तीन आयामी ऊतक दोहराऊंगा विकासात्मक तंत्र के लिए गठबंधन Astrocyte नेटवर्क इंजीनियर और तंत्रिका तंत्र पुनर्जनन की सुविधा

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

हम स्वयं के विकास का प्रदर्शन इकट्ठा, longitudinally के तीन आयामी बंडलों गठबंधन astrocytic सोमता और प्रक्रियाओं के भीतर एक उपंयास झालर । इन इंजीनियर "रहने पाड़", माइक्रोन पैमाने व्यास का प्रदर्शन अभी तक लंबाई में सेंटीमीटर का विस्तार, परीक्षण के रूप में काम कर सकते है बिस्तरों neurodevelopmental तंत्र का अध्ययन करने या neuroregeneration की सुविधा के द्वारा ंयूरॉंस माइग्रेशन और/ pathfinding.

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Katiyar, K. S., Winter, C. C., Gordián-Vélez, W. J., O'Donnell, J. C., Song, Y. J., Hernandez, N. S., Struzyna, L. A., Cullen, D. K. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (131), e55848, doi:10.3791/55848 (2018).

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Abstract

Neurotrauma और neurodegenerative रोग अक्सर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की सीमित क्षमता के कारण स्थाई स्नायविक घाटे में परिणाम के लिए खो ंयूरॉंस की जगह और axonal रास्ते पुनर्जीवित । हालांकि, तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान, न्यूरॉन्स माइग्रेशन और axonal विस्तार अक्सर अन्य कोशिकाओं द्वारा गठित रास्ते के साथ होते हैं, "रहने पाड़" के रूप में संदर्भित. इन तंत्र का अनुकरण करने की मांग और एक रणनीति है कि सीएनएस के निरोधात्मक पर्यावरण दरकिनार डिजाइन, इस पांडुलिपि एक प्रोटोकॉल के लिए ऊतक इंजीनियर astrocyte आधारित बनाना "रहने पाड़" प्रस्तुत करता है । इन constructs बनाने के लिए, हम एक उपंयास के लिए स्व astrocytes प्रेरित झालर योजना कार्यरत है द्विध्रुवी longitudinally के घने तीन आयामी बंडलों-संरेखित सोमता और प्रक्रियाओं में इकट्ठे । सबसे पहले, खोखले hydrogel सूक्ष्म कॉलम इकट्ठे हुए थे, और भीतरी लुमेन कोलेजन extracellular-मैट्रिक्स के साथ लेपित था । असंबद्ध सेरेब्रल cortical astrocytes तो बेलनाकार माइक्रो-कॉलम के लुमेन में दिया गया था और, < 350 µm के एक महत्वपूर्ण भीतरी व्यास पर, अनायास स्वयं गठबंधन और घने बंडलों से मिलकर लंबे समय फाइबर की तरह केबल का उत्पादन करने के लिए अनुबंध astrocyte प्रक्रियाओं और कोलेजन तंतुओं मापने < 150 µm व्यास में अभी तक लंबाई में कई सेमी का विस्तार । इन इंजीनियर रहने वाले पाड़ प्रदर्शित > 97% सेल व्यवहार्यता और वस्तुतः विशेष रूप से मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन glial-fibrillary अंलीय प्रोटीन (GFAP), vimentin, और nestin का एक संयोजन व्यक्त astrocytes के शामिल थे । इन गठबंधन astrocyte नेटवर्क के लिए एक स्वतंत्र सब्सट्रेट प्रदान करने के लिए पाया गया न्यूरॉन्स लगाव और गठबंधन neurite विस्तार. इसके अलावा, इन constructs अखंडता और संरेखण बनाए रखने जब hydrogel झालर से निकाले, उंहें सीएनएस आरोपण के लिए उपयुक्त बना । ये क्षेऽ का निर्माण संरचनात्मक रूप से vivo मेंप्राकृतिक रूप से होने वाली glial-आधारित "रहने पाड़ों" के प्रमुख cytoarchitectural तत्वों का अनुकरण । जैसे, इन इंजीनियर रहने पाड़ों परीक्षण के रूप में सेवा कर सकते है-बिस्तरों इन विट्रो में neurodevelopmental तंत्र का अध्ययन करने या neuroregeneration की सुविधा के द्वारा ंयूरॉन प्रवासन और/या axonal में सीएनएस अध: पतन के बाद vivo .

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) एक सीमित क्षमता को नुकसान और/या न्यूरॉन्स और axonal मार्ग है कि ऐसे दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (TBI), स्ट्रोक, रीढ़ की हड्डी की चोट (विज्ञान), और neurodegenerative रोग के रूप में शर्तों के साथ की शिथिलता प्रभावहीन है1 ,2,3,4,5. सीएनएस में Neurogenesis मस्तिष्क में क्षेत्रों की एक सीमित संख्या के लिए प्रतिबंधित है, खो ंयूरॉंस की बहाली में बाधा6,7। इसके अतिरिक्त, सीएनएस में खो axonal रास्ते का पुनर्जनन निर्देशित मार्गदर्शन की कमी के कारण अपर्याप्त है, वृद्धि अवरोधकों की उपस्थिति, और प्रतिक्रियाशील astrogliosis तंत्रिका ऊतक के लिए निंनलिखित क्षति2,8, 9,10. Astrocytes आमतौर पर आयन homeostasis, न्यूरोट्रांसमीटर मंजूरी, synapse गठन, और neurovascular युग्मन के साथ न्यूरॉन्स की सहायता करने में विविध कार्य किया है11. फिर भी, तंत्रिका ऊतक को हल्के नुकसान के बाद, astrocytes आणविक, संरचनात्मक, और कार्यात्मक परिवर्तन से गुजरना हो सकता है के रूप में वे एक hypertrophic राज्य के लिए संक्रमण11। गंभीर neurotrauma के जवाब में, इन परिवर्तनों के परिणामस्वरूप एक penumbra के साथ एक निशान के गठन में प्रतिक्रियाशील astrocytes और एक घाव कोर जिसमें टूटना रक्त-मस्तिष्क बाधा से लीक ल्यूकोसाइट्स शामिल है (BBB), microglia, oligodendrocytes, व fibroblasts११,१२,१३. ये प्रतिक्रियाशील astrocytes, मध्यम रेशा प्रोटीन और chondroitin सल्फेट proteoglycans (CSPGs), जो तंत्रिका पुनर्जनन12में बाधा की बढ़ती अभिव्यक्ति की एक आकृति विज्ञान, अव्यवस्थित प्रक्रियाओं और प्रदर्शनी की वृद्धि हुई । हालांकि glial निशान शुरू में मदद करता है BBB अखंडता को बहाल करने और आसपास के स्वस्थ ऊतकों के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया के संचरण से बचने, यह axon पुनर्जनन12के खिलाफ एक भौतिक और जैव रासायनिक बाधा के रूप में कार्य करता है,14 ,15,16. उदाहरण के लिए, axons है कि मुठभेड़ glial निशान प्रदर्शन बल्ब अपक्षयी विकास शंकु और स्टंट विकास12। इसके अलावा, astrocytic की प्रक्रिया की चोट के बाद axons17पुनः उत्पन्न करने के विस्तार में बाधा उत्पन्न करता है । इन निरोधात्मक विशेषताओं का परिणाम अक्सर स्थाई शारीरिक और स्नायविक दोष है कि रोगियों को गंभीर neurotrauma, TBI और विज्ञान सहित के बाद पीड़ित में प्रकट होता है ।

बाह्य सीएनएस में कार्यात्मक उत्थान का सामना करना पड़ रहा चुनौतियों के बावजूद, axons को पुनर्जीवित करने के लिए एक आंतरिक क्षमता के अधिकारी के लिए दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, glial निशान के साथ संपर्क में अपक्षयी विकास शंकु के गतिशील प्रकृति पता चलता है कि इन अंत अपनी क्षमता को बनाए रखने के लिए12का विस्तार । नतीजतन, यह माना जाता है कि axonal पुनः वृद्धि के लिए एक मुख्य बाधा पोस्ट सीएनएस के निरोधात्मक वातावरण है और यह है कि glial scarring को कम करने के माध्यम से एक अधिक स्वतंत्र वातावरण प्रदान करने और/या निशान भर में अपक्षयी पुलों प्रदान होगा लाभप्रद. दरअसल, पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि सीएनएस न्यूरॉन्स पुलों के रूप में परिधीय तंत्रिका भ्रष्टाचार का उपयोग कर एक घाव के माध्यम से axons का विस्तार करने में सक्षम थे, जो axon पुनर्जनन12के लिए एक और अधिक अनुकूल वातावरण वर्तमान,18, 19. कई अंय रणनीतियों इस vestigial अपक्षयी क्षमता का दोहन करने के लिए पीछा किया गया है । उदाहरण के लिए, सेल विकास के विभिंन चोट मॉडलों में संकेत रास्ते के हेरफेर axonal पुनर्जनन और glial निशान कमी10,20,21में हुई है । इसके अतिरिक्त, अध्ययनों से पता चला है कि chondroitinase एबीसी, जो CSPGs में चीनी श्रृंखला के बहुमत से सट के साथ उपचार, CSPGs के निरोधात्मक प्रभाव को कम करने के लिए सक्रिय द्वारा स्रावित astrocytes22। उत्साहजनक परिणाम के बावजूद, इन तरीकों विकास शंकु, जो संभवतः ंयायपालिका पुनर्जनन12में परिणाम कर सकते है के मार्गदर्शन निर्देशित प्रदान नहीं करते हैं, और भी ंयूरॉंस के नुकसान के लिए खाते में नहीं है । सेल आधारित दृष्टिकोण glial निशान के प्रभाव को दुर्गम और खो कोशिकाओं, विशेष रूप से ंयूरॉंस भरपाई करने के प्रयास में उपयोग किया गया है । कुछ समूहों astrocytes न्यूरॉन्स में विभेदित प्रतिक्रियाशील है, जबकि दूसरों को चोट क्षेत्र को फिर से बसाने और axon पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए सीएनएस घावों में तंत्रिका जनक कोशिकाओं प्रत्यारोपण किया है23,24, 25. हालांकि, स्टेम सेल प्रत्यारोपण अकेले कम जीवित रहने की दर, गरीब एकीकरण, और क्षतिग्रस्त ऊतक में मामूली प्रतिधारण द्वारा सीमित है5. इसके अलावा, इन सेल आधारित रणनीतियों के लिए लंबी दूरी axonal इलाकों, विशेष रूप से एक नियंत्रित तरीके से बहाल करने में विफल । इसलिए, अन्य दृष्टिकोण के साथ संयोजन में, विभिन्न तंत्रिका और जनक कोशिकाओं और विकास कारकों के लिए वितरण वाहनों के रूप में पता लगाया जा रहा है26। डिजाइन नियंत्रण के एक उच्च डिग्री-आधारित दृष्टिकोण सुविधा का निर्माण करने के लिए कि विशिष्ट शारीरिक, haptotaxic, और chemotaxic तीन आयामी (3 डी) लक्ष्य मेजबान ऊतक के microenvironment में मौजूद cues नकल का उत्पादन करने के लिए27, 28,29,30,31,३२,३३,३४. इन पर्यावरणीय संकेतों के प्रजनन, प्रत्यारोपण कोशिकाओं के लिए सर्वोपरि है मूल आकृति विज्ञान, प्रसार, प्रवास, और संकेतन, अन्य neurobiological विशेषताओं के बीच29पेश करने के लिए । इन लाभप्रद गुणों के बावजूद, पारंपरिक कोशिका से परे उंनति के लिए बीज बोने की एक साथ लंबी दूरी की axonal पुनर्जनन निर्देश को बढ़ावा देने और खो ंयूरॉंस की जगह की आवश्यकता है ।

एक आशाजनक वैकल्पिक दृष्टिकोण पर आधारित है तंत्रिका ऊतक इंजीनियर "रहने पाड़", जो अन्य कोशिका से अलग कर रहे हैं आधारित एक अनुरूप cytoarchitecture के साथ तंत्रिका कोशिकाओं के रहने की उपस्थिति के कारण दृष्टिकोण है कि देशी neuroanatomy का अनुकरण और/ विकासात्मक तंत्र लक्षित प्रतिस्थापन, पुनर्निर्माण, और तंत्रिका सर्किट4के उत्थान की सुविधा के लिए,३५। पाड़ों के डिजाइन के लिए विचार phenotypes और तंत्रिका कोशिकाओं के स्रोतों, साथ ही साथ यांत्रिक/भौतिक संपत्तियों और जैव रासायनिक संकेतों के किसी भी साथ के संयोजन से तय की संरचना में शामिल है३५। इन विट्रो मेंनिर्माण के बाद, इन रहने वाले पाड़ vivo में सेल-आसंजन अणुओं और chemotactic और neurotrophic संकेतों को सक्रिय रूप से विनियमित तंत्रिका सेल प्रवासन और राज्य के आधार पर axon वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए प्रत्यारोपित किया जा सकता है और ३५reअपक्षय प्रक्रियाओं की प्रगति । Glial कोशिकाओं के रहने वाले पाड़ के इंजीनियर cytoarchitecture के लिए एक आधार के रूप में इन कोशिकाओं vivo मेंविभिंन विकासात्मक तंत्र मध्यस्थता के बाद सेवा कर सकते हैं । मस्तिष्क के विकास के दौरान, नए ंयूरॉंस बेसल निर्देशित प्रवासन३६,३७के लिए रहने वाले पाड़ के रूप में विकासशील cortical प्लेट की ओर वेंट्रिकुलर क्षेत्र से रेडियल glia द्वारा विस्तारित प्रक्रियाओं पर निर्भर हैं । इसके अलावा, विकास शंकु का विस्तार करने के लिए खुद को आकर्षक और क्रीमी glial guidepost कोशिकाओं द्वारा उठाए गए संकेतों संवेदन द्वारा उंमुख दिखाया जाता है, और तथाकथित "अग्रणी" axons को पूर्व पैटर्न के साथ विस्तार से सही लक्ष्य तक पहुंचने का सुझाव दिया जाता है glial पाड़ो३५,३८,३९. इस प्रकार, glial कोशिकाओं अग्रणी axons के मार्गदर्शन के लिए आवश्यक हैं, जो बाद में axon के रूप में सेवा आधारित "रहने पाड़" के प्रक्षेपण निर्देशित करने के लिए "अनुयाई" axons । इसके अलावा, glia-मध्यस्थता विकास तंत्र postnatally बनाए रखने के लिए दिखाया गया है, के रूप में neuroblasts rostral प्रवासी धारा (RMS) का पालन करने के लिए subventricular क्षेत्र से नेविगेट करने के लिए (SVZ), वयस्क मस्तिष्क में neurogenesis के कुछ शेष क्षेत्रों में से एक, घ्राण बल्ब (ओबी)४० RMS में इन neuroblasts glial ट्यूब (चित्र 1a-1), जो longitudinally-संरेखित astrocytic प्रक्रियाओं, सीधे सेल-सेल आसंजन और स्थानीयकृत घुलनशील कारकों३७के माध्यम से शामिल है के भीतर माइग्रेट करें, ४१. अंत में, जबकि स्तनधारियों में सीएनएस नुकसान बाधित astrocytic प्रक्रिया एक glial निशान है कि शारीरिक रूप से axonal पुनर्जनन17, कई गैर स्तनधारी प्रणालियों एक हानिकारक glial निशान के गठन की कमी के गठन की व्यवस्था का कारण बनता है । बल्कि, गैर स्तनधारी प्रजातियों के glial कोशिकाओं को और अधिक संगठित, गठबंधन पैटर्न है कि घायल क्षेत्र के माध्यम से गाइड के रूप में उपयोग किया जाता है बनाए रखने के17,४२,४३। उदाहरण के लिए, गैर में स्तनधारी विज्ञान मॉडल, axons घाव पार glial पुलों के साथ निकट सहयोग में विकसित करने के लिए दिखाया जाता है, axonal पुनर्जनन और कार्यात्मक वसूली को सुविधाजनक बनाने के रूप में आयोजित glial पाड़ों के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव ( चित्र 1a -2) ४२ , ४४ , ४५. neuroanatomical सुविधाओं के Recapitulation और विकासात्मक/ऊपर वर्णित इंजीनियर glial के एक नए वर्ग उपज हो सकता है आधारित रहने वाले पाड़ों कि समवर्ती ड्राइव कर सकते है आवर्तक ंयूरॉन प्रवासन और axonal pathfinding अंयथा गैर स्वतंत्र वातावरण के माध्यम से, जिससे संभावित सीएनएस चोट और रोग के साथ जुड़े और axon पथ अध...

