Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

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Bioengineering
 

Summary

Nous vous présentons le développement des faisceaux auto-assemblés, en trois dimensions du corps alignés longitudinalement astrocytaires cellulaires et des processus dans un enrobage de nouveaux biomatériaux. Ces engineered « vie échafaudages », présentant le diamètre micron-échelle mais qui s’étend de centimètres de longueur, peut servir de bancs d’essai pour étudier les mécanismes du développement neurologique ou faciliter la neurorégénération en direction de la migration neuronale et/ou axonale pathfinding.

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Katiyar, K. S., Winter, C. C., Gordián-Vélez, W. J., O'Donnell, J. C., Song, Y. J., Hernandez, N. S., Struzyna, L. A., Cullen, D. K. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (131), e55848, doi:10.3791/55848 (2018).

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Abstract

Neurotraumatologie et neurodégénératives maladie se traduisent souvent par une durée des déficits neurologiques en raison de la capacité limitée du système nerveux central (CNS) pour remplacer les neurones perdus et régénérer les voies axonales. Cependant, au cours du développement du système nerveux, la migration neuronale et extension axonale surviennent souvent le long des voies, formés par les autres cellules, dénommé « échafaudages de vie ». Cherchant à imiter ces mécanismes et à concevoir une stratégie qui contourne l’environnement inhibiteur du SNC, ce manuscrit présente un protocole visant à fabriquer des tissus d’ingénierie axée sur les astrocytes « échafaudages de vie ». Pour créer ces constructions, nous avons utilisé un système de housse nouveau biomatériau pour induire des astrocytes de s’auto-assembler en denses faisceaux tridimensionnelle des bipolaires alignés longitudinalement corps cellulaires et des processus. Tout d’abord, creux hydrogel micro-colonnes ont été assemblés, et la lumière interne a été recouvert de collagène-matrice extracellulaire. Dissociées des astrocytes corticales cérébrales ont été livrés ensuite dans la lumière de la micro-colonne cylindrique et, à un diamètre intérieur critique du < 350 µm, spontanément auto aligné et contracté pour produire des câbles fibre longue comme consistant en des faisceaux denses des processus de l’astrocyte et des fibrilles de collagène mesurant < 150 µm de diamètre, mais s’étendant à plusieurs cm de longueur. Ces engineered échafaudages de vie exposées > 97 % viabilité cellulaire et étaient presque exclusivement composée d’astrocytes exprimant une combinaison de la filament intermédiaire protéines glial-protéine fibrillaire acide (GFAP), vimentine et nestin. Ces alignement astrocyte réseaux trouvées pour fournir un substrat permissif pour fixation neuronale et alignement les neurites extension. En outre, ces constructions de maintiennent l’intégrité et l’alignement lorsque extraites de la housse d’hydrogel, ce qui les rend appropriés pour l’implantation de la CNS. Ces constructions préformées émulent structurellement cytoarchitecturaux principaux éléments d’origine naturelle gliale basée sur « vivre échafaudages » in vivo. À ce titre, ces échafaudages machiné vivants peuvent servir de bancs d’essai pour étudier les mécanismes neurologiques du développement in vitro ou faciliter neurorégénération en orientant la migration neuronale et/ou novateur Axonal suite in vivo de la dégénérescence CNS .

Introduction

Le système nerveux central (CNS) a une capacité limitée pour contrebalancer la perte et/ou un dysfonctionnement des neurones et des voies axonales qui accompagnent les États tels que traumatisme crânien (TCC), accident vasculaire cérébral, la moelle épinière lésions Médullaires aigues et neurodégénératives maladie1 ,2,3,4,5. La neurogenèse dans le SNC est limitée à un nombre limité de zones dans le cerveau, qui entravent la restauration de neurones perdus6,7. En outre, la régénération du pertes axonales voies dans le système nerveux central est insuffisante en raison de l’absence d’orientation dirigée, la présence d’inhibiteurs de l’excroissance et réactive astrogliosis suite à une avarie de tissu neural2,8, 9,10. Astrocytes ont généralement des fonctions diverses en aidant les neurones avec l’homéostasie ionique, dégagement de neurotransmetteur, la formation des synapses et neurovascular couplage11. Néanmoins, suite de dommages même doux de tissu neural, astrocytes pourraient subir des changements moléculaires, structurales et fonctionnelles, comme la transition vers un État hypertrophique11. En réponse à des traumatismes neurologiques sévères, ces changements entraînent la formation d’une cicatrice avec une pénombre contenant des astrocytes réactifs migration et un noyau de lésion qui inclut les leucocytes sont échappés de la rupture – barrière hémato encéphalique (BHE), la microglie, oligodendrocytes et fibroblastes11,12,13. Ces astrocytes réactifs atteignent une morphologie des processus filamenteux, désorganisés et présentent une expression accrue de protéines des filaments intermédiaires et des protéoglycanes de sulfate de chondroïtine (CSPG), qui entravent la régénération neuronale12. Même si au départ, la cicatrice gliale contribue à rétablir l’intégrité BBB et éviter la transmission de la réponse inflammatoire aux tissus sains avoisinants, il sert de barrière physique et biochimique contre axon régénération12,14 ,15,16. Par exemple, les axones qui rencontrent la cicatrice gliale affichent les cônes de croissance dystrophiques bulbeux et chétive croissance12. En outre, la désorganisation des processus astrocytaires après une blessure empêche l’extension de la régénération des axones17. Le résultat de ces caractéristiques inhibitrices se manifeste dans la handicaps physique et neurologique souvent permanents que les patients souffrent après neurotrauma sévère, y compris les TBI et Sci.

Quelles que soient les défis extrinsèques régénération fonctionnelle dans le SNC, les axones ont démontré posséder une capacité intrinsèque à se régénérer. Par exemple, la nature dynamique des cônes au contact de la cicatrice gliale dystrophiques croissance suggère que ces terminaisons conservent leur capacité de s’étendre à12. Par conséquent, on croit qu’un obstacle principal à la repousse axonale est l’environnement inhibitrice de la CNS après l’accident et celui fournissant un environnement plus permissif via la réduction des cicatrices gliales et/ou la fourniture des ponts régénératrices dans la cicatrice serait avantageuse. En effet, les études antérieures ont démontré que les neurones de CNS étaient capables d’étendre des axones par une lésion à l’aide de greffes de nerfs périphériques comme des ponts, qui présente un environnement plus favorable pour axon régénération12,18, 19. Plusieurs autres stratégies ont été poursuivies pour exploiter cette capacité régénératrice vestigiale. Par exemple, manipulation des voies de signalisation de la croissance cellulaire dans divers modèles de lésion entraîne la régénération axonale et cicatrice gliale réduction10,20,21. En outre, des études ont montré que le traitement avec chondroïtinase ABC, qui s’attache à la plupart des chaînes de sucre dans le CSPG, diminue l’effet inhibiteur du CSPG sécrétée par les astrocytes réactifs22. Des résultats encourageant malgré, ces approches ne fournissent pas réalisé l’orientation des cônes de croissance, ce qui peut se traduire potentiellement par régénération aberrante12et ne tiennent pas compte de la perte de neurones. Approches axées sur les cellules ont été utilisés dans les tentatives pour surmonter les effets de la cicatrice gliale et à reconstituer les cellules perdues, en particulier des neurones. Certains groupes ont dédifférenciées astrocytes réactifs en neurones, tandis que d’autres ont transplanté des cellules progénitrices neurales en lésions CNS à repeupler la zone de la blessure et de promouvoir l’axone régénération23,24, 25. Cependant, greffe de cellules souches seule est limitée par les taux de survie faibles, mauvaise intégration et maintien modeste dans le tissu endommagé5. En outre, ces stratégies axées sur la cellule ne parviennent pas à restaurer sur de longues distances axonales étendues, en particulier d’une manière contrôlée. Par conséquent, les biomatériaux en combinaison avec d’autres approches est envisagées comme des véhicules de livraison pour les différents neurones et facteurs de croissance ou cellules progénitrices26. Approches axées sur les biomatériaux disposent d’un haut degré de contrôle de la conception pour produire des constructions qui imitent le haptotaxic physique, spécifique et chemotaxic repères présent dans le micro-environnement d’en trois dimensions (3D) de l’hôte cible tissus27, 28,29,30,31,32,33,34. Reproduction de ces signaux environnementaux est primordiale pour les cellules transplantées à présenter la morphologie natif, prolifération, la migration et signalisation, entre autres caractéristiques neurobiologiques29. Malgré ces propriétés avantageuses, avancement au-delà des traditionnelles cellules ensemencées biomatériau échafaudages est nécessaire pour favoriser la régénération axonale longue distance dirigée et remplacer les neurones perdus simultanément.

Une approche alternative est basée sur le tissu neural promettant d’ingénierie « échafaudages de vie », qui soient distinguent des autres approches basées sur les cellules en raison de la présence de cellules neuronales vivantes avec une cytoarchitecture préformé qui émule la neuroanatomie natif et/ou mécanismes de développement pour faciliter le remplacement ciblé, la reconstruction et la régénération des circuits neuronaux4,35. Considérations relatives à la conception des échafaudages de vie incluent les phénotypes et les sources de cellules nerveuses, ainsi que les propriétés mécaniques et physiques et les signaux biochimiques dicté par la composition de tout accompagnement de biomatériaux35. Après fabrication in vitro, ces échafaudages de vie peuvent être implanté en vivo de molécules d’adhésion cellulaire présentes et chimiotactiques et neurotrophiques signale à réguler activement la migration cellulaire neuronale et une excroissance axon selon l’État et progression du processus de régénération,35. Les cellules gliales peuvent servir de base pour la cytoarchitecture machiné des échafaudages de la vie puisque ces cellules médient divers mécanismes de développement in vivo. Pendant le développement du cerveau, nouveaux neurones dépendent de processus basales prolongées de cellules gliales radiales de la zone ventriculaire vers la plaque corticale en voie de développement comme vie échafaudages pour migration réalisé36,37. En outre, qui s’étend de la croissance, les cônes sont indiquées pour s’orienter en détectant les signaux attractifs et répulsifs, induites par les cellules gliales de point de repère et soi-disant « révolutionnaire » des axones sont proposées pour atteindre les objectifs corrects en étendant le long des motifs glial échafaudages35,38,,39. Ainsi, les cellules gliales sont nécessaires pour l’orientation des pionniers des axones, qui servent par la suite comme axée sur l’axone « échafaudages vivant » pour diriger la projection des axones « suiveur ». En outre, les mécanismes de croissance médiée par les cellules gliales ont démontré que persistent après la naissance, tout comme les neuroblastes suivent le flux migratoire rostral (RMS) pour naviguer de la zone sous-ventriculaire (SVZ), une des rares régions restantes de la neurogenèse dans le cerveau adulte, à la bulbe olfactif (OB)40. Ces neuroblastes dans le RMS migrent à l’intérieur du tube glial (Figure 1 a-1), qui comprend des processus astrocytaires alignés longitudinalement, via les adhérences cellule-cellule directe et par des facteurs solubles37, 41. Enfin, alors que les dégâts de la CNS à causes des mammifères perturbé arrangement processus astrocytaires formant une cicatrice gliale qui empêche physiquement la régénération axonale17, beaucoup de systèmes non mammifères n’ont pas la formation d’une cicatrice gliale préjudiciable. Plutôt, les cellules gliales non-mammifère d¿espèces maintiennent plus organisé, alignés sur les modèles qui sont utilisés comme guides à travers la région lésée17,42,43. Par exemple, modèles de non-mammifère SCI, axones sont divulgués à se développer en étroite association avec gliales ponts traversant la lésion, ce qui suggère un rôle important pour échafaudages gliales organisées comme substrats facilitant la régénération axonale et la récupération fonctionnelle ( Figure 1 a -2) 42 , 44 , 45. récapitulation des caractéristiques neuroanatomiques et les mécanismes du développement/régénératrice décrits ci-dessus peut-être donner une nouvelle classe d’échafaudages machiné vie gliales qui permet de piloter simultanément la migration neuronale immature et axonale découvrir à travers des environnements non permissif dans le cas contraire, ce qui peut atténuer les effets des neurones et axon tract dégénérescence associée aux maladies et des blessures de la CNS.

