Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

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Katiyar, K. S., Winter, C. C., Gordián-Vélez, W. J., O'Donnell, J. C., Song, Y. J., Hernandez, N. S., Struzyna, L. A., Cullen, D. K. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (131), e55848, doi:10.3791/55848 (2018).

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Abstract

NEUROTRAUMA e neurodegenerativas doença muitas vezes resultam em duração déficits neurológicos devido à capacidade limitada do sistema nervoso central (SNC) a substituir neurônios perdidos e regeneração axonal caminhos. No entanto, durante o desenvolvimento do sistema nervoso, migração neuronal e axonal extensão ocorrem frequentemente ao longo dos caminhos formados por outras células, conhecido como "andaimes de viver". Buscando para emular esses mecanismos e para a concepção de uma estratégia que contorna o ambiente inibitório do SNC, este manuscrito apresenta um protocolo para fabricar a engenharia de tecidos astrocyte-baseado "andaimes de viver". Para criar essas construções, utilizamos um esquema de invólucro romance biomaterial para induzir astrócitos de auto-montagem em feixes tridimensionais densas de bipolar somata alinhado longitudinalmente e processos. Primeiro, oco hidrogel microcolunas foram montados, e o lúmen interno foi revestido com colágeno-matriz extracelular. Astrócitos corticais cerebrais dissociados então foram entregues no lúmen da microcoluna cilíndrica e, com um diâmetro interno crítico de < 350 µm, espontaneamente Self-alinhado e contratada para produzir cabos de fibra-like longas que consiste de feixes densos dos processos de astrocyte e fibrilas de colágeno medindo < 150 µm em diâmetro ainda estender a vários centímetros de comprimento. Estas engenharia vivos andaimes exibidas > 97% de viabilidade celular e foram quase exclusivamente composta de astrócitos, expressando uma combinação de filamento intermediário proteínas glial fibrilar ácida proteína (GFAP), vimentina e nestin. Estas alinhadas astrocyte redes foram encontradas para fornecer um substrato permissivo para fixação neuronal e alinhado à extensão do axônio. Além disso, essas construções mantenham integridade e alinhamento quando extraído o invólucro de hidrogel, tornando-os adequados para implantação do CNS. Essas construções pré-formadas estruturalmente emulam chave cytoarchitectural elementos de ocorrência natural gliais com base em "vivendo andaimes" em vivo. Como tal, estes andaimes de vida projetada podem servir como teste-camas para estudar desenvolvimento neurológico mecanismos em vitro ou facilitar Epilepsias direcionando a migração neuronal e/ou axonal pathfinding degeneração CNS in vivo a seguir .

Introduction

Sistema nervoso central (SNC) tem uma capacidade limitada para compensar a perda e/ou disfunção dos neurônios e vias axonal que acompanham as condições tais como traumatismo crânio-encefálico (TCE), derrame, medular lesão (SCI) e neurodegenerativas doença1 ,2,3,4,5. Neurogênese no SNC é restrito a um número limitado de áreas no cérebro, impedindo a restauração de neurônios perdidos6,7. Além disso, a regeneração das vias axonal perdidas no SNC é insuficiente devido a falta de orientação dirigida, a presença de inibidores de consequência natural e astrogliosis reativa após danos ao tecido neural2,8, 9,10. Astrócitos normalmente têm diversas funções na assistência neurônios com homeostase iónica, liberação de neurotransmissores, formação de sinapse e neurovasculares acoplamento11. No entanto, seguindo até leve dano ao tecido neural, astrócitos podem sofrer mudanças moleculares, estruturais e funcionais como eles transição para um estado hipertrófica11. Em resposta à severa neurotrauma, estas mudanças resultam na formação de uma cicatriz com uma penumbra contendo migrando astrócitos reativos e um núcleo de lesão que inclui leucócitos vazados da ruptura barreira hemato - encefálica (BBB), microglia, oligodendrócitos e fibroblastos11,12,13. Estes astrócitos reativos atingir uma morfologia de processos filamentosos, desorganizados e exibem expressão aumentada de proteínas de filamento intermediário e proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs), que impedem a regeneração neural12. Mesmo que a cicatriz glial inicialmente ajuda a restaurar a integridade BBB e evitar a transmissão da resposta inflamatória ao tecido saudável circundante, serve como uma barreira física e bioquímica contra axônio regeneração12,14 ,15,16. Por exemplo, axônios que encontrar a cicatriz glial exibir cones de crescimento distrófica bulbosa e atrofiado crescimento12. Além disso, a desorganização dos processos hamartomas após lesão impede a extensão de regeneração de axônios17. O resultado destas características inibitório manifesta-se nas deficiências permanentes muitas vezes físicas e neurológicas que os pacientes sofrem após grave neurotrauma, incluindo TBI e Sci.

Independentemente dos extrínsecos desafios funcional regeneração no SNC, axônios demonstraram possuir uma capacidade intrínseca de se regenerar. Por exemplo, a natureza dinâmica dos cones distrófica crescimento em contato com a cicatriz glial sugere que estes finais mantém sua capacidade de estender12. Por conseguinte, acredita-se que um obstáculo principal para a re-crescimento axonal é o ambiente inibitório do CNS pós-lesão e que fornecendo um ambiente mais permissivo via redução de cicatrizes e/ou fornecendo regenerativas pontes sobre a cicatriz seria gliais vantajoso. De fato, estudos anteriores demonstraram que os neurônios do CNS eram capazes de estender axônios através de uma lesão utilizando enxertos de nervo periférico como pontes, que apresentam um ambiente mais favorável para o axônio regeneração12,18, 19. Seguiram-se diversas outras estratégias para explorar essa capacidade regenerativa vestigial. Por exemplo, manipulação de vias de sinalização celular crescimento em vários modelos de lesão resultou na regeneração axonal e cicatriz glial redução10,20,21. Além disso, estudos têm mostrado que o tratamento com chondroitinase ABC, que fende a maioria das cadeias de açúcar em CSPGs, diminui o efeito inibitório de CSPGs secretada por astrócitos reativos22. Apesar de encorajador resultados, essas abordagens não fornecem dirigido a orientação dos cones de crescimento, que pode potencialmente resultar em regeneração aberrante12e também não conta para a perda de neurônios. Abordagens baseadas em célula têm sido utilizadas em tentativas de ultrapassar os efeitos da cicatriz glial e para repor as células perdidas, particularmente os neurônios. Alguns grupos têm os astrócitos reativos em neurônios, enquanto outros transplantamos células progenitoras neurais em lesões de CNS para repovoar a área de lesão e promover o axônio regeneração23,24, 25. no entanto, transplante de células-tronco sozinho é limitado por taxas de sobrevivência baixa integração pobre e modesta de retenção no tecido danificado5. Além disso, estas estratégias baseadas em células não restaurar a longa distância axonal panfletos, especialmente em uma maneira controlada. Portanto, biomateriais em combinação com outras abordagens estão sendo exploradas como veículos de entrega para vários neural e fatores de crescimento e células progenitoras26. Abordagens baseadas em biomaterial apresentam um alto grau de controle de projeto para produzir construções que imitam o haptotaxic físico, específico, e sinais quimiotáxicas presente no microambiente (3D) tridimensional do destino anfitrião tecido27, 28,29,30,31,32,33,34. Reprodução desses sinais ambientais é de suma importância para células transplantadas apresentar morfologia como de um nativo, proliferação, migração e sinalização, entre outras características neurobiológicas29. Apesar dessas propriedades vantajosas, avanço além da tradicional célula semeada biomaterial andaimes é necessário para substituir neurônios perdidos e promover a regeneração axonal longa distância dirigida simultaneamente.

Uma promissora abordagem alternativa baseia-se no tecido neural engenharia "andaimes vivos", que são distintos de outras abordagens baseadas em célula devido à presença de células neurais vivas com um cytoarchitecture pré-formadas que emula neuroanatomia nativa e/ou mecanismos do desenvolvimento para facilitar a substituição do alvo, reconstrução e regeneração dos circuitos neurais4,35. Considerações para o projeto de vida andaimes incluem os fenótipos e fontes de células neurais, bem como as propriedades mecânicas e/ou físicas e os sinais bioquímicos ditaram pela composição de qualquer acompanhamento de biomateriais35. Após a fabricação em vitro, estes andaimes vivos podem ser implantado no vivo de moléculas de adesão celular presente e Quimiotáticos e neurotrophic sinaliza para regular ativamente a migração de células nervosas e consequência natural do axônio dependendo do estado e progressão dos processos regenerativos35. Células gliais podem servir como base para a cytoarchitecture engenharia de andaimes de vida, desde que estas células mediam diversos mecanismos do desenvolvimento na vivo. Durante o desenvolvimento do cérebro, os neurônios novos dependem de processos basais prorrogados pela glia radial da zona ventricular para a placa de desenvolvimento cortical como andaimes vivos para migração dirigida36,37. Além disso, estendendo o crescimento cones são mostrada para orientar-se por sensoriamento de sinais atraentes e repelentes eliciados células gliais guidepost, and so-called "pioneiro" axônios são sugeridos para alcançar as metas corretas, estendendo-se ao longo de pre-modelado gliais moldes de38,35,39. Assim, as células gliais são necessárias para a orientação do pioneirismo de axônios, que mais tarde servem como baseado no axônio "andaimes de vida" para direcionar a projeção de axônios "seguidor". Além disso, mecanismos de crescimento mediada por glia foram mostrados para persistir pós-natal, como neuroblastos seguem o fluxo migratório rostral (RMS) para navegar na zona subventricular (SVZ), uma das poucas áreas remanescentes da neurogênese no cérebro adulto, para o bulbo olfatório (OB)40. Estes neuroblastos em RMS migram dentro do tubo glia (figura 1A-1), que é composto por processos hamartomas alinhados longitudinalmente, através de aderências direta célula-célula e localizadas fatores solúveis37, 41. por fim, enquanto danos CNS em causas de mamíferos interrompeu arranjo hamartomas processo formando uma cicatriz glial que impede fisicamente a regeneração axonal17, muitos sistemas não-mamíferos faltam a formação de uma cicatriz glial prejudicial. Em vez disso, as células gliais de espécies não-mamíferos mantenham mais organizado, alinhados a padrões que são usados como guias através da região lesada17,42,43. Por exemplo, em modelos de não-mamíferos SCI, axônios são mostrados para crescer em estreita associação com gliais pontes cruzando a lesão, sugerindo um papel importante para andaimes gliais organizados como substratos, facilitando a regeneração axonal e recuperação funcional ( Figura 1A -2) 42 , 44 , 45. recapitulação das características neuroanatômica e os mecanismos do desenvolvimento/regenerativa descritos acima pode produzir uma nova classe de engenharia baseada em gliais vivos andaimes que simultaneamente pode conduzir a migração neuronal imatura e axonal Pathfinding através de ambientes caso contrário não-permissivo, assim, potencialmente, mitigação dos efeitos da neuronal e degeneração do trato de axônio associado com lesão do CNS e doença.