हमारे अनुसंधान समूह पहले से पुनर्निर्माण और सीएनएस में axonal इलाकों के उत्थान और परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) के माध्यम से सूक्ष्म ऊतक इंजीनियर तंत्रिका नेटवर्क (माइक्रो-टेननस) और ऊतक के लिए रहने वाले पाड़ के कई प्रकार के डिजाइन किए है इंजीनियर तंत्रिका भ्रष्टाचारियों (TENGs), क्रमशः27,४६,४७,४८। दोनों रणनीतियों स्वाभाविक रूप से नकल पर आधारित हैं । माइक्रो-टेननस शारीरिक-प्रेरित संरचनाओं को संरचनात्मक रूप से डिज़ाइन किया गया है और कार्यात्मक रूप से मस्तिष्क के विशिष्ट न्यूरॉन आबादी को जोड़ने वाले axonal इलाकों को प्रतिस्थापित करते हैं । TENGs axon के विकासात्मक तंत्र का दोहन-axonal पुनर्जनन की सुविधा, उदाहरण "के साथ अनुयाई" axon विकास के साथ "पायनियर" axons, लक्षित मेजबान axonal पुनर्जनन प्राप्त करने के लिए३५,४६,४८। हम हाल ही में रहने पाड़ तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा पर कैपिटल माइक्रो के रूप में एक समान झालर योजना का उपयोग-टेननस और glia से प्रेरणा की मांग आधारित विकास भर में मौजूद तंत्र । यहां, हम विकसित गठबंधन astrocytic एक hydrogel माइक्रो कॉलम४९के कोलेजन लुमेन फैले बंडलों से मिलकर निर्माण । इन astrocytic रहने वाले पाड़ पहले एक केशिका ट्यूब को भरने से विकसित कर रहे हैं-तरल agarose के साथ एक्यूपंक्चर सुई विधानसभा एक बाहरी व्यास (आयुध डिपो) और भीतरी व्यास (आईडी) के व्यास के लिए इसी के साथ एक खोखले बेलनाकार hydrogel बनाने के लिए ट्यूब और सुई, क्रमशः । agarose जमाना और hydrogel केशिका ट्यूब से सूक्ष्म कॉलम के निष्कर्षण के बाद, खोखले इंटीरियर प्रकार मैं कोलेजन के साथ लेपित है astrocyte आसंजन और गठबंधन बंडल गठन के लिए एक पर्यावरण स्वतंत्र की आपूर्ति (चित्र 1b -1) । बाद में, लुमेन मस्तिष्क cortical astrocytes प्रसव चूहा पिल्ले (चित्र 1b-2) से पृथक के साथ वरीयता प्राप्त है । दो आयामी (2d) संरेखण तकनीक है कि बिजली के खेतों, micropatterned खांचे के आवेदन पर निर्भर करते हैं, और extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन पैटर्न के विपरीत, रहने पाड़ तकनीक में astrocyte संरेखण आत्म विधानसभा पर निर्भर करता है ऐसे सब्सट्रेट वक्रता (कॉलम आईडी), कोशिका घनत्व, और कोलेजन एकाग्रता के रूप में नियंत्रणीय चर के अनुसार५०,५१,५२। astrocytes अनुबंध और कोलेजन remodel, और एक द्विध्रुवी प्राप्त, longitudinally-संरेखित आकृति विज्ञान के अनुरूप प्राकृतिक पाड़ों vivo में मनाया (चित्र 1b-3) । दरअसल, हम सक्रिय रूप से इन केबल का उपयोग कर रहे है के रूप में अच्छी तरह से क्षतिग्रस्त सीएनएस के प्रतिकूल वातावरण के माध्यम से axonal पुनर्जनन को सुविधाजनक बनाने के साथ ही स्थानांतरण अपरिपक्व न्यूरॉन्स के लक्षित मार्गदर्शन के लिए भौतिक सब्सट्रेट के रूप में संरचनाओं की तरह, विशेष रूप से स्तनधारी glial निशान (फिगर 1C). इस अनुच्छेद के astrocytic सूक्ष्म कॉलम, चरण इसके विपरीत और इम्यूनोफ्लोरेसेंस की छवियों की उंमीद cytoarchitecture के लिए विस्तृत निर्माण विधि पेश करेंगे, और वर्तमान सीमाओं और भविष्य के निर्देशों पर एक व्यापक चर्चा तकनीक.

Figure 1
चित्रा 1: प्रेरणा, निर्माण प्रोटोकॉल, और गठबंधन Astrocytic नेटवर्क के लिए प्रस्तावित अनुप्रयोगों. () Neurobiological प्रेरणा: (१) तंत्रिकाजन्य subventricular जोन (SVZ) से Neuroblasts उद्भव longitudinally बल्ब (ओबी) की ओर निर्देशित प्रवास के लिए glial प्रवासी धारा (आरएमएस) में rostral संरेखित घ्राण ट्यूब का उपयोग; (2) उभयचर और मछली जैसे गैर स्तनधारियों एक glial पुल है कि एक घाव के सिरों को जोड़ता है के गठन के कारण भाग में तंत्रिका ऊतक क्षति के बाद पुनर्जनन बनाए रखने कर सकते है (जैसे transected रीढ़ की हड्डी) और के मार्गदर्शन के लिए एक पाड़ के रूप में कार्य करता है चूकने axons. () निर्माण सिंहावलोकन: (1) एक माइक्रोन के निर्माण-आकार, खोखले hydrogel ECM के साथ लेपित लुमेन के साथ माइक्रो कॉलम, (2) प्राथमिक cortical astrocytes के सीडिंग प्रसव चूहा पिल्ले से पृथक, (3) longitudinally के आत्म-सभा उंमुख संस्कृति में बंडलों, और (4) भविष्य आरोपण अध्ययन के लिए झालर से बंडल के निष्कर्षण । (C) vivo अनुप्रयोगों में : (1) ये रहने वाले पाड़ तंत्रिकाजन्य केंद्रों से निर्देशित ंयूरॉन प्रवास के लिए इंजीनियर glial ट्यूबों के रूप में सेवा कर सकते है ंयूरॉन की कमी क्षेत्रों को फिर से आबाद; (२) अग्रणी axon मार्गदर्शन के विकासात्मक तंत्र की Recapitulation और गैर-स्तनधारियों में glial पुलों के पुनर्उत्पादक तंत्र के राज्यसत्ता इन astrocytic पाड़ों को गैर-axon के पार स्वतंत्र पुनर्जनन को प्रत्यक्ष करने की क्षमता के साथ- स्तनधारी glial निशान के पर्यावरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु देखभाल और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय और माइकल जे Crescenz बुजुर्ग मामलों चिकित्सा केंद्र में उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित और मानवीय पर NIH सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति में उल्लिखित दिशा निर्देशों का पालन किया गया प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग (२०१५) ।

1. Agarose Hydrogel माइक्रो कॉलम का विकास

  1. एक agarose 3% वजन/खंड (डब्ल्यू/v) agarose के 3 जी वजन से समाधान और यह एक बाँझ चोंच के लिए स्थानांतरित करने के १०० मिलीलीटर Dulbecco की फास्फेट (DPBS) की फॉस्फेट युक्त । चोंच के लिए एक बाँझ चुंबकीय बार जोड़ें, और यह एक गर्म थाली की सतह पर जगह/ अगले चरण में इसकी सामग्री के वाष्पीकरण को रोकने के लिए कवर चोंच रखें ।
  2. गर्मी agarose और १०० डिग्री सेल्सियस के तापमान पर DPBS और 60-120 rpm पर हलचल । आवश्यक के रूप में इन सेटिंग्स को समायोजित करें, और लगातार विघटन प्रक्रिया की प्रगति की निगरानी के रूप में समाधान शुरू में अपारदर्शी से एक स्पष्ट उपस्थिति है कि यह दर्शाता है कि agarose पूरी तरह से भंग कर दिया गया है ।
    सावधानी: गर्म चोंच और समाधान गर्म कर रहे हैं!
  3. के रूप में agarose समाधान गर्म और उभारा है, चार खाली 10 सेमी पेट्री पकवान पुनः प्राप्त और उनमें से दो को DPBS के 20 मिलीलीटर जोड़ें । जगह एक्यूपंक्चर सुई (व्यास: ३०० µm, लंबाई: ४० मिमी), कांच microliter केशिका ट्यूबों (व्यास: ७०१.०४ µm, लंबाई: ६५ मिमी, क्षमता: २५.० µ एल), और एक बल्ब औषधि के अंदर सुरक्षा कैबिनेट । जब तरल agarose समाधान बाहर साफ करता है, लगभग ५० डिग्री सेल्सियस पर लगातार हीटिंग बनाए रखने और agarose के जमाना से बचने के लिए सरगर्मी ।
  4. एक बल्ब मशीन के नीचे खोलने में एक एक्यूपंक्चर सुई परिचय । बाहर करने के लिए उजागर सुई पर एक केशिका ट्यूब डालें । बल्ब मशीन सिलेंडर के रबर खंड में इसका हिस्सा दर्ज करके केशिका ट्यूब सुरक्षित ।
  5. एक खाली पेट्री डिश की सतह के लिए एक micropipette के साथ तरल agarose के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण, और केशिका ट्यूब के एक छोर खड़ी (डाला सुई के साथ) agarose के साथ संपर्क में है, जबकि बल्ब मशीन के रबर टोपी चुटकी ली जा रही है । धीरे बल्ब मशीन टोपी पर दबाव को केशिका ट्यूब में agarose आकर्षित जारी ।
    नोट: केशिका ट्यूबों में तरल agarose के हस्तांतरण तेजी से किया जाना चाहिए । यदि तरल agarose पर्याप्त समय (लगभग ६० s) के लिए पेट्री डिश सतह पर शांत करने के लिए छोड़ दिया है, यह जेल के लिए शुरू होता है, केशिका ट्यूब के साथ agarose के उपयुक्त चूषण को रोकने ।
  6. एक मुक्त पेट्री डिश में एक बल्ब ट्यूब सुई विधानसभा प्लेस, और केशिका ट्यूब के अंदर agarose जेल चलो 5 मिनट के लिए जमना । ध्यान से अपने हाथों से बाहर बल्ब मशीन सिलेंडर में रबड़ डाट के साथ केशिका ट्यूब खींच, सुई छोड़ने और ट्यूब के अंदर जगह में agarose जेल ।
  7. मैंयुअल रूप से धीरे से एक्यूपंक्चर सुई निकालने से यह केशिका ट्यूब से बाहर खींच; नव जम agarose सिलेंडर भी इस प्रक्रिया में ट्यूब से बाहर स्लाइड, अभी भी सुई आसपास के । धीरे बाँझ संदंश की नोक के साथ एक्यूपंक्चर सुई के साथ सूक्ष्म स्तंभ कुहनी से ऊपर नज करने के लिए यह अंत करने के लिए कदम । एक खुले, DPBS युक्त पेट्री पकवान पर सुई प्लेस और संदंश के साथ DPBS में सूक्ष्म कॉलम धक्का ।
    नोट: यदि agarose माइक्रो कॉलम एक्यूपंक्चर सुई के हटाने पर कांच केशिका ट्यूब के भीतर रहता है, धीरे से agarose माइक्रो कॉलम एक 25 मिमी गेज सुई के साथ केशिका ट्यूब के बाहर धक्का और DPBS के साथ पकवान में ।
  8. microscalpels या संदंश एक गर्म मनका नसबंदी का उपयोग कर निष्फल । 4% w/v agarose agarose के 4 जी वजनी और यह DPBS के १०० मिलीलीटर के लिए स्थानांतरित करके बनाओ । गर्मी और हलचल के रूप में १.२ कदम में समझाया एक स्पष्ट 4% तरल agarose समाधान प्राप्त करने के लिए । हीटिंग और निंनलिखित चरणों में समाधान के सरगर्मी बनाए रखें ।
  9. एक विच्छेदन हुड के लिए सूक्ष्म कॉलम युक्त पेट्री व्यंजन हस्तांतरण, और एक खाली पेट्री डिश के लिए ठीक संदंश के साथ एक सूक्ष्म कॉलम चाल । दृश्य मार्गदर्शन और एक microscalpel के लिए stereoscope का उपयोग करने के लिए वांछित लंबाई करने के लिए सूक्ष्म स्तंभों में कटौती । ECM और सेल के अतिरिक्त के दौरान सूक्ष्म स्तंभों की हैंडलिंग की सुविधा के लिए क्षैतिज से ४५o कोण पर बेवल्ड समाप्त होता है दोनों सिरों को ट्रिम करें ।
  10. एक ही पेट्री डिश में तीन और सूक्ष्म स्तंभों के लिए पिछले कदम दोहराएं और प्रत्येक सिलेंडरों के बीच < 3 mm की जुदाई के साथ समानांतर में चार constructs अप लाइन । एक micropipette के साथ 4% agarose समाधान के ५० µ लोड और एक लकीर डालना सूक्ष्म स्तंभ सरणी पर तरल की लाइन/कनेक्ट करने के लिए और चार के समूहों में निर्माण बंडल (इसके बाद बुलाया "सूक्ष्म कॉलम नौकाओं") । सूक्ष्म स्तंभों के सिरों के लिए 4% agarose के आंदोलन से बचें, जो इंटीरियर रोकना हो सकता है, निर्माण के बीच की दूरी को कम करके और agarose जल्दी से एक पतली लाइन में जोड़ने.
    नोट: "नौकाओं" में चार सूक्ष्म कॉलम के समूहों की व्यवस्था करने के लिए astrocytic पाड़ बनाना आवश्यक नहीं है । फिर भी, नौकाओं के लिए निर्माण की प्रक्रिया की गुजारिश की सेवा और एक सुरक्षित तरीका है और स्थानांतरित करने के बाद चरणों में सूक्ष्म कॉलम संभाल प्रदान करते हैं ।
  11. माइक्रो कॉलम नाव 1-2 मिनट के लिए शांत करने के लिए जोड़ा गया 4% agarose के जमाना अनुमति देते हैं । कनेक्ट 4% agarose द्वारा ठीक संदंश के साथ सूक्ष्म कॉलम नाव उठाओ, और कदम 1.1.3 में तैयार अंय DPBS-युक्त पेट्री पकवान को सूक्ष्म कॉलम ले जाएं । वांछित के रूप में शेष सूक्ष्म स्तंभों के साथ और अधिक नावों गढ़े ।
  12. पेट्री सूक्ष्म कॉलम और/या एक सुरक्षा कैबिनेट के लिए नौकाओं युक्त व्यंजन ले जाएं और पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के लिए 30 मिनट के लिए जोखिम के साथ निष्फल ।
    चेतावनी: उपयुक्त सुरक्षा पहनें यूवी के लिए जोखिम को रोकने के लिए ।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर DPBS में सूक्ष्म कॉलम नौकाओं के साथ बर्तन की दुकान, अगर ECM इसके अलावा और सेल चढ़ाना तुरंत बाद में नहीं हो जाएगा, ऊपर 1 सप्ताह तक । यदि निर्माण इस समय सीमा के दौरान इस्तेमाल नहीं कर रहे है सूक्ष्म कॉलम निर्माण कदम दोहराएं ।

