PIP-on-a-chip:タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

Bioengineering

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Summary

ここでは、pH調節に基づく無標識法を用いてタンパク質 - ホスホイノシチド相互作用を研究するためのマイクロ流体プラットフォームの文脈で、支持された脂質二重層を提示する。

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Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

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Abstract

数多くの細胞タンパク質が膜表面と相互作用して必須の細胞プロセスに影響を与えます。これらの相互作用は、ホスホイノシチド(PIP)の場合のように、特定の細胞内局在および/または活性化を確実にするために、膜内の特定の脂質成分に向けられ得る。 PIPおよび細胞PIP結合ドメインは、細胞生理学におけるそれらの役割をよりよく理解するために広範に研究されている。本発明者らは、タンパク質-IPP相互作用を研究するためのツールとして、支持された脂質二重層(SLB)上にpHモジュレーションアッセイを適用した。これらの研究では、pH感受性オルソ -スルホローダミンB結合ホスファチジルエタノールアミンを用いてタンパク質-PIP相互作用を検出する。タンパク質がPIP含有膜表面に結合すると、界面電位が調節され( すなわち 、局所pHの変化)、プローブのプロトン化状態がシフトする。 pH調節アッセイの成功した使用の事例研究は、ホスホリパーゼC delta1 Pleckstr相同性(PLC-δ1PH)ドメインおよびホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(PI(4,5)P 2 )相互作用を例として示す。この相互作用の見かけの解離定数( K d、app )は、他のものによって得られたK d、app値と同様に、0.39±0.05μMであった。以前に観察されたように、PLC-δ1PHドメインはPI(4,5)P 2特異的であり、ホスファチジルイノシトール4-リン酸に対するより弱い結合を示し、純粋なホスファチジルコリンSLBへの結合は示されない。 PIP-on-a-chipアッセイは、従来のPIP結合アッセイよりも有利であるが、これには、限定されるものではないが、サンプル量が少なく、リガンド/レセプターの標識化要件がないこと、小型および低親和性膜相互作用大分子、および改善された信号対雑音比。したがって、PIP-on-a-chipアプローチの使用は、広範囲の膜相互作用のメカニズムの解明を容易にするであろう。さらに、この方法は潜在的にu膜と相互作用するタンパク質の能力を調節する治療薬を同定することには魅力的である。

Introduction

無数の相互作用および生化学プロセスは、二次元的に流体の膜表面上で起こる。真核細胞における膜封入オルガネラは、生化学プロセスおよびそれらの関連プロテオームだけでなく、それらの脂質組成においてもユニークである。例外的な種類のリン脂質の1つはホスホイノシチド(PIP)である。それらは細胞リピドームのわずか1%を占めるにもかかわらず、それらは他の1、2、3、4間の信号伝達、オートファジー、および膜輸送において重要な役割を演じます。細胞PIPキナーゼによるイノシトール頭部基のダイナミックリン酸化は、7つのPIPモノある頭部基、ビス- 、またはトリス-リン酸化5を生じます。さらに、PIPは、膜の細胞内同一性を規定し、1つまたは複数のホスホイノを含むタンパク質/酵素の特殊な膜ドッキング部位として機能するitide結合ドメイン、例えば、プレクストリン相同性(PH)、PHOX相同性(PX)、及びepsin N末端相同性(ENTH)6、7。最もよく研究PIP結合ドメインの一つは、ホスホリパーゼC(PLC)は、特に高ナノモル、低マイクロモルの範囲の親和8内ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(PI(4,5)P 2)と相互作用-δ1PHドメインであります、9、10、11。

種々の定性的および定量的インビトロ法が開発され、これらの相互作用の機構、熱力学および特異性を研究するために使用されている。最も一般的に使用されるPIP結合アッセイは、表面プラズモン共鳴(SPR)、等温熱量測定(ITC)、核磁気共鳴(NMR)分光法、リポソーム浮遊/沈降アッセイ、および脂質ブロット(脂肪 - ブロット/ PIP-ストリップ)12、13。これらは広範囲に利用されていますが、それらには多くの欠点があります。例えば、SPR、ITC、およびNMRは、サンプル、高価な計測機器、および/または訓練された人員12、13を大量に必要としています。そのような抗体ベースの脂質ブロットのようないくつかのアッセイ形式は、のPIPの水溶性形態を利用し、非生理的方法12、14、15、16にそれらを提示します。また、脂質ブロットは確実に定量することができないと、彼らは多くの場合、偽陽性/陰性所見12、17、18をもたらしました。これらの課題を克服し、現在のツールセットを改善するため、サポートされている脂質二重層(SLB)に基づいて新しいラベルフリーの方法が確立されました。これはタンパク質-IPP相互作用の研究に成功裏に適用された( 図119