Nosso grupo de pesquisa anteriormente desenvolveu vários tipos de andaimes de vida para a reconstrução e regeneração dos tracts axonal no SNC e o sistema nervoso periférico (SNP) através de microtecido projetado redes neurais (micro-TNS) e tecido enxertos de nervo engenharia (TENGs), respectivamente,27,46,,47,48. Ambas as estratégias são inerentemente baseia biomimetismo. Micro-TNS são estruturas anatomicamente inspirada projetadas estruturalmente e funcionalmente substituir axonal folhetos conectando distintas populações neuronais do cérebro. TENGs explorar o mecanismo de desenvolvimento da regeneração axonal axônio-facilitada, exemplificado pelo crescimento do axônio "seguidor" ao longo de axônios "pioneiro", para alcançar o hospedeiro alvo regeneração axonal35,46,48. Nós recentemente capitalizou a versatilidade do andaime a vida técnica usando um esquema similar do encastoamento como micro-TNS e buscando inspiração os mecanismos baseados em glia de presentes durante todo o desenvolvimento. Aqui, nós desenvolvemos construções consistindo de feixes hamartomas alinhados, abrangendo o lúmen colágenas de um hidrogel microcoluna49. Estes andaimes hamartomas vivos são desenvolvidos pelo primeiro preencher um conjunto de agulha de acupuntura-tubo capilar com líquido agarose para criar um hidrogel cilíndrico oco com um diâmetro externo (OD) e o diâmetro interno (ID) correspondente para os diâmetros do tubo e agulha, respectivamente. Na sequência de gelificação de agarose e extração de hidrogel microcoluna do tubo capilar, o interior oco é revestido com tipo eu colágeno para fornecer um ambiente permissivo para a adesão de astrocyte e alinhado à formação de feixe (figura 1B -1). Depois, o lúmen é semeado com astrócitos corticais cerebrais, isolados de filhotes pós-natal (figura 1B-2). Contrariamente ao bidimensional (2D) alinhamento as técnicas que dependem da aplicação de campos elétricos, micropatterned grooves e matriz extracelular da proteína (ECM), padronização, alinhamento astrocyte no cadafalso vivos técnica depende de auto-montagem de acordo com variáveis controláveis como colágeno concentração50,,51,52, densidade celular e curvatura do substrato (coluna ID). Os astrócitos contraem e remodelam o colágeno e adquirem uma morfologia bipolar, alinhado longitudinalmente análoga para os andaimes naturais observados na vivo (figura 1B-3). Com efeito, estamos ativamente perseguindo o uso destas estruturas de cabo, como como substratos físicos para orientação alvo da migração de neurônios imaturos, bem como facilitar a regeneração axonal através do ambiente desfavorável do SNC danificado, particularmente a cicatriz glial mamíferos (Figura 1). Este artigo irá apresentar o método de fabricação detalhada para as microcolunas hamartomas, contraste e imunofluorescência imagens de cytoarchitecture o esperado e uma discussão abrangente sobre as limitações atuais e futuras direções da fase a técnica.

Figure 1
Figura 1: inspiração, protocolo de fabricação e aplicações propostas para as redes de hamartomas alinhadas. (A) neurobiológicos inspiração: neuroblastos (1), originários da zona subventricular neurogênica (SVZ) utilizam o tubo glia alinhado longitudinalmente do fluxo migratório rostral (RMS) para migração dirigida para o bulbo olfatório (OB); (2) não-mamíferos, como os anfíbios e peixes podem sustentar a regeneração após dano no tecido neural em parte devido à formação de uma ponte glia que conecta as extremidades de uma lesão (por exemplo, medula espinhal necrosante) e serve como um andaime para a orientação de regeneração de axônios. (B) visão geral de fabricação: (1) a construção de uma hidrogel de micro-empresas, oco microcoluna com o lúmen revestido com ECM, (2) semeadura do primários astrócitos corticais isolados de filhotes pós-natal, (3) auto-montagem do longitudinalmente orientada pacotes em cultura e (4) extraído do pacote o invólucro de biomaterial para estudos futuros de implantação. (C) na vivo aplicações: (1) estes andaimes de vida podem servir como tubos gliais projetados para a migração de neurônio dirigido de centros neurogênicos repovoar regiões do neurônio-deficiente; (2) recapitulação o mecanismo do desenvolvimento de pioneirismo orientação do axônio e o mecanismo regenerativo das pontes gliais de não-mamíferos pode dotar estes andaimes hamartomas com a capacidade de direcionar a regeneração do axônio através do não-permissivo ambiente da cicatriz glial mamífera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso de comissões na Universidade da Pensilvânia e o Michael J. Crescenz veteranos assuntos Medical Center e aderiu às diretrizes estabelecidas na política de serviço de saúde pública de NIH em humanos Cuidado e uso de animais de laboratório (2015).

1. desenvolvimento de Agarose Hydrogel Microcolunas

  1. Fazer uma solução de peso/volume (p/v) de 3% de agarose pesando 3 g de agarose e transferindo-o para um copo esterilizado contendo 100 mL de solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS). Adicionar uma barra magnética estéril para o copo e coloque-o sobre a superfície de uma placa quente/agitador. Mantenha o béquer coberto para evitar a evaporação de seu conteúdo na próxima etapa.
  2. Aqueça a agarose e DPBS a uma temperatura de 100 ° C e agitar em 60-120 rpm. Ajustar essas configurações conforme necessário e constantemente monitorar a progressão do processo de dissolução, enquanto a solução muda inicialmente de opaco para uma clara aparência que significa que a agarose foi completamente dissolvido.
    Atenção: O copo quente e a solução estão quentes!
  3. Como a solução de agarose é aquecida e agitada, recuperar quatro pratos de Petri vazia 10cm e adicionar 20 mL de DPBS para dois deles. Coloque as agulhas de acupuntura (diâmetro: 300 µm, comprimento: 40 mm), microlitro tubos capilares de vidro (diâmetro: 701,04 µm, comprimento: 65 mm, capacidade: 25,0 µ l) e um dispensador de bulbo dentro do armário de biossegurança. Quando a solução de agarose líquido limpa, manter constante aquecimento a aproximadamente 50 ° C e mexendo para evitar gelificação da agarose.
  4. Introduza uma agulha de acupuntura na abertura inferior de um dispensador de bulbo. Inserir um tubo capilar sobre a agulha exposta para o exterior. Fixe o tubo capilar, inserindo parte para a seção de borracha do cilindro ampola dispensador.
  5. Transferir 1 mL de líquido agarose com uma micropipeta para a superfície de uma placa de Petri vazia e coloque uma extremidade do tubo capilar verticalmente (com a agulha inserida) em contacto com a agarose, enquanto a tampa de borracha do distribuidor bulbo está sendo comprimida para dentro. Libere lentamente a pressão na tampa do distribuidor do bulbo desenhar agarose no tubo capilar.
    Nota: A transferência de agarose líquido para os tubos capilares deve ser realizada rapidamente. Se o líquido agarose é deixado para esfriar sobre a superfície do prato de Petri por tempo suficiente (aproximadamente 60 s), que começa ao gel, evitando a sucção adequada do agarose ao longo do tubo capilar.
  6. Lugar de cada conjunto de bulbo-tubo-agulha em uma enciclopédia de Petri e deixar o agarose gel dentro dos tubos capilares solidificar por 5 min. puxe cuidadosamente o tubo capilar com as mãos para fora da rolha de borracha no cilindro ampola dispensador, deixando a agulha e o gel de agarose no lugar dentro do tubo.
  7. Extrair manualmente a agulha de acupuntura, puxando-o lentamente fora do tubo capilar; o cilindro de agarose recém solidificado também desliza para fora do tubo neste procedimento, ainda em torno da agulha. Nudge delicadamente a microcoluna ao longo da agulha de acupuntura com a ponta da pinça estéril para movê-lo até o fim. Coloque a agulha sobre um prato de Petri contendo DPBS aberto e empurrar a microcoluna para o DPBS com fórceps.
    Nota: Se a agarose microcoluna mantém-se dentro do tubo capilar de vidro, depois de retirar a agulha de acupuntura, empurre lentamente a agarose microcoluna do tubo capilar com uma agulha de calibre 25 mm e para o prato com DPBS.
  8. Esterilize microscalpels ou pinça usando um esterilizador de grânulo quente. Fazer 4% w/v agarose por pesagem 4G de agarose e transferi-lo para 100 mL de DPBS. Aquecer e agitar como explicado no passo 1.2 para obter uma solução clara de agarose líquida de 4%. Manter o aquecimento e agitação da solução durante as etapas a seguir.
  9. Transferir os pratos de Petri contendo as microcolunas para uma capa de dissecação e mover uma microcoluna com pinça fina para um prato de Petri vazia. Utilize o estereoscópio para orientação visual e um microscalpel para cortar as microcolunas até o comprimento desejado. Guarnição ambas as extremidades para termina de forma chanfrada em 45ó ângulos de horizontal para facilitar a manipulação das microcolunas durante a adição de ECM e celular.
  10. Repita o anterior passo para três mais microcolunas no mesmo prato de Petri e alinhe as quatro construções em paralelo com uma separação de < 3 mm entre cada um dos cilindros. Carregar 50 µ l de solução de agarose 4% com uma micropipeta e despeje uma raia/linha de líquido sobre a matriz de microcoluna para conectar e agrupar as construções em grupos de quatro (doravante chamado "microcoluna barcos"). Evite o movimento de agarose de 4% para as extremidades das microcolunas, que podem entupir o interior, minimizando a distância entre as construções e adicionando o agarose rapidamente em uma linha fina.
    Nota: Organizando grupos de quatro microcolunas em "barcos" não é necessário para fabricar os andaimes hamartomas. No entanto, os barcos servem para acelerar o processo de fabricação e oferecer uma maneira mais segura de se mover e manipular microcolunas em etapas posteriores.
  11. Deixe arrefecer o barco microcoluna para 1-2 min permitir a gelificação da agarose adicional de 4%. Pegar o barco de microcoluna com pinça fina pelo ligação agarose de 4% e mover as microcolunas para de outros que contenham DPBS Petri preparadas na etapa 1.1.3. Fabrica mais barcos com os microcolunas restantes conforme desejado.
  12. Mova os pratos de Petri contendo o microcolunas e/ou barcos para um armário de biossegurança e esterilizar com exposição aos raios ultravioleta (UV) por 30 min.
    Cuidado: Use proteção adequada para evitar a exposição aos raios UV.
  13. Armazenar os pratos com os barcos de microcoluna em DPBS a 4 ° C, se a adição de ECM e chapeamento de célula não ocorrerá imediatamente depois disso, até 1 semana. Repita as etapas de fabricação de microcoluna se as construções não são usadas durante este período de tempo.

