمولة بحماية الحل من الضوء.
  3. إزالة الحل مع ميكروبيبيتي أو ماصة باستور. شطف 2-3 مرات مع دببس كما هو موضح في الخطوة 5، 3. الفيضانات أطباق بيتري مع دببس وفقا لحجم الطبق. خلايا الصورة فورا بعد ذلك باستخدام ابيفلوريسسينسي أو تصوير [كنفوكل].
    ملاحظة: التحويل من نفاذية الغشاء كالسين صباحا إلى كالسين من الخلايا النشطة أيضي غلة الفلورية الخضراء من كالسين. وتتميز الخلايا الميتة كاختراق غشاء الخلايا، التي تسمح بدخول اتهد-1 إلى الخلية وملزمة لها للأحماض النووية، مما تسبب في ومضان أحمر.

Representative Results

مرحلة التباين في البداية، تم استخدام الفحص المجهري لرصد التقدم لتشكيل الالتصاق وحزمة astrocyte والاستقرار الشامل سيتوارتشيتيكتوري كدالة للزمن. في 1 ح بعد الطلاء، عثر astrocytes طوال التجويف الصغير-الأعمدة مع مورفولوجيا كروية (الشكل 2A). ح 5، بدأت astrocytes توسيع العمليات والتعاقد، بينما ح 8 خلايا معروضة مورفولوجيا الحاملة لعملية كاملة وتشكيل هياكل تشبه كيبل الموجه على طول المحور الطولي للعمود الصغير (الشكل 2A). جدير بالذكر أن مقارنة بوجود خلايا متفرقة في البداية عبر مايكرو-الأعمدة، ظهرت astrocytes أصيبوا بتشكيل شبكة حزم كثيفة على طول الداخلية (الشكل 2). بعد محاذاة الخلية الأولى، شبكات astrocyte غالباً ما سحبت معا على طول المحور الطولي، تشبه سحاب إغلاق، لتشكيل حزمة كثيفة في وسط العمود الصغير (الشكل 2). تشكيل هذا الهيكل المجمعة يعزى إلى عملية التجميع الذاتي، تمليها جزئيا اختيار الكثافة الصغرى-عمود معرف والخلية. Astrocytes الانحياز وحصلت مورفولوجيا قطبين عند المصنف في الصغرى-الأعمدة مع معرف أقل من 350 ميكرون (الشكل 3B، الأعلى والأوسط، و 3D-3F)49. على العكس من ذلك، أظهرت هذه الخلايا اتجاهية عشوائية عندما استخدم معرف من 1 ملم (الشكل 3B، أسفل)، وهو مشابه للمظهر 2D astrocyte الثقافات معرضة خالية من المصل، اشتركت الثقافة المتوسطة (الشكل 3 ألف، حق). وعلاوة على ذلك، حتى ولو أستروسيتيس لا يزال عرض محاذاة انخفاض كثافة البذر (2.0-3.0 × 105 خلايا/مل أو 2.0-3.0 x 10 خلايا/مم2 3) (الشكل 3)، وتشكل شبكات كثيفة إلا في كثافات عالية (9.0-12.0 × 105 خلايا/مل أو 9.0-12.0 x 102 خلايا/مم3) داخل الأعمدة الدقيقة أسطواني من أبعاد مماثلة (ينظر في الشكل 3B، أعلى)، كما اقترح في البروتوكول49. وكان كمياً البقاء في حزم أستروسيتيك، استخدام مقايسة يعيش الميت، كالنسبة مجال الخلايا الاستشعاع الأخضر (كالسين AM) بالنسبة للمساحة الإجمالية للخلايا الاستشعاع الأخضر (كالسين AM) والأحمر (اتهد-1). كان بقاء حزم أستروسيتيك 97.4%، ومماثلة لاستمرارية 98.2 في المائة من عناصر الثقافة 2D astrocyte (الشكل 4A-4B)، تثبت أن البيئة داخل الأعمدة-الصغرى مناسبة لحيوية أستروسيتي ( الرقم 4E). كما تثبت إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للخلايا الحية والميتة في السقالات أستروسيتيك محاذاة الخلية عموما داخل بنيات (الشكل 4-4 د). بالإضافة إلى ذلك، وضعت أعمدة طويلة جداً الصغرى أستروسيتيك-التحقيق في استقرار حزم astrocyte مع طول كبيرة. حتى على المسافة غير عادية من 3.5 سم، لحقت سيتوارتشيتيكتوري حزم أستروسيتيك الانحياز وكثيفة، والتعاقد مع استمرار طوال طول العمود الصغير (الشكل 5A)، كما يتضح في التكبير في المناطق الصغير-أعمدة (الشكل 5-5 ج).

بمجرد تشكيلها، الحزم ثابت والملون بتقنيات إيمونوسيتوتشيميستري للبروتينات خيوط متوسطة مميزة من الخلايا الدبقية، مثل توصيني، نيستين وفيمنتين. وتؤكد الصور [كنفوكل] مورفولوجية الحاملة لعملية astrocytes والمحاذاة طولية للعمليات (رقم 6 و رقم 7). يتبين تعبير البروتينات الشعيرة المتوسطة في كل الثقافات astrocyte ثنائي الأبعاد (الشكل 7 أ) كذلك حزم astrocyte داخل العمود الصغير (الشكل 6، 7B الرقم-7 د). وباﻹضافة إلى ذلك، الكولاجين تلطيخ إثبات وجود هذا البروتين ECM في الدقيقة-الأعمدة. أستروسيتيس لا تشكل بنية مستمرة مع الكولاجين عند مثقف في بيئة ثنائية الأبعاد (الشكل 8 أ)، بينما يبدو astrocytes التمسك ويعيد الكولاجين موجودة داخل التجويف عند مثقف في الأعمدة الدقيقة، مما يسمح لخلية الانكماش وحزمة تكوين (الرقم 8B). تراكب القنوات توصيني والكولاجين أظهرت أن الكابلات astrocyte يتألف من العمليات المرتبطة محكم مع ألياف الكولاجين طولية (الرقم 8B). ولذلك، وبصرف النظر عن تقدم مرسى، ييفات الكولاجين قد وفرت أيضا تلميحات إضافية اتجاهي أستروسيتيس شكل حزم كثيفة بعد انكماش. وفي بعض الحالات، انكماش الكولاجين astrocyte استمرت، وأسفر عن انهيار الرزمة الانحياز ما يزيد على 12-24 ح بعد تشكيل (الشكل 9 ألف). بغية تثبيت بنية أستروسيتي مثل كبل داخل المائية الصغيرة-الأعمدة، تمت إضافة مصفوفة الكولاجين إضافية إلى نهايات حزمة شكلت بالكامل منع المزيد من الانكماش والانهيار. هذا أسلوب التعزيز يسمح ببقاء الهيكل الكابل المطلوب لمدة 4 أيام على الأقل، مع نافذة أطول من الاستقرار المتوقع (9B الشكل). وعلاوة على ذلك، كانت حزم أستروسيتيك الممثل المستخرجة من العمود الصغير المائية وشنت والثابتة مع 4% فورمالدهايد على الزجاج كوفيرسليبس لتقييم متانة بهم عندما تتعرض قوات التوتر والبيئة الخارجية. حتى بعد الاستخراج والتلاعب المادي إلى أشكال مختلفة (الشكل 10A، 10B)، سوماتى أستروسيتيك وعمليات الحفاظ على محاذاة، المجمعة الصغر مورفولوجيا (الشكل 10)، تسليط الضوء على مرونة السقالة أستروسيتيك الانحياز الذاتي، تشكلت مرة واحدة، حتى إذا غاب الدعم الهيكلي المائية الصغيرة-العمود.