2. प्राथमिक सेल संस्कृति और अलगाव

  1. Cortical astrocyte चूहा पिल्ले से अलगाव
    1. निंनलिखित चरणों के लिए तैयार करने में, है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 20 मिलीलीटर जोड़ें ४ १० सेमी पेट्री व्यंजन है कि विच्छेदित ऊतकों के लिए जलाशयों के रूप में काम करेंगे । बर्फ पर सभी व्यंजन रखें । एक गर्म मनका बंध्याकरण में साफ सर्जिकल कैंची, संदंश, सूक्ष्म रंग, और सूक्ष्म नश्तर निष्फल ।
    2. 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और ०.१५ मिलीग्राम/एमएल deoxyribonuclease (DNase) मैं HBSS में ३७ डिग्री सेल्सियस पर के साथ गर्म ०.२५% trypsin । इसके अलावा, ३७ डिग्री सेल्सियस है, जो Dulbecco है हैम एफ 12 पोषक तत्व मिश्रण और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के होते है पर astrocyte संस्कृति मध्यम गर्म ।
    3. Anesthetize प्रसव दिन 0 या दिन 1 Sprague-Dawley चूहा पिल्ले ने उन्हें hypothermic स्थितियों को उजागर करके, और euthanize decapitation । आंखों के लिए पूर्वकाल थूथन में रखा एक 19 मिमी गेज सुई का उपयोग कर एक मंच में सिर पिन.
    4. पूर्वकाल के लिए मध्य पीछे एक स्केलपेल के साथ एक चीरा बनाओ, गर्दन के आधार से सिर्फ आंखों के पीछे तक । एक और बाद में सीधे आंखों के नीचे से नीचे की तरफ जा रहा चीरा, एक टी आकार बनाने ले । ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए कपाल त्वचा खींच/
    5. थूथन द्वारा सिर पकड़ (ऊपर का सामना) जानवर के मुंह में संदंश के एक शूल और बाहर की सतह पर दूसरे रखकर । एक बाँझ माइक्रो रंग के साथ मस्तिष्क निकालें और यह ठंडा HBSS से भरा पेट्री व्यंजनों में से एक में जगह है । बर्फ पर इस पेट्री पकवान तुरंत बाद में और हर समय को छोड़कर जब उपयोग में जगह है ।
    6. उपकररों एक ग्रेनाइट ब्लॉक पहले एक विच्छेदन हुड के अंदर एक stereoscope नीचे-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । ग्रेनाइट ब्लॉक की सतह पर मस्तिष्क के ऊतकों के साथ पेट्री पकवान जगह विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान अपने कम तापमान को बनाए रखने के लिए । निंन चरणों में दृश्य मार्गदर्शन के रूप में stereoscope का उपयोग करें ।
    7. यदि घ्राण बल्ब बरकरार रहते हैं, उंहें संदंश या microscalpels के साथ काटने से निकालें । इसके अलावा, सेरिबैलम को दूर करने के लिए और एक midline दो मस्तिष्क गोलार्द्धों को अलग चीरा बनाने के लिए एक microscalpel का उपयोग करें । संदंश के साथ एक पेट्री डिश ताजा, ठंडा HBSS युक्त करने के लिए गोलार्द्धों हस्तांतरण ।
    8. टुकड़े midbrain संरचनाओं को गोलार्द्धों के अंदर से एक microscalpel के साथ केवल अलग cortices प्राप्त करने के लिए । मेनिन्जेस, एक शीट की तरह संरचना, cortical ऊतक से दूर छील और ठंडे पेट्री के साथ एक नया HBSS डिश के लिए अलग cortices हस्तांतरण करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें । microscalpel के लिए ऊतक कीमा का प्रयोग करें क्रम में अगले कदम में trypsin कार्रवाई के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए ।
    9. एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें एक 15 मिलीलीटर के लिए cortices हस्तांतरण ट्यूब गरम trypsin के 4 मिलीलीटर-EDTA (प्रत्येक ट्यूब में 8 cortices) युक्त । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए trypsin-EDTA के लिए cortical ऊतक बेनकाब ।
    10. एक पाश्चर पिपेट के साथ, ध्यान से हटा trypsin-EDTA और जोड़ने के ४०० µ एल के ०.१५ mg/एमएल DNAse मैं समाधान के लिए केंद्रापसारक ट्यूब । आंदोलन ट्यूब या भंवर जब तक सभी ऊतक असंबद्ध है और तरल में कोई शेष ऊतक टुकड़े कर रहे हैं । यदि यह ऊतक को पूरी तरह भंग करने के लिए संभव नहीं है, एक पाश्चर पिपेट की नोक के साथ शेष टुकड़े को हटा दें ।
    11. 3 मिनट के लिए २०० x g पर असंबद्ध सेल समाधान युक्त ट्यूब केंद्रापसारक । कोशिकाओं को परेशान किए बिना एक पाश्चर पिपेट के साथ supernatant निकालें । astrocyte संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें (चरण 2.1.2 में परिभाषित) एक micropipette के साथ ट्यूब करने के लिए और reसस्पैंड और एक सजातीय समाधान बनाने के लिए आंदोलन ।
    12. एक टी ७५ कुप्पी के लिए एक सीरम पिपेट के साथ astrocyte संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर स्थानांतरण । 1 मिलीलीटर सेल समाधान के २५० µ एल जोड़ें (चरण 2.1.11 में तैयार) कुप्पी के प्रति एक micropipette कोशिकाओं के लिए एक पिल्ला मस्तिष्क के लायक थाली के साथ । निर्वहन सेल समाधान समान रूप से संस्कृति माध्यम में वितरित और धीरे कुप्पी आंदोलन को आगे एक भी वितरण को बढ़ावा देने के ।
    13. संस्कृति ३७ ° c और 5% CO2में एक humidified मशीन में मढ़वाया कुप्पी । संस्कृति में 24 और ७२ ज तक पहुंचने के बाद, इस कुप्पी और oligodendrocytes के रूप में गैर-अनुयाई कोशिका प्रकार, अलग करने के लिए फ्लैक्सी को उत्तेजित करते हैं ।
    14. बाद में, इन timepoints में से प्रत्येक पर, एक मीडिया परिवर्तन करते हैं । कुप्पी को लंबवत रखें तो कल्चरल मीडिया कुप्पी के नीचे, पालने वाली कोशिकाओं को कवर नहीं करने पर निहित है. एक पाश्चर पिपेट के साथ संस्कृति माध्यम महाप्राण, कुप्पी के नीचे कोने के खिलाफ पिपेट की नोक दबाने कोशिकाओं को निकालने से बचने के लिए । मूल क्षैतिज स्थिति में कुप्पी रखें और धीरे से एक सीरम पिपेट के साथ कोशिकाओं पर astrocyte मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    15. एक मीडिया परिवर्तन के बाद मशीन के लिए कुप्पी वापस । ९०% के प्रवाह को प्राप्त करने के बाद, एक बार फिर से किसी भी शेष गैर-पालन कोशिकाओं को हटाने के लिए एक और कुप्पी आंदोलन यांत्रिक ।
    16. एक वैक्यूम और एक पाश्चर पिपेट के साथ संस्कृति माध्यम बाहर ले जाने से astrocytes गद्यांश । पालन कोशिकाओं पर एक सीरम पिपेट के साथ ०.२५% trypsin-EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे trypsin सुनिश्चित करने के लिए कुप्पी आंदोलन सभी कोशिकाओं को शामिल किया गया है, और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर 5-7 मिनट के लिए कुप्पी मशीन2
    17. एक सीरम पिपेट के साथ कोशिकाओं को astrocyte माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बुझाने । एक सीरम पिपेट के साथ कुप्पी से सेल समाधान निकालें और यह एक बाँझ 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । 3 मिनट के लिए २०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
    18. एक सीरम पिपेट के साथ supernatant निकालें और astrocyte संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में इसे पुनर्निलंबित । ट्यूब आंदोलन को सुनिश्चित करने के लिए सेल समाधान सजातीय है । किसी hemocytometer या किसी स्वचालित कक्ष काउंटर के साथ समाधान में कक्षों की संख्या गिनना ।
      नोट: एक कुप्पी कि ९०% है धाराप्रवाह आमतौर पर पैदावार लगभग ३,०००,००० astrocytes ।
    19. एक टी-७५ कुप्पी के लिए astrocyte संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें । एक 1:4 कमजोर करने के लिए सेल समाधान के २५० µ एल स्थानांतरित (कदम 2.1.18) टी-७५ कुप्पी पहले से ही संस्कृति माध्यम से युक्त करने के लिए एक micropipette के साथ प्रदर्शन । धीरे कुप्पी की सतह भर में एक सजातीय सेल वितरण सुनिश्चित करने के लिए आंदोलन ।
    20. दोहराएं चरण 2.1.16-2.1.19 हर बार ९०% प्रवाह कोशिकाओं को पारित करने के लिए हासिल की है ।
  2. चूहा भ्रूण से Cortical ंयूरॉन अलगाव
    1. कदम 2.1.1 और 2.1.2 के रूप में इसी तरह की तैयारी का पालन करें, अपवाद के साथ कि गर्म मीडिया सह संस्कृति मीडिया, Neurobasal मध्यम से मिलकर + 2% B-27 अनुपूरक (ंयूरॉंस के लिए) + 1% जी-5 सीरम मुक्त पूरक (astrocytes के लिए) + ०.२५% L-glutamine ।
    2. Euthanize समय-गर्भवती भ्रूण दिवस 18 Sprague-Dawley चूहों कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation के साथ और decapitation द्वारा मौत की पुष्टि करें ।
    3. चूहा भ्रूण निकालें और टुकड़े cortices पेट्री व्यंजन में मस्तिष्क ऊतक के बाकी हिस्सों से ठंडा ग्रेनाइट ब्लॉक की सतह पर HBSS युक्त, दृश्य मार्गदर्शन के लिए एक stereoscope का उपयोग कर और निष्फल कैंची, microscalpel, और संदंश५३ . सिर, दिमाग, मस्तिष्क गोलार्द्धों, और cortices के क्रमिक विच्छेदन के बाद, एक नए HBSS-भरा पेट्री डिश के लिए प्रत्येक ऊतक हस्तांतरण ।
    4. trypsin के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए छोटे टुकड़ों में cortical ऊतक कीमा बनाना । 4-6 cortices एक पाश्चर पिपेट के साथ एक ट्यूब करने के लिए गरम trypsin-EDTA के 5 मिलीलीटर के साथ स्थानांतरण और बनाए रखने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊतक अलग । 5-7 मिनट पर मैंयुअल रूप से ट्यूब के मिश्रण और ऊतक के झुरमुट को रोकने के लिए आंदोलन ।
    5. 10 मिनट के बाद ३७ ° c से ट्यूब निकालें । के रूप में पहले चरण २.१ में बताया गया है, trypsin-EDTA और विकल्प ०.१५ मिलीग्राम/एमएल DNAse समाधान के १.८ मिलीलीटर के साथ निकालें । बाद में, भंवर ऊतक जब तक समाधान सजातीय प्रकट होता है, कोई ऊतक तरल में तैर टुकड़े के साथ ।
    6. 3 मिनट के लिए २०० x g पर असंबद्ध ऊतक समाधान केंद्रापसारक । supernatant को हटाने के बाद, सह संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में पुनर्निलंबित । किसी hemocytometer या किसी स्वचालित कक्ष काउंटर के साथ इस समाधान में कक्षों की संख्या गिनना ।
      नोट: सामांय उपज है 3.0-5.0 x 106 कक्ष/cortical गोलार्द्ध ।
    7. ऊपर परिभाषित सह संस्कृति मीडिया में 2.0-4.0 x 105 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व के साथ एक नया सेल समाधान तैयार करें ।