2. a célula primária cultura e isolamento

  1. Isolamento de astrocyte cortical de filhotes
    1. Em preparação para as próximas etapas, adicione 20 mL de Hank está equilibrada (HBSS) solução de sal de quatro pratos de Petri de 10 cm que irá servir como reservatórios para os tecidos dissecados. Manter todos os pratos no gelo. Esterilize a tesoura cirúrgica limpa, fórceps, microespátula e microbisturis num esterilizador quente do grânulo.
    2. Escaldar a tripsina 0,25% com ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e desoxirribonuclease 0,15 mg/mL (DNase) I em HBSS a 37 ° C. Além disso, escaldar o meio de cultura astrocyte a 37 ° C, que consiste de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com a mistura de nutrientes do Ham F-12 e 10% de soro fetal bovino (FBS).
    3. ANESTHETIZE pós-Natal dia 0 ou filhotes de ratos Sprague-Dawley dia 1, expondo-os às condições hipotérmicas e eutanásia por decapitação. Pino da cabeça num palco usando um 19 mm bitola agulha colocada no focinho à frente dos olhos.
    4. Fazer uma incisão com um bisturi no meio posterior para anterior, da base do pescoço até atrás dos olhos. Realize uma outra incisão passando lateralmente de diretamente atrás dos olhos para baixo, formando um T. Use pinça fina para retirar o pele craniano/crânio para o lado.
    5. Segure a cabeça pelo focinho (para cima), colocando um pino da pinça na boca do animal e a outra na face externa. Remover o cérebro com um microespátula estéril e colocá-lo em um dos pratos Petri preenchida com HBSS refrigerados. Lugar este prato de Petri no gelo imediatamente depois e em todas as vezes exceto quando em uso.
    6. Situa um bloco de granito previamente armazenado a-20 ° C abaixo de um estereoscópio dentro de uma capa de dissecação. Coloque a placa de Petri com o tecido cerebral na superfície do bloco de granito para preservar sua baixa temperatura durante o processo de dissecação. Use o estereoscópio como orientação visual durante as etapas a seguir.
    7. Se os bulbos olfatórios permanecem intactos, extraí-los cortando com fórceps ou microscalpels. Além disso, use um microscalpel para remover o cerebelo e tornar-se uma incisão mediana, separando os dois hemisférios cerebrais. Transferi os hemisférios com fórceps para uma placa de Petri contendo HBSS frescos, refrigerados.
    8. Disse as estruturas do mesencéfalo de dentro dos hemisférios com um microscalpel para obter apenas os córtices separados. Use a pinça fina Descole as meninges, uma estrutura de folha, no tecido cortical e transferir os córtices isolados para uma nova placa de Petri com HBSS frio. Use o microscalpel para picar o tecido a fim de aumentar a área de superfície para a ação da tripsina na próxima etapa.
    9. Use uma pipeta Pasteur para transferir os córtices para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 4 mL de escaldadas do trypsin-EDTA (8 córtices em cada tubo). Expor o tecido cortical do trypsin-EDTA por 5-7 min a 37 ° C.
    10. Com uma pipeta Pasteur, cuidadosamente remova do trypsin-EDTA e adicione 400 µ l de 0,15 mg/mL DNAse eu solução no tubo de centrífuga. Agite o tubo ou vórtice até que todo o tecido é dissociado e existem pedaços tecido restante no líquido. Se não é possível dissolver completamente o tecido, remova os fragmentos restantes com a ponta de uma pipeta Pasteur.
    11. Centrifugar o tubo contendo a solução de células dissociadas a 200 x g, durante 3 min. Retire o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, sem perturbar as células. Adicionar 1 mL de meio de cultura de astrocyte (definido na etapa 2.1.2) para o tubo com uma micropipeta e agitar para Ressuspender e criar uma solução homogênea.
    12. Transferi 10 mL do meio de cultura astrocyte com uma pipeta sorológica para um balão de T-75. Adicione 250 µ l de 1ml célula solução (preparada na etapa 2.1.11) com uma micropipeta no balão para a placa de um cérebro de cachorro vale de células por balão. Distribuir a solução de pilha descarregada uniformemente entre o meio de cultura e agitar suavemente o frasco para promover uma distribuição uniforme.
    13. Cultura os frascos chapeados em uma incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2. Depois de atingir 24 e 72 h em cultura, mecanicamente agite o frasco para desanexar os tipos de células não-aderentes, tais como os neurônios e oligodendrócitos.
    14. Depois disso, em cada um destes momentos, realizar uma alteração de mídia. Segure o frasco verticalmente para que os meios de cultura encontra-se no fundo do frasco, não cobrindo as células aderidas. Aspire o meio de cultura com uma pipeta Pasteur, pressionando a ponta da pipeta contra o canto inferior do frasco para evitar a extração de células. Coloque o frasco em posição horizontal original e suavemente, adicionar 10 mL de meio de astrocyte sobre as células com uma pipeta sorológica.
    15. Retorne os frascos para a incubadora após cada mudança de mídia. Depois de confluência de 90% é alcançada, mecanicamente agite o frasco mais uma vez para remover qualquer restantes células não-aderentes.
    16. Passagem os astrócitos tirando o meio de cultura com um vácuo e uma pipeta Pasteur. Adicione 5 mL de 0,25% do trypsin-EDTA com uma pipeta serológica sobre as células aderidas. Agitar suavemente o frasco para assegurar que a tripsina abrange todas as células e incubar o frasco para 5-7 min a 37 ° C e 5% de CO2.
    17. Saciar a tripsina, adicionando 1 mL de meio de astrocyte para as células com uma pipeta sorológica. Extrair a solução de célula do balão com uma pipeta sorológica e transferi-lo para um tubo de centrífuga estéril 15 mL. Centrifugar o tubo a 200 x g, durante 3 min.
    18. Remover o sobrenadante com uma pipeta sorológica e ressuspendê-lo em 1 mL de meio de cultura astrocyte. Agite o tubo para garantir que a solução da célula é homogênea. Conte o número de células na solução com um hemocytometer ou um contador automático de células.
      Nota: Um frasco que é 90% de confluencia normalmente produz cerca de 3 milhões astrócitos.
    19. Adicione 10 mL de meio de cultura de astrocyte para um balão de T-75. Realizar uma diluição de 1:4 através da transferência de 250 µ l da solução de célula (etapa 2.1.18) com uma micropipeta para o balão de T-75 já contendo meio de cultura. Suavemente agite para garantir uma distribuição homogênea de células em toda a superfície do balão.
    20. Repita os passos 2.1.16-2.1.19 cada vez confluência de 90% é alcançada para a passagem das células.
  2. Isolamento do neurônio cortical de fetos de rato
    1. Siga preparações semelhantes como etapas 2.1.1 e 2.1.2, com exceção de que a mídia escaldada é meios de cultura co, consistindo de Neurobasal médio, suplemento de B-27 2% (para os neurônios) + suplemento isento de soro de G-5 1% (para astrócitos) + 0,25% L-glutamina.
    2. Eutanásia em ratos Sprague-Dawley cronometrado-grávida embrionárias dia 18 asfixia de dióxido de carbono e confirmar a morte por decapitação.
    3. Extrair os fetos de rato e dissecar os córtices do resto do tecido cerebral em placas de Petri contendo HBSS na superfície do bloco de granito refrigerados, usando um estereoscópio para orientação visual e tesoura esterilizada, microscalpel e fórceps53 . Após a dissecação sucessiva das cabeças, cérebro, hemisférios cerebrais e córtices, transferir cada tecido para um novo prato de Petri HBSS-cheia.
    4. Picar o tecido cortical em fragmentos menores para aumentar a área de superfície de tripsina. Transferência de 4-6 córtices com uma Pasteur Pipetar para um tubo com 5 mL de EDTA-tripsina escaldada e mantêm a 37 ° C para dissociar o tecido. Em 5-7 min manualmente agite o tubo para misturar e impedir a aglutinação do tecido.
    5. Retire o tubo de 37 ° C após 10 min. Como explicado anteriormente no passo 2.1, extrair o tripsina-EDTA e substituir com 1,8 mL de 0,15 mg/mL solução de DNAse. Depois, vórtice o tecido até a solução aparece homogêneo, com nenhum fragmento de tecido flutuando no líquido.
    6. Centrifugue a solução de tecido dissociado a 200 x g, durante 3 min. Depois de retirar o sobrenadante, resuspenda em 2 mL de meio de cultura co. Conte o número de células nesta solução com um hemocytometer ou um contador automático de células.
      Nota: O rendimento habitual é 3.0-5.0 x 106 células/cortical hemisfério.
    7. Prepare uma nova solução de célula com uma densidade de 2,0-4,0 x 105 células/mL na mídia co-cultura definida acima.