タンパク質-PIP相互作用を検出するために使用される戦略は、pH調節感知に基づく。これには、ホスファチジルエタノールアミン脂質頭部群20に直接コンジュゲートされたオルト -スルホローダミンB( o SRB)を有するpH感受性色素が関与する。 Oの SRB-POPEのプローブ( 図2A)は低pHで強い蛍光と7.5モル%のPI(4,5)P 2つの含有のSLB( 図5B)内を6.7のpKaを有する高pHでクエンチします。ドメインは、PIに向かってその高い特異性タンパク質PIP結合の方法論を検証するために広く使用されてきたPLC-δ1のPH(4,5)P 2( 5A)、21、22、「> 23、24、25 .Hence、我々は、PLC-δ1のPHドメインは、そのは、PIPオンチップアッセイを介してPI(4,5)P 2への結合を試験するために使用することができると推論した。PHドメイン構築物をこの研究において正味の正電荷(PI 8.4)を有し、したがってOHを集めて使用-イオン( 図5C)、PI(4,5)P 2含有のSLBに結合すると、PHドメインはOHをもたらす-にイオンを今度は界面電位を変調してO SRB-POPE( 5C)26。PHドメイン濃度の関数として、蛍光が消光される( 図6A)のプロトン化状態をシフト膜表面は、最後に、正規化されたデータでありますPHドメイン-PI(4,5)P 2相互作用の親和性を決定するために結合等温線に適合させた( 図6B6C )/ p>

この研究では、マイクロ流体プラットフォーム内のPIP含有SLBへのタンパク質結合を行うための詳細なプロトコールが提供される。このプロトコルは、読者に、マイクロ流体デバイスおよび小胞調製物をSLB形成およびタンパク質結合に組み立てることを要する。さらに、PLC-δ1PHドメイン-PI(4,5)P 2相互作用の親和性情報を抽出するためのデータ分析のための指示が提供される。

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Protocol

1.ガラスカバースリップの清掃

  1. 平らな底を有する100mmの深さのホウケイ酸ガラス皿の中に脱イオン水で7倍に希釈し、レベルのホットプレート上で95℃まで20分間または曇った溶液が透明になるまで加熱する( 材料表参照) 。
    注記:このソリューションは熱くなります。身体からの怪我を避けるために注意してください。 7x洗浄液は、六ナトリウム[オキシド[オキシド(ホスホナトオキシ)ホスホリル]オキシホスホリル]ホスフェート、2-(2-ブトキシエトキシ)エタノール、1,4-ビス(2-エチルヘキソキシ)-1,4-ジオキソブタン-2-スルホネートおよび非有害な添加物を含む。
  2. ピンセットを使用して、アルミ染色ラックにカバースリップ(長さ40 mm×幅22 mm×高さ0.16〜0.19 mm)を交互に配置します。彼らがお互いに触れるのを防ぐために各カバースリップの間に空の場所を保つ。
  3. 汚れラックに洗浄液のカバーガラスを完全に浸してください。カバースリップを溶液を1時間インキュベートする。
    注:水が蒸発するにつれて、新鮮な脱イオン水を加え続けて、溶液の濃度を変えないようにしてください。
  4. 汚れラックを洗浄液から取り出し、大量の脱イオン水でカバースリップを洗って洗剤を除去する。
  5. カバースリップを窒素ガスで乾燥させ(約5分/染色ラック)、カバーガラスを550℃で6時間キルン中に置き、アニーリングする。
    注:これは、ガラス表面の粗いフィーチャーを滑らかにする重要なステップです。
  6. カバースリップをプラスチック容器に入れ、埃から遠ざけてください。

2.微細パターン化されたPDMSブロックの製作

  1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)プレポリマーと硬化剤とを10:1(w / w)の割合で大型のプラスチック製の秤量ボートに混合し、500Torr以下の真空強度で1時間減圧脱気する。
    注:PDMSは透明で不活性なシリコーンポリマーです。所望のPDMSブロックtを得るために(0.5cm)に入れ、55gのプレポリマーを5.5gの硬化剤と混合する。
  2. 同一のSU-8マイクロパターンの複数の複製を含むシリコンマスターを大きな(10cmベース直径の)プラスチック製の秤量ボートに入れ、脱気したPDMSに注ぐ。その後、60℃の乾燥オーブンで一晩中硬化させます。
    注:マイクロパターンは肉眼で見ることができる大きさです。各パターンは、間隔が40μmの8個のマイクロチャネル(幅100μm×高さ40μm×長さ1cm)を含む( 図1A1B )。硬質焼成SU-8フォトレジストからなるシリコンウェハ型をナノ加工設備27で製作した。マスターを調製するための他のアプローチは、フッ化水素酸(HF)エッチング、高温水エッチング、xurography、及び3Dは28、29、30、31印刷を含みます。 Commercシリコンマスター調製のための原料も使用することができる。マイクロ流体デバイスのパターンは、製図ソフトウェア(材料表を参照)を用いて設計された。パターンデザインを含む元のファイルは、補足ファイル "Pattern Design.dwg"として提供され、メーカーに直接提供することができます。
  3. 静かに、PDMSをシリコンマスターから手で剥がします。外科用メスとルーラーを使用して、矩形内の各マイクロパターンの境界をマークします。次に、PDMSをブロックに切断します。
  4. 図3Bに示すように、生検パンチ(穴径1.0mm)を用いて、各マイクロチャネルの両端に16穴(ブロック当たり8つの入口および8つの出口)を突き刺す
  5. 各PDMSブロックにテープを貼り、マイクロパターンを損傷や埃から保護します。それらをプラスチック容器に保管してください。