3. सूक्ष्म स्तंभों के अंदर Astrocytic केबल का विकास

  1. ECM कोर निर्माण
    नोट: ECM को उसी दिन hydrogel माइक्रो कॉलम के इंटीरियर में जोड़ा जाना है जिसमें सेल सीडिंग का प्रदर्शन किया जाएगा ।
    1. एक एक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में चूहे की पूंछ प्रकार मैं सह संस्कृति माध्यम में कोलेजन का एक 1 मिलीग्राम/ जब उपयोग में के अलावा हर समय बर्फ पर ECM समाधान के साथ microcentrifuge ट्यूब बनाए रखें ।
    2. एक micropipette के साथ ECM समाधान के 1-2 µ एल स्थानांतरण लिटमस पेपर की एक पट्टी पर अपने पीएच अनुमान है । ECM समाधान के पीएच को बढ़ाने या घटाने के लिए एक micropipette के साथ 1 N सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) या हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) के 1 µ एल जोड़ें, और पिपेट के लिए ऊपर और नीचे के लिए नीचे और ऊपर और ऊपर की और ऊपर की और ऊपर की और ऊपर की और एक लिटमस कागज पट्टी के साथ नए पीएच सत्यापित करें और अधिक एसिड या आधार जोड़ने के लिए, आवश्यकतानुसार, जब तक पीएच 7.2-7.4 रेंज में स्थिर है ।
    3. कदम १.२ से एक विच्छेदन डाकू के लिए पेट्री व्यंजन हटो, और 4-5 सूक्ष्म कॉलम या एक नाव बाँझ ठीक संदंश के साथ एक खाली, बाँझ ३५ या ६० mm पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण । मार्गदर्शन के लिए stereoscope का उपयोग करना, DPBS और हवा के लुमेन को खाली करने के लिए प्रत्येक सूक्ष्म कॉलम और सक्शन के एक छोर पर एक micropipette के 10 µ एल टिप उपकररों । stereoscope के साथ हवा के बुलबुले के अभाव की पुष्टि करने के लिए सुनिश्चित करें कि ECM अगले कदम में जोड़ा लुमेन भर में स्वतंत्र रूप से प्रवाह कर सकते हैं ।
    4. ECM समाधान के साथ एक P10 micropipette प्रभारी, hydrogel सूक्ष्म कॉलम के एक छोर के खिलाफ 10 µ एल टिप जगह है, और लुमेन (लगभग 3-5 µ एल) को भरने के लिए पर्याप्त समाधान देने, ECM के साथ stereoscope की प्रविष्टि देख । पिपेट एक छोटा सा जलाशय (2-4 µ एल) ECM समाधान के सूक्ष्म स्तंभ के अंत में या तो ।
      नोट: हमेशा एक समय में 4-5 सूक्ष्म कॉलम या एक नाव का प्रबंधन निर्माण के लंबे समय तक सुखाने को रोकने के लिए, के रूप में यह सूक्ष्म स्तंभ संरचना के crumpling में परिणाम हो सकता है । पूरी तरह से सूखे सूक्ष्म कॉलम मजबूती से पेट्री व्यंजन है, जो सेल बोने के लिए उनके उपयोग से बचाता है की सतह को देते हैं । सह संस्कृति मीडिया की अत्यधिक मात्रा (एक जलयोजन उपाय के रूप में) सूक्ष्म कॉलम में नहीं जोड़ा जा सकता है क्योंकि यह ECM नीचे वर्णित मशीन अवधि के दौरान बाहर प्रवाह करने के लिए कारण हो सकता है ।
    5. पिपेट सह संस्कृति मीडिया पेट्री डिश के आसपास एक अंगूठी में एक नमी सिंक प्रदान करने के लिए गर्मी के दौरान बाहर सुखाने से कॉलम को रोकने के लिए । पेट्री पकवान युक्त ECM-माइक्रो कॉलम युक्त ३७ ° c और 5% CO2 1 h के लिए बहुलकीकरण को बढ़ावा देने के लिए और ंयूरॉंस जोड़ने से पहले/
      नोट: ECM एक परत कोटिंग के रूप में खोखले लुमेन के भीतरी सतह, के बजाय एक ठोस ECM इंटीरियर शामिल कोर, दोनों जिनमें से stereoscope का उपयोग कर मनाया जा सकता है चाहिए । यदि ECM एक कोर रूपों, जब तक केवल परत छोड़ दिया है गर्मी की अवधि जारी है । इस परत के गठन के साथ, astrocyte सेल समाधान चढ़ाना कदम में सूक्ष्म कॉलम के इंटीरियर भर सकते हैं ।
    6. मशीन अवधि के दौरान, astrocyte सेल समाधान तैयार (नीचे वर्णित के रूप में) ।
  2. माइक्रो कॉलम में Astrocyte और न्यूरॉन सीडिंग
    1. मार्ग चढ़ाया astrocytes (चौथे और बारहवें मार्ग के बीच) के रूप में कदम में बताया 2.1.16-2.1.19 । कुप्पी में कोशिकाओं की संख्या की गिनती के बाद, सेल समाधान की एक घनत्व पर तैयार 9.0-12.0 x 105 कक्ष-संस्कृति मीडिया में निलंबित समाधान/
    2. एक stereoscope का प्रयोग, माइक्रो कॉलम के एक छोर पर एक P10 micropipette की नोक जगह है, और लुमेन में पर्याप्त सेल समाधान (~ 5 µ एल) हस्तांतरण करने के लिए पूरी तरह से इसे भरने के लिए । के रूप में ECM के साथ ऊपर किया, सेल समाधान के छोटे जलाशयों प्रत्येक सूक्ष्म कॉलम के दोनों सिरों को जोड़ें ।
    3. ३७ ° c पर पेट्री व्यंजन पर मढ़वाया माइक्रो कॉलम मशीन और 5% CO2 1 h के लिए ECM को astrocytes के लगाव को बढ़ावा देने के लिए । यदि न्यूरॉन्स सूक्ष्म कॉलम में नहीं जोड़ा जाएगा, कदम 3.2.5 के लिए आगे बढ़ना.
    4. प्रारंभिक मशीन अवधि के बाद, stereoscope के अंतर्गत अवलोकन करते हुए, cortical ंयूरॉन समाधान के एक micropipette के साथ सूक्ष्म कॉलम के दोनों सिरों में चरण 2.2.7 में प्राप्त की 1-2 µ एल जोड़ें । सुनिश्चित करें कि पर्याप्त मीडिया बर्तन में मौजूद है सुखाने से बचने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर ४० मिनट के लिए फिर से मशीन ंयूरॉंस के आसंजन के लिए अनुमति देते हैं ।
      नोट: Cortical ंयूरॉन समाधान भी जोड़ा जा सकता है 1-2 दिन बंडल गठन के बाद, सावधानी से एक micropipette के साथ पेट्री डिश से संस्कृति मीडिया को हटाने के बाद कदम 3.2.4 प्रदर्शन ।
    5. मशीन अवधि के बाद, ध्यान से पेट्री व्यंजन को भरने के साथ मढ़वाया सूक्ष्म कॉलम युक्त 3 या 6 ३५ या ६० mm पेट्री व्यंजन, क्रमशः के लिए संस्कृति मीडिया के मिलीलीटर । ३७ ° c और 5% CO2 में संस्कृति में मढ़वाया माइक्रो कॉलम को बनाए रखने के लिए गठबंधन astrocytic बंडलों, जो एक बंडल, केबल की तरह संरचना के रूप में होना चाहिए की आत्म-विधानसभा को बढ़ावा देने के लिए 6-10 ज ।
  3. Astrocyte केबल वास्तुकला का स्थिरीकरण
    नोट: बंडलों के गठन के बाद, लगभग 6-12 संवर्धन के h constructs, astrocytic पाड़ों की संरेखित संरचना के पतन को रोकने के लिए निंन चरणों का पालन करें ।
    1. एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में, एक 3 मिलीग्राम/एमएल चूहे पूंछ कोलेजन मैं सह संस्कृति मीडिया में समाधान तैयार करते हैं । समाधान का पीएच 7.2-7.4 चरण 3.1.2 में उल्लिखित कार्यविधि के बाद समायोजित करें । कोलेजन स्टॉक और सह-संस्कृति मीडिया बर्फ पर बनाए रखें जब उपयोग में नहीं है, और हर समय बर्फ पर तैयार कोलेजन समाधान जगह है ।
    2. एक micropipette के साथ astrocytic पाड़ युक्त पेट्री व्यंजन से मीडिया को हटा दें, डिश के पक्षों पर कुछ मीडिया छोड़ने के लिए एक नमी सिंक कि माइक्रो कॉलम के जलयोजन सुनिश्चित करता है बनाएं । एक stereoscope के तहत पकवान प्लेस दृश्य में सहायता ।
    3. एक micropipette के साथ, ले 2-3 µ एल कोलेजन समाधान और निर्वहन सूक्ष्म कॉलम के प्रत्येक के अंत के लिए, दृश्य मार्गदर्शन के लिए stereoscope का उपयोग कर । पकवान के किनारों के आसपास एक नमी सिंक के रूप में कार्य करने के लिए पक्ष के आसपास पर्याप्त मीडिया है सुनिश्चित करें । ३७ ° c और 5% CO2 में एक humidified मशीन में 30 मिनट के लिए सूक्ष्म कॉलम के साथ पेट्री व्यंजन मशीन नई जोड़ी कोलेजन के जमाना को बढ़ावा देने के लिए ।
    4. धीरे से जोड़ने के 3 या 6 सह संस्कृति मीडिया के (३५ या ६० mm पेट्री व्यंजन के लिए, क्रमशः) एक पिपेट के साथ पेट्री व्यंजन के लिए, और संस्कृति में एक humidified मशीन में पकवान ३७ सी और 5% सह2

4. Hydrogel इंटीरियर से Astrocytic बंडलों का निष्कर्षण

  1. एक आटोक्लेव में काँच का coverslips निष्फल । एक 20 µ जी/मिलि समाधान पाली-एल-lysine (पीएलएल) बाँझ सेल संस्कृति ग्रेड पानी में तैयार करें ।
  2. एक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, मैंयुअल रूप से एक बाँझ 10 सेमी पेट्री डिश के लिए निष्फल गिलास coverslips हस्तांतरण, और coverslips को कवर करने के लिए पर्याप्त पीएलएल समाधान जोड़ें ।
  3. coverslips की मशीन, पीएलएल समाधान के साथ कवर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोट सतह के लिए । एक पाश्चर पिपेट के साथ 30 मिनट के बाद पीएलएल समाधान निकालें coverslip के लिए सेल संस्कृति ग्रेड पानी जोड़कर तीन बार कुल्ला और एक पाश्चर पिपेट के साथ इसे हटाने ।
  4. गठबंधन glial बंडल के गठन के बाद, सूक्ष्म कॉलम बाँझ ठीक संदंश के साथ एक बाँझ पेट्री पकवान के लिए नाजुक हस्तांतरण, और एक micropipette के साथ सह संस्कृति मीडिया के 10 µ एल के एक छोटे से पूल जोड़ने निर्जलीकरण को रोकने और बंडल स्वास्थ्य सुनिश्चित करने के लिए । धीरे से बाँझ शल्य संदंश के साथ एक छोर से खींच कर hydrogel सूक्ष्म स्तंभ से astrocytic बंडल निकालें, दृश्य मार्गदर्शन के लिए एक stereoscope का उपयोग.
  5. संदंश के साथ astrocytic बंडल होल्डिंग, यह एक पीएलएल-लेपित coverslip पर माउंट । फिक्स और नीचे प्रोटोकॉल के साथ दाग ।

5. Immunocytochemistry के लिए इन विट्रो स्टडीज

नोट: इस अध्ययन के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश विरोधी glial अंलीय fibrillary प्रोटीन थे (GFAP) (1:500), माउस विरोधी β-tubulin III (1:500), खरगोश विरोधी कोलेजन मैं (1:500), माउस विरोधी nestin (1:200), और खरगोश विरोधी vimentin (1:100) । माध्यमिक एंटीबॉडी गधा विरोधी थे माउस ५६८, गधा विरोधी खरगोश ५६८, गधा विरोधी खरगोश ४८८, और गधा विरोधी माउस ५६८ (1:500 सभी के लिए) । सभी उदाहरणों में, प्रत्येक समाधान की पर्याप्त मात्रा जोड़ने के लिए पूरी तरह से सूक्ष्म स्तंभों को कवर ।