3. desenvolvimento dos hamartomas cabos dentro do Microcolunas

  1. Fabricação de núcleo de ECM
    Nota: O ECM tem a ser adicionado para o interior das microcolunas de hidrogel no mesmo dia em que célula semeadura será executada.
    1. Dentro de uma armário de biossegurança, preparar um 1 mg/mL solução de rabo de rato colágeno tipo I em meio de cultura co em um tubo estéril microcentrifuga. Manter o tubo de microcentrifugadora com a solução de ECM no gelo em todos os momentos, exceto quando em uso.
    2. Transferi 1-2 µ l da solução de ECM com uma micropipeta para uma tira de papel de tornassol para estimar o seu pH. Adicione 1 µ l de 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) ou ácido clorídrico (HCl) com uma micropipeta para aumentar ou diminuir o pH da solução de ECM, respectivamente e pipetar para cima e para baixo para homogeneizar. Verificar o pH de novo com uma tira de papel tornassol e adicionar mais ácido ou base, conforme necessário, até que o pH é estável na faixa de 7,2-7,4.
    3. Mover as caixas de Petri da etapa 1.2 para uma capa de dissecação e transferir o micro de 4-5-colunas ou um barco com pinça fina estéril para um vazio, estéril 35 ou 60 mm placa de Petri. Usando o estereoscópio para orientação, situa a ponta de 10 µ l de uma micropipeta em uma extremidade de cada microcoluna e sucção para esvaziar o lúmen de bolhas de ar e DPBS. Confirme a ausência de bolhas de ar com o estereoscópio para garantir que o ECM adicionado na próxima etapa pode fluir livremente entre o lúmen.
    4. Cobra uma micropipeta P10 com solução de ECM, lugar a 10 µ l de ponta contra uma das extremidades do hydrogel microcolunas e entregar a solução suficiente para preencher o lúmen (aproximadamente 3-5 µ l), observando a entrada do ECM com o estereoscópio. Pipete um pequeno reservatório (2-4 µ l) da solução de ECM em cada extremidade da microcoluna.
      Nota: Sempre gerir micro de 4-5-colunas ou de um barco de cada vez para evitar prolongada secagem das construções, pois isto pode resultar na amassando da estrutura microcoluna. Microcolunas completamente secas anexar firmemente à superfície dos pratos Petri, que impede a sua utilização para a propagação da célula. Quantidades excessivas de meios de cultura co (como uma medida de hidratação) não podem ser adicionadas para as microcolunas porque isso pode causar o ECM fluir para fora durante o período de incubação, descrito abaixo.
    5. Pipeta de meios de cultura co em um anel ao redor do prato de Petri para fornecer um dissipador de humidade para evitar que as colunas de secar durante a incubação. Incube a placa de Petri contendo as ECM-contendo microcolunas em 37 ° C e 5% CO2 para 1 h promover a polimerização do colágeno antes de adicionar os neurônios e/ou astrócitos.
      Nota: O ECM deve formar uma camada de revestimento de superfície interna do lúmen do oco, ao invés de um núcleo sólido de ECM, englobando o interior, ambos os quais podem ser observados usando o estereoscópio. Se o ECM forma um núcleo, continue o período de incubação até que resta apenas a camada. Com esta camada formada, a solução de célula astrocyte pode preencher o interior da coluna-micro nas etapas de chapeamento.
    6. Durante o período de incubação, prepare a solução de célula astrocyte (conforme descrito abaixo).
  2. Astrocyte e neurônio semeadura nas Microcolunas
    1. Passagem os astrócitos chapeados (entre a quarta e décima segunda passagem), conforme explicado nos passos 2.1.16-2.1.19. Depois de contar o número de células no frasco, prepare solução de célula em uma densidade de 9.0-12,0 x 105 células/mL solução suspendida em meios de cultura de células.
    2. Usando um estereoscópio, coloque a ponta de uma micropipeta de P10 em uma extremidade das microcolunas e transferir a solução de célula suficiente (~ 5 µ l) no lúmen para preenchê-lo completamente. Como feito acima com o ECM, adicione pequenos reservatórios de solução de célula para ambas as extremidades de cada microcoluna.
    3. Incube as chapeado microcolunas sobre os pratos de Petri em 37 ° C e 5% CO2 para 1 h promover a fixação de astrócitos para o ECM. Se os neurônios não serão adicionados para microcolunas, prossiga para o passo 3.2.5.
    4. Após o período de incubação inicial, adicionar 1-2 µ l da solução de neurônio cortical obtida na etapa 2.2.7 em ambas as extremidades das microcolunas com uma micropipeta, enquanto observa sob o estereoscópio. Certifique-se de que os meios suficientes está presente nos pratos para evitar a secagem e incube novamente por 40 min a 37 ° C e 5% CO2 para permitir a adesão de neurônios.
      Nota: Solução de neurônio Cortical pode também ser adicionada 1-2 dias após a formação de feixe, realizando passo 3.2.4 após remover cuidadosamente os meios de cultura da caixa de Petri com uma micropipeta.
    5. Após a incubação período, cuidadosamente encha os pratos de Petri contendo as microcolunas chapeadas com 3 ou 6 mL de meio de cultura co para 35 ou 60 mm placas de Petri, respectivamente. Manter as microcolunas chapeadas na cultura em 37 ° C e 5% CO2 para promover o Self-assembly dos pacotes hamartomas alinhados, que devem formar uma estrutura empacotada, cabo, como depois de 6-10 h.
  3. Estabilização de arquitetura de cabo Astrocyte
    Nota: Após a formação de feixes, cerca de 6-12 h de cultivo as construções, execute as seguintes etapas para evitar o colapso da estrutura alinhada as hamartomas andaimes.
    1. Em um tubo estéril microcentrifuga, preparar um colágeno de cauda de rato de 3 mg/mL eu solução em meios de cultura co. Ajuste o pH da solução de 7,2-7,4 seguindo o procedimento descrito no passo 3.1.2. Manter a mídia de estoque e co-cultura de colágeno no gelo quando não estiver em uso e coloque a solução preparada de colágeno no gelo em todos os momentos.
    2. Remova a mídia os pratos de Petri contendo os andaimes hamartomas com uma micropipeta, deixando alguns meios de comunicação nas laterais do prato para criar um coletor de umidade que garante a hidratação das microcolunas. Coloque o prato em um estereoscópio para ajudar na visualização.
    3. Com uma micropipeta, tome 2 a 3 µ l de solução de colágeno e descarga a cada extremidade das microcolunas, usando o estereoscópio para orientação visual. Certifique-se que o prato tem meios suficientes em torno dos lados para agir como um dissipador de umidade em torno das bordas do prato. Incube as placas de Petri com as microcolunas para 30 min a 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada para promover a gelificação do colágeno recém-adicionado.
    4. Lentamente, adicionar 3 ou 6 mL de meios de cultura co (para 35 ou 60 milímetros Petri pratos, respectivamente) para a Petri pratos com uma pipeta e cultura os pratos em uma incubadora umidificado no 37 oC e 5% de CO2.

4. extração dos pacotes hamartomas do Hydrogel Interior

  1. Esterilize em autoclave, as lamelas de vidro. Prepare um 20 µ g/mL solução de poli-L-lisina (PLL) em água de grau de cultura de células estéreis.
  2. Dentro de uma armário de biossegurança, manualmente transferir as lamelas de vidro esterilizado para um estéril de Petri de 10 cm e adicionar solução PLL suficiente para abranger as lamelas.
  3. Incube as lamelas, cobertas com a solução PLL, por 30 min a 37 ° C para revestir a superfície. Remova a solução PLL com uma pipeta Pasteur após 30 min. enxaguar três vezes adicionando água de grau de cultura de células para a lamela e removê-lo com uma pipeta Pasteur.
  4. Após a formação do bundle glia alinhado, transferir a microcoluna delicadamente para uma placa de Petri estéril com pinça fina estéril e adicionar uma pequena piscina de 10 µ l de meios de cultura co com uma micropipeta para prevenir a desidratação e garantir a saúde de pacote. Extraia o pacote hamartomas da microcoluna hidrogel puxando suavemente de um lado com pinça cirúrgica estéril, usando um estereoscópio para orientação visual.
  5. Segurando o pacote hamartomas com fórceps, montá-lo em uma lamela de PLL-revestido. Corrigir e mancha com o protocolo abaixo.

5. imunocitoquímica para estudos In Vitro

Nota: Para este estudo, os anticorpos primários foram coelho anti-glial ácida fibrilar proteína (GFAP) (1: 500), mouse anti-β-tubulina III (1: 500), coelho antieu colágeno (1: 500), mouse anti-nestin (1: 200) e o coelho antivimentina (1: 100). Os anticorpos secundários foram anti-rato 568 de burro, burro anti-coelho 568, burro anti-coelho 488 e anti-rato burro 568 (1: 500 para todos). Em todas as instâncias, adicione volume suficiente de cada solução para cobrir inteiramente as microcolunas.