Notre groupe de recherche a déjà conçu plusieurs types d’échafaudages de vie pour la reconstruction et la régénération axonale parcelles dans le SNC et le système nerveux périphérique (PNS) via micro-tissu fabriqué réseaux neuronaux (micro-ados) et tissu ingénierie des greffes nerveuses (TENGs), respectivement27,46,47,48. Les deux stratégies reposent fondamentalement sur "biomimétisme". Micro-ados sont des structures d’inspiration anatomiquement conçus structurellement et fonctionnellement remplacer tracts axones reliant les différentes populations de neurones du cerveau. TENGs exploiter le mécanisme du développement de la régénération axonale facilitées par axon, illustrée par croissance axonale « suiveur » le long des axones de « pionnier », pour atteindre l’hôte ciblé la régénération axonale35,46,48. Nous avons récemment capitalisés sur la polyvalence de l’échafaudage de vie technique utilisant un modèle similaire de la housse comme micro-ados et cherchant l’inspiration dans les mécanismes de cellules gliales présentes tout au long du développement. Ici, nous avons développé des constructions constituée d’astrocytes alignés s’étendant sur la lumière du collagène d’un hydrogel micro-colonne49. Ces échafaudages de vie astrocytaires sont mis au point par premier remplissage un pointeau de tube capillaire-acupuncture avec liquide d’agarose pour créer un hydrogel cylindrique creux avec un diamètre extérieur (OD) et le diamètre intérieur (ID) correspondant aux diamètres de la tube et l’aiguille, respectivement. Après gélification d’agarose et extraction de l’hydrogel micro-colonne du tube capillaire, l’intérieur creux est recouvert de type j’ai collagène pour fournir un environnement permissif pour adhérence astrocyte et aligné bundle formation (Figure 1 b -1). Par la suite, la lumière est ensemencée avec des astrocytes corticaux cérébraux isolées de ratons postnatal (Figure 1 b-2). Contrairement aux techniques bidimensionnelles (2D) alignement qui s’appuient sur l’application de champs électriques, micromotifs rainures et matrice extracellulaire protéines (ECM) le patterning, alignement des astrocytes dans l’échafaudage de vie technique se fonde sur l’auto-assemblage selon les variables contrôlables comme la courbure de substrat (ID de la colonne), la densité cellulaire et collagène concentration50,51,52. Les astrocytes du contrat et remodèlent le collagène et d’acquièrent une morphologie bipolaire, alignés longitudinalement analogue aux échafaudages naturelles observées in vivo (Figure 1 b-3). En effet, nous poursuivons activement l’utilisation de ces structures ressemblant à des câbles comme substrats physiques d’orientation ciblée de la migration des neurones immatures ainsi que faciliter la régénération axonale dans l’environnement défavorable du SNC endommagé, particulièrement la cicatrice gliale chez les mammifères (Figure 1). Cet article va présenter la méthode de fabrication détaillées pour les astrocytes micro-colonnes, phase contraste et immunofluorescence des images de la cytoarchitecture attendue et un débat approfondi sur les limitations actuelles et les orientations futures de la technique.

Figure 1
Figure 1 : Inspiration, protocole de Fabrication et Applications proposées pour les réseaux astrocytaires alignées. Inspiration neurobiologiques (A) : (1) neuroblastes émanant de la zone sous-ventriculaire neurogène (SVZ) utilisent le tube glial aligné longitudinalement dans le flux migratoire rostral (RMS) pour une migration dirigée vers le bulbe olfactif (OB) ; (2) Non-mammifères tels que les amphibiens et les poissons peuvent soutenir la régénération après que tissu neural endommager en partie due à la formation d’un pont glial qui relie les extrémités d’une lésion (par exemple le percement la moelle épinière) et sert comme un échafaudage pour l’orientation des régénération des axones. (B) vue d’ensemble de la Fabrication : (1) construction d’une micro-colonne taille micron, creux hydrogel avec la lumière recouverte d’ECM, (2) semis des astrocytes corticales primaires, isolées de ratons postnatal, (3) l’auto-assemblage de l’orienté longitudinalement faisceaux dans la culture et l’extraction (4) du faisceau de la housse de biomatériau pour études d’implantation future. (C) In vivo applications : (1) ces échafaudages de vie peuvent servir des tubes gliales machinés pour la migration de neurone dirigé des centres neurogènes de repeupler des régions de neurone déficitaires ; (2) récapitulation du mécanisme du développement du pionnier de guidage axonal et le mécanisme régénératrice des ponts gliales non mammifères peut doter ces échafaudages astrocytaires avec la capacité de diriger la régénération axonale dans la non permissif environnement de la cicatrice gliale chez les mammifères. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les méthodes qui ont été approuvés par l’animalier institutionnel et l’utilisation des comités à l’Université de Pennsylvanie et le Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center et ont adhéré aux lignes directrices énoncées dans la politique de Service de santé publique de NIH sur sans cruauté Care and Use of Laboratory Animals (2015).

1. développement de l’Agarose Hydrogel Micro-colonnes

  1. Faire une solution de poids/volume (p/v) de 3 % d’agarose en pesant 3 g d’agarose et de le transférer dans un bécher stérile contenant 100 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD). Ajouter une barre magnétique stérile dans le bécher et placez-le sur la surface d’une plaque chauffante/agitateur. Garder le récipient couvert pour éviter l’évaporation de son contenu à l’étape suivante.
  2. Faire chauffer l’agarose et SPD à une température de 100 ° C et mélanger à 60-120 t/mn. Réglez ces paramètres au besoin et constamment surveiller la progression du processus de dissolution que la solution vire au départ d’opaque à un aspect clair qui signifie que l’agarose a été complètement dissous.
    ATTENTION : Le bol chaud et la solution sont chauds !
  3. Comme la solution de gel d’agarose est chauffée et brassée, récupérer quatre plats de Pétri vide de 10 cm et ajouter 20 mL de SPD à deux d'entre eux. Placer les aiguilles d’acupuncture (diamètre : 300 µm, longueur : 40 mm), microlitre tubes capillaires de verre (diamètre : 701,04 µm, longueur : 65 mm, capacité : 25,0 µL) et un distributeur de l’ampoule à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Lorsque la solution liquide d’agarose efface, maintenir constante chauffage à environ 50 ° C et en remuant pour éviter la gélification de l’agarose.
  4. Introduire une aiguille d’acupuncture dans l’ouverture inférieure d’un distributeur de l’ampoule. Insérer un tube capillaire au fil de l’aiguille exposé à l’extérieur. Fixez le tube capillaire en entrant la partie de celui-ci dans la partie en caoutchouc du cylindre distributeur ampoule.
  5. Transférer 1 mL de liquide d’agarose avec une micropipette à la surface d’une boîte de Pétri vide, puis placez une extrémité du tube capillaire verticalement (avec l’aiguille insérée) au contact de l’agarose, tandis que le bouchon sur la distributeur ampoule se coince à l’intérieur. Relâcher lentement la pression sur le bouchon du distributeur ampoule dessiner d’agarose dans le tube capillaire.
    Remarque : Le transfert d’agarose liquide dans les tubes capillaires doit être exécuté rapidement. Si l’agarose liquide est laissé à refroidir la surface de la boîte de Pétri pendant assez longtemps (environ 60 s), il commence à gel, empêchant l’aspiration adapté de l’agarose le long du tube capillaire.
  6. Place chaque ampoule-tube-pointeau dans un gratuit de Pétri et laissez l’agarose gel à l’intérieur des tubes capillaires se solidifient pour 5 min. Retirer soigneusement le tube capillaire avec vos mains sur le bouchon en caoutchouc dans le cylindre de distributeur ampoule, laissant l’aiguille et la gel d’agarose à l’intérieur du tube.
  7. Extrayez manuellement l’aiguille d’acupuncture en le tirant lentement hors du tube capillaire ; le cylindre d’agarose nouvellement solidifiée aussi glisse hors du tube dans cette procédure, toujours autour de l’aiguille. Déplacer doucement vers micro-poteau le long de l’aiguille d’acupuncture avec la pointe d’une pince stérile pour le déplacer vers la fin. Placez l’aiguille sur un plat de Pétri contenant du SPD ouvert et poussez la micro-colonne dans le SPD avec une pince.
    Remarque : En si l’agarose micro-colonne reste dans le tube capillaire de verre lors du retrait de l’aiguille d’acupuncture, pousser doucement l’agarose micro-colonne hors du tube capillaire avec une aiguille de calibre 25 mm et dans le plat avec le SPD.
  8. Stériliser à le microscalpels ou une pince à l’aide d’un stérilisateur de boudin chaud. Faire 4 % p/v d’agarose en pesant 4 g d’agarose et de le transférer à 100 mL de SPD. Faire chauffer et remuer comme expliqué à l’étape 1.2 pour obtenir une solution claire d’agarose liquide 4 %. Maintenir le chauffage et l’agitation de la solution dans l’ensemble les étapes suivantes.
  9. Placer les boîtes de Petri contenant les colonnes-micro à une hotte de dissection et déplacer une colonne en micro avec une pince fine pour un plat de Pétri vide. Utiliser le stéréoscope pour guidage visuel et un microscalpel pour couper les micro-colonnes à la longueur désirée. Coupez les deux extrémités aux extrémités de la forme biseauté à 45o angle par rapport à l’horizontale pour faciliter la manipulation des micro-colonnes au cours de l’ECM et les cellules plus.
  10. Répétez la précédente étape pour trois micro-plus de colonnes dans la même boîte de Pétri et alignez les quatre constructions en parallèle avec une séparation de < 3 mm entre chacun des cylindres. Charger 50 µL de solution à 4 % d’agarose avec une micropipette et versez une strie/ligne de liquide sur le tableau de micro-colonne pour connecter et regrouper les constructions en groupes de quatre (ci-après appelés « micro-colonne boats »). Éviter tout mouvement de 4 % d’agarose jusqu’aux extrémités des micro-colonnes, qui peuvent obstruer l’intérieur, en minimisant la distance entre les constructions et en ajoutant l’agarose rapidement en une fine ligne.
    Remarque : Organiser des groupes de micro quatre-colonnes « bateaux » n'est pas nécessaire pour fabriquer les astrocytes. Néanmoins, les bateaux servent d’accélérer le processus de fabrication et d’offrir un moyen plus sûr de circuler et de traiter les micro-colonnes dans les étapes ultérieures.
  11. Laissez refroidir le micro-colonne bateau pendant 1-2 min permettre la gélification de l’agarose supplémentaire de 4 %. Soulever le bateau micro-colonne avec une pince fine par le raccordement 4 % d’agarose et déplacez les micro-colonnes vers l’autre contenant du SPD Pétri préparées à l’étape 1.1.3. Fabriquer des bateaux plus avec les micro-colonnes restantes comme vous le souhaitez.
  12. Déplacez les boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes ou les bateaux d’une armoire de biosécurité et stériliser à l’exposition aux rayons ultraviolets (UV) pendant 30 min.
    ATTENTION : Porter une protection adéquate pour prévenir l’exposition aux UV.
  13. Stocker les plats avec les bateaux micro-colonne au SPD à 4 ° C, si l’addition de l’ECM et le placage de cellule ne produira pas immédiatement par la suite, jusqu'à 1 semaine. Répétez les étapes de la fabrication de micro-colonne si les constructions ne sont pas utilisées pendant cette période.