أيضا كانت مثقف الخلايا العصبية القشرية الابتدائي المشترك مع astrocytes داخل الجزئي-الأعمدة استكشاف ما إذا كانت حزم astrocyte قادرة على إثارة التصاق الخلايا العصبية وثمرة نورت. توصيني والبروتين ميكروتوبولي β-tubulin الثالث كانت تستخدم كعلامات محددة ل astrocytes والخلايا العصبية، على التوالي. ويبين الشكل 11 ألف أن astrocytes المصنف المشترك مع الخلايا العصبية القشرية كانت أيضا قادرة على العارضة العمليات وتشكيل حزم تمت محاذاته. ويبدو الخلايا العصبية قد انضمت تفضيلي لحزم أستروسيتي، منذ كل إيجابية β-tubulin الثالث تلطيخ مترجمة شارك مع توصيني (التراكبات في الشكل 11 باء-ج 11). لإظهار خصائص التجدد من بنيات أستروسيتيك، كانت مطلي الخلايا العصبية القشرية (الرقم 12B) داخل العمود الصغير المائية 2 يوما بعد أن كانت astrocytes مطلي (الشكل 12 ألف). الخلايا العصبية إرفاق حزمة أستروسيتي، ومدد نيوريتيس مباشرة على امتداد مساحات أستروسيتيك. مواصلة التفتيش أظهرت ثمرة نورت الموجهة باتجاه كابل أستروسيتيك، بينما في مناطق لم تكن موجودة فيها المسالك astrocyte، شوهدت نيوريتيس تنمو بشكل غير منظم (الشكل 12). هذه الملاحظات تثبت أن البروتوكول النتائج في الشبكات أستروسيتيك تمت محاذاته، وقادرة على البقاء والقوية التي يمكن أن تعمل كمسارات الحية القابلة للغرس تعزيز ثمرة الالتصاق ونورت العصبية.

Figure 2
رقم 2: يبين الفحص المجهري برايتفيلد تشكيل حزم Astrocyte داخل المائية الصغيرة-الأعمدة مع مرور الوقت- (أ) مورفولوجيا Astrocyte كدالة للزمن بعد الطلاء: أستروسيتيس (ح 1) كروية الشكل ومتناثرة في جميع أنحاء البناء؛ astrocytes (ح 5) الشروع في عملية التمديد وانكماش؛ astrocytes (ح 8) الانحياز والتعاقد. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر-(ب) حزمة تشكيل في سقالة ممثل إضافية مرور الوقت: (ح 1) في البداية astrocytes كروية ولا يحمل العمليات؛ ويتكون (24 ساعة) حزمة كثيفة من عمليات أستروسيتيك. تغيير حجم أشرطة = 300 ميكرون (يسار) و (يمين) 500 ميكرومتر. تماما شكلت (ج) حزمة أستروسيتيك ح 24 بعد الطلاء، يظهر تأثير "زيبيرينج"، حيث إرفاق نهايات كبل طرفي متميزة من جدران التجويف. شريط المقياس = 1000 ميكرون.