3.小型ユニラメラベシクル(SUV)

注:陰性対照二層組成99.5モル%の1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ -3-ホスホコリン(POPC)および0.5モル%のオルト -スルホローダミンB-1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ -3-ホスホエタノールアミン( o SRB-法王)。試験の二層組成物は、92.0モル%のPOPC、0.5モル%のOの SRB-POPE、およびL-α-ホスファチジルイノシトール-4-リン酸(PI4P)またはL-α-ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート(PI(いずれかの7.5モル%です4,5)P 2 )。以下92.0モル%のPOPC、0.5モル% のOの SRB-POPE、および7.5モル%のPI(4,5)P 2台の含有のSUVを調製するための手順です。本研究で用いたO SRB-POPEの合成は、以前に20を説明しました。

  1. 次の全量を占める、混合に必要POPCの体積、PI(4,5)P 2、及びO SRB-POPE計算:POPCの2.22 mgの、PI(4,5)P 2の0.26ミリグラム、 Oの SRB-POPEの2.1×10 -5 mgの。
  2. POPC、PI(4,5)P 2 、SRB-POPEを単一の20mLガラスシンチレーションバイアルに入れる。
    注:PI(4,5)P 2 (および他のホスホイノシチド)ストックは、クロロホルム:メタノール:水(20:9:1)溶媒混合物になるが、POPCおよびO SRB-POPEストック溶液はクロロホルム溶液になる。精度のために、ピペットチップをクロロホルムで湿らせてから使用してください。安全のために、このステップは化学的なヒュームフード内で行うべきである。
  3. この混合物を窒素ガスの流れの中で化学的なフュームフード内で10分間、または溶剤が蒸発し、薄い脂質膜がバイアルの底に形成されるまで乾燥する。
  4. この混合物を10mTorrの真空強度で3h以上真空下で乾燥させて残留有機溶媒を除去する。
    注:3時間の乾燥時間は、このプロトコールに記載されているSUV調製のスケールに対して十分であり、これは50回の実験に適切である。大規模なSUV調製が必要な場合は、一晩の乾燥を行うことができる。
  5. ドクターを水分補給する5mLのランニングバッファー(20mM HEPES、100mM NaCl、pH7.0)で希釈し、室温で30分間、35kHzの操作周波数で超音波浴に入れる。
    注:ステップ3.5で指定した脂質の量を混合し、ステップ3.5で5mLのランニングバッファーを添加すると、0.5mg / mLのベシクル懸濁液が得られます。この段階で、小胞懸濁液は、単層小胞および多層小胞の混合物である( 図2B )。溶液はピンク色/紫色で、比較的濁って見える。
  6. 40℃で液体窒素と水浴で小胞懸濁液を凍結融解して単層ベシクルを得る。凍結融解を10回繰り返す。
    注:(オプション)懸濁液中の非単層小胞が存在しないことを確実にするために、遠心分離工程32、33適用することができます。
  7. 小胞懸濁液を、脂質押出機を用いて0.10μmトラックエッチングされたポリカーボネート膜に押し出す(材料の表)をSUVのために豊かにする。押し出しを10回繰り返します。
    注:15 mLコニカルチューブを使用して押出小胞を集めることができます。溶液はこの段階では濁りがないはずである。 SUVの直径は、動的光散乱(DLS)によって確認することができる( 図2C )。 SUVが最高のSLB 34を形成するのに適しています。
  8. コニカルチューブをアルミホイルで覆い、使用するまで4℃で保存します。

4.マイクロ流体デバイスの組み立て

  1. PDMSブロックの入口および出口を、水洗瓶を用いて穴を通して脱イオン水を噴出させることによって妨害するように試験する。次に、PDMSブロックを窒素ガスで乾燥する。
    注:この手順では、チャネル内および/またはチャネル間に閉じ込められた可能性のあるほこりも取り除きます。必要に応じて、ダス​​ト粒子を除去するために、カバースリップを窒素ガスで予備洗浄した。
  2. PDMSブロックとプレクリーニング済み75ワットの出力設定、10cm 3 /分の酸素流速、および200mTorrの真空強度で45秒間酸素プラズマを曝露する酸素プラズマシステム(材料の表を参照)サンプルチャンバ内のカバースリップ(セクション1を参照) 。
  3. 酸素プラズマ処理の直後に、PDMSブロックのパターン化された表面をカバースリップと接触させる。静かに押して、接触部位で気泡を除去する。
  4. 接着を強化するために、デバイスを100℃のレベルのホットプレート上に3分間置きます。
  5. 100%エタノールで濡れた糸くずのないワイプ( 例: kimwipe)を使用して、デバイスの上部(PDMS)および下部(ガラス)からほこりを取り除きます。次に、ガラス顕微鏡スライドの上にデバイスをテープで固定します。
    注:エタノールを過剰に使用したり、エタノールが入口と出口の流路に入らないようにしてください。装置が高温のときにこのステップを実行することは、エタノールが直ちに蒸発することを保証するために推奨されます。ガラス製マイクロレンズoscopyスライドは、100%エタノール溶液に保存して、ほこりや他の汚染物質を除去することができます。