2. isolement et Culture cellulaire de primaire

  1. Isolement des astrocytes corticaux de ratons
    1. Pour préparer les étapes suivantes, ajouter 20 mL de Hank équilibré de solution saline (HBSS) à quatre plats de Pétri de 10 cm qui lui serviront de réservoirs pour les tissus disséqués. Garder tous les plats sur la glace. Stériliser ciseaux chirurgicaux propre, pinces, micro-spatule et micro-scalpels dans un stérilisateur de boudin chaud.
    2. Préchauffer la trypsine 0,25 % avec l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM et 0,15 mg/mL par désoxyribonucléase (DNase) I en HBSS à 37 ° C. En outre, Préchauffer le milieu de culture des astrocytes à 37 ° C, qui se compose de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) avec F-12 mélange du jambon de nutriments et 10 % sérum fœtal (SVF).
    3. Offrir une jour post-natal 0 ou ratons de jour 1 Sprague-Dawley en les exposant aux conditions de l’hypothermie et euthanasier par décapitation. Broche la tête dans un stade à l’aide d’un 19 mm jauge aiguille placée dans le museau devant les yeux.
    4. Faites une incision au scalpel au milieu postérieur à la partie antérieure, de la base du cou jusqu’au juste derrière les yeux. Effectuer une autre incision passant latéralement directement derrière les yeux vers le bas, formant une forme en T. Pince fine permet de retirer la peau/crâne crâne sur le côté.
    5. Maintenez la tête par le museau (vers le haut) en plaçant une branche de la pince dans la bouche de l’animal et l’autre sur la surface extérieure. Enlever le cerveau avec une micro-spatule stérile et placez-le dans un des plats Petri rempli de HBSS réfrigérés. Place ce Pétri sur glace immédiatement après et en tout temps sauf lorsque vous l’utilisez.
    6. Situer un bloc de granit précédemment stocké à-20 ° C au-dessous d’un stéréoscope à l’intérieur d’une hotte de dissection. Place la boîte de Pétri avec le tissu de cerveau sur la surface du bloc de granit pour préserver sa basse température au cours de la procédure de dissection. Servir le stéréoscope de guidage visuel tout au long de la procédure suivante.
    7. Si les bulbes olfactifs restent intacts, les extraire en coupant avec une pince ou microscalpels. En outre, utiliser un microscalpel pour enlever le cervelet et faire une incision médiane qui sépare les deux hémisphères cérébraux. Transférer les hémisphères avec une pince à une boîte de Pétri contenant HBSS fraîches, réfrigérées.
    8. Disséquer les structures mésencéphale depuis l’intérieur des hémisphères avec un microscalpel pour obtenir uniquement le cortex séparées. Utilisez des pinces fines à décoller les méninges, une structure en feuille, du tissu cortical et de transférer le cortex isolé à nouveau Pétri avec froid HBSS. Le microscalpel permet de découper le tissu afin d’augmenter la surface d’action de la trypsine dans l’étape suivante.
    9. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer le cortex dans un tube à centrifuger 15 mL contenant 4 mL de préchauffée trypsine-EDTA (8 cortex dans chaque tube). Exposer le tissu cortical de la trypsine-EDTA pour 5-7 min à 37 ° C.
    10. Avec une pipette Pasteur, soigneusement retirer la trypsine-EDTA et ajouter 400 µl de 0,15 mg/mL DNAse I solution dans le tube à centrifuger. Agiter le tube ou le vortex jusqu'à ce que tous les tissus sont dissocié, et il n’y a aucune pièce de tissu restant dans le liquide. S’il n’est pas possible de dissoudre complètement le tissu, enlever les fragments restants avec la pointe d’une pipette Pasteur.
    11. Centrifuger le tube contenant la solution dissocié de cellules à 200 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant avec une pipette Pasteur sans déranger les cellules. Ajouter 1 mL de milieu de culture des astrocytes (définie à l’étape 2.1.2) dans le tube avec une micropipette et agiter pour remettre en suspension et obtenir une solution homogène.
    12. Transférer 10 mL de milieu de culture astrocyte avec une pipette sérologique dans une fiole de T-75. Ajouter 250 µl de la solution de cellule de 1 mL (préparée à l’étape 2.1.11) avec une micropipette dans le ballon à un cerveau chiot d’une valeur de cellules par flacon sur plaque. Répartir la solution cellule déchargée dans le milieu de culture et agiter doucement le flacon pour mieux promouvoir une répartition uniforme.
    13. Les fioles plaqués dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2humidifié à la culture. Après avoir atteint 24 et 72 h en culture, mécaniquement agiter le flacon pour détacher des types de cellules non adhérentes, telles que des neurones et des oligodendrocytes.
    14. Par la suite, à chacun de ces points, effectuer un changement de support. Tenir le flacon verticalement pour les milieux de culture se trouve sur le fond du flacon, ne couvrant pas les cellules adhérentes. Aspirez le milieu de culture avec une pipette Pasteur, en appuyant sur l’extrémité de la pipette contre le coin en bas du ballon pour éviter l’extraction des cellules. Placer le ballon dans la position horizontale originale et doucement ajouter 10 mL de milieu astrocyte sur les cellules avec une pipette sérologique.
    15. Remettez les fioles dans l’incubateur après chaque changement de support. Après que la confluence de 90 % est atteint, mécaniquement agiter la fiole une fois de plus pour enlever toutes les cellules restantes non adhérents.
    16. Passage les astrocytes en ôtant le milieu de culture avec un vide et une pipette Pasteur. Ajouter 5 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA avec une pipette sérologique sur les cellules adhérentes. Agiter doucement le flacon pour s’assurer que la trypsine couvre toutes les cellules et incuber le ballon pendant 5-7 min à 37 ° C et 5 % de CO2.
    17. Étancher la trypsine en ajoutant 1 mL de milieu astrocyte dans les cellules avec une pipette sérologique. Extrait de la solution de la cellule du flacon avec une pipette sérologique et transférez-le dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 3 min.
    18. Retirez le surnageant avec une pipette sérologique et il resuspendre dans 1 mL de milieu de culture des astrocytes. Agiter le tube afin de s’assurer que la solution de la cellule est homogène. Compter le nombre de cellules dans la solution avec un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
      Remarque : Un ballon qui est 90 % anastomosé typiquement donne environ 3 millions d’astrocytes.
    19. Ajouter 10 mL de milieu de culture des astrocytes dans une fiole de T-75. Effectuer une dilution au 1:4 en transférant 250 µl de la solution de la cellule (point 2.1.18) avec une micropipette dans le ballon T-75 contenant déjà le milieu de culture. Agiter doucement pour assurer une distribution cellulaire homogène sur toute la surface du ballon.
    20. Répétez les étapes 2.1.16-2.1.19 chaque fois confluence de 90 % est atteint pour les cellules.
  2. Isolement des neurones corticaux de foetus de Rat
    1. Suivre les préparations similaires comme étapes 2.1.1 et 2.1.2, sauf que les médias préchauffées sont des milieux de culture Co, consistant en Neurobasal moyen + Supplément B-27 2 % (pour les neurones), Supplément d’exempt de sérum de la G-5 de 1 % (pour les astrocytes) + 0,25 % L-glutamine.
    2. Euthanasier les rats Sprague-Dawley chronométré-enceintes embryonnaires jour 18 avec asphyxie de dioxyde de carbone et de confirmer la mort par décapitation.
    3. Extraire les foetus de rat et de disséquer le cortex du reste du tissu cérébral en boîtes de Pétri contenant HBSS sur la surface du bloc de granite surgelée, à l’aide d’un stéréoscope pour guidage visuel et ciseaux stérilisés, microscalpel et53 de la pince . Après la dissection successive des chefs, cerveaux, les hémisphères cérébraux et cortex, transférer chaque tissu à un récipient Petri HBSS nouvelle.
    4. Émincer le tissu cortical en fragments plus petits pour augmenter la surface pour la trypsine. Transfert cortex 4-6 avec un Pasteur Pipeter dans un tube contenant 5 mL d’EDTA-trypsine préchauffée et maintenir à 37 ° C, de dissocier le tissu. À 5-7 min manuellement agiter le tube pour mélanger et empêcher l’agglutination du tissu.
    5. Retirez le tube de 37 ° C après 10 min. Comme expliqué précédemment à l’étape 2.1, extraire la trypsine-EDTA et remplacer par 1,8 mL de 0,15 mg/mL solution de DNAse. Par la suite, vortex le tissu jusqu'à la solution apparaît homogène, avec aucun fragment de tissu flottant dans le liquide.
    6. Centrifuger la solution tissus dissociés à 200 x g pendant 3 min. Après avoir retiré le liquide surnageant, resuspendre dans 2 mL de milieu de culture mixte. Compter le nombre de cellules dans cette solution avec un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
      Remarque : Le rendement habituel est de 3,0 à 5,0 x 106 cellules/corticale hémisphère.
    7. Préparer une nouvelle solution de cellule avec une densité de 2,0 à 4,0 x 105 cellules/mL dans les milieux de culture co définies ci-dessus.