  1. एक रासायनिक धुएं हुड के अंदर 1x DPBS में एक 4% मात्रा/खंड (v/v) formaldehyde समाधान तैयार करें ।
    चेतावनी: formaldehyde एक विषाक्त यौगिक यलो होना करने के लिए जाना जाता है, और एक अलग कंटेनर में का निपटारा किया जाना चाहिए. हमेशा एक रासायनिक धुएं हुड के अंदर इस यौगिक में हेरफेर और प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मे, और दस्ताने के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग ।
  2. सूक्ष्म कॉलम के मामले में, hydrogel सिलिंडरों को बिना गलती से चूषण करने वाले पाश्चर पिपेट के साथ पेट्री व्यंजन से कल्चर मीडिया को हटा दें । सूक्ष्म कॉलम या घुड़सवार coverslips (दोनों जिनमें से पेट्री व्यंजन पर बने रहते हैं) को कवर करने के लिए पर्याप्त formaldehyde समाधान जोड़ें और 18-24 डिग्री सेल्सियस पर ३५ मिनट के लिए मशीन ।
  3. एक सीरम पिपेट के साथ फिक्स्ड माइक्रो कॉलम या coverslips से ४.०% formaldehyde समाधान निकालें । जल्दी से जोड़ने और दो बार पंजाबियों को हटाने और फिर उंहें 10 मिनट एक तीसरी बार के लिए सोख दे द्वारा पंजाबियों के साथ निश्चित सूक्ष्म कॉलम तीन बार कुल्ला ।
  4. 4% v/v की एकाग्रता के लिए पंजाब में सामान्य हार्स सीरम (एन एच एस) भंग. ०.३% v/वी की एकाग्रता पर गैर ईओण डिटर्जेंट के साथ एक समाधान तैयार विलायक के रूप में एन एच एस समाधान का उपयोग कर ।
  5. एक पिपेट के साथ माइक्रो कॉलम या coverslips युक्त पेट्री व्यंजन से पंजाबियों को हटा दें । कोशिकाओं को permeabilize करने के लिए 18-24 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए माइक्रो कॉलम/coverslips को कवर करने के लिए पर्याप्त ०.३% डिटर्जेंट सॉल्यूशन जोड़ें ।
  6. बाहर डिटर्जेंट समाधान ले लो, और जल्दी से दो बार पंजाबियों के साथ और तीन बार कुल्ला के लिए भिगोने से 5 min. 4% एन एच एस और प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रत्येक वांछित एंटीबॉडी सांद्रता के साथ एक समाधान तैयार करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना ।
  7. पेट्री व्यंजन से पंजाबियों को हटा दें और सूक्ष्म स्तंभों या निकाले गए astrocytic बंडलों को कवर करने के लिए पर्याप्त प्राथमिक एंटीबॉडी (4% एन एच एस-DPBS में पतला) समाधान जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी (12-16 ज) ।
  8. बाहर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान ले लो और जल्दी से दो बार पंजाबियों और तीन बार 5 मिनट प्रत्येक के लिए भिगोने के साथ कुल्ला । माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार, अंधेरे में, प्रत्येक एंटीबॉडी ४.०% एन एच एस समाधान में 1:500 के एक कमजोर पड़ने पर उपस्थित के साथ ।
  9. 18-24 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ कोशिकाओं की मशीन । गर्मी के पूरे समय के दौरान, पेट्री एल्यूमीनियम पंनी के साथ सूक्ष्म कॉलम युक्त व्यंजन को कवर करने के लिए प्रकाश जोखिम से बचने के ।
  10. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें और नाभिक दाग करने के लिए 18-24 ° c पर 10 मिनट के लिए Hoechst समाधान (1:10000) जोड़ें ।
    सावधानी: Hoechst एक जाना-पहचाना mutagen है जिसका इलाज एक यलो के रूप में करना चाहिए । इसलिए, यह एक अलग कंटेनर में निपटारा किया जाना चाहिए और पीपीई इस एजेंट हेर-फेर करते समय हर समय इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  11. पंजाबियों के साथ कुल्ला पांच बार, 5-10 मिनट के लिए हर समय । बाद में, पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस पर दाग माइक्रो कॉलम की दुकान और एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर । घुड़सवार astrocytic बंडलों के मामले में, बंडल करने के लिए जलीय बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ने, तय बंडल पर एक और गिलास coverslip जगह है, और लंबी अवधि के भंडारण और बाद में इमेजिंग के लिए नेल पॉलिश के साथ दोनों coverslips सील ।

6. व्यवहार्यता परख के साथ रहते है मृत (Calcein-AM/ethidium Homodimer) धुंधला

  1. 5 μl calcein AM (4 mm in निर्जल dimethyl sulfoxide (DMSO)) और 20 μl ethidium homodimer-1 (EthD-1) (2 mm in DMSO/H2O 1:4 v/v) को जोड़कर रिएजेंट समाधान तैयार करें 1x DPBS की 10 मिलीलीटर । अंधेरे में एल्यूमीनियम पंनी या दुकान के साथ समाधान कवर प्रकाश से बचाने के लिए ।
  2. पेट्री डिश से महाप्राण मीडिया एक पाश्चर पिपेट के साथ मढ़वाया सूक्ष्म कॉलम युक्त, और पर्याप्त समाधान जोड़ने (ऊपर तैयार) के लिए निर्माण कवर । ३७ ° c और 5% CO2पर 30 मिनट के लिए मशीन, प्रकाश से समाधान की रक्षा के लिए कवर पेट्री डिश रखते हुए ।
  3. समाधान को किसी micropipette या पाश्चर पिपेट से निकालें । कुल्ला DPBS के साथ 2-3 बार के रूप में ५.३ कदम में बताया । DPBS डिश के आकार के अनुसार के साथ पेट्री पकवान बाढ़ । छवि कोशिकाओं को तुरंत बाद epifluorescence या फोकल इमेजिंग का उपयोग कर ।
    नोट: झिल्ली के रूपांतरण-पारगंय calcein हूं चयापचय सक्रिय कोशिकाओं द्वारा calcein के लिए calcein की हरी प्रतिदीप्ति पैदावार । मृत कोशिकाओं झिल्ली समझौता कोशिकाओं के रूप में चिह्नित कर रहे हैं, जो EthD-1 के प्रवेश की अनुमति सेल में और उसके न्यूक्लिक एसिड के लिए बाध्यकारी, लाल प्रतिदीप्ति के कारण ।

Representative Results

शुरू में, चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी astrocyte आसंजन और बंडल गठन और समय के एक समारोह के रूप में cytoarchitecture के समग्र स्थिरता की प्रगति की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चढ़ाना के बाद 1 ज में, astrocytes एक गोलाकार आकृति विज्ञान (चित्र 2a) के साथ सूक्ष्म स्तंभों के लुमेन भर में पाए गए थे. 5 एच में, astrocytes प्रक्रियाओं और करार का विस्तार शुरू कर दिया है, जबकि 8 एच कोशिकाओं द्वारा एक पूरी प्रक्रिया असर आकृति विज्ञान और गठन केबल की तरह संरचनाओं का प्रदर्शन किया माइक्रो कॉलम (चित्रा 2a) की अनुदैर्ध्य धुरी के साथ उंमुख. विशेष रूप से, माइक्रो कॉलम भर में कोशिकाओं के शुरू में फैलाया उपस्थिति की तुलना में, astrocytes के लिए इंटीरियर के साथ घने बंडलों के एक नेटवर्क के रूप में अनुबंध किया है दिखाई दिया ( चित्रा बी) । प्रारंभिक कक्ष संरेखण के बाद, astrocyte नेटवर्क अक्सर अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ एक साथ खींच लिया, एक ज़िप बंद जैसी, सूक्ष्म स्तंभ के केंद्र में एक घने बंडल बनाने के लिए (चित्रा 2c) । इस बंडल वास्तुकला के गठन एक आत्म विधानसभा प्रक्रिया के कारण था, भाग में सूक्ष्म कॉलम आईडी और कोशिका घनत्व के विकल्प के द्वारा तय की । Astrocytes गठबंधन और प्राप्त एक द्विध्रुवी आकृति विज्ञान जब सूक्ष्म-स्तंभों में एक आईडी से कम ३५० µm (चित्र 3 बी, ऊपर और मध्य, और 3d-3F) के साथ बीज४९। इसके विपरीत, इन कोशिकाओं को यादृच्छिक दिशात्मकता का प्रदर्शन किया जब 1 मिमी की एक आईडी (चित्र 3 बी, नीचे), जो 2d astrocyte की उपस्थिति के समान है सीरम मुक्त, सह संस्कृति मध्यम (चित्राएक, सही) के संपर्क में है । इसके अलावा, हालांकि astrocytes अभी भी कम बोने घनत्व पर संरेखण प्रदर्शन (2.0-3.0 x 105 कोशिकाओं/एमएल या 2.0-3.0 x 102 कोशिकाओं/mm3) (चित्रा 3सी), घने नेटवर्क केवल उच्च घनत्व (9.0-12.0 पर बनते हैं x 105 कोशिकाओं/एमएल या 9.0-12.0 x 102 कोशिकाओं/mm3) समान आयामों के बेलनाकार सूक्ष्म कॉलम के भीतर ( चित्र बी, ऊपर) में देखा, के रूप में प्रोटोकॉल४९में सुझाव दिया । astrocytic बंडलों में व्यवहार्यता मात्रा था, जीवित/मृत परख का उपयोग कर, कोशिकाओं के क्षेत्र के अनुपात के रूप में fluorescing ग्रीन (calcein) कोशिकाओं के कुल क्षेत्र के सापेक्ष हरे fluorescing (calcein am) और लाल (EthD-1) । astrocytic बंडलों की व्यवहार्यता ९७.४% थी, जो 2d astrocyte संस्कृति नियंत्रण (चित्रा 4a-4B) के ९८.२% व्यवहार्यता के समान है, साबित करना है कि सूक्ष्म कॉलम के भीतर पर्यावरण astrocyte जीवन शक्ति के लिए उपयुक्त है ( चित्रा 4E). astrocytic पाड़ों में रहते है और मृत कोशिकाओं के 3 डी पुनर्निर्माण भी निर्माण के भीतर समग्र सेल संरेखण प्रदर्शित करता है (चित्र 4c-4d) । इसके अतिरिक्त, अल्ट्रा लंबी astrocytic सूक्ष्म कॉलम पर्याप्त लंबाई के साथ astrocyte बंडलों की स्थिरता की जांच करने के लिए विकसित किए गए थे । यहां तक कि ३.५ सेमी की असाधारण दूरी पर, गठबंधन, घने, और अनुबंधित astrocytic बंडलों की cytoarchitecture सूक्ष्म-स्तंभ (चित्र 5) की लंबाई के दौरान लगातार कायम थी, जैसा कि स्पष्ट रूप से ज़ूम-इन क्षेत्रों में देखा सूक्ष्म कॉलम (चित्रा 5B-5C) ।

एक बार गठित, बंडलों तय किया गया और मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन की विशेषता के लिए immunocytochemistry तकनीकों से सना हुआ glial कोशिकाओं, जैसे GFAP, nestin, और vimentin. फोकल छवियां प्रक्रिया का असर आकृति विज्ञान की पुष्टि (चित्रा 6 और चित्रा 7) प्रक्रियाओं के astrocytes और अनुदैर्ध्य संरेखण । मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन की अभिव्यक्ति दोनों 2d astrocyte संस्कृतियों (चित्रा 7A) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सूक्ष्म स्तंभ (चित्रा 6, चित्रा 7B-7d) के भीतर astrocyte बंडलों में देखा जा सकता है । इसके अलावा, कोलेजन धुंधला पुष्टि सूक्ष्म कॉलम में इस ECM प्रोटीन की उपस्थिति । astrocytes कोलेजन के साथ एक सतत संरचना फार्म नहीं था जब एक 2d वातावरण में संस्कृति (चित्रा ८अ), जबकि astrocytes का पालन करने के लिए और लुमेन के भीतर मौजूद कोलेजन को remodel जब सूक्ष्म कॉलम में संस्कृति, की अनुमति दिखाई सेल संकुचन और बंडल गठन (चित्रा 8B) के लिए । GFAP और कोलेजन चैनलों के ओवरले का प्रदर्शन किया है कि astrocyte केबल अनुदैर्ध्य कोलेजन फाइबर के साथ कसकर जुड़े प्रक्रियाओं के शामिल (चित्रा 8B). इसलिए, anchorage की पेशकश के अलावा, कोलेजन तंतुओं भी astrocytes के लिए अतिरिक्त दिशात्मक cues प्रदान की है संकुचन के बाद घने बंडलों फार्म कर सकते हैं । कुछ मामलों में, astrocyte-कोलेजन संकुचन बनी, गठन के बाद 12-24 ज पर गठबंधन बंडल के पतन में जिसके परिणामस्वरूप (चित्रा 9A) । आदेश में केबल को स्थिर करने के लिए hydrogel सूक्ष्म कॉलम के भीतर astrocyte वास्तुकला की तरह, अतिरिक्त कोलेजन मैट्रिक्स एक पूरी तरह से बनाई बंडल के सिरों को आगे संकुचन और पतन को बाधित करने के लिए जोड़ा गया था । यह सुदृढीकरण तकनीक वांछित केबल वास्तुकला के कम से कम 4 दिनों के लिए अस्तित्व के लिए अनुमति दी, स्थिरता की एक लंबी खिड़की के साथ की उंमीद (चित्रा 9B) । इसके अलावा, प्रतिनिधि astrocytic बंडलों hydrogel सूक्ष्म कॉलम से निकाले गए थे, घुड़सवार, और ग्लास coverslips पर 4% formaldehyde के साथ तय करने के लिए अपने मजबूती का आकलन जब तनाव बलों को उजागर और बाहरी वातावरण के लिए । यहां तक कि विभिंन आकारों में निष्कर्षण और शारीरिक हेरफेर के बाद (चित्रा 10A, 10B), astrocytic सोमता और प्रक्रियाओं को बनाए रखा एक गठबंधन, बंडल सूक्ष्म पैमाने पर आकृति विज्ञान (चित्रा 10C), पर प्रकाश डाला स्व के लचीलापन-गठबंधन astrocytic पाड़, एक बार का गठन, भले ही hydrogel सूक्ष्म कॉलम के संरचनात्मक समर्थन अनुपस्थित है ।