5.支持脂質二重層(SLB)の形成

  1. ステップ3.8のPI(4,5)P 2含有SUV100μLを0.65mLのマイクロ遠心チューブに移す。 0.2 N塩酸6.4μLを加えて溶液のpHを約3.2に調整する。
    注:マイクロpHプローブを備えたpHメーターで溶液のpHを確認します(材料の表を参照)。
  2. pH調整されたSUV溶液10μLを注入口から各チャネルに注入し、溶液が排出口に到達するまでピペットを介して圧力を加える。チップをピペットから取り外し、デバイスに取り付けたままにしておきます。
  3. 各チャンネルについて上記のステップを繰り返し、室温で10分間インキュベートする。
    注:小胞のマイクロチャネルへの注入は、デバイスアセンブリの直後に行う必要があります。
  4. 入口および出口管のセットを切断するそれぞれ60cm(入口管)および8cm(出口管)の長さである。
    注記:チューブを斜めに切断して鋭いエッジを作成すると、チューブをインレットとアウトレットに簡単に挿入できます。出口チューブは、円弧状でなければなりません。入口チュービングの長さは、顕微鏡のセットアップに基づいて変化し得る。配管の内径は0.05cmです。
  5. ピンセットを使用して、コンセントのチューブセットをデバイスに接続し、次にデバイスを顕微鏡ステージにテープで固定します。
  6. コニカルチューブに入っている25 mLのランニングバッファーに入っているインレットチューブセットの一端を水中に浸し、テープでチューブが固定されていることを確認します。
  7. 重力流を介してマイクロチャネルを通して溶液を押すために、円錐管を装置より高い地面(約20cm)に置く。これを達成するためにラボジャックを使用することができます。
  8. 各インレットチューブについて、シリンジを使用して、チューブの自由端から1 mLのランニングバッファーを吸引します。インレットからピペットチップを取り出し、入口管の自由端を装置内に挿入する。
    注記:このステップ中に気泡がチャネルに導入される可能性を減らすために、注入バッファーに注入バッファーを導入してください。インレットチューブを装置に取り付けたら、糸くずのないワイプを使用して余分なバッファーを取り除きます。
  9. 上記の手順を繰り返して、すべてのインレットチューブピースをデバイスに接続します。
    注:チャネルを通って流れるバッファを流すことは、過剰な小胞を除去し、二重層を実験条件に平衡させるのに役立つ。
  10. 顕微鏡コントロールソフトウェアを開きます(材料の表を参照)。左側のパネルで、 "Microscope"タブをクリックし、 "10X"目的を選択します。
  11. ツールバーの "Live"と "Alexa 568"の画像アイコンをクリックします。微調整とコース調整ノブを使用して、マイクロチャンネルに焦点を合わせます。
  12. デバイスをスキャンして、SLBとチャネルの品質を確認します( 図8 )。次に、ツールバーの "FL Shutter Closed"画像アイコンをクリックしてください。
  13. [Acquisition]タブをクリックし、[Basic adjustment]で[Exposure time]を選択します。露光時間を「200ms」に設定します。
  14. 左側のパネルで[Multidimensional Acquisition]をクリックし、フィルタメニューの下に赤いチャンネル(「Alexa 568」とマークされています)を選択します。次に、「時間経過」メニューをクリックし、時間間隔を5分に設定し、時間を30分に設定し、「開始」をクリックします。
    注:時間(30分)と流速(〜1.0μL/ min)に基づいて、実行バッファー30μLを使用してチャネル内のSLBを平衡化します。 つまり 、8つのチャネルすべてに240μLのランニングバッファーを使用します。
  15. [測定]タブの下にある[サークル]ツールを選択し、任意のチャンネルに円を描きます。円が選択されている間、右クリックし、「プロパティ」を選択します。 [プロフィール]タブの下にある[すべてのT]にチェックを入れて時間の関数としての蛍光強度。
    1. 次のステップに進む前に、この曲線が平衡を示すプラトーに到達していることを確認してください。
  16. バッファー溶液を装置と同じ地面に下げて流れを止める。
  17. タイムラプスファイルを保存します。

PI(4,5)P 2含有SLBとのPLC-δ1PHドメイン相互作用の試験

  1. 実行中のバッファーを希釈剤として使用してPHドメインの希釈液を調製する。
    注記:デバイスには8つのチャネルがあるため、ブランクコントロールには2つ以上のチャネルを使用してください。各側の遠端を選び、タンパク質希釈のために残りのチャネルを使用する。以下のPHドメイン濃度を試験した:0.10,0.25,0.50,1.00および2.50μM。約200μLの各希釈液で30分以内に平衡に達しました。
  2. 一度に1つずつ、各アウトレットチューブを外し、各タンパク質希釈液200μLを出口チャネルはピペットを使用します。圧力をかけないで、重力が仕事をするようにしてください。チップをピペットから取り外し、マイクロ流体デバイスに取り付けたままにしておきます。
  3. 各チャンネルについて上記の手順を繰り返し、このプロセス中に気泡がチャンネルに導入されていないことを確認します。
  4. インレットチューブをマイクロ流体装置の下の地面に下ろして、マイクロチャネルを通してタンパク質を流し始める。配管の自由端を廃棄容器に貼り付けます。タンパク質希釈液を30分間流す。
    注:これは流れを逆転させ、タンパク質がチャネルに導入されるようにします。平衡までの時間および必要とされるタンパク質希釈の量は、相互作用の親和性に依存する。
  5. ソフトウェアの左側のパネルで、 "Time Lapse"タブの下で、 "Start"をクリックしてイメージングをもう一度開始します。
  6. ステップ5.15を繰り返して、平衡に達していることを確認します。実験が完了したら、時間の経過を保存するファイル。