Figure 3
الشكل 3: القطر الصغير-العمود الداخلي وتأثير كثافة الخلية التجميع الذاتي لحزم المنحازة للقطبين أستروسيتيس. (A) أستروسيتي 2D الثقافات مع الوسائط التي تحتوي على المصل (يسار) ووسائط الثقافة المشتركة خالية من المصل (يمين) إظهار مورفولوجيا تأثير غير عملية وعملية متعددة، على التوالي. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. (ب) Astrocytes المصنفة في كثافة عالية (9.0-12.0 x 105 خلايا/مل) في الأعمدة الدقيقة مع معرف من 180 و 350 ميكرون شكل الانحياز حزم بالنسبة للمحور الطولي، بينما معرف النتائج 1 ملم في أستروسيتيس عرض متعددة، الوسط والعمليات في جميع أنحاء قطر التجويف. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر (أعلى، وسط) و 150 ميكرومتر (أسفل). الانحياز Astrocytes (ج) المصنف في معرف ميكرومتر 350 مايكرو-عمود في الكثافة السكانية المنخفضة (2.0-4.0 × 105 خلايا/مل)، ولكن غير المجمعة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(د) عندما مطلي في معرف ميكرومتر 350 مايكرو-عمود في كثافة الخلية منخفضة أو متوسطة، astrocytes الحصول مورفولوجيا قطبين. تغيير حجم أشرطة = 300 ميكرون. () مربع في د عرض التكبير/تصغير في سلاسل من القطبين astrocytes هذا النموذج داخل المائية الصغيرة-الأعمدة. شريط المقياس = 300 ميكرون. (و) مثال astrocyte القطبين الفردية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: البقاء أستروسيتيس بعد تشكيل حزمة داخل المائية الصغيرة-العمود- (أ-ب)، (ج-د) إعادة البناء [كنفوكل] 3D عرض استمرارية الخلايا في جميع أنحاء ثقافات مستو والانحياز حزم أستروسيتيك، على التوالي، كما جزيئي مع هوموديمير كالسين-صباحا/اثيديوم تلطيخ (الأخضر--لايف الخلايا؛ خلايا الأحمر-الميت). () التقدير الكمي للخلايا الحية والميتة أسفرت عن نسبة مئوية مماثلة من astrocytes يعيش الميت عند مثقف على الأسطح 2D والصغرى-الأعمدة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
رقم 5: مرحلة التباين صورة تمثيلية طويلة جداً الانحياز أستروسيتيك حزمة داخل المائية الصغيرة-العمود- (أ) حزمة تشكيل طوال طول عمود الصغيرة 3.5 سم. شريط المقياس = 1,000 ميكرومتر. (ب-ج) أعلى التكبير التكبير الإضافية إظهار astrocyte المحاذاة في مناطق مختلفة على طول بأكملها بناء، المقابلة للمربعات في A. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: إيمونولابيلينج السقالات أستروسيتيك يوضح المحاذاة طولية من عمليات أستروسيتيك. (أ) إعادة الإعمار [كنفوكل] حزمة أستروسيتيك عرض تلطيخ توصيني (الأحمر؛ واليسار) ونوى (هويشت؛ الأوسط) وتراكب لكلتا القناتين (يمين). (ب) أعلى التكبير التكبير في حزمة أستروسيتيك في منطقة محاصر تصاريح تصور سيتوارتشيتيكتوري أستروسيتيس داخل الأعمدة الصغيرة. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: وصف لحزم أستروسيتيك الممثل عن طريق إيمونوسيتوتشيميستري- (أ-ب) Astrocytes مثقف على الأسطح 2D وتبذر في المائية الصغرى-أعمدة تعبر عن علامات مماثلة أستروسيتيك توصيني (أحمر) وفيمنتين (أخضر). (أ) إعادة الإعمار [كنفوكل] ثقافة astrocyte مستو 2D عرض القنوات المنفصلة والمدمجة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) [كنفوكل] صور حزمة أستروسيتيك، تأكيد التعبير عن العلامات وعرض محاذاة أستروسيتي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج-د) مثقف داخل الأعمدة الصغيرة Astrocytes أيضا التعبير عن خيوط متوسطة البروتينات نيستين (أحمر) وفيمنتين (أخضر). (ج) [كنفوكل] صورة حزمة أستروسيتيك. شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(د) أعلى التكبير التكبير في ج. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: أستروسيتيس في حزم الانحياز وثيقا تتفاعل مع مصفوفة الكولاجين المتعاقد عليها، طولية، بدلاً من الترتيب غير النظامية من الكولاجين في 2D الثقافات. وكانت الزنزانات إيمونولابيليد لمراقبة astrocytes (توصيني؛ الأحمر)، ونوى (هويشت؛ الأزرق) والكولاجين (أخضر). (A) أستروسيتي 2D الثقافات مع الكولاجين في 1 ملغ/مل تظهر محازى astrocytes والكولاجين موزعة عشوائياً. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. الكولاجين (ب) هو اقتلع من جدران التجويف الصغير-العمود ويتم التعاقد على شكل مصفوفة الانحياز هو جزء من حزمة أستروسيتيك. شريط المقياس = 150 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: "الكولاجين إضافية" يمكن استخدامها لتحقيق الاستقرار في "هيكل كابلات أستروسيتيك". حزم (A) شكلت حوالي 6 ح بعد تصفيح astrocytes داخل المغلفة بالكولاجين المائية الصغيرة-أعمدة. متى تم تشكيل حزم، تمت إضافة أعلى تركيز (3 ملغ/مل) الكولاجين إلى نهايات العمود الصغير لتحول دون انكماش الكابلات أستروسيتيك. في بنيات لا تستقر مع الكولاجين إضافية، قد بدأ حزم الكولاجين أستروسيتيك العقد قبل ح 18، والكابلات astrocyte قد انهارت تماما خلال 24 ساعة. لم يلاحظ هذا الانكماش عندما تعززت الحزم مع الكولاجين 3 ملغ/مل. شريط المقياس = 1,000 ميكرومتر. (ب) التكبير في حزمة أستروسيتيك أنهار غير معززة بالكولاجين 3 ملغ/مل. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ج) التكبير في المناطق من أعمدة-الصغرى تعزيزه الكولاجين. وأبقى على مورفولوجيا حزمة astrocyte طوال بأكملها العمود الصغير. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
رقم 10: استخراج الحزم أستروسيتيك من العمود الصغير وتصاعد في بولي-L-يسين المغلفة الزجاج كوفيرسليبس يدل على متانة الأسلوب. (أ) التباين مرحلة استخراج الصورة من عدة حزم أستروسيتيك، التلاعب في هجاء الكلمة "بنسلفانيا". استخراج التعمير [كنفوكل] (ب) من نفس حزم الملون لعلامة أستروسيتيك توصيني (أحمر) ونواة الخلية (هويشت؛ الأزرق). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. التكبير (ج) المنطقة محاصر في ب يظهر السقالات أستروسيتيك، حتى عندما تتلاعب في الأشكال غير النظامية، الاحتفاظ التشكل بين القطبين، والانحياز وسيتوارتشيتيكتوري المجمعة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. علما بأن من المرجح أن أي الاختلافات الهيكلية بين المرحلة والصور [كنفوكل] قطعة أثرية نيات التحول بسبب الشطف أثناء إجراء إيمونوسيتوتشيميستري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 11
رقم 11: التمسك بالخلايا العصبية وتمديد نيوريتيس على طول حزم Astrocyte المنحازة في السقالات شارك مثقف العصبية-أستروسيتي- (أ) صورة المرحلة-على النقيض من حزمة أستروسيتيك المصنفة العصبية. شريط مقياس = 300 ميكرون-(ب)-(ج) الخلايا العصبية لوحظ أن تلتزم بحزم أستروسيتيك وتمديد نيوريتيس على طول اتجاه الكابل (هويشت الأزرق؛ توصيني-أخضر؛ Β-tubulin الثالث-الأحمر). تغيير حجم أشرطة = 200 و 100 ميكرومتر، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 12
الشكل 12: كابلات Astrocyte بمثابة "السقالة يعيشون" لتوجيه ثمرة نورت. عمليات إعادة البناء [كنفوكل] عرض منطقة عمود صغيرة تتكون من الخلايا العصبية المصنف حوالي 2 يوما بعد تشكيل الحزمة. (أ) حزم astrocyte توصيني إيجابية، (ب) β-tubulin الثالث-إيجابية الخلايا العصبية و (ج) دمج جميع القنوات، بما في ذلك هويشت الملون الأنوية (أزرق). علما بأن الخلايا العصبية أظهرت المحاذاة نورت عندما انضمت إلى مناطق العمليات astrocyte الانحياز (الأسهم)، بينما الخلايا العصبية لم تنضم إلى محاذاة astrocytes المعرض العشوائي على ما يبدو (أي الاتجاه المتعدد) نورت ثمرة (رؤوس الأسهم). (د) التكبير في منطقة يظهر اتجاهية ثمرة نورت. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