  1. Prepare uma solução de formol 4% volume/volume (v/v) em 1 x DPBS dentro de uma coifa de química.
    Cuidado: formaldeído é um composto tóxico conhecido por ser cancerígeno e deve ser descartado em recipiente separado. Sempre manipular este composto dentro uma coifa química e utilizar equipamento de protecção pessoal (PPE) como casaco de laboratório, óculos de segurança e luvas.
  2. No caso das microcolunas, descarte os meios de cultura, desde os pratos de Petri contendo as construções com uma pipeta Pasteur sem acidentalmente a sucção dos cilindros de hidrogel. Adicionar a solução de formaldeído suficiente para cobrir as microcolunas ou as lamelas montadas (ambos os quais permanecem sobre os pratos de Petri) e incube por 35 min em 18-24 ° C.
  3. Extrai a solução de formaldeído de 4,0% de microcolunas fixas ou as lamelas com uma pipeta sorológica. Enxague as microcolunas fixas três vezes com PBS rapidamente adicionando e removendo PBS duas vezes e então deixá-los mergulhar por 10 min uma terceira vez.
  4. Dissolva o soro de cavalo normal (NHS) em PBS para uma concentração de 4% v / v. Prepare uma solução com detergente não-iônico em uma concentração de 0,3% v/v usando a solução de NHS como solvente.
  5. Retire os pratos de Petri contendo as microcolunas ou as lamelas com uma pipeta, a PBS. Adicione a solução de detergente de 0.3% suficiente para cobrir as microcolunas / lamelas por 60 min em 18-24 ° C para permeabilize as células.
  6. Retire a solução detergente e enxágue rapidamente duas vezes com PBS e três vezes por imersão durante 5 min. calcular o volume necessário de NHS 4% e cada um dos anticorpos primários para preparar uma solução com as concentrações do anticorpo desejado.
  7. Retire os pratos de Petri a PBS e adicionar suficiente anticorpo primário (diluída em 4% NHS-DPBS) solução para cobrir as microcolunas ou os pacotes hamartomas extraídos. Incubar durante a noite (12-16 h), a 4 ° C.
  8. Retire a solução de anticorpo primário e rapidamente lave duas vezes com PBS e três vezes por imersão durante 5 min cada. Prepare a solução de anticorpo secundário, no escuro, com cada anticorpo presente em uma diluição de 1: 500 em 4,0% solução de NHS.
  9. Incubar as células com a solução de anticorpo secundário para h 2 a 18-24 ° C. Ao longo de todo o tempo de incubação, cobrir os pratos de Petri contendo as microcolunas com folha de alumínio para evitar a exposição à luz.
  10. Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar solução de Hoechst (01:10, 000) por 10 min em 18-24 ° C para manchar os núcleos.
    Cuidado: Hoechst é um conhecido agente mutagénico que deve ser tratado como uma substância cancerígena. Portanto, ele deve ser descartado de em um recipiente separado e EPI deve ser usado em todos os momentos ao manipular este agente.
  11. Enxaguar com PBS cinco vezes, cada vez por 5-10 min. depois, armazenar as microcolunas manchadas a 4 ° C em PBS e cubra com papel alumínio. No caso dos feixes hamartomas montados, adicione uma gota de meio de montagem aquoso para o pacote, coloque outra lamela de vidro sobre o pacote fixo e selar as duas lamelas com esmaltes para armazenamento a longo prazo e imagens subsequentes.

6. viabilidade ensaio com Live-morto (calceína-AM/ethidium homodímero) coloração

  1. Prepare a solução reagente, acrescentando 5 μl calceína AM (4 mM em anidro dimetilsulfóxido (DMSO)) e 20 μl ethidium homodímero-1 (EthD-1) (2 mM em DMSO/H2O 1:4 v/v) de 10 mL de 1 x DPBS. Cubra a solução com papel alumínio ou guarde no escuro para protegê-lo contra a luz.
  2. Aspirar a mídia a partir da placa de Petri contendo as microcolunas chapeadas com uma pipeta Pasteur e adicionar suficiente solução (preparada acima) para cobrir as construções. Incube durante 30 min a 37 ° C e 5% CO2, mantendo o prato de Petri coberto para proteger a solução contra a luz.
  3. Remova a solução com uma micropipeta ou pipeta Pasteur. Lave 2 - 3 vezes com DPBS conforme explicado na etapa 5.3. Inunde os pratos de Petri com DPBS de acordo com o tamanho do prato. Células de imagem imediatamente depois usando epifluorescência ou imagem latente confocal.
    Nota: Conversão de membrana permeável calceína AM de calceína pelas células metabolicamente ativas produz fluorescência verde de calceína. As células mortas são marcadas como células de membrana-comprometido, que permitem a entrada de EthD-1 na célula e sua ligação aos ácidos nucleicos, causando a fluorescência vermelha.

Representative Results

Inicialmente, contraste de fase microscopia foi usada para monitorar a progressão da formação de aderência e pacote de astrocyte e a estabilidade geral da cytoarchitecture como uma função do tempo. A 1 h depois de chapeamento, astrócitos foram encontrados ao longo do lúmen das microcolunas com uma morfologia esférica (Figura 2A). Às 5h, astrócitos começaram a estender processos e contraindo, enquanto h 8 células exibiram uma morfologia de processo-rolamento completa e formaram cabo-como estruturas orientadas ao longo do eixo longitudinal da microcoluna (Figura 2A). Notavelmente, comparado à presença de células inicialmente dispersa através da microcolunas, astrócitos pareciam ter contraído formar uma rede de pacotes densos ao longo do interior (Figura 2B). Após o alinhamento da célula inicial, as redes de astrocyte frequentemente puxados juntos ao longo do eixo longitudinal, semelhante a um zíper de fechamento, para formar um molho denso no centro da microcoluna (Figura 2). A formação desta arquitetura empacotado deveu-se a um processo Self-assembly, em parte ditada pela escolha da densidade de microcoluna ID e celular. Astrócitos alinhados e adquiriu uma morfologia bipolar quando semeado em microcolunas com um ID a menos de 350 µm (Figura 3B, superior e médio e 3D-3F)49. Pelo contrário, estas células demonstraram direcionalidade aleatória quando foi utilizado um ID de 1 mm (Figura 3B, inferior), que é semelhante ao aparecimento de culturas de astrocyte 2D expostas ao soro livres, cultura co médio (Figura 3A, direita). Além disso, mesmo que astrócitos, ainda, exibir alinhamento em baixas densidades de semeadura (2.0-3.0 x 105 células/mL ou 2.0-3.0 x 102 células/mm3) (Figura 3), redes densas formam-se apenas às altas densidades (9.0-12.0 x 105 células/mL ou 9.0-12,0 x 102 células/mm3) dentro de microcolunas cilíndricas de dimensões semelhantes (visto na Figura 3B, top), como sugerido pela protocolo49. Viabilidade nos pacotes hamartomas foi quantificada, utilizando o ensaio ao vivo/morto, como a relação entre a área de células que fluoresce verde (calceína AM) em relação à área total de células fluoresce verde (calceína AM) e vermelho (EthD-1). A viabilidade dos pacotes hamartomas foi 97,4%, que é semelhante para a viabilidade de 98,2% dos controles de cultura astrocyte 2D (Figura 4A-4B), provando que o ambiente dentro do microcolunas destina-se a vitalidade astrocyte ( Figura 4E). As reconstruções 3D das células vivas e mortas nos andaimes hamartomas também demonstraram o alinhamento da célula total dentro dos limites (Figura 4-4-D). Além disso, hamartomas ultra-longa microcolunas foram desenvolvidos para investigar a estabilidade dos pacotes astrocyte com comprimento substancial. Mesmo à distância extraordinária de 3,5 cm, o cytoarchitecture de feixes hamartomas alinhados, densas e contratados foi sustentada consistentemente em todo o comprimento da coluna-micro (Figura 5A), tão claramente visto nas regiões de zoom a microcolunas (Figura 5B-5C).

Uma vez formado, os pacotes foram fixados e corados por técnicas de imunocitoquímica para proteínas de filamento intermediário características de células gliais, tais como GFAP, nestin e vimentina. As imagens confocal confirmam a morfologia do processo-rolamento de astrócitos e alinhamento longitudinal dos processos (Figura 6 e Figura 7). Expressão das proteínas de filamento intermediário pode ser visto em ambas as culturas astrocyte 2D (Figura 7A), bem como os pacotes de astrocyte dentro da microcoluna (Figura 6, Figura 7B-7D). Além disso, colágeno coloração corroborou a presença desta proteína ECM nas microcolunas. Os astrócitos não formou uma estrutura contínua com o colágeno quando cultivadas em um ambiente 2D (Figura 8A), Considerando que os astrócitos apareceram para aderir e remodelar o colágeno presente dentro do lúmen quando cultivadas nas microcolunas, permitindo para contração e pacote de formação de células (Figura 8B). Sobreposição dos canais GFAP e colágeno demonstrado que os cabos de astrocyte consistiam de processos fortemente associados com as fibras de colágeno longitudinal (Figura 8B). Portanto, além de oferecer ancoragem, fibrilhas de colagénio podem também forneceram pistas direcionais adicionais para astrócitos formar feixes densos após contração. Em alguns casos, contração de astrocyte-colágeno persistiu, resultando em um colapso do feixe alinhado mais de 12-24 h após a formação (Figura 9A). A fim de estabilizar a arquitetura como cabo astrocyte dentro da microcolunas de hidrogel, matriz de colagénio adicional foi adicionado às extremidades de um feixe totalmente formado para inibir ainda mais a contração e colapso. Esta técnica de reforço permitiu para a sobrevivência da arquitetura cabo desejado pelo menos 4 dias, com uma maior janela de estabilidade esperado (Figura 9B). Além disso, pacotes hamartomas representativas foram extraídos da microcoluna de hidrogel, montados e fixados com 4% de formaldeído em lamelas de vidro para avaliar sua robustez quando expostos a forças de tensão e para o ambiente externo. Mesmo depois de extração e manipulação física em diferentes formas (Figura 10A, 10B), hamartomas somata e processos mantidos um alinhado, empacotado morfologia micro escala (Figura 10), destacando o resiliência do cadafalso hamartomas Self alinhado, uma vez formada, mesmo se o apoio estrutural da microcoluna hidrogel está ausente.