7.膜の流動性の評価

注:光漂白後の蛍光回収(FRAP)実験は、SLBが液体であることを確認するために、新しい各バッチのSUVおよび清浄なガラスカバースリップで行う必要があります。

  1. ガラスカバースリップ(1.1-1.6)の洗浄、マイクロパターン化PDMSブロックの製作(2.1-2.5)、SUVの調製(3.1-3.8)、マイクロ流体装置の組み立て(4.1-4.5)およびSLBの形成(5.1-5.17)記載されている。
  2. 顕微鏡を二重層に合わせ、露光時間を200 msに設定し、ビニングを1に設定します。
  3. 532nm、2mWのレーザービーム(半径13μM)を使用して、円形のスポットを光漂白する。光退色の直後に、最初の45秒間に3秒ごとに一連の画像をキャプチャし、残りの時間(合計15分間)の間に30秒間隔で撮影を開始します。データ収集が完了したら、時間経過ファイルを保存します。
  4. 漂白剤を選択してください円描画ツールを使用して時間の関数として蛍光強度値を抽出する。さらに、近くにさらに2つの領域を選択します.1つは未漂白領域に対応し、もう1つはSLBがない領域に対応します。
  5. 次の式を使用して蛍光回収率( y )を計算する:
    式
    注:ここで、 F tは時間の関数としての漂白領域の強度を表し、 F iは漂白前の蛍光強度を表す(この場合、正規化された値として「1」を使用する)。 F 0は背景強度である。
  6. FRAP曲線を生成するために時間(x軸)の関数として蛍光回復(y軸)をプロットする。次に、以下のように1つの指数関数にデータをフィットさせ、
    式
    注:ここで、 Aは移動部分を表し、 t 1/2 )を計算するために使用される。
    式
  7. t 1/2を使用して拡散定数( D )を計算する:
    式
    注記:ここでRはレーザービーム半径(13μm)を表します。流体二重層のための拡散定数は≥1.0ミクロン2 / s あるべきです。

処理データ

注:データ解析のルーチンは、顕微鏡、画像処理ソフトウェア、および使用されているカーブフィッティングソフトウェアに依存します。

  1. PHドメインを滴定する前(ステップ5.17から)および後(ステップ6.6から)の時間経過ファイルを開く。各タイムラプスファイルの最後のフレームに移動し、すべてのマイクロチャンネルを走査して蛍光を得るピクセル単位の距離の関数として強度データを収集する( 図6A )。スプレッドシートソフトウェアにデータを転送します。
  2. 各マイクロチャネル(PHドメインの追加の前後)について、チャネル内のいくつかのデータと、ベースラインを表すチャネルのいずれかの側をサンプリングする( 図7A )。
    注:ブランクチャネルの蛍光強度は変化していないはずです。他のすべてのチャンネルはブランクチャンネルに標準化されているので、2つのブランクチャンネルを持ち、蛍光強度が互いに一致していることを確認することが重要です。
  3. 下の公式を適用して空のチャンネルにデータを正規化します。 図7Bにサンプル計算が提供される。
    式
    注:ここで、 ΔF タンパク質は、タンパク質チャネルのバックグラウンドを差し引いた蛍光強度を表し、 Δ; F ブランクは、[背景前後前およびタンパク質滴定工程の後を参照して、ブランクチャネルの蛍光強度を差し引き、そしてαは、タンパク質チャネルとブランクチャンネル(の蛍光強度の比である補正係数を表しF タンパク質 / F ブランク ] プレ )を用いて、蛍光強度はPHドメイン濃度の関数として減少するので、正規化されたデータは値が負である。
  4. 曲線適合ソフトウェア( 材料表を参照)を用いて、PHドメイン濃度の関数として正規化された蛍光をプロットし、ラングミュア等温線に適合させる( 図6C )。
    式
    注:ここで、 ΔFは蛍光強度の最大変化に対する蛍光強度の変化を表すrescence強度タンパク質の飽和濃度は、(ΔFmax)存在する場合、K dの一方、アプリケーションは 、50%の被覆率(バルクのタンパク質濃度([PLC-δ1のPH])に等しい、見かけ解離定数を表し膜結合複合体)が達成される。これは、平衡に基づく結合測定であるので、正規化されたデータは、単純なラングミュア等温線に適合して、見掛けの実験パラメータK d、appを抽出する。フィッティングソフトウェアに基づいて、PLC-δ1PH-PI(4,5)P 2相互作用のK d appは0.39±0.05μMである( 図6B )。