عند مقارنة إلى بيئة داعمة أكثر من السندات الإذنية، يقتصر الجهاز العصبي المركزي خاصة في التعامل مع العواقب الضارة نيوروتروما ونيوروديجينيريشن. بعد إهانة خطيرة للجهاز العصبي المركزي الثدييات، تتشكل ندبة الدبقية، تتألف من مجموعة أساسية خلايا تليفية والتهابات تحيط به ميشوورك كثيفة من أستروسيتيس رد الفعل غير منظم التي تفرز إكسون تثبيط ثمرة بروتيوجليكانس14. هذه الندبة بمثابة عقبة الفيزيائية والكيميائية الحيوية ضد تجديد إكسون النهايات12. وعلاوة على ذلك، يمتلك CNS الثدييات الكبار مصادر محدودة من الخلايا العصبية الجديدة لاستعادة الخلايا المفقودة بعد الصدمة أو نيوروديجينيريشن، حيث تقتصر المراكز العصبية سفز والمغزلي المسنن هيبوكامبال وأخرى يحتمل أن تكون عادة غير نشط 54من المناطق. استراتيجية مثالية أن يتحايل على كل من الجوانب للنقاهة القدرات المحدودة للجهاز العصبي المركزي، الذي فشل النهج الحالي لمعالجة. على هذا النحو، وضعت مجموعتنا البحثية المستندة إلى astrocyte السقالات تهدف إلى عرض مسارات المعيشية للهجرة العصبية نحو المناطق التي تفتقر إلى الخلايا العصبية وتمديد تسترشد تجديد الأقماع النمو إكسون. حزم أستروسيتيك الانحياز الواردة داخل الداخلية الكولاجين الصغرى-عمود [اغروس] تشكل هذه السقالات أستروسيتيك الحية. بريفورميد فرقا كبيرا من التقليدية ومادة بيولوجية-يستند إلى الخلية الاستراتيجيات المستخدمة لإصلاح الجهاز العصبي المركزي والتجديد أن سيتوارتشيتيكتوري من هذه الثوابت تماما في المختبر لمحاكاة عدة في فيفو التوجيه القائم على إطلاق وأبنية السقالات. على سبيل المثال، أثناء التطور الجنيني، مسارات إطلاق شعاعي بمثابة السقالات الحية للخلايا العصبية الجديدة يهاجرون إلى اللحاء الجديد، والخلايا الدبقية التوسط من أجل تمديد المستهدفة من دور رائد في محاور عصبية متنكرين ركائز منقوشة و/أو خلايا تنطوي35 ،،من3839. كما تنتج إطلاق شعاعي الجنينية في منطقة سوبفينتريكولار أستروسيتيس التي تشكل أنابيب الدبقية الانحياز طوليا، التي تهاجر neuroblasts وأرزان ارتباط المستقبلات في السلاسل-تشكيل من سفز على المكشوف41. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت في بعض غير الثدييات أنه، في أعقاب المؤتمر الوطني السيادي الضرر، درجة أكبر من التجديد ممكن بسبب تشكيل ترتيب منظم والانحياز أستروسيتيك44. على سبيل المثال، الزرد الكبار قادرون على تجديد تلك الحبال الشوكي بعد هجرة الخلايا الدبقية غير ناضجة إلى موقع الآفة، والتمايز في التشكل بين القطبين، واستطالة العمليات الدبقية لسد الآفة، تشكيل مسار هذا توجه محاور عصبية تجديد45. نيات هندسيا للانحياز حزم أستروسيتيك قد تكون قادرة على لخص هذه الآليات وتقديم إشارات الهيكلية وقابل للذوبان المطلوبة لإطلاق وساطة الهجرة العصبية و التجدد إكسون35. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب إدراج astrocytes المعيشة، يمكن أن يقدم هذه الثوابت بنشاط العظة البيئية المطلوبة على أساس التغذية المرتدة من البلد المضيف.

لدينا تقنية، محاذاة astrocyte عملية التجميع الذاتي يتوقف على الرموز المادية، وتفاعلات خلية خلية تعزيزها عن طريق القطر الصغير-العمود الداخلي، وتركيز الكولاجين، وكثافة البذر. ميزة أخرى جذابة من هذا الأسلوب هو حجمه حجم ميكرون، مما قد يسمح بغرس كسبها في المناطق المتضررة الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، النتائج المعروضة في هذه المخطوطة تثبت أن بنيات التي تم الحصول عليها مع البروتوكول تمتلك صلاحية عالية والتعبير عن خيوط متوسطة البروتينات توصيني ونيستين وفيمنتين، بغض النظر عن العمر astrocyte كما يحددها عدد مرور . بينما توصيني وفيمنتين يتم التعبير عنها في أستروسيتيس غير ناضجة وناضجة، نيستين يقتصر أساسا على خلايا غير متمايزة أو غير ناضجة، مع نضج upregulating إطلاق التعبير عن توصيني وتناقص إنتاج نيستين45، 55-الدراسات السابقة قد أظهرت أن astrocyte التغييرات في السلوك مع التقدم في السن، لكن كان ينظر التعبير متسقا من البروتينات الشعيرة المتوسطة، وكذلك تجميع عبر مجموعة من الأرقام (الفقرات 4-12) مرور56. وعرضت السقالات أستروسيتيك أيضا لتحقيق طويل جداً، السنتيمتر-مقياس أطوال في المختبر، مما يوحي بأن هذا الأسلوب يمكن تكييفها لأطوال إصابة متميزة وهندستها مصادفة في فيفو. وعلاوة على ذلك، يحمل حزم أستروسيتيك الانحياز السلامة الهيكلية ملحوظة والاستقرار، كما يتم الاحتفاظ بهم سيتوارتشيتيكتوري مثل كبل حتى بعد التعرض للاستخراج من مايكرو-الأعمدة. المعيشة على أساس astrocyte السقالات أيضا دعم الخلايا العصبية الالتصاق ونورت ثمرة، يعزز إمكانات هذا الأسلوب لتعزيز العصبية موجه الهجرة واكسون الإرشاد لإصلاح الجهاز العصبي المركزي.