Neurônios corticais primários co também foram cultivados com astrócitos dentro do microcolunas para explorar se os feixes de astrocyte foram capazes de fomentar a aderência neuronal e consequência natural do axônio. GFAP e a proteína microtubule β-tubulina III foram utilizados como marcadores específicos para astrócitos e neurônios, respectivamente. Figura 11A mostra que astrócitos co semeados com neurônios corticais também eram capazes de exibir processos e formando feixes alinhados. Os neurônios pareciam ter aderido preferencialmente para os pacotes de astrocyte, desde todos os β-tubulina positivo III coloração co localizados com GFAP (sobreposições na Figura 11B-11C). Para demonstrar as propriedades regenerativas das construções de hamartomas, os neurônios corticais (Figura 12B) foram chapeados dentro o hidrogel microcoluna 2 dias depois de astrócitos chapeado (Figura 12A). Neurônios anexado para o pacote de astrocyte e estendido neuritos diretamente ao longo os panfletos hamartomas. Inspeção mais mostrou axônio consequência orientada na direção do cabo hamartomas, Considerando que, em regiões onde o tracto astrocyte não estava presente, neuritos foram vistos crescendo de forma desorganizada (Figura 12). Essas observações demonstram que o protocolo resulta em redes hamartomas alinhadas, viáveis e robustas que têm o potencial para atuar como caminhos de vida implantável promovendo consequência de adesão e axônio do neurônio.

Figure 2
Figura 2: Brightfield microscopia mostra formação de feixes de Astrocyte dentro de hidrogel Microcolunas ao longo do tempo. (A) morfologia Astrocyte em função do tempo após chapeamento: astrócitos (1 h) são esférico em forma e dispersos por toda a construção; astrócitos (5h) iniciar o processo de extensão e contração; astrócitos (8 h) tem alinhado e contratados. Barras de escala = 100 µm. (B) Bundle formação ao longo do tempo em um andaime representante adicional: (1 h) inicialmente os astrócitos são esféricos e não exibem processos; (24 h), um conjunto denso de processos hamartomas é formado. Escala de barras = 300 µm (à esquerda) e 500 µm (à direita). (C) totalmente formada hamartomas bundle 24 h após o chapeamento, mostrando um efeito de "encerramento", onde as extremidades do cabo anexar para fins distintos das paredes do lúmen. Barra de escala = 1000 µm.

Figure 3
Figura 3: Microcoluna de diâmetro interno e a influência de densidade celular a auto-montagem de feixes alinhados de astrócitos bipolares. (A) culturas de astrocyte 2D com mídia contendo soro (à esquerda) e meios de cultura co isento de soro (à direita) mostram uma morfologia de rolamento não-processo e multiprocessadas, respectivamente. Barras de escala = 100 µm. (B) astrócitos semeados em alta densidade (9.0-12,0 x 105 células/mL) em microcolunas com uma identificação de 180 e 350 µm feixes de forma alinhada em relação ao eixo longitudinal, enquanto um ID de resultados de 1mm em astrócitos exibindo vários, desalinhada processos em todo o diâmetro do lúmen. Barras de escala = 100 µm (superior, médio) e 150 µm (parte inferior). (C) astrócitos semeados em uma 350 µm ID microcoluna de baixa densidade (2.0-4.0 x 105 células/mL) estão alinhados, mas não empacotados. Barra de escala = 100 µm. (D) quando banhado em uma 350 µm ID microcoluna em densidade celular baixa ou média, astrócitos adquirem uma morfologia bipolar. Escala de barras = 300 µm. (E) a caixa D mostrando um zoom-in das cadeias de astrócitos bipolares que se formam dentro da microcolunas de hidrogel. Barra de escala = 300 µm. (F) exemplo de um indivíduo astrocyte bipolar. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: astrócitos permanecem viáveis após Bundle formação dentro do Microcoluna Hydrogel. (A-B), (C-D) reconstruções confocal 3D, mostrando a viabilidade das células durante todo culturas planares e pacotes hamartomas alinhados, respectivamente, como analisada com calceína-AM/ethidium homodímero coloração (verde-ao vivo células; células vermelhas-morto). (E) quantificação de células vivas e mortas resultou em uma porcentagem semelhante de astrócitos vivo/morto quando cultivadas em superfícies 2D e o microcolunas. Barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: imagem de contraste de fase de um representante ultra-longa alinhado hamartomas pacote dentro do Microcoluna Hydrogel. (A) pacote de formação ao longo de todo o comprimento de uma coluna de micro 3,5 cm. Barra de escala = 1.000 µm. (B-C) maior ampliação zoom-ins apresentando astrocyte alinhamento em várias regiões ao longo da totalidade da construção, correspondente as caixas na . Escala de barras = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Immunolabeling dos andaimes hamartomas demonstra o alinhamento Longitudinal de processos hamartomas. (A) reconstrução Confocal de um bundle hamartomas mostrando coloração para GFAP (vermelho; esquerda) e núcleos (Hoechst; médio) e uma sobreposição de dois canais (à direita). (B) maior ampliação zoom em do bundle hamartomas na região Box na permite a visualização da cytoarchitecture dos astrócitos dentro microcolunas. Barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: caracterização de fibrados de hamartomas representativas através de imunocitoquímica. (A-B) Astrócitos cultivadas em superfícies 2D e semeado em hidrogel microcolunas expressam marcadores hamartomas semelhantes (vermelho) GFAP e vimentina (verde). (A) Confocal reconstrução de uma cultura 2D astrocyte planar mostrando os canais separados e mesclados. Barra de escala = 100 µm. (B) Confocal imagens de um pacote hamartomas, confirmando a expressão dos marcadores e apresentando alinhamento astrocyte. Barra de escala = 50 µm. (C-D) astrócitos cultivados dentro microcolunas também expressam as proteínas de filamento intermediário nestin (vermelho) e vimentina (verde). (C) imagem Confocal de um bundle hamartomas. Barra de escala = 100 µm. (D) maior ampliação zoom em c. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: astrócitos nos feixes alinhados interagirem intimamente com uma matriz de colagénio contratados, Longitudinal, em oposição ao regime Irregular de colágeno em culturas 2D. As células foram immunolabeled para observar astrócitos (GFAP; vermelho), núcleos (Hoechst; azul) e colágeno (verde). (A) culturas de astrocyte 2D com colágeno em 1 mg/mL mostram astrócitos desalinhados e colágeno distribuído aleatoriamente. Barra de escala = 250 µm. colágeno (B) é puxado para fora das paredes do lúmen do microcoluna e é contratado para formar uma matriz alinhado que faz parte do pacote hamartomas. Barra de escala = 150 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: colágeno adicionais podem ser usado para estabilizar a estrutura de cabos hamartomas. (A) pacotes formaram aproximadamente 6 h após chapeamento astrócitos dentro de colágeno-revestido hidrogel microcolunas. Uma vez que os pacotes foram formadas, colágeno mais elevado de concentração (3 mg/mL) foi adicionado para as extremidades da coluna-micro para inibir a contração dos cabos hamartomas. Em construções não estabilizadas com colágeno adicional, os feixes de colágeno hamartomas tinham começado a contrair por 18 h, e os cabos de astrocyte tinham desmoronado completamente por 24 h. Esta contração não foi observada quando os pacotes foram reforçados com colágeno de 3 mg/mL. Barra de escala = 1.000 μm. (B) Zoom-in de bundle hamartomas colapsado, não reforçado com colágeno de 3 mg/mL. Barra de escala = 500 μm. (C) Zoom em regiões de microcolunas reforçadas com colágeno. Morfologia de pacote astrocyte foi mantida ao longo da totalidade da microcoluna. Escala de barras = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: extração dos pacotes hamartomas do Microcoluna e montagem em lamelas de vidro revestido de poli-L-lysine evidencia a robustez da técnica. (A) contraste de fase extraído de imagem de vários feixes hamartomas, manipulados para soletrar a palavra "Penn". (B) reconstrução Confocal do mesmo extraído feixes manchadas para o marcador hamartomas GFAP (vermelho) e do núcleo de células (Hoechst; azul). Barra de escala = 100 µm. (C) ampliação da região Box em B mostra que, mesmo quando manipulado em formas irregulares, os andaimes hamartomas retêm uma morfologia alinhada, bipolar e um pacote cytoarchitecture. Barra de escala = 200 µm. Note que quaisquer diferenças estruturais entre a fase e imagens confocal provavelmente é um artefato de construções de deslocamento devido a lavagem durante o procedimento de imunocitoquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: neurônios aderir e estender neuritos ao longo dos feixes Astrocyte alinhados no neurônio Astrocyte andaimes co culta. (A) imagem de contraste de fase de um pacote de hamartomas neurônio-semeado. Barra de escala = 300 µm. (B)-(C) os neurônios foram observados para aderir os pacotes hamartomas e estender neuritos ao longo da direção do cabo (Hoechst-azul; GFAP-verde; Β-tubulina III-vermelho). Escala de barras = 200 e 100 µm, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12: Astrocyte cabos servem como um andaime vivendo por consequência de axônio dirigido. Reconstruções confocal, mostrando uma região de uma microcoluna consiste em neurônios semearam aproximadamente 2 dias após a formação do pacote. (A) GFAP positivo astrocyte pacotes, os neurônios III-positivo de β-tubulina (B) e (C) direta de todos os canais, incluindo núcleos HOECHST-manchado (azul). Note que os neurônios exibiram alinhamento axônio quando aderiu às regiões com processos astrocyte alinhados (setas), Considerando que os neurônios não se adere a alinhada astrócitos apareceram para exibição aleatória (ou seja, multi direcional) consequência do axônio (setas). (D) Zoom-na região mostra a direção do axônio consequência. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Quando comparado com o ambiente mais favorável do PNS, o CNS é particularmente limitado em lidar com as consequências prejudiciais de neurotrauma e neurodegeneração. Após um grave insulto ao SNC mamífero, é formada uma cicatriz glial, consistindo de um núcleo de células inflamatórias e fibróticos rodeado por uma densa malha de astrócitos reativos desorganizadas que secretam proteoglicanos inibindo a consequência natural do axônio14. Esta cicatriz atua como uma obstrução física e bioquímica contra a regeneração do axônio terminações12. Além disso, o CNS mamíferos adultos possui limitadas fontes de novos neurônios para restaurar células perdidas após trauma ou neurodegeneração, desde centros neurogênicos são restritos a SVZ, giro denteado do hipocampo e potencialmente outros geralmente inativa áreas de54. Uma estratégia ideal seria contornar ambos os aspectos dos limitados recursos recuperação do SNC, que as abordagens atuais não endereço. Como tal, o nosso grupo de pesquisa desenvolveu andaimes baseada em astrocyte objetivo é apresentar caminhos de vida para migração neural para áreas de neurônio-deficiente e extensão guiada de regenerar os cones de crescimento do axônio. Alinhado hamartomas pacotes contidos no interior de colágeno de uma microcoluna de agarose constituem estes andaimes hamartomas vivos. Uma distinção considerável de convencional e biomateriais-baseada em célula estratégias utilizadas para a regeneração e reparação do CNS é que a cytoarchitecture dessas construções é totalmente pré-formado em vitro para simular várias em vivo orientação baseada em glia e arquiteturas de andaimes. Por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário, caminhos de glia radial agir como andaimes vivos para novos neurônios, migrando para o neocórtex e células gliais mediam a extensão do alvo da pioneira axônios posando como substratos estampados e/ou células guidepost35 ,38,39. Embrionária glia radial na zona subventricular também produzir astrócitos que formam tubos gliais alinhados no sentido longitudinal, sobre o qual neuroblastos migram pós-natal acorrentado formação da SVZ para o OB41. Além disso, foi demonstrado em alguns não-mamíferos que, seguindo o CNS danos, um maior grau de regeneração é possível devido à formação de um arranjo de hamartomas organizada, alinhados,44. Por exemplo, o zebrafish adulto são capazes de regenerar seus espinais após a migração de células gliais imaturas para o local da lesão, a diferenciação em uma morfologia bipolar e alongamento dos processos gliais para colmatar a lesão, formando um caminho que direciona a regeneração de axônios de45. Engenharia construções de fibrados de hamartomas alinhados podem ser capazes de recapitulando estes mecanismos e apresentando os sinais estruturais e solúveis necessários para a migração neuronal mediada por glia e de regeneração do axônio35. Além disso, devido à inclusão de astrócitos vivos, essas construções podem apresentar ativamente as pistas ambientais exigidas com base no feedback do host.