3. développement des astrocytes câbles à l’intérieur des Micro-colonnes

  1. Fabrication de noyau ECM
    Remarque : L’ECM doit être ajoutée à l’intérieur de l’hydrogel micro-colonnes le même jour où cell semis seront effectué.
    1. À l’intérieur d’une armoire de biosécurité, préparer un 1 mg/mL solution de queue de rat collagène de type I dans le milieu de culture mixte dans un tube de microcentrifuge stérile. Maintenir le tube de microcentrifuge avec la solution ECM sur glace en tout temps sauf lorsqu’il est en cours d’utilisation.
    2. Transférer 1-2 µL de la solution ECM avec une micropipette sur une bande de papier de tournesol pour estimer son pH. Ajouter 1 µL de 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH) ou l’acide chlorhydrique (HCl) avec une micropipette pour augmenter ou diminuer le pH de la solution ECM, respectivement et Pipeter de haut en bas pour homogénéiser. Vérifier le pH de nouveau avec une bande de papier de tournesol et ajouter plus acide ou base, si nécessaire, jusqu'à ce que le pH soit stable dans la gamme 7,2 – 7,4.
    3. Déplacez les boîtes de Pétri d’étape 1.2 à une hotte de dissection et déposer 4-5 micro-colonnes ou un bateau avec une pince fine stérile dans un vide et stérile 35 ou 60 mm Pétri. En utilisant le stéréoscope pour orientation, situer la pointe 10 µL d’une micropipette à une extrémité de chaque micro-colonne et aspiration de vider la lumière des bulles d’air et le SPD. Confirmer l’absence de bulles d’air avec le stéréoscope pour s’assurer que l’ECM a ajouté à l’étape suivante puisse s’écouler librement à travers la lumière.
    4. Charger une micropipette P10 avec solution ECM, place les 10 µL Astuce contre une extrémité de l’hydrogel micro-colonnes et fournir suffisamment de solution pour combler la lumière (environ 3-5 µL), observant l’entrée de l’ECM avec le stéréoscope. Pipetter un petit réservoir (2-4 µL) de solution ECM aux deux extrémités de la micro-colonne.
      NOTE : Toujours gérer 4-5 micro-colonnes ou un bateau à la fois pour éviter une longue séchage des constructions, car cela pourrait entraîner la froisser de la structure micro-colonne. Micro-colonnes complètement séchés fixent fermement à la surface de la boîtes de Pétri, qui empêche leur utilisation pour l’ensemencement de la cellule. Impossible d’ajouter des quantités excessives de milieux de culture Co (comme une mesure de l’hydratation) aux micro-colonnes car cela pourrait provoquer l’ECM s’écoule pendant la période d’incubation décrite ci-dessous.
    5. Pipetter médias culture mixte dans un anneau autour de la boîte de Pétri pour fournir un récepteur d’humidité afin d’éviter les colonnes ne se dessèchent pas durant l’incubation. Incuber le plat de Pétri contenant les colonnes micro ECM-contenant à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 1 h à promouvoir la polymérisation du collagène avant d’ajouter les neurones ou les astrocytes.
      Remarque : L’ECM devrait former une couche de revêtement de la surface intérieure de la lumière du creuse, plutôt que d’un noyau solide de ECM englobant l’intérieur, qui peuvent être observés à l’aide du stéréoscope. Si l’ECM forme un noyau, poursuivre la période d’incubation jusqu'à ce que la couche est à gauche. Avec cette couche formée, la solution de cellules astrocytes peut remplir l’intérieur de la micro-colonne dans les étapes de l’électrodéposition.
    6. Au cours de la période d’incubation, préparer la solution de cellule d’astrocyte (comme décrit ci-dessous).
  2. Astrocytes et neurones ensemencement dans les Micro-colonnes
    1. Passage des astrocytes plaqués (entre le passage de la quatrième et douzième) comme expliqué dans les étapes 2.1.16-2.1.19. Après avoir compté le nombre de cellules dans la fiole, préparer la solution de cellules à une densité de 9.0-12,0 x 105 cellules/mL de solution suspendue dans les milieux de culture cellulaire.
    2. À l’aide d’un stéréoscope, placer l’extrémité d’une micropipette P10 à une extrémité des micro-colonnes et transférer la solution cellulaire suffisante (~ 5 µL) dans la lumière pour le remplir complètement. Comme ci-dessus avec l’ECM, ajouter des petits réservoirs de solution de la cellule aux deux extrémités de chaque micro-colonne.
    3. Incuber les micro-colonnes plaqués sur les boîtes de Pétri à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 1 h à promouvoir l’attachement des astrocytes à l’ECM. Si les neurones ne seront pas ajoutés aux micro-colonnes, passez à l’étape 3.2.5.
    4. Après la période initiale d’incubation, ajouter 1-2 µL de la solution de neurones corticaux obtenue à l’étape 2.2.7 dans les deux extrémités des micro-colonnes avec une micropipette, tout en observant sous le stéréoscope. Veiller à ce que les médias suffisant sont présent dans les plats pour éviter le séchage et incuber à nouveau pendant 40 min à 37 ° C et 5 % de CO2 pour permettre l’adhérence des neurones.
      NOTE : Solution de neurones corticaux peut également être ajoutée 1-2 jours après la formation de bundle, exécution étape 3.2.4 après avoir soigneusement enlevé les milieux de culture de la boîte de Pétri avec une micropipette.
    5. Après l’incubation, période, soigneusement remplir les boîtes de Pétri contenant les colonnes micro plaqués avec 3 ou 6 mL de milieux de culture Co pour boîtes de Petri 35 ou 60 mm, respectivement. Maintenir les micro-colonnes plaqués en culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pour promouvoir l’auto-assemblage des faisceaux astrocytaires alignés, qui devraient former une structure groupée, comme câble après 6 à 10 h.
  3. Stabilisation de l’Astrocyte câble Architecture
    Remarque : Après la formation de faisceaux, environ 6 à 12 h de culture les constructions, effectuez les opérations suivantes pour empêcher l’effondrement de la structure alignée des astrocytes utilisés.
    1. Dans un tube stérile microcentrifuge, préparer un collagène de queue de rat de 3 mg/mL j’ai solution dans des milieux de culture mixte. Ajuster le pH de la solution à 7,2-7,4 suivant la procédure décrite à l’étape 3.1.2. Maintenir les médias de stock et co-culture de collagène sur la glace quand pas en service et placer la solution de collagène préparés sur la glace en permanence.
    2. Retirez le support de la boîtes de Pétri contenant les échafaudages astrocytaires avec une micropipette, laissant certains médias sur les côtés du plat pour créer un récepteur d’humidité qui assure l’hydratation des micro-colonnes. Placer le plat dans un stéréoscope pour aider à la visualisation.
    3. Avec une micropipette, prendre 2 à 3 µL de solution de collagène et décharge à chaque extrémité des micro-colonnes en utilisant le stéréoscope pour guidage visuel. Assurez-vous que le plat a suffisamment médiatique autour des côtés d’agir comme un réservoir d’humidité sur les bords du plat. Incuber les boîtes de Pétri avec les micro-colonnes pendant 30 min à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié pour favoriser la gélification du collagène nouvellement ajouté.
    4. Ajouter lentement les 3 ou 6 mL de milieu de culture Co (35 ou 60 mm Petri plats, respectivement) à la Petri plats avec une pipette et la culture de la vaisselle dans un incubateur humidifié à 37 oC et 5 % de CO2.

4. extraction des astrocytes faisceaux de l’intérieur de l’Hydrogel

  1. Stériliser des lamelles de verre dans un autoclave. Préparer une solution de 20 µg/mL de la poly-L-lysine (PLL) dans l’eau de la culture de la qualité cellule stérile.
  2. Manuellement à l’intérieur d’une armoire de biosécurité, transférer les lamelles de verre stérilisé dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm et ajouter la solution PLL suffisante pour couvrir les lamelles.
  3. Incuber les lamelles, recouvert de la solution de la PLL, pendant 30 min à 37 ° C à recouvrir la surface. Enlever la solution PLL avec une pipette Pasteur après 30 min. Rincer trois fois en ajoutant l’eau qualité de culture cellulaire à la lamelle et retirer avec une pipette Pasteur.
  4. Après la formation du faisceau glial aligné, transférer la micro-colonne délicatement dans une boîte de Petri stérile avec une pince fine stérile et ajouter un petit bassin de 10 µL de milieux de culture Co avec une micropipette pour prévenir la déshydratation et assurer la santé bundle. Extrait le bundle astrocytaires l’hydrogel micro-colonne en tirant doucement d’un bout avec une pince chirurgicale stérile, à l’aide d’un stéréoscope pour guidage visuel.
  5. Le bundle astrocytaires en tenant avec une pince, monter sur une lamelle de PLL-enduit. Difficulté et tacher avec le protocole ci-dessous.

5. l’immunocytochimie pour des études In Vitro

Remarque : Pour cette étude, les anticorps primaires étaient de lapin anti-acides protéine fibrillaire gliale (GFAP) (1/500), anti-β-tubuline III (1/500) de souris, de lapin anti-collagène I (1/500), souris anti-nestin (1 : 200) et lapin anti-vimentine (1/100). Les anticorps secondaires sont âne anti-souris 568, 568 anti-lapin d’âne, anti-lapin d’âne 488 et anti-souris âne 568 (1/500 pour tous). Dans tous les cas, ajouter un volume suffisant de chaque solution pour couvrir entièrement les micro-colonnes.