حزم أستروسيتيك الانحياز ترد داخل الداخلية كولاجينوس انكاسيمينت المائية أنبوبي الواقية. تصنيع السقالات أستروسيتيك يبدأ مع الجمعية الصغرى-العمود بإدراج أنبوب شعري إبرة الوخز بالإبر والمص السائل [اغروس] في ذلك. [اغروس] كان مادة بيولوجية المحدد بسبب لها خصائص خاملة، وتوافق مع الحياة، والميكانيكية التي تسيطر عليها بسهولة، الخصائص الفيزيائية، والكيميائية الحيوية49. تركيز [اغروس] في المائية قد يكون متغيراً هاما منذ خلايا الإحساس بالمنبهات الميكانيكية من هذه الركيزة (مثل صلابة) والاستجابة مع التغيرات داخل الخلايا57. معايير التصميم لهذه الجزئية-الأعمدة تتضمن مسامية عالية بما يكفي للسماح لملائمة للنقل الجماعي، ولكن صغيرة حجم المسام ما يكفي لحظر ثمرة عملية الأفقي؛ استيفاء هذه المعايير بمقياس نانو المفتوحة-المسامية في [اغروس] في تركيز المستخدمة في هذا البروتوكول. واختير التركيز [اغروس] في هذا البروتوكول أيضا سبب لها الاستقرار، وسهولة التعامل، والتشابه في الخواص الميكانيكية ل البيئة الدماغ58. دراسة جديرة بالذكر هو موضع الإبرة داخل الأنبوب الشعرية المركزية. في كثير من الأحيان، قد تكون الإبرة مائلة قليلاً أو المشردين خلال هذه العملية، مما تسبب في التجويف أن يقع قبالة مركز قريب للجدران الخارجية بعد إزالة جيلاتيون والعمود الصغير [اغروس] من الأنبوب. لتجنب هذا الأمر، ينبغي أن تكون الإبرة المستقيمة، وينبغي الإبقاء على الجمعية الغطاس-أنبوب-إبرة في وضع عمودي في حين يجري [اغروس] الاحتفاظ بالإبرة على طول المحور المركزي. ضمانات مركزية دقيقة التجويف astrocytes الانحياز بين الجدران [اغروس]؛ التجويف أكثر عرضه لتمزيق إذا كان الموقع الأقرب إلى الحافة الخارجية للأسطوانة. وباﻹضافة إلى ذلك، مسافة كافية بين التجويف والجدار الخارجي قد فوائد الحماية أثناء وبعد زرع الأعضاء (بشرط أن لا تتم إزالة بنيات أستروسيتيك من قبل العمود الصغير زرع). هذه المرحلة الأولية من تلفيق سقالة أستروسيتيك بالغ الأهمية لنجاح هذه التقنية، كاختيار إبرة قطرها أمر حاسم أستروسيتي السليم سوما/عملية المحاذاة وكابل التجميع الذاتي. وجدنا أن المحاذاة astrocyte كان يعتمد عكسيا على معرف العمود الصغير، مع مجموعة معرف مثلى لمحاذاة الخلية وتكوين حزم astrocyte قوية يجري 180 إلى 350 ميكرون (الشكل 3). وبالمثل، قد تجلى سابقا أن الخلايا العصبية مباشرة على ثمرة على طول اتجاه انحناء الركازة الحد الأدنى لتقليل عملية الانحناء59،60، والآليات المماثلة من المحتمل في العمل يؤثر على أستروسيتي المحاذاة في النظام لدينا49. وبالإضافة إلى انحناء التي تؤثر على محاذاة astrocyte، وجدنا أن 180 إلى 350 ميكرون معرف النطاق أسفرت astrocytes الحصول مورفولوجيا قطبين49، خلافا للنموذج متعدد الأقطاب النجمية، ولاحظ مع معرف من 1 ملم أو عندما كانت مثقف أستروسيتيس في 2D (الشكل 3). ومن المرجح أن هذه التغيرات المورفولوجية العميقة إلى مورفولوجيا astrocyte قطبين تغيير خصائصها الفسيولوجية كذلك؛ على سبيل المثال، قد أعرب عن هذه أستروسيتيس عوامل سيكريتابل البديلة أو علامات خلية السطحية التي قد يكون من المفيد للتجدد، ولكن هذا يستحق مزيدا من الوصف. إجمالاً، النتائج التي توصلنا إليها تدلل على أن اختيار مناسب للرموز المادية، مثل انحناء السطح، لا بد من محاكاة سيتوارتشيتيكتوري الأصلية في المعيشة أستروسيتيك السقالات.

بناء السقالات أستروسيتيك العائدات مع إدراج متسلسلة الحل ECM الكولاجين و astrocytes القشرية في الداخلية أجوف الصغرى-الأعمدة. التجويف الداخلي من العمود الصغير فهي مغلفة بالكولاجين لدعم بقاء astrocyte ومرفق، وتشكيل حزمة الانحياز، نظراً لعدم قدرة [اغروس] لدعم نورت ثمرة61بشكل مستقل. الكولاجين بتركيز 1 ملغ/مل واختير نظراً لتحديد الدراسات السابقة أن تركيزات أقل وأعلى أدى إلى عدم التصاق وعدم استقرار إدارة المحتوى في المؤسسة، على التوالي49. وهكذا، كما هو متوقع، تركيز الكولاجين له آثار كبيرة على فعالية هذا الأسلوب. وعلاوة على ذلك، حل إدارة المحتوى في المؤسسة يتكون من النوع فقط أنا الكولاجين. بالمقارنة مع laminin وركائز المغلفة ماتريجيل للثقافات أستروسيتيك 2D، astrocytes مطلي على نوع أنا الكولاجين أظهر الالتصاق الأمثل و تشكيل شبكة62. وقت حضانة تستخدم البلمرة الكولاجين قبل الخلية البذر أيضا خطوة أساسية في البروتوكول. لقد وجدنا سابقا أن عندما تم تسليم الخلايا العصبية في الوقت ذاته مع ECM أونبوليميريزيد إلى [اغروس] الصغرى-الأعمدة، كانت ثمرة نورت المخفضة وتليف محواري المشاهدة47، ومن الممكن أن يمدد هذه النتائج إلى أستروسيتيس كذلك. منذ الكولاجين مطلوب لتشكيل الالتصاق وحزمة أستروسيتي، ينبغي تصور وجود إدارة المحتوى في المؤسسة في جميع أنحاء البناء وعدم وجود فقاعات الهواء أو جيوب فارغة وأكدت مع التقنيات المجهرية.