Em nossa técnica, alinhamento de astrocyte é um processo Self-assembly depende a pistas físicas e interações célula-célula, promovidas pelo microcoluna de diâmetro interno, concentração de colágeno e densidade de semeadura. Outra característica atraente deste método é seu tamanho de mícron-escala, que pode permitir para implantação minimamente invasiva em áreas danificadas do SNC. Além disso, os resultados apresentados neste manuscrito demonstram que as construções obtidas com o protocolo possuem alta viabilidade e expressam as proteínas de filamento intermediário GFAP, nestin e vimentina, independentemente da idade astrocyte conforme definido pelo número de passagem . Enquanto ambos GFAP e vimentina são expressos em astrócitos maduros e imaturos, nestin é restringida às células indiferenciadas ou imaturas, com amadurecimento estrogenos glia a expressão de GFAP e produção decrescente de nestin45, 55. Previous estudos têm mostrado que astrocyte mudanças de comportamento com a idade, no entanto consistente expressão de proteínas de filamento intermediário, bem como a agregação foi visto em uma faixa de passagem de números (passagens de 4-12)56. Os hamartomas andaimes também foram mostrados para alcançar ultra-longa, centímetro-escala comprimentos em vitro, que sugere que esta técnica é adaptável aos comprimentos distintos de lesão e geometrias encontraram na vivo. Além disso, os pacotes de hamartomas alinhados exibem notável integridade estrutural e a estabilidade, como seu cytoarchitecture de cabo, como é mantida mesmo depois de ser submetido à extração das microcolunas. Baseado em astrocyte vivos também moldes suporte neurônio adesão e axônio consequência natural, reforçando o potencial desta técnica para promover a extensão de migração e axônio neurônio direcionado para reparação de CNS.

Os pacotes de hamartomas alinhados estão contidos no interior de um invólucro protetor tubular hidrogel colágenas. Fabricação de andaimes a hamartomas começará com a montagem de microcoluna inserindo uma agulha de acupuntura em um tubo capilar e a aspiração de líquidos agarose nele. Agarose foi o biomaterial selecionado por causa de suas propriedades físicas e bioquímicas Propriedades inertes, biocompatibilidade e facilmente controlada mecânica,49. Concentração de agarose no hidrogel pode ser uma variável importante desde células estímulos mecânicos do sentido de seu substrato (por exemplo, rigidez) e responder com alterações intracelulares57. Critérios de projeto para essas microcolunas inclui uma porosidade elevada o suficiente para permitir o transporte de massa adequada, mas uma pequena suficiente tamanho de poro proibir a consequência natural do processo lateral; Estes critérios são atendidos pela porosidade aberta a nano-escala presente em agarose, na concentração utilizada no presente protocolo. A concentração de agarose neste protocolo foi escolhida devido à sua estabilidade, facilidade de manuseio e semelhança nas propriedades mecânicas para o cérebro ambiente58. Uma consideração digno de nota é a colocação central da agulha no interior do tubo capilar. Muitas vezes, a agulha pode ser ligeiramente inclinada ou deslocadas durante o processo, causando o lúmen ser localizado fora do centro relativo para as paredes exteriores, seguindo a remoção de gelificação e microcoluna de agarose do tubo. Para evitar isso, a agulha deve ser reta, e o conjunto agulha-êmbolo-tubo deve ser mantido na posição vertical, enquanto agarose está sendo desenhado reter a agulha ao longo do eixo central. Centralização precisa do lúmen protege os astrócitos alinhados entre as paredes de agarose; o lúmen é mais propenso a ruptura se localizado proximal à borda externa do cilindro. Além disso, uma distância suficiente entre o lúmen e a parede exterior pode oferecer benefícios protetores durante e após o transplante (desde que as construções de hamartomas não são removidas do microcoluna antes do implante). Nesta fase inicial da fabricação de andaime hamartomas é fundamental para o sucesso da técnica, como a seleção do diâmetro da agulha é crucial para o cabo e alinhamento de soma/processo adequado astrocyte auto-montagem. Achamos que o alinhamento de astrocyte foi inversamente dependente ID microcoluna, com uma gama óptima de ID para o alinhamento da célula e a formação de feixes astrocyte robusta, sendo 180 a 350 µm (Figura 3). Da mesma forma, foi demonstrado anteriormente que os neurônios direto sua consequência natural ao longo da direção de curvatura mínimo de substrato para diminuir o processo de dobra59,,60, e mecanismos similares são prováveis no trabalho para afetar astrocyte alinhamento em nosso sistema de49. Além de curvatura que afetam o alinhamento astrocyte, descobrimos que um 180 a 350 µm gama de ID resultou em astrócitos, adquirindo uma morfologia bipolar49, contrariando a forma estrelada, multipolar, observada com uma ID de 1 mm ou quando astrócitos foram cultivados em 2D (Figura 3). É provável que essas profundas mudanças morfológicas para uma morfologia bipolar astrocyte alteram suas características fisiológicas por exemplo, estes astrócitos podem expressar alternativas secretable fatores ou marcadores de superfície celular que podem ser vantajosos para a regeneração, mas isso garante ainda mais a caracterização. Em geral, nossos resultados demonstram que seleção apropriada de sinais físicos, como a curvatura de superfície, imperativo emulando cytoarchitecture nativa em andaimes hamartomas vivos.

Construção de andaimes a hamartomas prossegue com a inclusão sequencial dos astrócitos corticais e solução de ECM de colágeno para o interior oco das microcolunas. O lúmen interno da microcoluna é revestido com colágeno para apoiar a sobrevivência astrocyte, acessório e formação de feixe alinhado, devido à incapacidade de agarose para apoiar independentemente de consequência natural do axônio61. Uma concentração de colágeno de 1 mg/mL foi escolhida porque estudos anteriores determinaram que concentrações inferiores e superiores resultaram em uma falta de aderência e instabilidade de ECM, respectivamente49. Assim, como esperado, a concentração de colágeno tem efeitos dramáticos sobre a eficácia desta técnica. Além disso, a solução de ECM consiste apenas tipo eu colágeno. Quando comparado com laminina e substratos revestidos Matrigel para culturas hamartomas 2D, astrócitos chapeado no tipo eu colágeno demonstrado óptima aderência e formação de rede62. O tempo de incubação utilizado para a polimerização do colágeno antes da semeadura de célula também é um passo essencial no protocolo. Encontramos anteriormente que quando os neurônios foram entregues concomitantemente com ECM não polimerizada a agarose microcolunas, consequência natural do axônio reduzida e fasciculação axonal foram vistos47, e é possível que esses achados se estenderia para astrócitos tão bem. Desde que o colágeno é necessário para a formação de aderência e pacote de astrocyte, a presença de ECM em toda a construção e a ausência de bolhas de ar ou os bolsos vazios devem ser visualizados e confirmados com técnicas microscópicas.