  1. Préparer une solution de formaldéhyde de volume/volume (v/v) de 4 % à 1 x DPBS à l’intérieur d’une hotte chimique.
    ATTENTION : le formaldéhyde est un composé toxique, connu pour être cancérigènes et doit être jeté dans un récipient séparé. Toujours manipuler ce composé à l’intérieur d’une hotte chimique et d’utiliser l’équipement de protection individuelle (EPI) comme manteau de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants.
  2. Dans le cas des micro-colonnes, jeter les milieux de culture, de la vaisselle de Petri contenant les constructions avec une pipette Pasteur sans aspiration accidentellement les cylindres d’hydrogel. Ajouter la solution de formaldéhyde suffisante pour couvrir les micro-colonnes ou les lamelles montés (qui restent sur les boîtes de Pétri) et incuber pendant 35 min à 18-24 ° C.
  3. La solution de formaldéhyde de 4,0 % extrait des micro-colonnes fixes ou les lamelles couvre-objet avec une pipette sérologique. Rincez les micro-colonnes fixes trois fois avec du PBS par rapidement en ajoutant et supprimant les PBS deux fois et puis les laisser tremper pour 10 min une troisième fois.
  4. Sérum de cheval normal (NHS), dissoudre dans du PBS pour une concentration de 4 % v / c. préparer une solution avec un détergent non ionique à une concentration de 0,3 % v/v à l’aide de la solution de NHS comme solvant.
  5. Enlever les PBS de la vaisselle de Petri contenant les colonnes micro ou les lamelles couvre-objet avec une pipette. Ajouter suffisamment 0,3 % solution détergente pour couvrir le micro-colonnes/lamelles pendant 60 min à 18-24 ° C pour permeabilize des cellules.
  6. Sortez la solution détergente et rincez rapidement deux fois avec du PBS et trois fois en faisant tremper pendant 5 min. calculer le volume requis de 4 % NHS et chacun des anticorps primaires pour préparer une solution avec les concentrations d’anticorps désiré.
  7. Retirer les PBS de la boîtes de Pétri et ajouter suffisamment d’anticorps primaire (dilué dans 4 % NHS-SPD) solution pour couvrir les micro-colonnes ou les faisceaux astrocytaires extraites. Incuber pendant la nuit (12-16 h) à 4 ° C.
  8. Souscrire à la solution d’anticorps primaire et rincer rapidement deux fois avec du PBS et trois fois en faisant tremper pendant 5 min chacun. Préparer la solution d’anticorps secondaire, dans l’obscurité, avec chaque anticorps présent à une dilution de 1/500 dans la solution de NHS de 4,0 %.
  9. Incuber les cellules avec la solution d’anticorps secondaire pendant 2 h 18 et 24 ° c. Pendant toute la durée de l’incubation, couvrir les boîtes de Pétri contenant les micro-colonnes avec du papier aluminium pour éviter l’exposition à la lumière.
  10. Enlever la solution de l’anticorps secondaire et ajouter la solution de Hoechst (01:10, 000) pendant 10 min à 18-24 ° C pour colorer les noyaux.
    ATTENTION : Hoechst est un mutagène connu qui devrait être considéré comme une substance cancérogène. Par conséquent, il doit être jeté dans un récipient séparé et EPI doit être utilisé à tout moment lors de la manipulation de cet agent.
  11. Rincer avec du PBS cinq fois, à chaque fois pendant 5-10 min. par la suite, stocker les micro-colonnes colorées à 4 ° C dans du PBS et la couverture de papier d’aluminium. Dans le cas des faisceaux astrocytaires montés, ajouter une goutte de milieu de montage aqueux à un forfait, placez une autre lamelle de verre sur le faisceau fixe et scelle les deux lamelles couvre-objet avec vernis à ongles pour stockage à long terme et l’imagerie ultérieur.

6. viabilité dosage avec Live-dead (homodimère de calcéine-AM / d’éthidium) coloration

  1. Préparer la solution de réactif en ajoutant 5 μl calcéine AM (4 mM en anhydre diméthyl sulfoxyde (DMSO)) et 20 μl d’éthidium homodimère-1 (EthD-1) (2 mM de DMSO/H2O 1:4 v/v) à 10 mL de 1 x DPBS. Couvrir la solution avec du papier aluminium ou stocker dans l’obscurité pour le protéger de la lumière.
  2. Aspirer les médias de la boîte de Pétri contenant les colonnes micro plaqués avec une pipette Pasteur et ajouter suffisamment de solution (préparé ci-dessus) pour couvrir les constructions. Incuber 30 min à 37 ° C et 5 % CO2, garder la boîte de Pétri couverts pour protéger la solution de la lumière.
  3. Supprimer la solution avec une micropipette ou d’une pipette Pasteur. Rincer 2 - 3 fois avec le SPD comme expliqué dans l’étape 5.3. Inonder les boîtes de Pétri avec SPD selon la taille du plat. Cellules d’image immédiatement après utilisation épifluorescence ou imagerie confocale.
    Remarque : Conversion de la membrane perméable calcéine AM de calcéine par cellules métaboliquement actives donne la fluorescence verte de calcéine. Les cellules mortes sont marqués comme cellules de membrane-compromise, permettant l’entrée de EthD-1 dans la cellule et sa liaison aux acides nucléiques, causant une fluorescence rouge.

Representative Results

Au départ, contraste de phase microscopie a été utilisée pour surveiller la progression de la formation groupée et adhérence astrocyte et la stabilité globale de la cytoarchitecture en fonction du temps. À 1 h après l’ensemencement, les astrocytes ont été trouvés tout au long de la lumière des micro-colonnes avec une morphologie sphérique (Figure 2 a). À 5 h, astrocytes a commencé à étendre les processus et passation de marchés, même si après 8 h cellules présentaient une morphologie complète de processus portant et forment des structures ressemblant à des câbles orientées selon l’axe longitudinal de la micro-colonne (Figure 2 a). Notamment, par rapport à la présence au départ dispersée des cellules sur les micro-colonnes, astrocytes semblent avoir contracté pour former un réseau de faisceaux denses le long de l’intérieur (Figure 2 b). Après l’alignement de la cellule initiale, les réseaux d’astrocyte souvent rassemblées le long de l’axe longitudinal, ressemblant à une fermeture à glissière de fermeture, pour former un faisceau dense dans le centre de la micro-colonne (Figure 2). La formation de cette architecture groupée est due à un processus d’auto-assemblage, en partie dictée par le choix de la densité de la micro-colonne ID et cell. Astrocytes alignés et acquis une morphologie bipolaire lorsqu’ensemencées en micro-colonnes avec un ID de moins de 350 µm (Figure 3 b, top et middle et 3D-3F)49. Au contraire, ces cellules ont démontré la directionnalité aléatoire lorsqu’un ID de 1 mm a été utilisé (Figure 3 b, en bas), qui est semblable à l’aspect des cultures astrocyte 2D exposés pour le milieu sans sérum, co-culture moyenne (Figure 3 a, droite). En outre, même si astrocytes affichent toujours l’alignement à de faibles densités de semis (2,0-3,0 x 105 cellules/mL ou 2,0-3,0 x 102 cellules/mm3) (Figure 3), réseaux denses sont forment uniquement à la forte densité (9.0-12,0 x 105 cellules/mL ou 9.0-12,0 x 102 cellules/mm3) au sein de la micro-colonnes cylindriques de dimensions semblables (vu dans la Figure 3 b, en haut), comme le suggère dans le protocole49. Viabilité dans les astrocytes faisceaux a été quantifiée, utilisant le test de vivre/morts, comme le rapport entre la zone de cellules réagissant vert (calcéine AM) par rapport à la superficie totale de cellules réagissant vert (calcéine AM) et rouge (EthD-1). La viabilité des faisceaux astrocytaires était de 97,4 %, ce qui est similaire à la viabilité de 98,2 % des contrôles de culture astrocyte 2D (Figure 4 a-4 b), prouvant que l’environnement au sein des micro-colonnes est adapté à la vitalité de l’astrocyte ( Figure 4E). Les reconstructions 3D des cellules vivantes et mortes dans les échafaudages astrocytaires démontrent également l’alignement global de cellule dans les constructions (Figure 4-4D). En outre, ultra-longue astrocytaires micro-colonnes ont été développés pour étudier la stabilité des faisceaux astrocyte avec la bonne longueur. Même à la distance extraordinaire de 3,5 cm, la cytoarchitecture de faisceaux astrocytaires alignés, dense et sous contrat a été soutenue uniformément sur toute la longueur de la micro-colonne (Figure 5 a), vue aussi clairement dans les régions de zoom de la micro-colonnes (Figure 5 b-5C).

Une fois formés, les faisceaux étaient fixes et colorées par immunocytochimie techniques pour les protéines des filaments intermédiaires caractéristiques des cellules gliales, tels que GFAP, nestin et vimentine. Les images confocales confirment la morphologie des processus contenant des astrocytes et alignement longitudinal de processus (Figure 6 et Figure 7). Expression des protéines filament intermédiaire peut être vu dans les deux cultures astrocyte 2D (Figure 7 a) ainsi que les faisceaux astrocyte dans la micro-colonne (Figure 6, Figure 7 b-7D). En outre, collagène coloration corrobore la présence de cette protéine de l’ECM dans les micro-colonnes. Les astrocytes ne forment pas une structure continue avec le collagène lorsqu’il est cultivé dans un environnement 2D (Figure 8 a), alors que les astrocytes semblent respecter et remodeler le collagène présent dans la lumière lorsqu’il est cultivé dans les micro-colonnes, qui permet pour la contraction et le faisceau de la formation des cellules (Figure 8 b). Superposition des canaux GFAP et collagène a démontré que les câbles de l’astrocyte consistaient en un processus étroitement associés avec des fibres de collagène longitudinale (Figure 8 b). Donc, en dehors de l’offre d’ancrage, des fibrilles de collagène peuvent également ont fourni supplémentaires signaux directionnels pour les astrocytes former des faisceaux denses après contraction. Dans certains cas, la contraction astrocyte-collagène persistantes, résultant en un effondrement du faisceau aligné sur une période de 12 à 24 h après la formation (Figure 9 a). Afin de stabiliser l’architecture astrocyte câble ressemblant au sein de l’hydrogel micro-colonnes, matrice de collagène supplémentaire a été ajouté à l’extrémité d’un ensemble entièrement formée à inhiber la contraction et l’effondrement. Ce renforcement technique a permis la survie de l’architecture câble désirée pendant au moins 4 jours, avec une fenêtre plus longue de stabilité devrait (Figure 9 b). En outre, représentant faisceaux astrocytaires ont été extraites de l’hydrogel micro-colonne, monté et fixé avec 4 % de formaldéhyde sur couvre-objet en verre pour évaluer leur robustesse lorsqu’ils sont exposés aux forces de tension et à l’environnement extérieur. Même après le processus d’extraction et de manipulation physique dans des formes différentes (Figure 10 a, 10 b), le corps cellulaires astrocytes et maintenus une alignées, livré à micro-échelle morphologie (Figure 10), mettant en évidence la résilience de l’échafaudage astrocytaires auto-alignement, une fois formée, même si le soutien structurel de la micro-colonne hydrogel est absent.