ويختتم البروتوكول astrocyte الطلاء، فترة حضانة لضمان التصاق الخلية للكولاجين، والثقافة قصير الأجل لتشكيل سيتوارتشيتيكتوري الهدف. واستخدمت أستروسيتيس بين الممر رقم 4-12، كما أنها عرضت قوي الإصلاح تجميع والكولاجين أستروسيتيك. كما قدمت هذه أستروسيتيس النمط الظاهري ناضجة تتكون من > 95% ثقافات نقية63،64 مع قليل من أي تلوث الخلايا العصبية. على النقيض من الثقافات أستروسيتي العادية، التي توظف المتوسطة المحتوية على مصل (يسارالشكل 3A، )، تستخدم تقنية لدينا المتوسطة خالية من المصل للسماح أستروسيتيس أن تعتمد مورفولوجيا الحاملة للعملية (الشكل 3 ألف، الحق ) وشكل حزم سوماتى الانحياز والعمليات داخل65،،من62أعمدة الصغرى-66. فيما يتعلق بالخلية البذر التركز، أسفرت تركيزات أعلى في نطاق الخلايا5 9.0-12.0 x 10/مل، مع معرف من 350 ميكرون، تشكيل حزم محكم معبأة مع المرافقين الكولاجين يعيد البناء، في حين تم تفريق astrocytes أكثر ، لكن لا يزال الانحياز، عندما استخدمت تركيزات أقل (الشكل 3). وهكذا يؤثر تأثير بذر التركيز على التفاعلات خلية خلية درجة محاذاة astrocyte وتشكيل هياكل مثل كبل الملاحظة. هو تصور حقن الحل خلية في التجويف عموما استخدام ستيريوسكوبي لضمان تسليم متجانسة عبر طول العمود الصغير، الذي حاسم بالنسبة لتشكيل حزمة المستمر. بعد البذر، فترة الحضانة الأولية قبل الفيضانات مع ثقافة وسائل الإعلام أمر لا غنى عنه لتأمين رسو السفن أستروسيتيس إلى إدارة المحتوى في المؤسسة. يجوز تعديل المدة إذا astrocytes الهروب من بنيات، شريطة أن يتم هوميديفيد بنيات بما فيه الكفاية للحيلولة دون تجفيف. الصور المرحلة-على النقيض من السقالات أستروسيتيك كدالة للوقت أظهر أن شبكة حزم أستروسيتيك تمت محاذاته 8 ح، بصدد يجري تشكيلها. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ المفرزة من إدارة المحتوى في المؤسسة من الجدار التجويف، وأن الانكماش الذي أعقب ذلك، ورابطة ضيق بين الخلايا والكولاجين المتعاقد عليها عندما كانت المسمى بنيات للكولاجين وتوصيني كما هو موضح في الشكل 8. هذه الظاهرة هو ربما نتيجة لقوات الهوس أستروسيتيك فصل الكولاجين من الجدران، واستنادا إلى تقارير سابقة لقدرة تنتجها الخلايا الليفية مثل الخلايا الدبقية لتوليد القوى التي تشوه ركائز مرنة وإعادة عرض مصفوفة قدرة أستروسيتيس في astrocyte فقط واشتركت الثقافات العصبية-أستروسيتي28،49،،من6768. على وجه التحديد، من عواقب حركية astrocyte والتفاعل بوساطة إنتغرين ييفات الكولاجين هو جيل قوات كافية لعقد17،ييفات69. عموما، ينتج تنفيذ بروتوكول وصف السقالات الحية تتألف من شبكات التجميع الذاتي الكثيفة، والانحياز أستروسيتيك كابل تشبه هياكل تلخيص الركازات المادية الحالية في عدة مراحل لتطوير الجهاز العصبي المركزي.

بالإضافة إلى القضايا الفردية التي يمكن أن تنشأ في جميع أنحاء البروتوكول، تمتلك تقنية سقالة أستروسيتيك عوائق أخرى قد تؤثر على قدرته على إصلاح في الجهاز العصبي المركزي. على سبيل المثال، مرهون بالنجاح النهائي لهذه التقنية في اللدونة العصبي والتكامل الوظيفي من السقالة أستروسيتيك مع الدوائر المضيف. وهي إمكانية استجابة التحريضية التي يمكن التصدي لسمات برو-التجدد الحزم أستروسيتيك المتصلة بغرس هذه السقالات. جميع التقنيات المستندة إلى زرع لديها القدرة على تمزق حاجز الدم في الدماغ، ويسبب تسلل الخلايا التحريضية، نظراً للقرب بين الخلايا العصبية والشعيرات الدموية في الأنسجة47. وفي هذه الحالة، يمكن استخدام العمود الصغير المائية أو نظام انكاسيمينت آخر للسقالات أستروسيتيك كوسيلة للإفراج عن العوامل المضادة للالتهابات لتقليل الاستجابة الالتهابية التي تسيطر عليها. في البداية، حزمة أستروسيتيك الانحياز لم تكن مستقرة داخل العمود الصغير، كالقوى التي تجبر محاذاة الخلية وإعادة عرض مصفوفة أدت في نهاية المطاف إلى انهيار سيتوارتشيتيكتوري المرجوة بعد 1-2 يوم في الثقافة. ومع ذلك، أعاق انهيار الانكماش وحزمة إضافية تقديم تعزيزات إضافية للحزم في نهايات العمود الصغير عن طريق إضافة أعلى تركيز الكولاجين من أجل عقد الحزمة في مكان. تكتيك إضافية يمكن أن توظف تغليف ثانوية، حيث طلاء المائية جديدة يتم تطبيقها على حزم أستروسيتيك الانحياز كما أنها يتم سحبها من مايكرو-الأعمدة. ومن المحتمل أن إيصال شبكات astrocyte تمت محاذاته إلى الدماغ ستستقر أيضا بنيات بسبب الالتصاقات خلية خلية بين الخلايا المضيفة وبناء على الطول، على الرغم من أن هذا سوف تحتاج إلى اختبار مباشرة في الدراسات المستقبلية.

وبناء على ذلك، تهدف الجهود في المستقبل تطوير أسلوب زرع فعال الذي يضمن الاستقرار والحماية من حزمة أستروسيتيك أثناء وبعد الولادة في فيفو بغية السماح للهجرة العصبية، إصلاح، و التجديد في CNS المصابين. وقد أثبتنا سابقا نجاح زرع الخلايا العصبية/محواري المستندة إلى الصغرى-مزح، التي تشترك في مخطط انكاسيمينت بنيات أستروسيتيك، في مسارات كورتيكوثالاميك، أسفر عن بقاء والهيكلية التكامل مع البلد المضيف الأنسجة على الأقل حتى شهر 146،47. وهكذا، يمكن أن تستغل متانة الكابلات بعد الاستخراج من الأعمدة-الصغرى. وفي هذه الحالة، سيكون بمثابة المائية [اغروس] سرير الثقافة الأولية للحث على التجميع الذاتي وثم سيتم إزالتها من انكاسيمينت كبل أستروسيتيك وحقنها مباشرة في الدماغ باستخدام إبرة رقيقة الجدران. التشوه أستروسيتي سبب قوي ميكانيكية أثناء استخراج من العمود الصغير المائية لم يحترم، وليس من المتوقع. الأعمال السابقة دراسة آثار تشوه الميكانيكية في مفاعليه astrocyte تشير إلى أن أي تشوه الناتجة لن تطبق سريعاً ما يكفي لحمل أستروسيتوسيس أو عملية استطالة62،70. للتقليل من الأضرار التي لحقت بأنسجة المخ واستجابة الالتهابات الممكنة، يمكن مزروع الحزم داخل المائية استخدام تكنولوجيا إبرة أقل نمواً سابقا للصغير-مزح. في هذه المنهجية، وهي مغلفة المائية مع طبقة رقيقة من كاربوكسيميثيلسيلولوسي التي تسمح بدخول إبرة أقل في الدماغ مما قد يؤدي إلى تضاؤل البصمة التحريضية والتخريبية لغرس47. بعد ذلك، زرع دراسات يمكن أداؤها لتقييم قدرة هذه السقالات للبقاء على قيد الحياة، وتتكامل مع النسيج المضيف، وتشجيع الهجرة العصبية والإرشاد إكسون. خاصة، قد زرع هذه الثوابت مع نهاية واحدة النابعة من منطقة العصبية مثل سفز الوصول إلى ما تجمع من الخلايا الجذعية العصبية، ونيوروبلاستس، في تقليد مباشرة RMS، والطرف الآخر متصل بموقع إصابة يحتمل أن محرك الأقراص الهجرة العصبية وإعادة ملء المنطقة بطريقة أجهزة الاستنشاق.