O protocolo conclui com astrocyte, chapeamento, um período de incubação para assegurar a aderência de célula para colágeno e cultura a curto prazo para a formação de cytoarchitecture o alvo. Astrócitos entre número de passagem 4-12 foram utilizados, como eles exibiram robusta reforma hamartomas de empacotar e colágeno. Estes astrócitos também apresentaram um fenótipo maduro consistindo de > 95% culturas puras63,64 com pouca ou nenhuma contaminação neuronal. Em contraste com culturas de astrocyte comuns, que utilizam meio contendo soro (esquerdaFigura 3A, ), nossa técnica utiliza meio livre de soro para permitir que os astrócitos adotar uma morfologia de processo-rolamento (Figura 3A, direito ) e formam feixes de somata alinhado e processos dentro do microcolunas62,,65,66. Em termos de célula concentração de semeadura, concentrações mais elevadas na faixa de 9,0-12,0 x 105 células/mL, com uma identificação de 350 µm, resultaram na formação de pacotes hermeticamente embalados com acompanhamento de remodelação de colágeno, enquanto astrócitos foram mais dispersas , mas ainda assim alinhados, quando foram utilizadas concentrações inferiores (Figura 3). Assim, o efeito da concentração sobre interacções célula-célula de semeadura influencia o grau de alinhamento de astrocyte e a formação das estruturas observadas como cabo. A injeção da solução de célula no lúmen geralmente é visualizada usando um estereoscópio para assegurar a entrega homogénea em todo o comprimento da coluna de micro, que é crucial para formação de feixe contínuo. Após a semeadura, o tempo de incubação preliminar antes da inundação com meio de cultura é indispensável para garantir a ancoragem de astrócitos para o ECM. A duração pode ser modificada se astrócitos escaparem as construções, desde que as construções são suficientemente úmidas para impedir a secagem. Imagens de contraste de fase dos andaimes hamartomas em função do tempo, mostrou que por 8 h, uma rede de pacotes hamartomas alinhados no processo de ser formada. Além disso, o destacamento de ECM de parede lúmen, sua contração que se seguiu e a associação apertada entre as células e o colágeno contratado foi observado quando construções foram rotuladas para colágeno e GFAP como mostrado na Figura 8. Este fenómeno é, possivelmente, uma consequência das forças contráteis hamartomas, destacando o colágeno da parede, com base em relatórios anteriores da capacidade dos fibroblastos, como de células gliais para gerar forças que distorcem substratos flexíveis e a matriz-remodelação capacidade de astrócitos em apenas astrocyte e neurônio-astrocyte co culturas28,,49,67,68. Especificamente, uma das consequências da motilidade astrocyte e a interação mediada por integrina com fibrilhas de colagénio é a geração de forças suficientes para contratar a fibrilas17,69. Em geral, a implementação do protocolo descrito produzirá andaimes de vida compostos por redes Self montadas de densas, alinhadas hamartomas cabo-como estruturas que recapitular físicos substratos presentes em vários estágios de desenvolvimento do CNS.

Além de questões específicas que possam surgir em todo o protocolo, a técnica de hamartomas andaime possui outros obstáculos que possam afectar a sua capacidade para reparar o CNS. Por exemplo, o sucesso final desta técnica está dependente de plasticidade do sistema nervoso e integração funcional de hamartomas cadafalso com os circuitos de anfitrião. Relacionadas com a implantação destes andaimes é a possibilidade de uma resposta inflamatória que pode contrariar os atributos pro-regenerativa dos pacotes hamartomas. Todas as técnicas baseadas em transplante têm a capacidade de romper a barreira sangue - cérebro e causar infiltração de células inflamatórias, devido à proximidade entre os neurônios e os capilares no tecido47. Neste caso, o hidrogel microcoluna ou outro esquema de invólucro para as andaimes hamartomas pode ser utilizada como um veículo para a liberação controlada de fatores anti-inflamatórios para diminuir a resposta inflamatória. Inicialmente, o pacote de hamartomas alinhado não era estável dentro da microcoluna, como as forças que obrigam o alinhamento da célula e matriz remodelação levou a um colapso do cytoarchitecture desejado após 1-2 dias em cultura. No entanto, colapso de contração e pacote adicional foi impedido por fornecendo reforço adicional para os pacotes nas extremidades da microcoluna adicionando colágeno de concentração superior a fim de manter o pacote no lugar. Uma tática adicional poderia ser empregar um encapsulamento secundário, segundo o qual um novo revestimento com hidrogel é aplicado para os pacotes de hamartomas alinhados como eles são retirados da microcolunas. É provável que a entrega das redes astrocyte alinhados no cérebro também seria estabilizar as construções devido a aderências célula-célula entre host e construção de células ao longo do comprimento inteiro, embora isto precisa ser testado diretamente em estudos futuros.

Nesse sentido, serão dirigidos futuros esforços no desenvolvimento de um método eficaz de transplante que garante a estabilização e proteção do bundle hamartomas durante e após a entrega na vivo a fim de permitir a migração neuronal, reparar, e regeneração no SNC lesionado. Nós demonstramos anteriormente bem-sucedida implantação de micro-TNS neuronal/axonal-baseado, que compartilham o esquema do encastoamento das construções hamartomas, em vias de corticothalamic, resultando em sobrevivência e estrutural de integração com o host tecido pelo menos, até 1 mês46,47. Assim, a robustez dos cabos após a extração das microcolunas pode ser explorada. Neste caso, o hidrogel de agarose serviria como cama para induzir a auto-montagem cultura inicial e em seguida o cabo hamartomas seria retirado o invólucro e injetado diretamente no cérebro usando uma agulha de paredes finas. Astrocyte deformação devido a forças mecânicas durante a extração da coluna de micro hidrogel não foi observada e não é esperada. Trabalhos anteriores, estudando os efeitos da deformação mecânica na reatividade astrocyte sugerem que qualquer deformação resultante não poderá ser aplicada rapidamente o suficiente para induzir astrocytosis ou processo alongamento62,70. Para minimizar os danos ao tecido cerebral e a possível resposta inflamatória, os pacotes dentro o hidrogel podem ser implantados usando a tecnologia de agulha-menos desenvolvida anteriormente para micro-TNS. Esta metodologia, o hidrogel é revestido com uma camada fina de carboximetilcelulose que permite a entrada de agulha-menos para o cérebro que pode diminuir a pegada de interrupções e inflamatória de implantação47. Depois, transplante estudos podem ser realizados para avaliar a capacidade destes andaimes para sobreviver, integrar-se com o tecido do hospedeiro e promovem a migração neural e orientação do axônio. Particularmente, essas construções podem ser implantadas com uma extremidade emana uma região neurogênica como o SVZ para acessar seu pool de células-tronco neurais e neuroblastos, no mimetismo direto de RMS e a outra extremidade, conectado a um site de lesão potencialmente conduzir migração neural e repovoar a área de forma calibrada.

Na sequência de otimização de protocolo de transplante, a técnica pode ser melhorada em outras áreas. As microcolunas podem ser fabricadas especificamente com astrócitos imaturos (por exemplo, glia radial, RMS-tipo pilhas) ou os fenótipos maduros que são mais tarde para aumentar a capacidade regenerativa indutora destas construções49. Em modelos em vitro da cicatriz glial, astrócitos maduros não tiveram a capacidade de formar caminhos para axônio consequência71. Em contraste, astrócitos imaturos têm sido mostrados para promover o axônio consequência in vitro e regeneração axonal na vivo quando transplantada concomitantemente com chondroitinase ABC para tratar os altos níveis de CSPGs na cicatriz glial71 , 72. para coincidir com o advento da medicina personalizada, hamartomas autólogos microcolunas poderão ser desenvolvidos por semeadura de células-tronco de células-tronco pluripotentes fontes tais como induzidas (iPSCs) e células-tronco neurais humanas (hNSCs). Esta modificação permite estes andaimes para funcionar como conduítes para individualizado e reparação de percurso específico e regeneração. Além disso, a utilização destas fontes de célula pode subtrair-se a possível resposta imunogênica essa implantação astrocyte poderia causar. Apesar de imunogenicidade difere de acordo com linhas de células de iPSC, estas células são teoricamente capazes de evitar ou diminuir respostas imunes ao transplante, como sugerido pela ausência de respostas deletérias após órgão derivado de iPSC implantação em ratos73,74. Além disso, hNSCs autólogo e seus derivados hamartomas reprimir alogênico respostas imunes75. Por conseguinte, fabricar estas alinhadas astrocyte redes com células-tronco autólogas podem ser um futuro crítico intervir fazendo esta técnica mais facilmente aplicável na prática clínica.

Para além da aplicação como guia para a reparação do CNS e regeneração, vida hamartomas andaimes podem ser usados como em vitro teste-camas, com ou sem o invólucro de hidrogel baseado sobre os objectivos de um paradigma de teste específico. Por exemplo, essas construções hamartomas podem ser usadas para investigar fenômenos neurobiológicos como extensão de migração e axônio neurônio mediada por astrócitos, explorando as propriedades controláveis e o ambiente 3D de andaimes vivos como modelos de condições na vivo . O protocolo discutido neste manuscrito detalhada a fabricação de feixes de hamartomas alinhados Self montados numa matriz de colágeno dentro de uma microcoluna de hidrogel. Por sintetizando características de neuroanatomia do cérebro, os mecanismos do desenvolvimento/regenerativa e caminhos de migração neuroblasto, estes andaimes hamartomas implantáveis têm o potencial para oferecer apoio caminhos para dirigido axônio e migração neural orientação no ambiente caso contrário inibitório do SNC danificado.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Apoio financeiro foi fornecido pelo National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [terapêutico Pipeline programa #9998 (Cullen)], Penn medicina neurociência centro piloto Award (Cullen), Fundação Nacional de ciência [bolsas de pós-graduação pesquisa DGE-1321851 (Struzyna)], departamento de veteranos dos assuntos [RR & D mérito revisão #B1097-eu (Cullen)] e a pesquisa médica do exército dos EUA e Materiel comando [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter) Lhasa Medical HS.30x40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm) Fisher 21-170J The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser Fisher 21-170J Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N
Micro-spatula Fisher S50821
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11330-032 Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11195 Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups Charles River Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium Invitrogen 21103049 Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement Invitrogen 12587010 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement Invitrogen 17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Incubator Fisher 13 998 076
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip Fisher 12-548-5M
Nail polish Electron Microscopy Sciences (EMS) 72180
Fluoromont mounting medium Southern Biotech 0100-01
Poly-L-lysine Sigma P4707
Phosphate buffered saline Fisher BP3994
Triton X-100 Sigma T8787
Normal horse serum Gibco 16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody Millipore AB5804 Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody Sigma T8578 Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody Abcam ab34710 Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin Millipore AB3400 Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin Millipore AB5326 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody Invitrogen A10042 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM Sigma C1359 4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1 Life Technologies E1169 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO) Sigma 276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope Nikon Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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