Les neurones corticaux primaires provenaient d’échantillons aussi conjointement avec astrocytes à l’intérieur des micro-colonnes d’examiner si les faisceaux astrocyte étaient capables de fomenter l’adhésion neuronale et la croissance des neurites. GFAP et la protéine microtubulaire tubuline β III ont été utilisés comme marqueurs spécifiques pour les astrocytes et les neurones, respectivement. Figure 11 a montre que les astrocytes ont ensemencé avec les neurones corticaux étaient également capables d’exposer le processus et former des faisceaux alignés. Il semble que les neurones ont adhéré préférentiellement pour les faisceaux astrocyte, depuis tous les β-tubuline positive III coloration localisée conjointement avec GFAP (superpositions Figure 11 b-11 C). Afin de démontrer les propriétés régénératrices des constructions d’astrocytes, neurones corticaux (Figure 12 b) ont été cultivées au sein de l’hydrogel micro-colonne 2 jours après les astrocytes ont plaqué (Figure 12 a). Neurones attachés au lot de l’astrocyte et étendu des neurites directement le long du tractus astrocytaires. Une inspection plus approfondie a montré la croissance neuritique orientée dans la direction du câble astrocytaires, tandis que dans les régions où les voies de l’astrocyte n’était pas présente, les neurites voyait croître de manière désorganisée (Figure 12). Ces observations démontrent que le protocole se traduit par des réseaux astrocytaires alignés, viables et robustes qui ont le potentiel d’agir en tant que voies de vie implantables favorisant l’adhérence et la croissante neuritique l’excroissance des neurones.

Figure 2
Figure 2 : fond clair microscopie montre la Formation de faisceaux Astrocyte dans Hydrogel Micro-colonnes au fil du temps. (A) la morphologie Astrocyte en fonction du temps après placage : astrocytes (1 h) sont de forme sphérique et dispersées tout au long de la construction ; les astrocytes (5 h) lancer processus extension et la contraction ; les astrocytes (8 h) ont aligné et contracté. Barreaux de l’échelle = 100 µm. (B) forfait formation au fil du temps en un échafaudage représentant supplémentaire : (1 h) initialement les astrocytes sont sphériques et ne présentent pas de processus ; (24h) une touffe dense de processus astrocytaires est formé. Barreaux de l’échelle = 300 µm (à gauche) et 500 µm (à droite). (C) complètement formées astrocytaires bundle 24h après l’ensemencement, montrant un effet « anti-effilochage », où les extrémités du câble attachent à extrémités distinctes des parois de la lumière. Echelle = 1000 µm.

Figure 3
Figure 3 : diamètre intérieur Micro-colonne et Influence de la densité cellulaire l’auto-assemblage des faisceaux alignés des Astrocytes bipolaires. (A) 2D astrocyte cultures avec les milieux contenant du sérum (à gauche) et les milieux de culture co sans sérum (à droite) montrent une morphologie hors procédé et multiprocessus roulement, respectivement. Barreaux de l’échelle = 100 µm. (B) Astrocytes injectées à haute densité (9.0-12,0 x 105 cellules/mL) en micro-colonnes avec un ID de 180 et 350 µm faisceaux de forme aligné par rapport à l’axe longitudinal, tandis que l’ID de 1 mm dans les astrocytes, affichage multiple, processus non alignés tout au long du diamètre de la lumière. Barreaux de l’échelle = 100 µm (haut, moyen) et 150 µm (en bas). (C) les Astrocytes ensemencées dans une micro-colonne 350 µm ID à faible densité (2,0 à 4,0 x 105 cellules/mL) sont alignés, mais pas livrés. Echelle = 100 µm. (D) lorsque plaqué dans une micro-colonne 350 µm ID à densité cellulaire faible ou moyenne, les astrocytes acquièrent une morphologie bipolaire. Barreaux de l’échelle = 300 µm. (E) Box en D montrant un zoom-in des chaînes des astrocytes bipolaires qui se forment à l’intérieur de l’hydrogel micro-colonnes. Echelle = 300 µm. (F) exemple d’un astrocyte bipolaire individuel. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Astrocytes demeurent viables après Bundle Formation au sein de la Micro-colonne Hydrogel. (A-B), (C-D) des reconstructions confocale 3D montrant la viabilité des cellules tout au long des cultures planaires et faisceaux astrocytaires alignés, respectivement, comme dosés calcéine-AM / d’éthidium homodimère de coloration (vert-live cellules ; cellules rouges-morts). (E) Quantification des cellules vivantes et mortes ont entraîné dans un pourcentage similaire des astrocytes de vivre/morts lorsqu’il est cultivé sur une surface 2D et les micro-colonnes. Barres d’erreur représentent déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Image à contraste de Phase d’un faisceau astrocytaires aligné ultra-longue représentatif au sein de l’Hydrogel Micro-colonne. (A) Bundle formation sur toute la longueur d’une colonne-micro de 3,5 cm. Echelle = 1 000 µm. (B-C) supérieur grossissement zoom-ins montrant astrocyte alignement dans diverses régions le long de la totalité de la construction, correspondant aux boîtes à l’A. Barreaux de l’échelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : immunomarquage des échafaudages astrocytaires montre l’alignement Longitudinal des processus astrocytaires. (A) Confocal reconstruction d’un bundle astrocytaires présentant une coloration pour la GFAP (rouge ; gauche) et noyaux (Hoechst ; moyen) et une superposition des deux canaux (à droite). (B) supérieur grossissement zoom composant logiciel enfichable du faisceau astrocytaires dans la région en boîte a permet visualisation de la cytoarchitecture des astrocytes dans micro-colonnes. Barreaux de l’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : caractérisation des faisceaux astrocytaires représentatif par immunocytochimie. (A-B) Astrocytes cultivés sur des surfaces 2D et ensemencé en hydrogel micro-colonnes expriment similaires marqueurs astrocytes GFAP (rouge) et la vimentine (vert). (A) Confocal reconstruction d’une culture de l’astrocyte plane 2D montrant les canaux distincts et fusionnés. Echelle = 100 µm. (B) images confocales d’un bundle astrocytaires, confirmant l’expression des marqueurs et mettant en vedette l’alignement astrocyte. Echelle = 50 µm. (C-D) Astrocytes cultivés dans les micro-colonnes également exprimer les protéines des filaments intermédiaires nestin (rouge) et la vimentine (vert). (C) image confocale d’un bundle d’astrocytes. Echelle = 100 µm. (D) supérieur grossissement zoom-in de C. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Astrocytes dans les faisceaux alignés interagissent étroitement avec une matrice de collagène sous contrat, Longitudinal, par opposition à la disposition irrégulière du collagène dans les Cultures 2D. Les cellules ont été immunomarquées pour observer des astrocytes (GFAP ; rouge), les noyaux (Hoechst ; bleu) et le collagène (vert). (A) 2D astrocyte cultures avec le collagène à 1 mg/mL montrent unaligned astrocytes et collagène distribué aléatoirement. Echelle = 250 µm. collagène (B) est tiré des murs de la micro-colonne de lumière et se contracte pour former une matrice alignée qui fait partie du paquet astrocytaires. Echelle = 150 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : collagène supplémentaire peut être utilisé pour stabiliser la Structure de câbles astrocytaires. (A) faisceaux formé environ 6 h après placage des astrocytes dans collagène-enduit hydrogel micro-colonnes. Une fois que les faisceaux ont été formés, collagène plus élevé de concentration (3 mg/mL) a été ajouté aux extrémités de la micro-colonne pour inhiber la contraction des câbles astrocytaires. Dans les constructions non stabilisées avec collagène supplémentaire, les faisceaux de collagène-astrocytaires avaient commencé à se contracter de 18 h, et les câbles de l’astrocyte avaient complètement effondré par 24h. Cette contraction n’a pas été observée lorsque les faisceaux ont été renforcées avec le collagène de 3 mg/mL. Echelle = 1 000 μm. (B) de Zoom-in d’effondré bundle astrocytaires ne pas renforcie de collagène 3 mg/mL. Echelle = 500 μm. (C) de Zoom-dans des régions de collagène armé micro-colonnes. Morphologie du bundle astrocyte a été maintenue pendant l’intégralité de la micro-colonne. Barreaux de l’échelle = 500 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Extraction des faisceaux du gliome de la Micro-colonne et montage sur couvre-objet en verre revêtu de Poly-L-lysine atteste de la solidité de la Technique. (A) contraste de Phase image de plusieurs extraits des faisceaux astrocytaires, manipulés dans l’orthographe du mot « Penn ». Reconstruction confocale (B) du même extrait faisceaux colorés pour les astrocytes marqueur GFAP (rouge) et les noyaux cellulaires (Hoechst ; bleu). Echelle = 100 µm. grossissement (C) de la région en boîte B montre que, même lorsque manipulé dans des formes irrégulières, les échafaudages astrocytaires conservent une morphologie alignée, bipolaire et une cytoarchitecture groupé. Echelle = 200 µm. Note que des différences structurelles entre la phase et les images confocales est probablement un artefact de déplacement en raison de rinçage lors de la procédure de l’immunocytochimie des constructions. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : neurones respecter et prolonger les Neurites le long des faisceaux alignés Astrocyte dans Neuron-Astrocyte échafaudages co cultivés. (A) image à contraste de Phase d’un bundle astrocytaires graines neurone. Echelle = 300 µm. (B)-(C) les neurones ont été observés à respecter les faisceaux astrocytaires et étendre des neurites le long de la direction du câble (Hoechst-bleu ; GFAP-vert ; Β-tubuline III-rouge). Barreaux de l’échelle = 200 et 100 µm, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12 : Astrocyte câbles servent un échafaudage vivant pour réalisé la croissance neuritique. Reconstructions confocale montrant une région d’une micro-colonne constituée de neurones ensemencé environ 2 jours après la formation du faisceau. (A) GFAP-positive astrocyte faisceaux, les neurones de III-positif β-tubuline (B) et (C) fusion de tous les canaux, y compris les noyaux colorés à HOECHST (bleu). Notez que les neurones exposées neurites alignement quand ont adhéré aux régions avec les processus astrocyte alignés (flèches), tandis que les neurones ont adhéré pas à aligné astrocytes est apparu à exposer au hasard (c.-à-d. multi-directionnelle) la croissance neuritique (pointes de flèche). (D) Zoom-in de la région montre la directionnalité des neurites. Barreaux de l’échelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Par rapport à l’environnement plus favorable de la PNS, le système nerveux central est particulièrement limité pour traiter les conséquences néfastes de neurotraumatologie et neurodégénérescence. Après une grave insulte dans le SNC chez les mammifères, une cicatrice gliale est formée, composé d’un noyau de cellules fibreuses et inflammatoires, entouré d’un réseau dense de désorganisé astrocytes réactifs qui sécrètent axon inhibant l’excroissance des protéoglycanes14. Cette cicatrice agit comme une obstruction physique et biochimique contre la régénération axonale terminaisons12. En outre, le système nerveux central chez les mammifères adult possède des sources limitées de nouveaux neurones à restaurer les cellules perdues suite à un traumatisme ou neurodégénérescence, neurogènes centres étant limités à la SVZ, l’hippocampe gyrus denté et potentiellement d’autres généralement inactif 54de zones. Une stratégie idéale pourrait atteinte à ces deux aspects de la capacité limitée réparateur du CNS, qui ne sont pas les approches actuelles à l’adresse. Par conséquent, notre groupe de recherche a développé des échafaudages axée sur les astrocytes, visant à présenter la vie voies neurales migration vers les zones déficientes en neurone et guidée extension de régénérer des cônes de croissance des axones. Alignés les faisceaux astrocytaires contenues à l’intérieur de collagène d’une micro-colonne d’agarose constituent ces échafaudages astrocytaires vivant. Une distinction considérable de conventionnel et biomatériaux-basés sur les cellules stratégies utilisées pour la régénération et la réparation de la CNS, c’est que la cytoarchitecture de ces constructions est complètement réalisées in vitro afin de simuler plusieurs en vivo orientation axée sur les cellules gliales et architectures de l’échafaudage. Par exemple, durant le développement embryonnaire, les voies de cellules gliales radiales agissent comme vie échafaudages pour les nouveaux neurones migrent vers le néocortex et cellules gliales médient l’extension ciblée du pionnier des axones se faisant passer pour des substrats à motifs ou cellules de point de repère35 ,38,,39. Embryonnaire glie radiale dans la zone sous-ventriculaire produisent également des astrocytes qui forment des tubes gliales alignés longitudinalement, sur laquelle neuroblastes migrent après la naissance en enchaînés-formation de la SVZ au OB41. En outre, il a été démontré chez certains mammifères non-que, par suite des CNS endommagent, un plus grand degré de régénération est possible grâce à la formation d’un arrangement astrocytaires organisé, aligné44. Par exemple, le poisson-zèbre adulte sont capables de régénérer leurs moelles épinières suite à la migration des cellules gliales immatures au site de lésion, différenciation dans une morphologie bipolaire et l’allongement des processus gliales pour combler la lésion, formant un chemin qui ordonne en régénération axones45. Ingénierie constructions de faisceaux astrocytaires aligné peuvent pouvoir récapitulant ces mécanismes et de présenter les signaux structurels et solubles requis pour la migration neuronale médiée par les cellules gliales et de régénération axonale35. En outre, en raison de l’inclusion des astrocytes vivants, ces constructions peuvent présenter activement les signaux environnementaux requis basés sur les commentaires de l’hôte.