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Representative Results

我々はPIP-on-a-chipマイクロデバイス( 図1 )内のPLC-δ1PHドメイン-PI(4,5)P 2相互作用を研究するためにpH調節アッセイを使用した。詳細なプロトコールを通して、マイクロ流体デバイスコンポーネントの準備と組み立て、小型ユニラメラベシクル(SUV)の作成( 図2 )、デバイス内でのSLBの作成( 図3 )、PIP含有SLBへのタンパク質結合のテスト方法を示しました。典型的なSLB結合実験のフローチャートを図4示す 。 pH調節アッセイの原理を、例としてPHドメイン-PI(4,5)P 2結合を用いて図5に示す。この研究から得られた結果は、PHドメインがPI(4,5)P 2含有SLBに結合することを示唆した。より具体的には、結合すると、局所pHがより基本的になることが観察された。この SLB内に存在するo SRB-POPE蛍光プローブによって局部的なpH変化を感知し、それに応じてそれをクエンチした( 図6A6C )。急冷は濃度依存性で飽和性であったため、データをラングミュア等温線に適合させると、0.39±0.05μMのK d appが得られた( 図6B6D )。 PHドメインは、POPC(双性イオン性脂質)に対して結合が観察されず、PI4P含有SLB( K d、app = 1.02±0.20μM)に対する結合が弱かったので、PI(4,5)P 2に対する選択性を示した( 図6B )。蛍光データがどのように処理されるかを示すためのサンプル計算が含まれています( 図7 )。 図8では、SLBおよびマイクロチャネルの品質を決定する視覚的手掛かりを提供するために、一連のマイクロチャネル画像が提示されている。

_content "fo:keep-together.within-page =" 1 "> 図1
図1:タンパク質-IPP相互作用を研究するためのPIP-on-a-chipマイクロ流体デバイス。A )マイクロ流体デバイスは、8個のマイクロチャネルを有し、8個のマイクロチャネルおよび8個のマイクロ流体チャネルを有する。色付きの溶液を流し、この画像でチャネルを可視化した。装置の幅(x)は2.0cm、高さ(y)は0.5cm、長さ(z)は3.0cmです。 ( B )マイクロチャネルの床はガラスであるが、壁および天井はポリジメチルシロキサン(PDMS)で構成される。各マイクロチャネルの幅は100μm、高さは40μm、長さは1cmです。隣接する2つのマイクロチャネル間の間隔は40μmである。支持された脂質二重層(SLB)がガラス表面の上に形成される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2.小型単層ベシクル(SUV)調製と品質管理試験A )脂質成分: オルト -スルホローダミンB-POPE( O -SRB-POPE)、L-α-フォスファチジルイノシトール-4-リン酸(PI4P)、L-α-フォスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート( PI(4,5)P 2 )、および1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ -3-ホスホコリン(POPC)からなる群から選択される。 ( B )脂質小胞のタイプ:SUV、大単層小胞(LUV)、巨大単層小胞(GUV)、および多重小胞(MLV)。 SUVはSLBの準備に最も適しています34 。 ( C )動的光散乱(DLS)に基づいて、小胞後脂質押出(0.1μmフィルターを通して)のサイズを確認した。 53.9nmの流体力学的半径(Rh)は、m小胞のサイズ分布の約100nmである。結果は、PI(4,5)P 2含有SUVからの測定値を表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3
図3:ガラス支持体上のSLB形成。A )所望の脂質組成のベシクルを調製し、マイクロチャネルに流す。ベシクルはガラス表面に吸着して変形する。臨界表面被覆率が達成されると、ベシクルは自発的に破裂してSLBを形成する。参考文献35、36から適応。 ( B )10X対物レンズ下のデバイス内のSLBが示されています。 Alexa 568フィルターセット(励起/発光576/603 nm)が使用されます。ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4
図4:典型的なSLB結合実験のフローチャート。マイクロ流体デバイスの構成要素、 すなわちパターニングされたPDMSブロックおよび洗浄されたカバースリップは、酸素プラズマで処理されて、両表面を親水性にし、次いで組み立てられる。 SUVは、マイクロチャネルを流れてSLBを形成する。余分な小胞を除去し、ランニング緩衝溶液を流すことによってSLBを実験条件に平衡化する。次に、タンパク質希釈液をマイクロチャネルに流す。最後に、蛍光強度データを分析し、正規化し、タンパク質濃度の関数としてプロットする。正規化されたデータは、見掛けの解離定数( K d、app )vaルーこの図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5
図5:pH変調に基づくセンシングの原理。A )PI(4,5)P 2頭部イノシトール1,4,5-三リン酸(Ins(1,4,5)P 3 )との複合体におけるPLC-δ1PHドメインのX線結晶構造(PDB ID:1MAI) 37(B)O SRB-POPEプローブは非常に低pHでの蛍光と7.5モル%のPI pH滴定曲線に示されているようのSLBを含有(4,5)P 2内で6.7のpKaを有する高pHでクエンチします。 ( C )この研究で用いたPHドメインは等電点(pI)が8.4であるため、実験的pH(7.0)ではタンパク質は正に荷電している。ネット正のcを持つタンパク質はOH -イオンを引きつける。 PHドメインは、PIに(4,5)P 2含有のSLBを結合すると、それはOHをもたらす-膜表面にイオンが、界面電位を順番に入出力 SRB-POPE、その蛍光のプロトン化状態をシフトする変調されPHドメイン濃度依存的にクエンチされる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図6
図6:pH調節によってモニタリングされたPLC-δ1PH-膜結合。A )示された濃度でPHドメインを添加する前後のマイクロチャネルの図。 ( B )POPC、PI4PおよびPI(4,5)P 2含有SLBに対する親和性の比較。 PHドメイン結合 〜7.5モル%のPI(4,5)P 2含有SLBは、0.39±0.05μMのK d appを生じた。 7.5モル%のPI4P含有SLB( K d、 1.02±0.20μM)に対してより弱い結合が観察され、純粋なPOPC SLBについては結合が観察されなかった。エラーバーはSEM(n = 3)を示す。両側t検定を使用して、PI4PとPI(4,5)P 2結合(* p = 0.0396)との間の親和性を比較した。 ( C )POPC、PI4PおよびPI(4,5)P 2結合実験のために、マイクロチャネルを横切るラインスキャンからの蛍光強度をピクセル単位の距離の関数としてプロットする。 ( D )標準化および平均化されたPOPC、PI4P、およびPI(4,5)P 2結合データをPLC-δ1PHドメイン濃度の関数としてプロットし、次にLangmuir等温線に適合させてK d appを抽出する。詳細は、ステップ8.4の式を参照してください。"target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図7
図7:データ処理の計算例A )ブランク(タンパク質なし)およびタンパク質チャネルのタンパク質滴定ラインスキャンデータの前(黒色)および後(赤色)。蛍光強度データはピクセル単位の距離の関数として示される。網掛け領域は、計算のためにデータを抽出するために使用された領域を表します。ベースライン蛍光強度データは、各チャネルの直前および直後に抽出される。 ( B )ブランクおよびタンパク質チャネルについて、タンパク質滴定前後のデータを抽出する。平均は、ベースラインおよびチャネル蛍光データ内で取られる。ベースライン減算の後、蛍光データはブランクチャネルに対して正規化される。詳細は、ステップ8.3の式を参照してください。 href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8
図8:SLBとマイクロチャネルの完全性の評価A )高品質のSLBおよびマイクロチャネルを示す画像。 ( B )不完全な融合。 ( C )融合マイクロチャネル。 ( D )マイクロチャネル内に閉じ込められた粉塵粒子。 ( E )マイクロチャネル内に閉じ込められた気泡。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:Pattern_Design.dwgblank ">ここをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