प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स भी सूक्ष्म-स्तंभों के अंदर astrocytes के साथ सह-कल्चरित थे कि पता लगाने के लिए कि क्या astrocyte बंडलों को न्यूरॉन आसंजन और neurite भड़काने में सक्षम किया गया था. GFAP और microtubule प्रोटीन β-tubulin III क्रमशः astrocytes और न्यूरॉन्स के लिए विशिष्ट मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया. चित्रा 11A से पता चलता है कि astrocytes cortical न्यूरॉन्स के साथ सह वरीयता प्राप्त प्रक्रियाओं का प्रदर्शन और गठबंधन के बंडल बनाने के लिए भी सक्षम थे. न्यूरॉन्स astrocyte बंडलों के लिए तरजीह का पालन किया है दिखाई दिया, के बाद से सभी सकारात्मक β-tubulin III दाग सह GFAP के साथ स्थानीयकृत ( चित्रा 11B-11Cमें ओवरले). astrocytic के अपक्षयी गुणों का प्रदर्शन करने के लिए, cortical न्यूरॉन्स (चित्रा 12B) hydrogel माइक्रो कॉलम के भीतर चढ़ाया गया 2 दिनों के बाद astrocytes (चित्रा 12A) चढ़ाया गया. न्यूरॉन्स astrocyte बंडल करने के लिए संलग्न है, और विस्तारित neurites सीधे astrocytic इलाकों के साथ. आगे निरीक्षण ने astrocytic केबल की दिशा में उन्मुख neurite को दिखाया, जबकि उन क्षेत्रों में जहां astrocyte पथ मौजूद नहीं था, neurites को अव्यवस्थित तरीके से (फिगर 12C) में बढ़ते देखा गया । इन टिप्पणियों का प्रदर्शन है कि प्रोटोकॉल गठबंधन में परिणाम, व्यवहार्य, और मजबूत astrocytic नेटवर्क है कि के रूप में प्रत्यारोपित रहने वाले रास्ते के रूप में कार्य करने की क्षमता है ंयूरॉन आसंजन और neurite वृद्धि को बढ़ावा देने ।

Figure 2
चित्रा 2: Brightfield माइक्रोस्कोपी समय के साथ Hydrogel सूक्ष्म कॉलम के भीतर Astrocyte बंडलों के गठन से पता चलता है. () चढ़ाना के बाद समय के एक समारोह के रूप में Astrocyte आकृति विज्ञान: (1 ज) astrocytes आकार में गोलाकार और निर्माण भर में फैलाया जाता है; (5 ज) astrocytes आरंभ प्रक्रिया विस्तार और संकुचन; (८ ज) astrocytes ने गठबंधन और करार किया है. स्केल बार्स = १०० µm. (B) एक अतिरिक्त प्रतिनिधि पाड़ा में समय के साथ बंडल निर्माण: (1 h) शुरू में astrocytes गोलाकार हैं और प्रक्रियाओं का प्रदर्शन नहीं करते हैं; (24 ज) astrocytic प्रक्रियाओं का एक घना बंडल बनता है । स्केल पट्टियां = ३०० µm (बाएं) और ५०० µm (दाएं) । () चढ़ाना के बाद पूरी तरह से astrocytic बंडल 24 एच का गठन, एक "ज़िपिंग" प्रभाव दिखा रहा है, जहां केबल के सिरों लुमेन की दीवारों के विशिष्ट सिरों को देते हैं । स्केल बार = १००० µm ।

Figure 3
चित्रा 3: सूक्ष्म स्तंभ भीतरी व्यास और सेल घनत्व द्विध्रुवी Astrocytes के गठबंधन बंडलों की आत्म विधानसभा को प्रभावित । () सीरम युक्त मीडिया (बाएं) और सीरम मुक्त सह संस्कृति मीडिया (दाएं) के साथ 2d astrocyte संस्कृतियों एक गैर प्रक्रिया और बहु प्रक्रिया असर आकृति विज्ञान, क्रमशः दिखाओ । स्केल बार्स = १०० µm । () Astrocytes उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त (9.0-12.0 x 105 कोशिकाओं/एमएल) एक आईडी के साथ सूक्ष्म कॉलम में १८० और ३५० µm फार्म का अनुदैर्ध्य अक्ष के सापेक्ष बंडलों, जबकि 1 मिमी के एक आईडी Astrocytes में प्रदर्शित परिणाम एकाधिक, लुमेन के व्यास भर में डिग्रियों की प्रक्रिया । स्केल बार्स = १०० µm (ऊपर, मध्य) और १५० µm (नीचे) । () कम घनत्व पर ३५० µm आईडी माइक्रो कॉलम में Astrocytes वरीयता प्राप्त (2.0-4.0 x 105 कोशिकाओं/एमएल) गठबंधन कर रहे हैं, लेकिन बंडल नहीं । स्केल बार = १०० µm. (D) जब एक ३५० µm आईडी कम या मध्यम कोशिका घनत्व पर माइक्रो कॉलम में चढ़ाया, astrocytes एक द्विध्रुवी आकृति विज्ञान प्राप्त करते हैं । स्केल सलाखों = ३०० µm. () बॉक्स में डी दिखा रहा है एक ज़ूम-द्विध्रुवी astrocytes की जंजीरों के अंदर है कि फार्म का hydrogel माइक्रो कॉलम । स्केल बार = ३०० µm. () एक व्यक्ति द्विध्रुवी astrocyte का उदाहरण । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Astrocytes Hydrogel सूक्ष्म कॉलम के भीतर बंडल गठन के बाद व्यवहार्य रहते हैं । (बी), (सी-डी) planar संस्कृतियों और गठबंधन astrocytic बंडलों भर में कोशिकाओं की व्यवहार्यता दिखा 3d फोकल पुनर्निर्माण, क्रमशः, के रूप में calcein के साथ परख रहा हूं/ethidium homodimer धुंधला (ग्रीन-लाइव कोशिकाओं; लाल मृत कोशिकाओं) । (E) लाइव और मृत कोशिकाओं के ठहराव 2d सतहों पर और सूक्ष्म स्तंभों में जब संस्कृतिित रहते/मृत astrocytes के एक समान प्रतिशत के परिणामस्वरूप । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Hydrogel माइक्रो कॉलम के भीतर एक प्रतिनिधि अल्ट्रा लंबे गठबंधन Astrocytic बंडल के चरण विपरीत छवि. (एक) एक ३.५ सेमी सूक्ष्म कॉलम की पूरी लंबाई भर में बंडल गठन । स्केल बार = १,००० µm. (B-C) उच्च आवर्धन ज़ूम-निर्माण की संपूर्णता के साथ विभिंन क्षेत्रों में astrocyte संरेखण दिखा रहा है, एकमें बक्से के लिए इसी । स्केल बार्स = ५०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: Astrocytic पाड़ों के Immunolabeling Astrocytic प्रक्रियाओं के अनुदैर्ध्य संरेखण प्रदर्शित करता है । (A) एक astrocytic GFAP के लिए दाग दिखा बंडल के फोकल पुनर्निर्माण (लाल; बाएं) और नाभिक (Hoechst; मध्य) और दोनों चैनलों के एक ओवरले (दाएं) । () सूक्ष्म स्तंभों के भीतर astrocytes के cytoarchitecture के एक परमिट दृश्य में बॉक्स क्षेत्र में astrocytic बंडल के उच्च आवर्धन ज़ूम-इन । स्केल बार्स = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: Immunocytochemistry के माध्यम से प्रतिनिधि Astrocytic बंडलों के लक्षण वर्णन । (A-B) 2d सतहों पर Astrocytes और hydrogel सूक्ष्म कॉलम में वरीयता प्राप्त समान astrocytic मार्करों GFAP (लाल) और vimentin (हरा) । () एक 2d planar astrocyte संस्कृति के फोकल पुनर्निर्माण अलग और विलय चैनल दिखा । स्केल बार = १०० µm. (B) एक astrocytic बंडल की फोकल छवियां, मार्करों की अभिव्यक्ति की पुष्टि करना और astrocyte संरेखण प्रदर्शित करना । स्केल बार = ५० µm. (C-D) सूक्ष्म स्तंभों के भीतर Astrocytes कल्चर्ड भी मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन nestin (लाल) और vimentin (हरा) व्यक्त करते हैं । (C) किसी astrocytic बंडल की फोकल छवि । स्केल बार = १०० µm. (D) उच्च आवर्धन ज़ूम-इन C। स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: गठबंधन बंडलों में Astrocytes अच्छी तरह से एक अनुबंध, अनुदैर्ध्य कोलेजन मैट्रिक्स के साथ बातचीत, के रूप में 2d संस्कृतियों में कोलेजन की अनियमित व्यवस्था करने का विरोध किया । कोशिकाओं astrocytes (GFAP; लाल), नाभिक (Hoechst; नीला), और कोलेजन (हरा) का निरीक्षण करने के लिए immunolabeled थे । (A) 2 डी astrocyte संस्कृतियों में कोलेजन के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल दिखाएं unडिग्रियों astrocytes और बेतरतीब ढंग से वितरित कोलेजन । स्केल बार = २५० µm. (B) कोलेजन को सूक्ष्म कॉलम लुमेन की दीवारों से निकाला जाता है और एक गठबंधन मैट्रिक्स है कि astrocytic बंडल का हिस्सा है बनाने के लिए अनुबंधित है । स्केल बार = १५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: अतिरिक्त कोलेजन Astrocytic केबल की संरचना को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (A) बंडलों कोलेजन-लेपित hydrogel माइक्रो कॉलम के भीतर astrocytes चढ़ाना के बाद लगभग 6 ज का गठन किया । एक बार बंडलों का गठन किया गया, उच्च एकाग्रता (3 मिलीग्राम/कोलेजन सूक्ष्म स्तंभ के सिरों को जोड़ा गया था astrocytic केबल के संकुचन को बाधित । में अतिरिक्त कोलेजन के साथ स्थिर नहीं constructs, astrocytic-कोलेजन बंडलों के लिए 18 घंटे से अनुबंध शुरू कर दिया था, और astrocyte केबल पूरी तरह से 24 एच द्वारा ढह गई थी । इस संकुचन देखा नहीं था जब बंडलों के साथ प्रबलित थे 3 मिलीग्राम/ स्केल बार = १,००० माइक्रोन । () ज़ूम-में ढह astrocytic बंडल के साथ प्रबलित नहीं 3 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन । स्केल बार = ५०० माइक्रोन । () ज़ूम-में क्षेत्रों के कोलेजन से प्रबलित सूक्ष्म कॉलम । Astrocyte बंडल आकृति विज्ञान सूक्ष्म कॉलम की पूरी तरह भर में बनाए रखा गया था । स्केल बार्स = ५०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्रा 10: माइक्रो कॉलम से Astrocytic बंडलों का निष्कर्षण और पाली पर बढ़ते-L-lysine लेपित ग्लास Coverslips सबूत तकनीक की मजबूती । (A) चरण-कई निकाले astrocytic बंडलों के विपरीत छवि, शब्द "पेन" वर्तनी में हेरफेर । () astrocytic मार्कर GFAP (लाल) और कोशिका नाभिक (Hoechst; नीला) के लिए दाग ही निकाले गए बंडलों का फोकल पुनर्निर्माण । स्केल बार = १०० µm. (C) B में बॉक्स्ड क्षेत्र का इज़ाफ़ा दिखाता है कि, यहां तक कि जब अनियमित आकार में हेरफेर, astrocytic पाड़ एक गठबंधन, द्विध्रुवी आकृति विज्ञान और एक बंडल cytoarchitecture बनाए रखने । स्केल बार = २०० µm । ध्यान दें कि चरण और फोकल छवियों के बीच किसी भी संरचनात्मक मतभेदों की संभावना immunocytochemistry प्रक्रिया के दौरान धोने के कारण स्थानांतरण constructs का एक विरूपण साक्ष्य है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: न्यूरॉन्स का पालन करें और न्यूरॉन-Astrocyte सह-कल्चरल पाड़ों में संरेखित Astrocyte बंडलों के साथ Neurites का विस्तार. () एक ंयूरॉन बीज astrocytic बंडल के चरण विपरीत छवि । स्केल बार = ३०० µm. (B)-(C) न्यूरॉन्स astrocytic बंडलों का पालन करने के लिए और केबल की दिशा के साथ neurites का विस्तार करने के लिए मनाया गया (Hoechst-नीला; GFAP-हरा; β-tubulin III-लाल). स्केल बार्स = २०० और १०० µm, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्रा 12: Astrocyte केबल्स निर्देशित Neurite वृद्धि के लिए एक जीवित पाड़ के रूप में सेवा । फोकल पुनर्निर्माण न्यूरॉन्स से मिलकर एक सूक्ष्म स्तंभ के एक क्षेत्र को दिखाने के बंडल गठन के बाद लगभग 2 दिनों के लिए वरीयता प्राप्त. () GFAP-धनात्मक astrocyte बंडलों, () β-tubulin III-धनात्मक न्यूरॉन्स, और () HOECHST-सना नाभिक (नीला) सहित सभी चैनलों का विलय. ध्यान दें कि न्यूरॉन्स neurite संरेखण का प्रदर्शन जब गठबंधन astrocyte प्रक्रियाओं (तीर) के साथ क्षेत्रों का पालन किया, जबकि ंयूरॉंस गठबंधन astrocytes का पालन नहीं करने के लिए यादृच्छिक प्रदर्शन (यानी बहु दिशात्मक) neurite वृद्धि (ऐरोहेड) दिखाई दिया । (D) ज़ूम-इन क्षेत्र में neurite के दिशात्मकता का पता चलता है । स्केल बार्स = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