Dans notre technique, alignement de l’astrocyte est un processus d’auto-assemblage éventuel sur les repères physiques et les interactions cellule-cellule promues par le micro-colonne de diamètre intérieur, concentration de collagène et la densité de semis. Un autre atout de cette méthode est sa taille à l’échelle du micron, ce qui peut permettre pour l’implantation de mini-invasive dans les zones endommagées du SNC. En outre, les résultats présentés dans ce manuscrit démontrent que les constructions obtenues avec le protocole possèdent grande viabilité et expriment les protéines des filaments intermédiaires GFAP nestin et vimentine, indépendamment de l’âge de l’astrocyte tel que défini par le nombre de passage . Tandis que GFAP et vimentine sont exprimés dans les astrocytes immatures et matures, nestin est principalement limité aux cellules indifférenciées ou immatures, avec la maturation des cellules gliales cytoprotectrices l’expression de l’accord-cadre et de la baisse de production de nestin45, 55. études antérieures ont montré qu’astrocyte des changements de comportement avec l’âge, mais une expression cohérente de protéines des filaments intermédiaires, groupement ainsi a été vu dans un éventail de passage nombres (4-12 passages)56. Les échafaudages astrocytaires apparaissaient également pour atteindre ultra-longue, centimètre-échelle longueurs in vitro, ce qui suggère que cette technique s’adapte à la longueur de blessures distinctes et géométries rencontrent en vivo. En outre, les faisceaux alignés astrocytaires pièce remarquable intégrité structurale et la stabilité, que leur câble type cytoarchitecture est maintenue même après avoir été soumis à l’extraction des micro-colonnes. La vie axée sur l’astrocyte échafaudages également soutien neurone adhérence et la croissante neuritique excroissance, renforçant le potentiel de cette technique pour promouvoir l’extension de migration et axon neurone dirigé pour réparation de CNS.

Les faisceaux alignés astrocytaires sont contenus dans le collagène intérieur d’une gaine de protection tubulaire hydrogel. Fabrication d’échafaudages astrocytaires commence par micro-colonne Assemblée en insérant une aiguille d’acupuncture dans un tube capillaire et aspiration liquide d’agarose dedans. Agarose était le biomatériau sélectionné en raison de ses propriétés physiques et biochimiques de propriétés inertes, biocompatibilité et mécanique facile à contrôler,49. Concentration d’agarose dans l’hydrogel peut représenter une variable importante depuis les cellules stimuli mécaniques de sens de leur substrat (par exemple la rigidité) et répondre aux changements intracellulaire57. Critères de conception pour ces micro-colonnes comprend une porosité assez élevée pour permettre pour le transport de masse adéquat, mais un petit assez taille de pore d’interdire l’excroissance des processus latéral ; ces critères sont respectés par la porosité ouverte nanométriques présentes dans l’agarose à la concentration utilisée dans le présent protocole. La concentration d’agarose dans le présent protocole a également été choisie en raison de sa stabilité, facilité de manipulation et de similitude dans les propriétés mécaniques de l' environnement de cerveau58. Une étude remarquable est l’emplacement central de l’aiguille dans le tube capillaire. Souvent, l’aiguille peut être légèrement incliné ou déplacées au cours du processus, causant la lumière se trouve excentré par rapport à des murs extérieurs, après le retrait de gélification et micro-colonne d’agarose du tube. Pour éviter cela, l’aiguille doit être tendue, et l’ensemble piston-tube-aiguille doit être maintenu en position verticale, tandis que l’agarose est tracée conserver l’aiguille le long de l’axe central. La centralisation précise de la lumière protège les astrocytes alignés entre les murs d’agarose ; la lumière est plus encline à se rompre si trouve proximale à la bordure extérieure de la bouteille. En outre, une distance suffisante entre la lumière et la paroi extérieure peut offrir de bienfaits protecteurs pendant et après la transplantation (à condition que les astrocytes constructions ne sont pas retirées de la micro-colonne avant l’implant). Cette première étape de la fabrication d’échafaudages astrocytaires est primordiale pour la réussite de la technique, comme le choix du diamètre de l’aiguille est crucial pour câble et l’alignement de soma/processus approprié astrocyte auto-assemblage. Nous avons trouvé que l’alignement astrocyte dépendait inversement de micro-colonne ID, avec une gamme optimale d’ID pour l’alignement de la cellule et la formation de faisceaux astrocyte robuste étant de 180 à 350 µm (Figure 3). De même, il a été démontré précédemment que les neurones directement leur excroissance dans la direction de courbure minimale de substrat afin de réduire le processus de pliage59,60, et des mécanismes similaires sont susceptibles au travail affecte l’astrocyte alignement dans notre système49. En plus de courbure alignement d’un astrocyte, nous avons constaté qu’un 180 à 350 µm plage d’ID conduit à acquérir une morphologie bipolaire49, contrairement à la forme stellaire, multipolaire, observée avec un ID de 1 mm ou lorsque les astrocytes sont cultivées dans les astrocytes 2D (Figure 3). Il est probable que ces profonds changements morphologiques à une morphologie astrocytaire bipolaire altèrent leurs caractéristiques physiologiques par exemple, ces astrocytes peuvent exprimer des facteurs ainsis alternatifs ou des marqueurs de surface de cellules qui peuvent être avantageuses pour la régénération, mais cela garantit davantage de caractérisation. Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les choix approprié de signaux physiques, comme la courbure de la surface, sont impératif d’émulation cytoarchitecture native dans vie astrocytaires échafaudages.

Construction d’échafaudages astrocytaires procède à l’inscription séquentielle de la solution ECM de collagène et des astrocytes corticaux à l’intérieur creux des micro-colonnes. La lumière interne de la micro-colonne est revêtue de collagène pour soutenir la survie astrocyte, attachement et formation alignée bundle, en raison de l’incapacité d’agarose pour soutenir indépendamment de l’excroissance des neurites61. Une concentration de 1 mg/mL de collagène a été choisie parce que les études antérieures a déterminé que les concentrations inférieures et supérieures a entraîné un manque d’adhérence et d’instabilité de l’ECM, respectivement de49. Ainsi, comme prévu, concentration de collagène a des effets dramatiques sur l’efficacité de cette technique. En outre, la solution ECM est constitué de seulement de type I collagène. Par rapport à la laminine et enduit de Matrigel substrats pour les cultures astrocytaires 2D, astrocytes plaqué sur type j’ai collagène a démontré une adhérence optimale et réseau formation62. Le temps d’incubation utilisé pour la polymérisation de collagène avant l’ensemencement de cellule est également une étape essentielle dans le protocole. Nous avons constaté précédemment que lorsque les neurones ont été livrés en même temps avec ECM non polymérisée aux micro-colonnes d’agarose, des neurites réduite et axonale fasciculation ont été vu47, et il est possible que ces conclusions seraient étendrait aux astrocytes aussi bien. Collagène étant requis pour la formation groupée et adhérence astrocyte, la présence d’ECM tout au long de la construction et de l’absence de bulles d’air ou de vides poches devraient être visualisés et confirmés avec des techniques microscopiques.