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Discussion

各PIP変異体は、低濃度ではあるが、それらは独特の物理的組成およびオルガネラ膜1の機能的特異性の確立に寄与する特定の細胞小器官の細胞質表面に存在します。 PIPの最も重要な用途の一つは、特定の細胞内局在および/または活性化6,7必要とするタンパク質の多数のための特定のドッキングプラットフォームとしてあります。細胞生理学および疾患におけるそれらの役割のために、生理学的に関連する状況において、 インビトロでタンパク質-PIP相互作用を研究する能力が重要である。本明細書に記載されたアッセイフォーマットは、極性脂質の混合物の存在下、極性頭部基および天然長の脂肪アシル鎖の正常な提示と、流体脂質二重層との関連でタンパク質-PIP相互作用を考慮することを可能にする。

このアッセイは、組み合わせてpHシステムを検出システムとして使用し、SLBをマイクロ流体プラットフォームにセットされたモデル膜システムとして使用することは、他の膜結合技術と比較して独特の利点を提供する。まず第一に、マイクロ流体プラットフォームは、使用されるタンパク質および脂質(40nLの全チャネル容積、1.0mm 2の SLB表面積)の両方について、容積要件が低いために材料を節約する。また依然として二次元膜流動性を維持しながら、生理学的に関連する脂質組成物を使用することができる(≥1.0ミクロン2 / S)28、38。この検出システムは、タンパク質 - 膜相互作用だけでなく、イオン、小分子、ペプチド - 膜相互作用を試験することを可能にする、散逸(QCM-D)モニタリングを伴うITC、SPR、および水晶振動子マイクロバランスと比較して、ウェル19、20、39、 40歳 。また、pH感受性蛍光プローブは非常に安定であり、19、20、41試験の実験条件下で光退色しません。このプラットフォームの別の利点は、膜表面を視覚的に観察する能力である。ある種の相互作用は、脂質ミクロドメインの形成を誘発し、および/または光漂白(FRAP)後の蛍光回復を介して直接視覚化および/または試験することができる膜流動性に影響を与え得る42 。ここに記載されたアッセイは、蛍光顕微鏡を超える高価な機器を必要としない。最後に、最も重要なことに、リガンド/レセプター標識の非存在下で膜相互作用を評価することにより、PIP-on-a-chipアッセイが従来のアッセイよりも好ましい方法となる。