पीएन के अधिक सहायक वातावरण की तुलना में, सीएनएस neurotrauma और neurodegeneration के हानिकारक परिणामों से निपटने में विशेष रूप से सीमित है । स्तनधारी सीएनएस के लिए एक गंभीर अपमान के बाद, एक glial निशान का गठन किया है, fibrotic और भड़काऊ अव्यवस्थित प्रतिक्रियाशील astrocytes के एक घने meshwork से घिरा कोशिकाओं के एक कोर से मिलकर कि axon वृद्धि-बाधा proteoglycans14। यह निशान axon के उत्थान के खिलाफ एक भौतिक और जैव रासायनिक रुकावट के रूप में कार्य करता है12अंत । इसके अलावा, वयस्क स्तनधारी सीएनएस नए न्यूरॉन्स के सीमित स्रोतों के पास आघात या neurodegeneration के बाद खो कोशिकाओं को बहाल करने के लिए, के बाद से तंत्रिकाजन्य केन्द्रों SVZ, हिप्पोकैम्पस dentate गाइरस, और संभावित रूप से अन्य आमतौर पर निष्क्रिय करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं क्षेत्र५४। एक आदर्श रणनीति सीएनएस, जो वर्तमान दृष्टिकोण को संबोधित करने में विफल की सीमित recuperative क्षमताओं के दोनों पहलुओं को दरकिनार होगा । जैसे, हमारे अनुसंधान समूह विकसित किया गया है astrocyte आधारित पाड़ों ंयूरॉन की कमी क्षेत्रों की ओर तंत्रिका प्रवास के लिए रहने वाले रास्ते पेश करने और axon विकास शंकु के लिए निर्देशित विस्तार के उद्देश्य से । गठबंधन astrocytic एक agarose सूक्ष्म स्तंभ के कोलेजन इंटीरियर के भीतर समाहित बंडल इन astrocytic रहने पाड़ों का गठन । पारंपरिक सेल से एक काफी अंतर और तंत्रिका तंत्र की मरंमत और पुनर्जनन के लिए इस्तेमाल किया आधारित रणनीति है कि इन constructs के cytoarchitecture पूरी तरह से इन विट्रो में है अनुरूप है vivo में कई अनुकरण glia-आधारित मार्गदर्शन और मचान वास्तुकला । उदाहरण के लिए, भ्रूण के विकास के दौरान, रेडियल glia रास्ते नए neocortex के लिए पलायन ंयूरॉंस के लिए रहने वाले पाड़ के रूप में कार्य, और glial कोशिकाओं अग्रणी axons की लक्षित विस्तार के रूप में प्रस्तुत नमूनों सब्सट्रेट और/ ,३८,३९. subventricular क्षेत्र में भ्रूण रेडियल glia भी astrocytes कि फार्म longitudinally गठबंधन glial ट्यूबों, जिस पर neuroblasts postnatally से एक श्रृंखलित-गठन SVZ से ओबी४१में माइग्रेट) का उत्पादन. इसके अलावा, यह कुछ गैर में प्रदर्शन किया गया है स्तनधारियों कि, सीएनएस क्षति के बाद, पुनर्जनन के एक अधिक से अधिक डिग्री एक संगठित, गठबंधन astrocytic व्यवस्था४४के गठन के कारण संभव है । उदाहरण के लिए, वयस्क zebrafish घाव साइट, एक द्विध्रुवी आकृति विज्ञान में अंतर अपरिपक्व glial कोशिकाओं के प्रवास के बाद उनकी रीढ़ की हड्डी को फिर से पैदा करने में सक्षम हैं, और घाव को पाटने के लिए glial प्रक्रियाओं के बढ़ाव, एक रास्ता बनाने कि axons४५को पुनः उत्पंन करने के लिए निर्देशित करता है । गठबंधन astrocytic बंडलों के इंजीनियर constructs इन तंत्र recapitulating करने में सक्षम हो सकता है और glia के लिए आवश्यक संरचनात्मक और घुलनशील संकेतों पेश-मध्यस्थता ंयूरॉन प्रवासन और axon पुनर्जनन३५। इसके अलावा, लिविंग astrocytes के शामिल होने के कारण, इन constructs सक्रिय रूप से आवश्यक पर्यावरणीय cues मेजबान से प्रतिक्रिया के आधार पर उपस्थित कर सकते हैं ।

हमारी तकनीक में, astrocyte संरेखण भौतिक cues और सेल सेल बातचीत सूक्ष्म स्तंभ भीतरी व्यास, कोलेजन एकाग्रता, और बोने की सघनता द्वारा पदोंनत पर एक आत्म विधानसभा प्रक्रिया आकस्मिक है । इस विधि का एक और आकर्षक सुविधा अपने माइक्रोन पैमाने पर आकार है, जो सीएनएस के क्षतिग्रस्त क्षेत्रों में न्यूनतम इनवेसिव प्रत्यारोपण के लिए अनुमति दे सकता है । इसके अलावा, इस पांडुलिपि में प्रस्तुत परिणाम प्रदर्शित करता है कि प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त निर्माण उच्च व्यवहार्यता और मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन GFAP, nestin, और vimentin व्यक्त, astrocyte उंर की परवाह किए बिना बीतने संख्या द्वारा परिभाषित के रूप में . जबकि दोनों GFAP और vimentin अपरिपक्व और परिपक्व astrocytes में व्यक्त कर रहे हैं, nestin मुख्य रूप से विभिन्नता या अपरिपक्व कोशिकाओं के लिए प्रतिबंधित है, परिपक्व glia के GFAP की अभिव्यक्ति को विनियमित करने और nestin के उत्पादन को कम करने के साथ४५, ५५. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि उंर के साथ astrocyte व्यवहार परिवर्तन, मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन की हालांकि लगातार अभिव्यक्ति, के रूप में अच्छी तरह से bundling गद्यांश संख्या (मार्ग 4-12)५६की एक सीमा के पार देखा गया था । astrocytic पाड़ों भी अति लंबी, सेंटीमीटर इन विट्रो, जो पता चलता है कि इस तकनीक को अलग चोट लंबाई और geometries vivo मेंसामना करने के लिए अनुकूलनीय है में बड़े पैमाने पर लंबाई को प्राप्त करने के लिए दिखाए गए थे । इसके अलावा, गठबंधन astrocytic बंडलों उल्लेखनीय संरचनात्मक अखंडता और स्थिरता का प्रदर्शन, के रूप में अपने केबल की तरह cytoarchitecture भी सूक्ष्म कॉलम से निष्कर्षण के अधीन किया जा रहा है बनाए रखा है । Astrocyte आधारित रहने पाड़ भी ंयूरॉन आसंजन और neurite वृद्धि का समर्थन, इस तकनीक की क्षमता मजबूत करने के लिए निर्देशित ंयूरॉन प्रवासन और axon विस्तार सीएनएस मरंमत के लिए बढ़ावा देने के ।

गठबंधन astrocytic बंडलों एक सुरक्षात्मक ट्यूबलर hydrogel झालर के कोलेजन इंटीरियर के भीतर समाहित कर रहे हैं । astrocytic पाड़ों का निर्माण एक केशिका ट्यूब में एक एक्यूपंक्चर सुई डालने और इसे में तरल agarose को सक्शन द्वारा सूक्ष्म कॉलम विधानसभा के साथ शुरू होता है । Agarose अपने निष्क्रिय गुणों, जैव संगतता, और आसानी से नियंत्रित यांत्रिक, शारीरिक, और रासायनिक गुण४९की वजह से चुना गया था. hydrogel में Agarose एकाग्रता एक महत्वपूर्ण चर के बाद से अपने सब्सट्रेट (कठोरताजैसे ) से कोशिकाओं को यांत्रिक उत्तेजनाओं हो सकता है और intracellular परिवर्तन के साथ प्रतिक्रिया५७। इन सूक्ष्म कॉलम के लिए डिजाइन मानदंड पर्याप्त जन परिवहन के लिए अनुमति देने के लिए एक उच्च पर्याप्त porosity भी शामिल है, लेकिन एक छोटे से पर्याप्त ताकना आकार पार्श्व प्रक्रिया को कम करने के लिए प्रतिबंधित; इन मानदंडों को नैनो पैमाने पर खुले porosity इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एकाग्रता पर agarose में मौजूद द्वारा संतुष्ट हैं । इस प्रोटोकॉल में agarose एकाग्रता भी अपनी स्थिरता के कारण चुना गया था, हैंडलिंग में आसानी, और मस्तिष्क पर्यावरण के लिए यांत्रिक गुणों में समानता५८। एक उल्लेखनीय विचार केशिका ट्यूब के भीतर सुई की केंद्रीय नियुक्ति है । अक्सर, सुई थोड़ा तिरछा या प्रक्रिया के दौरान विस्थापित किया जा सकता है, लुमेन के लिए बंद स्थित होने के कारण केंद्र बाहरी दीवारों के सापेक्ष agarose जमाना और ट्यूब से सूक्ष्म कॉलम हटाने के बाद । इस से बचने के लिए, सुई सीधे होना चाहिए, और सवार-ट्यूब-सुई विधानसभा एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में बनाए रखा जाना चाहिए, जबकि agarose केंद्रीय धुरी के साथ सुई बनाए रखने के लिए में तैयार किया जा रहा है । लुमेन की सटीक विकेंद्रीकरण सुरक्षा agarose दीवारों के बीच गठबंधन astrocytes; लुमेन अधिक rupturing करने के लिए प्रवण अगर सिलेंडर के बाहरी रिम के समीपस्थ स्थित है । इसके अलावा, लुमेन और बाहरी दीवार के बीच पर्याप्त दूरी के दौरान और प्रत्यारोपण के बाद सुरक्षात्मक लाभ प्रदान कर सकते हैं (प्रदान की astrocytic निर्माणों से पहले प्रत्यारोपण करने के लिए सूक्ष्म स्तंभ से हटा नहीं रहे हैं). astrocytic पाड़ निर्माण के इस प्रारंभिक चरण तकनीक की सफलता के लिए सर्वोपरि है, सुई व्यास के चयन के रूप में उचित astrocyte सोमा/प्रक्रिया संरेखण और केबल स्वयं विधानसभा के लिए महत्वपूर्ण है । हमने पाया है कि astrocyte संरेखण, कक्ष संरेखण के लिए इष्टतम id श्रेणी और १८० से ३५० µm (चित्र 3) तक के मजबूत astrocyte बंडलों के निर्माण के साथ, लघु-स्तंभ id पर व्युत्क्रम रूप से निर्भर था । इसी तरह, यह पहले से प्रदर्शित किया गया था कि न्यूरॉन्स न्यूनतम सब्सट्रेट वक्रता की दिशा के साथ अपनी वृद्धि प्रत्यक्ष५९झुकने की प्रक्रिया को कम करने के लिए,६०, और इसी तरह तंत्र काम पर होने की संभावना को प्रभावित करने के लिए astrocyte हमारे सिस्टम४९में संरेखण । astrocyte संरेखण को प्रभावित वक्रता के अलावा, हमने पाया है कि एक १८० ३५० µm आईडी श्रेणी एक द्विध्रुवी आकृति विज्ञान४९प्राप्त astrocytes के परिणामस्वरूप, stellate के विपरीत, बहु-ध्रुवीय रूप 1 मिमी की एक आईडी के साथ मनाया या जब astrocytes में culture थे 2d (चित्रा 3) । यह संभावना है कि एक द्विध्रुवी astrocyte के लिए इन गहन रूपात्मक परिवर्तन आकृति विज्ञान के रूप में अच्छी तरह से उनकी शारीरिक विशेषताओं को बदल; उदाहरण के लिए, इन astrocytes वैकल्पिक स्रावी कारकों या सेल सतह मार्करों कि पुनर्जनन के लिए लाभप्रद हो सकता है व्यक्त कर सकते हैं, लेकिन यह वारंट आगे लक्षण वर्णन । कुल मिलाकर, हमारे निष्कर्षों ऐसे सतह वक्रता के रूप में भौतिक cues, के उपयुक्त चयन प्रदर्शित करता है, astrocytic रहने वाले पाड़ में देशी cytoarchitecture अनुकरण करने के लिए अनिवार्य हैं ।

astrocytic पाड़ों के निर्माण सूक्ष्म स्तंभों के खोखले इंटीरियर में कोलेजन ECM समाधान और cortical astrocytes के अनुक्रमिक शामिल किए जाने के साथ आय । सूक्ष्म कॉलम के भीतरी लुमेन कोलेजन के साथ लेपित को astrocyte अस्तित्व, लगाव का समर्थन है, और गठबंधन बंडल गठन, agarose की अक्षमता के कारण स्वतंत्र रूप से neurite वृद्धि का समर्थन करने के लिए६१। 1 मिलीग्राम/एमएल के एक कोलेजन एकाग्रता चुना गया था क्योंकि पिछले अध्ययनों से निर्धारित किया गया था कि कम और उच्च सांद्रता आसंजन की कमी और ECM की अस्थिरता के परिणामस्वरूप, क्रमशः४९। इस प्रकार, के रूप में की उंमीद है, कोलेजन एकाग्रता इस तकनीक की प्रभावशीलता पर नाटकीय प्रभाव पड़ता है । इसके अलावा, ECM समाधान केवल प्रकार मैं कोलेजन के होते हैं । जब 2d astrocytic संस्कृतियों के लिए laminin और Matrigel-लेपित सब्सट्रेट्स की तुलना में, astrocytes प्रकार पर मढ़वाया मैं कोलेजन इष्टतम आसंजन और नेटवर्क गठन६२का प्रदर्शन किया । मशीन समय कोलेजन बहुलकीकरण के लिए इस्तेमाल किया सेल बोने से पहले भी प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम है । हम पहले पाया गया कि जब ंयूरॉंस agarose सूक्ष्म कॉलम, कम neurite वृद्धि और axonal fasciculation के लिए unECMed के साथ concomitantly दिया गया था४७देखा गया है, और यह संभव है कि इन निष्कर्षों astrocytes का विस्तार होगा के रूप में अच्छी तरह से । के बाद से कोलेजन astrocyte आसंजन और बंडल गठन के लिए आवश्यक है, निर्माण और हवा के बुलबुले या खाली जेब के अभाव में ECM की उपस्थिति visualized किया जाना चाहिए और सूक्ष्म तकनीकों के साथ की पुष्टि की ।