Le protocole se termine par l’astrocyte plating, une période d’incubation pour assurer une adhérence de cellules de collagène et de la culture à court terme pour la formation de la cytoarchitecture cible. Astrocytes entre nombre de passage 4-12 ont été utilisés, car ils ont montré robuste astrocytaires réforme de groupage et de collagène. Ces astrocytes a également présenté un phénotype mature composé de > 95 % des cultures pures63,64 avec peu ou pas de contamination neuronale. Contrairement aux cultures astrocyte ordinaire, qui emploient un milieu contenant du sérum (Figure 3 a, , gauche), notre technique utilise un milieu sans sérum pour permettre des astrocytes à adopter une processus portant la morphologie (Figure 3 a, droit ) et forment des faisceaux des corps alignés et des processus au sein de la micro-colonnes62,65,66. En ce qui concerne la cellule ensemencement de concentration, des concentrations plus élevées de l’ordre de 9.0-12,0 x 105 cellules/mL, avec un ID de 350 µm, conduit à la formation de faisceaux serrés avec accompagnement transformant le collagène, tandis que les astrocytes sont plus dispersées , mais quand même aligné, lorsque des concentrations plus faibles ont été utilisées (Figure 3). Ainsi, l’effet de la concentration sur les interactions cellule-cellule de semis influe sur le degré d’alignement astrocyte et la formation des câble-comme les structures observées. L’injection de la solution de cellules dans le lumen est généralement visualisée à l’aide d’un stéréoscope d’assurer une prestation homogène sur toute la longueur du micro-colonne, qui est cruciale pour la formation continue offre groupée. Après l’ensemencement, le temps d’incubation préliminaire avant l’inondation avec les milieux de culture est indispensable pour garantir l’ancrage des astrocytes à l’ECM. La durée peut être modifiée si les astrocytes échappent les constructions, sous réserve que les constructions sont suffisamment humidifiées pour empêcher le séchage. Images de contraste de phase des astrocytes utilisés en fonction du temps ont montré que de 8 h, un réseau de faisceaux astrocytaires alignés était en train d’être formé. En outre, le détachement de l’ECM de la paroi de lumen, sa contraction qui s’ensuivie et l’association étroite entre les cellules et le collagène sous contrat a été observé lorsque des constructions ont été marquées pour le collagène et GFAP tel qu’illustré à la Figure 8. Ce phénomène est peut-être une conséquence des astrocytes forces contractiles, détacher le collagène des parois, issu des précédents rapports de la capacité de fibroblastes-comme des cellules gliales pour générer des forces qui faussent les substrats flexibles et le remodelage de la matrice capacité des astrocytes dans astrocyte seule et neuron-astrocyte cultures co28,49,67,,68. Plus précisément, une des conséquences de la motilité astrocyte et l’interaction induite par l’intégrine avec des fibrilles de collagène est la génération de forces suffisantes pour les fibrilles17,69sur les contrats. Dans l’ensemble, mise en œuvre du protocole décrit produira des échafaudages de vie composés des réseaux auto-assemblés dense, alignés structures de câble type astrocytaires qui récapitulent les substrats physiques présents à diverses étapes du développement de CNS.

Outre les problèmes individuels qui pourraient surgir dans tout le protocole, la technique de l’échafaudage astrocytaires possède autres entraves qui pourraient influer sur sa capacité à réparer le système nerveux central. Par exemple, le succès ultime de cette technique est subordonné à la plasticité du système nerveux et l’intégration fonctionnelle de l’échafaudage astrocytaires avec les circuits de l’hôte. Liées à l’implantation de ces échafaudages est la possibilité d’une réaction inflammatoire qui peut contrer les attributs pro-régénération des astrocytes faisceaux. Toutes les techniques de transplantation ont la capacité de rompre la barrière hémato - encéphalique et causer l’infiltration de cellules inflammatoires, en raison de la proximité entre les neurones et les capillaires dans le tissu47. Dans ce cas, la colonne micro d’hydrogel ou un autre jeu de housse pour les échafaudages astrocytaires peut être utilisé comme un véhicule pour la libération contrôlée des facteurs anti-inflammatoires pour diminuer la réponse inflammatoire. Initialement, le bundle astrocytaires aligné n’était pas stable à l’intérieur de la micro-colonne, alors que les forces qui obligent l’alignement de la cellule, et le remodelage de la matrice conduit finalement à l’effondrement de la cytoarchitecture désirée après 1-2 jours de culture. Cependant, effondrement de contraction et bundle supplémentaire a été entravé par fournissant des renforts supplémentaires aux forfaits aux extrémités de la micro-colonne en ajoutant le collagène de concentration plus élevé afin de maintenir l’ensemble en place. Une tactique supplémentaire pourrait être d’employer une encapsulation secondaire, dans laquelle un nouveau revêtement hydrogel est appliqué pour les faisceaux astrocytaires alignés comme ils sont tirés des micro-colonnes. Il est probable que la livraison des réseaux astrocyte alignés dans le cerveau serait aussi stabiliser les constructions en raison d’adhérences cellule-cellule entre les cellules de l’hôte et de construire sur toute la longueur, même si cela devra être testé directement dans de futures études.

En conséquence, les efforts futurs viseront à développer une méthode efficace de transplantation qui assure la stabilisation et la protection du faisceau astrocytaires pendant et après en vivo afin de permettre la migration neuronale, la prestation de réparation, et régénération dans le SNC lésé. Nous avons démontré précédemment implantation réussie de neuronale axonale base/micro-ados, qui se partagent le régime de la housse des astrocytes constructions, dans les voies corticothalamiques, résultant en une intégration de survie et de la structure avec l’hôte tissu au moins jusqu'à 1 mois46,47. Ainsi, la robustesse des câbles après extraction des micro-colonnes peut être exploitée. Dans ce cas, l’hydrogel d’agarose servirait le lit de la culture initiale pour induire l’auto-assemblage et ensuite le câble astrocytaires serait retiré de la housse et injecté directement dans le cerveau à l’aide d’une aiguille à parois minces. Astrocyte déformation due à des forces mécaniques lors de l’extraction de l’hydrogel micro-colonne n’a pas été observée et ne devrait pas. Des travaux antérieurs, étudie les effets de la déformation mécanique sur la réactivité de l’astrocyte suggèrent que toute déformation qui en résulte ne s’appliquerait assez rapidement pour induire astrocytose ou processus d’élongation62,70. Afin de minimiser les dommages aux tissus du cerveau et de la réponse inflammatoire, les faisceaux au sein de l’hydrogel pourraient être implantées en utilisant la technologie sans aiguille développée antérieurement pour micro-ados. Dans cette méthode, l’hydrogel est recouvert d’une fine couche de carboxyméthylcellulose qui permet à l’entrée sans aiguille dans le cerveau qui peut-être diminuer l’empreinte perturbateur et inflammatoire de l’implantation de47. Après, études de transplantation peuvent être réalisés pour évaluer la capacité de ces échafaudages pour survivre, de s’intégrer avec les tissus de l’hôte et promouvoir la migration neuronale et guidage axonal. En particulier, ces constructions peuvent être implantées avec une extrémité émanant d’une région neurogène comme la SVZ accéder son pool de cellules souches neurales et des neuroblastes, en imitation directe de la RMS et l’autre extrémité connectée à un site de la lésion potentiellement conduire à la migration neuronale et repeupler la région de façon mesurée.

Après optimisation de protocoles de transplantation, la technique peut être améliorée dans d’autres domaines. Les micro-colonnes peuvent être fabriqués spécifiquement avec les astrocytes immatures (p. ex. radial glia, cellules de type RMS) ou dédifférenciéesnt phénotypes matures qui sont plus tard afin d’augmenter la capacité régénérative inducteurs de ces constructions49. Dans les modèles de in vitro de la cicatrice gliale, astrocytes mûrs n’ont pas la capacité de former des voies pour axon excroissance71. En revanche, les astrocytes immatures auraient dû être divulgués afin de promouvoir l’excroissance des neurites in vitro et la régénération axonale dans vivo lorsque transplantés en même temps avec chondroïtinase ABC pour répondre aux niveaux élevés du CSPG dans la cicatrice gliale71 , 72. pour coïncider avec l’avènement de la médecine personnalisée, autologues astrocytaires micro-colonnes peuvent être développés par ensemencement des cellules souches provenant de sources telles qu’induite par les cellules souches pluripotentes (CISP) et des cellules souches neurales humaines (hNSCs). Cette modification permettra ces échafaudages de fonctionner comme conduits pour individualisée et la réparation de la voie spécifique et la régénération. En outre, l’utilisation de ces sources de cellules peut contourner l’éventuelle réponse immunogène cette implantation astrocyte pourrait causer. Même si l’immunogénicité diffère selon les lignées iPSC, ces cellules sont théoriquement capables de prévenir ou diminuer les réponses immunitaires à la transplantation, comme le suggère l’absence de réponses nocives après organe dérivé iPSC implantation chez des souris73,74. En outre, hNSCs autologues et leurs dérivés astrocytaires répriment des réponses immunitaires allogéniques75. Par conséquent, ces fabrication alignés astrocyte réseaux avec autogreffe de cellules souches peuvent être un futur critique étape pour rendre cette technique plus facilement applicable en milieu clinique.

En dehors de l’application comme conduits pour la réparation de la CNS et régénération, échafaudages astrocytaires vie peuvent servir de in vitro -bancs d’essai, avec ou sans la housse en hydrogel basée sur les objectifs d’un paradigme d’essai particulière. Par exemple, ces constructions astrocytaires peuvent être utilisées pour étudier des phénomènes neurobiologiques comme extension de migration et la croissante neuritique neurone médiée par les astrocytes, exploitant les propriétés contrôlables et l’environnement 3D des vivants utilisés comme modèles de conditions in vivo . Le protocole indiqué dans ce manuscrit en détail la fabrication d’auto-assemblés faisceaux astrocytaires alignés dans une matrice de collagène dans une hydrogel micro-colonne. En récapitulant les caractéristiques de la neuroanatomie du cerveau, des mécanismes du développement/régénératrice et voies de migration des neuroblastes, ces échafaudages astrocytaires implantables ont le potentiel d’offrir des voies de soutien adressées axone et la migration neuronale orientation dans l’environnement sinon inhibiteur du SNC endommagé.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Soutien financier a été fourni par le National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (kone)], Michael J. Fox Foundation [thérapeutiques Pipeline programme #9998 (Cullen)], Penn médecine neurosciences centre pilote Award (Cullen), National Science Foundation [bourses d’études supérieures DGE-1321851 (Struzyna)], ministère des anciens combattants [RR & D mérite examen #B1097-je (Cullen)] et l’US Army Medical Research and Materiel Command [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter) Lhasa Medical HS.30x40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm) Fisher 21-170J The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser Fisher 21-170J Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N
Micro-spatula Fisher S50821
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11330-032 Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11195 Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups Charles River Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium Invitrogen 21103049 Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement Invitrogen 12587010 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement Invitrogen 17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Incubator Fisher 13 998 076
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip Fisher 12-548-5M
Nail polish Electron Microscopy Sciences (EMS) 72180
Fluoromont mounting medium Southern Biotech 0100-01
Poly-L-lysine Sigma P4707
Phosphate buffered saline Fisher BP3994
Triton X-100 Sigma T8787
Normal horse serum Gibco 16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody Millipore AB5804 Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody Sigma T8578 Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody Abcam ab34710 Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin Millipore AB3400 Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin Millipore AB5326 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody Invitrogen A10042 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM Sigma C1359 4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1 Life Technologies E1169 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO) Sigma 276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope Nikon Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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References

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