PIP-on-a-chipアッセイは強力な技術であるが、末梢膜タンパク質は、カチオン性およびアニオン性残基の全体的な組成および結合部位内/その周りのそれらの分布において一定の問題を生じる。いくつかのタンパク質は多くの塩基性残基からなるPIP結合部位を有するが、他のタンパク質は少数しかない。したがって、結合部位でのH + / OH -比は異なってくるであろうし、結合時の局所pHの変化の大きさも変わるであろう。相互作用の化学量論およびPIP-結合が他の脂質との相互作用によって安定化されるかどうかは、場合をさらに複雑にする。したがって、タンパク質のpI、特に大きなタンパク質のpIは、期待される蛍光変化の唯一の指標ではない可能性がある。いくつかのタンパク質-IPP相互作用は大きな蛍光変化をもたらすが、残りは小さな蛍光変化をもたらし得る。後者の場合、信号対雑音比を高めるために少なくとも2つの処置を取ることができる:1)二重層上のより大きなPIPレベルを使用してタンパク質の数を増加させる。rすなわち 、補充されたOH -イオンの数および急冷されたo SRB-POPE分子の数を増加させる; 2)信号対雑音比を向上させるためO SRB-POPEのレベルを増加させます。

現在のプラットフォームは末梢膜タンパク質の研究に多くの利点を提供するが、膜貫通タンパク質の研究にはいくつかの課題がある。 SLB-ガラス支持近接(水層は、脂質組成に応じて約1~2 nmである)に、膜貫通タンパク質、ガラス支持体相互作用は、タンパク質の変性を促進することができる機能の損失につながる、そして固定化34により、43、44、45 。より関与していても、これらの課題を克服するために、ポリマークッションを提供するためのガラス支持体の表面改質またはリポポリームを含む様々なアプローチが開発されている二重層内のRテザー(例えば、PEG化脂質)がSLB-ガラス支持距離34、46、47、48増加させます。

高品質のSLBを形成することは、PIP-on-a-chipアッセイの最も重要な側面である( 図8A )。再現性を保証するには、きれいなカバースリップと新鮮なSUVを使用することをお勧めします。 PI(4,5)P 2のようなアニオン性脂質の存在により、SUVは負に帯電し、SUVの破裂効率を低下させ、膜の流動性に影響を及ぼす( 図8B )。したがって、SUV液のpH調整は、(4,5)P 2個のヘッド群リン酸PIをプロトン化し、破裂効率49、50増加させるためにガラスで静電反発力を低下させるために重要です。アニオン性lを含まないSUVipidsは、pH調整を必要としません。さらに、SUVは、酸素プラズマ処理および結合の直後にチャネルに注入されるべきであり、一方、ガラスカバースリップ表面は、SLB形成に必要な親水性である。 SLBの品質に加えて、塵埃粒子も別の問題です。デバイスの製造プロセス中、チャネル間にトラップされたダスト粒子はチャネル融合を引き起こしますが、チャネル内にトラップされたダスト粒子はSLBを損傷したり、溶液の流速を低下させたりします( 図8C、 8D )。作業エリアは定期的に清掃してほこりを除去する必要があります。同様に、チャネルへの気泡の曝露は、いずれのステップでも避けなければならず、さもなければSLBを不可逆的に損傷するであろう( 図8E )。

PIP-on-a-chipアッセイを計画する際に考慮すべき別のパラメータは、タンパク質貯蔵バッファーである。高濃度で使用する場合、個々の成分(還元剤、塩、抗菌剤、キレート試薬など )は、蛍光および/またはSLBの完全性に影響し得る。従って、その効果を試験するために貯蔵緩衝液を滴定する必要がある。効果が観察された場合、蛍光のドリフトを防ぐためにタンパク質を滴定する前に、SLBも保存緩衝液条件に平衡化しなければならない。これがpH調節に基づくアッセイであることを考慮すると、可能であれば、精製されたタンパク質は、緩衝液ミスマッチによって引き起こされる蛍光のドリフトを最小にするために、ランニング緩衝液(この場合20mM HEPES、pH7.0)と同じ緩衝成分をも含有するべきである。

結論として、本発明者らは、pH調節アッセイがタンパク質-PIP相互作用を調べるために首尾よく使用できることを実証した。 PIPに重点を置いていましたが、このプラットフォームは、ホスファチジルセリンなどの他の生理学的に関連する脂質を含むより複雑な膜システムとの相互作用を試験するために使用することができます他の28、39、42、51の間でNE、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、コレステロール、。細胞タンパク質以外にも、このアッセイプラットフォームは、ヒト病原体を研究する人々にとって有益であり得る。例えば、ウイルスおよび細菌によりコードされるタンパク質は、細胞膜とのPIP 52、53、54、55、56と特異的にいくつかと相互作用することが示されています。したがって、PIP-on-a-chipアッセイは、タンパク質-PIP相互作用の小分子阻害剤を発見し、特徴付ける手段を提供することができる。

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Disclosures

著者は何も開示することはない。

Acknowledgments

DSおよびCECは、一部、助成金AI053531(NIAID、NIH)によって支持された。 SSおよびPSCは、補助金N00014-14-1-0792(ONR)によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

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