بعد زرع البروتوكول الأمثل، ويمكن تحسين هذه التقنية في مجالات أخرى. قد لفقت الصغرى-الأعمدة على وجه التحديد مع أستروسيتيس غير ناضجة (مثل إطلاق شعاعي، RMS من نوع الخلايا) أو تعمل الناضجة التي أحدث ديديفيرينتياتيد لزيادة قدرة التجدد المسببة لهذه الثوابت49. في المختبر نماذج من ندبة الدبقية، لم astrocytes ناضجة القدرة على تشكيل مسارات إكسون ثمرة71. على النقيض من ذلك، أظهرت astrocytes غير ناضجة لتعزيز نورت ثمرة في المختبر والتجدد محواري في فيفو عند زرعها في الوقت ذاته مع تشوندرويتيناسي أي بي سي للتصدي لارتفاع مستويات كسبجس في ندبة الدبقية71 , 72-لكي تتزامن مع ظهور شخصية الطب، يمكن وضع أعمدة الذاتي الجزئي أستروسيتيك-بزرع الخلايا الجذعية من مصادر مثل التي يسببها الخلايا الجذعية pluripotent (إيبسكس) والخلايا الجذعية العصبية البشرية (هنسكس). سوف يسمح هذا التعديل هذه السقالات لتعمل كقنوات للفردي وإصلاح مسار محدد والتجدد. وعلاوة على ذلك، استخدام هذه المصادر الخلية قد التحايل بالإمكان مكسبه استجابة يمكن أن يسبب ذلك غرس أستروسيتي. على الرغم من أن الاستمناع يختلف وفقا لخطوط الخلايا اللجنة التوجيهية، من هذه الخلايا نظرياً قادرة على تجنب أو تقليل الاستجابات المناعية عند الزرع، كما اقترح عدم وجود ردود الضارة بعد الجهاز المستمدة من اللجنة التوجيهية غرس في الفئران73،74. وعلاوة على ذلك، هنسكس الذاتي ومشتقاتها أستروسيتيك قمع متمكنة من الاستجابات المناعية75. ونتيجة لذلك، اختﻻق هذه الانحياز astrocyte الشبكات مع الخلايا الجذعية الذاتي قد تكون خطوة مستقبل حاسمة تطبيق هذا الأسلوب أكثر سهولة في الإعداد السريرية.