प्रोटोकॉल astrocyte चढ़ाना, एक मशीन के लिए कोलेजन को सेल आसंजन सुनिश्चित करने के लिए अवधि के साथ समाप्त, और अल्पकालिक संस्कृति लक्ष्य cytoarchitecture के गठन के लिए । मार्ग संख्या 4-12 के बीच Astrocytes इस्तेमाल किया गया, के रूप में वे मजबूत astrocytic bundling और कोलेजन सुधार प्रदर्शित । इन astrocytes भी एक परिपक्व phenotype से मिलकर प्रस्तुत किया > 95% शुद्ध संस्कृतियों६३,६४ के साथ कोई न्यूरॉन्स के लिए थोड़ा संदूषण. साधारण astrocyte संस्कृतियों के विपरीत, जो सीरम युक्त मध्यम (आंकड़ा 3, बाएं) को रोजगार, हमारी तकनीक सीरम मुक्त माध्यम का इस्तेमाल करने के लिए astrocytes एक प्रक्रिया असर आकृति विज्ञान (चित्र 3ए अपनाने के लिए अनुमति, सही ) और सूक्ष्म कॉलम६२,६५,६६के भीतर गठबंधन सोमता और प्रक्रियाओं के फार्म बंडलों । सेल सीडिंग एकाग्रता के संदर्भ में, 9.0-12.0 x 105 कोशिकाओं की श्रेणी में उच्च सांद्रता/एमएल, ३५० µm की एक आईडी के साथ, के साथ कसकर पैक बंडलों के गठन के परिणामस्वरूप कोलेजन remodeling, जबकि astrocytes अधिक फैलाया गया , लेकिन अभी भी गठबंधन, जब कम सांद्रता का उपयोग किया गया (चित्रा 3सी). इस प्रकार, सेल पर एकाग्रता बोने के प्रभाव-सेल बातचीत astrocyte संरेखण और मनाया केबल संरचनाओं की तरह के गठन की डिग्री को प्रभावित करता है । लुमेन में सेल समाधान के इंजेक्शन आम तौर पर एक stereoscope का उपयोग कर सूक्ष्म स्तंभ लंबाई, जो निरंतर बंडल गठन के लिए महत्वपूर्ण है भर में समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए visualized है । बोने के बाद, प्रारंभिक मशीन समय संस्कृति मीडिया के साथ बाढ़ से पहले के लिए ECM को astrocytes के anchorage सुरक्षित अपरिहार्य है । अवधि को संशोधित किया जा सकता है यदि astrocytes से बच निर्माण, बशर्ते कि निर्माण पर्याप्त बाधा सुखाने के लिए humidified हैं । समय के एक समारोह के रूप में astrocytic पाड़ों के चरण विपरीत छवियों से पता चला कि 8 एच, गठबंधन astrocytic बंडलों के एक नेटवर्क के गठन की प्रक्रिया में था । इसके अलावा, लुमेन दीवार से ECM की टुकड़ी, उसके आगामी संकुचन, और कोशिकाओं और अनुबंधित कोलेजन के बीच तंग एसोसिएशन मनाया गया था जब निर्माण कोलेजन और GFAP के लिए लेबल के रूप में चित्रा 8में दिखाया गया है । इस घटना संभवतः astrocytic सिकुड़ा दीवारों से कोलेजन अलग बलों की एक परिणाम है, fibroblast-glial कोशिकाओं की क्षमता की तरह की पूर्व रिपोर्टों के आधार पर बलों है कि लचीला सब्सट्रेट और मैट्रिक्स को विकृत उत्पंन astrocyte में astrocytes की क्षमता-केवल और ंयूरॉन-astrocyte सह संस्कृतियों28,४९,६७,६८। विशेष रूप से, astrocyte गतिशीलता के परिणामों में से एक और integrin-कोलेजन तंतुओं के साथ मध्यस्थता बातचीत के लिए पर्याप्त बलों की पीढ़ी है तंतुओं17,६९अनुबंध । कुल मिलाकर, वर्णित प्रोटोकॉल के कार्यांवयन के रहने वाले पाड़ घने, गठबंधन astrocytic केबल की तरह संरचनाओं कि दोहराऊंगा शारीरिक सीएनएस विकास के कई चरणों में मौजूद के नेटवर्क इकट्ठे का उत्पादन होगा ।

व्यक्तिगत मुद्दों है कि प्रोटोकॉल भर में पैदा सकता है के अलावा, astrocytic पाड़ तकनीक अंय बाधा है कि इसकी क्षमता को प्रभावित सीएनएस की मरंमत कर सकते है के पास । उदाहरण के लिए, इस तकनीक की अंतिम सफलता तंत्रिका तंत्र प्लास्टिक और मेजबान सर्किट के साथ astrocytic पाड़ के कार्यात्मक एकीकरण पर आकस्मिक है । इन पाड़ों के आरोपण से संबंधित astrocytic बंडलों के प्रो-अपक्षयी विशेषताओं का मुकाबला कर सकते हैं कि एक भड़काऊ प्रतिक्रिया की संभावना है. सभी प्रत्यारोपण आधारित तकनीक रक्त मस्तिष्क बाधा टूटना और भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ के कारण, न्यूरॉन्स और ऊतक४७में केशिकाओं के बीच निकटता के कारण क्षमता है । इस मामले में, hydrogel सूक्ष्म कॉलम या astrocytic पाड़ों के लिए एक और झालर योजना विरोधी भड़काऊ कारकों के नियंत्रित रिहाई के लिए एक वाहन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम । शुरू में, गठबंधन astrocytic बंडल स्थिर नहीं था अंदर माइक्रो कॉलम, के रूप में बलों है कि मजबूर सेल संरेखण और मैट्रिक्स remodeling अंततः वांछित cytoarchitecture के एक पतन के बाद संस्कृति में 1-2 दिन के लिए नेतृत्व किया । हालांकि, अतिरिक्त संकुचन और बंडल पतन उच्च एकाग्रता कोलेजन जोड़ने के लिए जगह में बंडल रखने के द्वारा सूक्ष्म कॉलम के सिरों पर बंडलों के लिए अतिरिक्त सुदृढीकरण प्रदान करने से बाधित किया गया था । एक अतिरिक्त रणनीति के लिए एक माध्यमिक encapsulation, जिससे एक नया hydrogel कोटिंग गठबंधन astrocytic बंडलों के लिए लागू किया जाता है के रूप में वे सूक्ष्म कॉलम से खींच रहे है काम हो सकता है । यह संभावना है कि मस्तिष्क में गठबंधन astrocyte नेटवर्क के वितरण भी सेल-मेजबान और निर्माण के बीच सेल आसंजन के कारण निर्माण पूरी लंबाई के साथ कोशिकाओं को स्थिर होगा, हालांकि यह भविष्य के अध्ययन में सीधे परीक्षण की आवश्यकता होगी ।

तदनुसार, भविष्य के प्रयासों के लिए एक प्रभावी प्रत्यारोपण विधि विकसित करने के उद्देश्य से किया जाएगा कि स्थिरीकरण और के दौरान astrocytic बंडल की सुरक्षा सुनिश्चित करता है और के बाद vivo वितरण में आदेश में ंयूरॉन प्रवास के लिए अनुमति देने के लिए, मरंमत, और घायल सीएनएस में पुनर्जनन । हमने पहले axonal-आधारित माइक्रो-टेननस के सफल आरोपण का प्रदर्शन किया है, जो astrocytic के झालर योजना का हिस्सा है, corticothalamic रास्ते में, अस्तित्व और मेजबान के साथ संरचनात्मक एकीकरण में जिसके परिणामस्वरूप ऊतक 1 महीने४६,४७ इस प्रकार, सूक्ष्म स्तंभों से निष्कर्षण के बाद तारों की मजबूती का दोहन किया जा सकता है । इस मामले में, agarose hydrogel प्रारंभिक संस्कृति बिस्तर के रूप में सेवा करने के लिए आत्म विधानसभा पैदा होता है और फिर astrocytic केबल झालर से हटा दिया जाएगा और सीधे एक पतली घिरी सुई का उपयोग कर मस्तिष्क में इंजेक्शन । hydrogel सूक्ष्म कॉलम से निष्कर्षण के दौरान यांत्रिक बलों के कारण Astrocyte विकृति नहीं देखा गया है, और उंमीद नहीं है । पिछले astrocyte जेट पर यांत्रिक विकृति के प्रभाव का अध्ययन काम पता चलता है कि किसी भी परिणामी विकृति तेजी से लागू नहीं किया जाएगा astrocytosis या प्रक्रिया बढ़ाव६२,७०प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है । मस्तिष्क ऊतक और संभव भड़काऊ प्रतिक्रिया करने के लिए नुकसान को कम करने के लिए, hydrogel भीतर बंडलों माइक्रो-टेननस के लिए पहले से विकसित सुई कम प्रौद्योगिकी का उपयोग कर प्रत्यारोपित किया जा सकता है । इस पद्धति में, hydrogel carboxymethylcellulose की एक पतली परत के साथ लेपित है कि सुई कम मस्तिष्क में प्रवेश के लिए अनुमति देता है जो प्रत्यारोपण के विघटनकारी और भड़काऊ पदचिह्न कम हो सकता है४७। बाद में, प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए इन पाड़ों की क्षमता का आकलन करने के लिए जीवित रहने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है, मेजबान ऊतक के साथ एकीकृत, और तंत्रिका प्रवास और axon मार्गदर्शन को बढ़ावा देने । विशेष रूप से, इन का निर्माण एक अंत के साथ प्रत्यारोपित किया जा सकता है ऐसे SVZ के रूप में एक तंत्रिकाजन्य क्षेत्र से उत्पंन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और neuroblasts के अपने पूल का उपयोग करने के लिए, RMS की प्रत्यक्ष नकल में, और अंय अंत में एक चोट साइट से जुड़े संभावित ड्राइव तंत्रिका प्रवास और एक पैमाइश फैशन में क्षेत्र को फिर से आबाद ।

प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल अनुकूलन के बाद, तकनीक अंय क्षेत्रों में सुधार किया जा सकता है । सूक्ष्म कॉलम अपरिपक्व astrocytes के साथ विशेष रूप से गढ़े जा सकता है (जैसे रेडियल glia, RMS-प्रकार की कोशिकाओं) या परिपक्व phenotypes कि बाद में इन constructs की अपक्षयी क्षमता बढ़ाने के लिए विभेदित कर रहे है४९। में इन विट्रो glial निशान के मॉडल, परिपक्व astrocytes axon वृद्धि के लिए रास्ते बनाने की क्षमता नहीं था७१। इसके विपरीत, अपरिपक्व astrocytes विट्रो में neurite वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है और vivo में axonal पुनर्जनन जब chondroitinase एबीसी के साथ concomitantly प्रत्यारोपित CSPGs निशान में glial के उच्च स्तर को संबोधित करने के लिए७१ , ७२. व्यक्तिगत चिकित्सा के आगमन के साथ मेल करने के लिए, ऑटोलॉगस astrocytic सूक्ष्म कॉलम जैसे प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) और मानव तंत्रिका स्टेम सेल (hNSCs) के रूप में स्रोतों से स्टेम सेल बोने द्वारा विकसित किया जा सकता है । इस संशोधन इन पाड़ों व्यक्तिगत और विशिष्ट मार्ग की मरंमत और पुनर्जनन के लिए नाली के रूप में कार्य करने की अनुमति होगी । इसके अलावा, इन सेल सूत्रों का उपयोग संभव immunogenic प्रतिक्रिया है कि astrocyte आरोपण कारण हो सकता है दरकिनार कर सकते हैं । हालांकि immunogenicity iPSC सेल लाइनों के अनुसार अलग है, इन कोशिकाओं को टालना या प्रत्यारोपण पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कम करने में सैद्धांतिक रूप से सक्षम हैं, के रूप में iPSC-व्युत्पंन अंग के बाद बचके प्रतिक्रियाओं के अभाव द्वारा सुझाव दिया चूहों में आरोपण७३,७४. इसके अलावा, ऑटोलॉगस hNSCs और उनके astrocytic डेरिवेटिव allogeneic प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का दमन७५। नतीजतन, ऑटोलॉगस स्टेम सेल के साथ इन गठबंधन astrocyte नेटवर्क निर्माण इस तकनीक और नैदानिक सेटिंग में आसानी से लागू करने में एक महत्वपूर्ण भविष्य कदम हो सकता है ।

इसके अलावा सीएनएस मरंमत और पुनर्जनन के लिए नाली के रूप में आवेदन से, astrocytic रहने पाड़ों इन विट्रो परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है बिस्तरों, के साथ या बिना hydrogel एक विशेष परीक्षण प्रतिमान के लक्ष्यों के आधार पर झालर । उदाहरण के लिए, इन astrocytic constructs ंयूरॉन प्रवासन और neurite विस्तार astrocytes द्वारा मध्यस्थता के रूप में neurobiological घटना की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, नियंत्रणीय गुणों का शोषण और के मॉडल के रूप में रहने वाले पाड़ के 3 डी वातावरण vivo में स्थिति । प्रोटोकॉल इस पांडुलिपि में चर्चा की स्वयं के निर्माण विस्तृत एक कोलेजन मैट्रिक्स में एक hydrogel माइक्रो कॉलम के भीतर गठबंधन astrocytic बंडलों इकट्ठे हुए । मस्तिष्क neuroanatomy की recapitulating सुविधाओं द्वारा, विकास/अपक्षयी तंत्र, और neuroblast प्रवास रास्ते, इन प्रत्यारोपित astrocytic पाड़ क्षमता के लिए निर्देशित तंत्रिका प्रवासन और axon के लिए सहायक रास्ते की पेशकश की है क्षतिग्रस्त सीएनएस के अंयथा निरोधात्मक वातावरण में मार्गदर्शन ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

वित्तीय सहायता स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [U01-NS094340 (Cullen) और F31-NS090746 (कटियार)], माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन [चिकित्सकीय पाइपलाइन कार्यक्रम #9998 (Cullen)] द्वारा प्रदान किया गया था, पेन चिकित्सा तंत्रिका विज्ञान केंद्र पायलट पुरस्कार (Cullen), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन [ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप डीजीई-१३२१८५१ (Struzyna)], दिग्गजों मामलों के विभाग [आरआर एंड डी मेरिट समीक्षा #B1097-I (Cullen)], और अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और Materiel कमान [#W81XWH-13-207004 (Cullen) और W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter) Lhasa Medical HS.30x40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm) Fisher 21-170J The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser Fisher 21-170J Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N
Micro-spatula Fisher S50821
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11330-032 Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11195 Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups Charles River Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium Invitrogen 21103049 Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement Invitrogen 12587010 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement Invitrogen 17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Incubator Fisher 13 998 076
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip Fisher 12-548-5M
Nail polish Electron Microscopy Sciences (EMS) 72180
Fluoromont mounting medium Southern Biotech 0100-01
Poly-L-lysine Sigma P4707
Phosphate buffered saline Fisher BP3994
Triton X-100 Sigma T8787
Normal horse serum Gibco 16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody Millipore AB5804 Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody Sigma T8578 Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody Abcam ab34710 Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin Millipore AB3400 Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin Millipore AB5326 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody Invitrogen A10042 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM Sigma C1359 4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1 Life Technologies E1169 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO) Sigma 276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope Nikon Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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References

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