وبصرف النظر عن التطبيق كقنوات لإصلاح الجهاز العصبي المركزي والتجدد، السقالات المعيشة أستروسيتيك قد تستعمل في المختبر اختبار سرير، مع أو بدون انكاسيمينت المائية استناداً إلى أهداف نموذج اختبار معين. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه الثوابت أستروسيتيك للتحقيق في الظواهر العصبية الحيوية مثل تمديد الهجرة ونورت العصبية توسط astrocytes، استغلال الخصائص يمكن السيطرة عليها والبيئة 3D من السقالات المعيشة كنماذج من في فيفو الظروف. البروتوكول وناقش في هذه المخطوطة مفصلة تلفيق حزم أستروسيتيك الانحياز الذاتي تجميعها في مصفوفة collagenous داخل عمود الدقيقة المائية. أتصدى ميزات الدماغ التشريح والآليات الإنمائية/التجدد، ومسارات الهجرة نيوروبلاست، يكون هذه السقالات أستروسيتيك القابلة للغرس يمكن أن توفر مسارات داعمة لتوجيه الهجرة العصبية ومحور عصبي التوجيه في بيئة خلاف المثبطة للجهاز العصبي المركزي تلف.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وقدم الدعم المالي من المعاهد الوطنية للصحة [U01-NS094340 (كولين) & F31-NS090746 (كاتييار)]، ومايكل ج. فوكس مؤسسة [العلاجية أنابيب برنامج #9998 (كولين)]، بنسلفانيا طب الأعصاب مركز الطيار جائزة (كولين)، مؤسسة العلوم الوطنية [بحوث الدراسات العليا زمالات تأيين-1321851 (ستروزينا)]، وشؤون إدارة المحاربين القدماء [RR & د الجدارة استعراض #B1097--أنا (كولين)]، والبحوث الطبية في الجيش الأمريكي والعتاد الأمر [#W81XWH-13-207004 (كولين) & W81XWH-15-1-0466 (كولين)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter) Lhasa Medical HS.30x40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm) Fisher 21-170J The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser Fisher 21-170J Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N
Micro-spatula Fisher S50821
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11330-032 Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11195 Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups Charles River Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium Invitrogen 21103049 Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement Invitrogen 12587010 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement Invitrogen 17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Incubator Fisher 13 998 076
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip Fisher 12-548-5M
Nail polish Electron Microscopy Sciences (EMS) 72180
Fluoromont mounting medium Southern Biotech 0100-01
Poly-L-lysine Sigma P4707
Phosphate buffered saline Fisher BP3994
Triton X-100 Sigma T8787
Normal horse serum Gibco 16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody Millipore AB5804 Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody Sigma T8578 Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody Abcam ab34710 Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin Millipore AB3400 Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin Millipore AB5326 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody Invitrogen A10042 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM Sigma C1359 4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1 Life Technologies E1169 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO) Sigma 276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope Nikon Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  2. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  3. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  4. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  5. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  6. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  7. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  8. Huebner, E. A., Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  9. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons’ Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  10. Kyungsuk, K., Liu, K., et al. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN / mTOR Pathway. Science. 322, (5903), 963-966 (2008).
  11. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat. Neurosci. 18, (7), 942-952 (2015).
  12. Cregg, J. M., DePaul, M. A., Filous, A. R., Lang, B. T., Tran, A., Silver, J. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp. Neurol. 253, 197-207 (2014).
  13. Buffo, A., Rolando, C., Ceruti, S. Astrocytes in the damaged brain: Molecular and cellular insights into their reactive response and healing potential. Biochem. Pharmacol. 79, (2), 77-89 (2010).
  14. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, (2), 146-156 (2004).
  15. Toy, D., Namgung, U. Role of Glial Cells in Axonal Regeneration. Exp. Neurobiol. 22, (2), 68-76 (2013).
  16. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32, (12), 638-647 (2009).
  17. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16, (10), 3173-3184 (2010).
  18. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  19. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  20. Fry, E. J., Chagnon, M. J., López-Vales, R., Tremblay, M. L., David, S. Corticospinal tract regeneration after spinal cord injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma deficient mice. Glia. 58, (4), 423-433 (2010).
  21. Lin, B., Xu, Y., Zhang, B., He, Y., Yan, Y., He, M. -C. MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury. Exp. Ther. Med. 7, (1), 66-72 (2014).
  22. Bradbury, E. J., Carter, L. M. Manipulating the glial scar: Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84, (4-5), 306-316 (2011).
  23. Vadivelu, S., Stewart, T. J., et al. NG2+ Progenitors Derived From Embryonic Stem Cells Penetrate Glial Scar and Promote Axonal Outgrowth Into White Matter After Spinal Cord Injury. Stem Cells Transl. Med. 4, 401-411 (2015).
  24. Nishimura, Y., Natsume, A., et al. Interferon-beta delivery via human neural stem cell abates glial scar formation in spinal cord injury. Cell Transplant. 22, (12), 2187-2201 (2013).
  25. Guo, Z., Zhang, L., Wu, Z., Chen, Y., Wang, F., Chen, G. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14, (2), 188-202 (2014).
  26. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  27. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  28. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  29. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  30. Morrison, B. I. III, Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  31. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  32. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  33. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  34. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain tissue. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).
  35. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  36. Stiles, J., Jernigan, T. L. The basics of brain development. Neuropsychol. Rev. 20, (4), 327-348 (2010).
  37. Kaneko, N., Marín, O., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, (2), 213-223 (2010).
  38. Hidalgo, A., Booth, G. E. Glia dictate pioneer axon trajectories in the Drosophila embryonic CNS. Development. 127, (2), 393-402 (2000).
  39. Chotard, C., Salecker, I. Neurons and glia: Team players in axon guidance. Trends Neurosci. 27, (11), 655-661 (2004).
  40. Wang, C., Liu, F., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, (11), 1534-1550 (2011).
  41. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, (4), 407-427 (2005).
  42. Zukor, K. A., Kent, D. T., Odelberg, S. J. Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts. Neural Dev. 6, (2011).
  43. Reier, P. J. Penetration of grafted astrocytic scars by regenerating optic nerve axons in xenopus tadpoles. Brain Res. 164, (1-2), 61-68 (1979).
  44. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51, (8), 529-544 (2013).
  45. Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-Dependent Glial Cell Bridges Facilitate Spinal Cord Regeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 32, (22), 7477-7492 (2012).
  46. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  47. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  48. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  49. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  50. Alexander, J. K., Fuss, B., Colello, R. J. Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth. Neuron Glia Biol. 2, (2), 93-103 (2006).
  51. Hsiao, T. W., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes alignment and reactivity on collagen hydrogels patterned with ECM proteins. Biomaterials. 39, 124-130 (2015).
  52. Alekseeva, T., Katechia, K., Robertson, M., Riehle, M. O., Barnett, S. C. Long-term neurite orientation on astrocyte monolayers aligned by microtopography. Biomaterials. 28, (36), 5498-5508 (2007).
  53. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  54. Conway, A., Schaffer, D. V. Biomaterial microenvironments to support the generation of new neurons in the adult brain. Stem Cells. 32, (510), 1220-1229 (2014).
  55. Barry, D., McDermott, H. Differentiation of radial glia from radial precursor cells and transformation into astrocytes in the developing rat spinal cord. Glia. 50, (3), 187-197 (2005).
  56. Pertusa, M., Garcia-Matas, S., Rodriguez-Farre, E., Sanfeliu, C., Cristofol, R. Astrocytes aged in vitro show a decreased neuroprotective capacity. J. Neurochem. 101, (3), 794-805 (2007).
  57. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, (5751), 1139-1143 (2005).
  58. Balgude, A. P., Yu, X., Szymanski, A., Bellamkonda, R. V. Agarose gel stiffness determines rate of DRG neurite extension in 3D cultures. Biomaterials. 22, (10), 1077-1084 (2001).
  59. Smeal, R. M., Tresco, P. A. The influence of substrate curvature on neurite outgrowth is cell type dependent. Exp. Neurol. 213, (2), 281-292 (2008).
  60. Smeal, R. M., Rabbitt, R., Biran, R., Tresco, P. A. Substrate curvature influences the direction of nerve outgrowth. Ann. Biomed. Eng. 33, (3), 376-382 (2005).
  61. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  62. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L. A., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regen. Med. (2016).
  63. McCarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of Separate Astroglial and Oligodendroglial Cell Cultures from Rat Cerebral Tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  64. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  65. Kim, S. U., Stern, J., Kim, M. W., Pleasure, D. E. Culture of purified rat astrocytes in serum-free medium supplemented with mitogen. Brain Res. 274, (1), 79-86 (1983).
  66. Morrison, R. S., de Vellis, J. Growth of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, (11), 7205-7209 (1981).
  67. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Dev. Biol. 90, (2), 383-398 (1982).
  68. Hsiao, T. W., Swarup, V. M., Kuberan, B., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes specifically remove surface-adsorbed fibrinogen and locally express chondroitin sulfate proteoglycans. Acta Biomater. 9, (7), 7200-7208 (2013).
  69. Phillips, J. B., Bunting, S. C. J., Hall, S. M., Brown, R. A. Neural tissue engineering: a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 11, (9), 1611-1617 (2005).
  70. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  71. Filous, A. R., Miller, J. H., Coulson-Thomas, Y. M., Horn, K. P., Alilain, W. J., Silver, J. Immature astrocytes promote CNS axonal regeneration when combined with chondroitinase ABC. Dev. Neurobiol. 70, (12), 826-841 (2010).
  72. Johansson, S., Strömberg, I. Guidance of dopaminergic neuritic growth by immature astrocytes in organotypic cultures of rat fetal ventral mesencephalon. J. Comp. Neurol. 443, (3), 237-249 (2002).
  73. Jiang, Z., Han, Y., Cao, X. Induced pluripotent stem cell (iPSCs) and their application in immunotherapy. Cell. Mol. Immunol. 11, (1), 17-24 (2014).
  74. Wang, L., Cao, J., et al. Immunogenicity and functional evaluation of iPSC-derived organs for transplantation. Cell Discov. 1, (2015).
  75. Wolmer-Solberg, N., Cederarv, M., Falci, S., Odeberg, J. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response. Stem Cell Res. 2, (1), 56-67 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics