PIP-on-a-chip: En etiketfri undersøgelse af protein-phosphoinositid-interaktioner

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her præsenterer vi et understøttet lipid-dobbeltlag i forbindelse med en mikrofluidisk platform til undersøgelse af protein-phosphoinositidinteraktioner ved anvendelse af en etiketfri metode baseret på pH-modulation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Talrige cellulære proteiner interagerer med membranoverflader for at påvirke væsentlige cellulære processer. Disse interaktioner kan rettes mod en specifik lipidkomponent i en membran, som i tilfælde af phosphoinositider (PIP'er) for at sikre specifik subcellulær lokalisering og / eller aktivering. PIP'er og cellulære PIP-bindende domæner er blevet undersøgt udførligt for bedre at forstå deres rolle i cellulær fysiologi. Vi anvendte et pH-moduleringsassay på understøttede lipiddubber (SLB'er) som et værktøj til undersøgelse af protein-PIP-interaktioner. I disse undersøgelser anvendes pH-følsom ortho- sulforhodamin B-konjugeret phosphatidylethanolamin til at detektere protein-PIP-interaktioner. Ved binding af et protein til en PIP-holdig membranoverflade moduleres grænsefladespotentialet ( dvs. ændring i lokal pH), forskydning af probeens protoneringstilstand. En casestudie af den vellykkede anvendelse af pH-modulationsassayet er præsenteret ved anvendelse af phospholipase C delta1 Pleckstri Homologi (PLC-δ1 PH) domæne og phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P2) interaktion som et eksempel. Den tilsyneladende dissociationskonstant ( Kd , app ) for denne interaktion var 0,39 ± 0,05 μM, svarende til Kd , app- værdier opnået af andre. Som tidligere anført skal PLC-δ1 PH-domæne er PI (4,5) P2 specifik, viser svagere binding i retning phosphatidylinositol 4-phosphat og ingen binding til rene phosphatidylcholin SLBs. PIP-on-a-chip-analysen er fordelagtig i forhold til traditionelle PIP-bindingsassays, herunder men ikke begrænset til lavt prøvevolumen og ingen krav til ligand / receptor-mærkning, evnen til at teste høj- og lavaffinitetsmembraninteraktioner med både små og Store molekyler og forbedret signal til støjforhold. Anvendelsen af ​​PIP-on-a-chip-fremgangsmåden vil således lette klarlæggelsen af ​​mekanismer for en bred vifte af membraninteraktioner. Desuden kan denne metode potentielt være digSed i identificerende terapeutiske midler, der modulerer proteins evne til at interagere med membraner.

Introduction

Myriade interaktioner og biokemiske processer finder sted på todimensionelt flydende membranoverflader. Membran-lukkede organeller i eukaryote celler er unikke ikke kun i biokemiske processer og deres associerede proteom, men også i deres lipidsammensætning. En enestående klasse af phospholipider er phosphoinositider (PIP'er). Selvom de kun udgør 1% af det cellulære lipidom, spiller de en afgørende rolle i signaltransduktion, autofagi og membranhandel blandt andre 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamisk phosphorylering af inositolhovedgruppen med cellulære PIP-kinaser giver anledning til syv PIP-hovedgrupper, der er mono-, bis- eller trisphosphorylerede 5 . Derudover definerer PIP'ernes subcellulære identitet og tjener som specialiserede membrandockingssteder for proteiner / enzymer indeholdende en eller flere phosphoinosItid-bindende domæner, for eksempel Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) og epsin N-Terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . En af de bedst undersøgte PIP-bindende domæner er phospholipase C (PLC) -δ1 PH-domæne, som interagerer specifikt med phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P2) inden for en høj nanomolær-lav mikromolære område affinitet 8 , 9 , 10 , 11 .

En række kvalitative og kvantitative in vitro- metoder er blevet udviklet og anvendt til at studere mekanismen, termodynamikken og specificiteten af ​​disse interaktioner. Blandt de mest almindeligt anvendte PIP-bindingsanalyser er overfladeplasmonresonans (SPR), isotermisk kalorimetri (ITC), kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, liposomflotation / sedimenteringsassay og lipidblots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Selvom disse udnyttes i vid udstrækning, har de alle mange ulemper. For eksempel kræver SPR, ITC og NMR store mængder af prøve, dyr instrumentering og / eller uddannet personale 12 , 13 . Nogle assayformater, såsom antistofbaserede lipidblots, anvender vandopløselige former for PIP'er og præsenterer dem på en ikke-fysiologisk måde 12 , 14 , 15 , 16 . Derudover kan lipidblots ikke kvantificeres pålideligt, og de har ofte resulteret i falske positive / negative observationer 12 , 17 , 18 . For at overvinde disse udfordringer og forbedre det nuværende værktøjssæt blev der etableret en ny etiketfri metode baseret på et understøttet lipid-dobbeltlag (SLB) i forbindelse med am Mikrofluidisk platform, som med succes blev anvendt til undersøgelsen af ​​protein-PIP-interaktioner ( figur 1 ) 19 .

Den strategi, der anvendes til påvisning af protein-PIP-interaktioner, er baseret på pH-modulation sensing. Dette involverer et pH-følsomt farvestof, der har ortho- sulforhodamin B ( o SRB) direkte konjugeret til phosphatidylethanolamin lipid hovedgruppe 20 . O SRB-POPE-proben (figur 2A) er særdeles fluorescerende ved lav pH og standset ved høj pH med en pKa omkring 6,7 inden 7,5 mol-% PI (4,5) P2-holdige SLBs (figur 5B). PLC-δ1 PH domæne er blevet anvendt i vid udstrækning til validering af protein-PIP-bindende metoder på grund af sin høje specificitet mod PI (4,5) P2 (figur 5A) 21, 22,"> 23, 24, 25 .Hence ræsonnerede vi, at PLC-δ1 PH-domæne kan anvendes til at teste dets binding til PI (4,5) P2 gennem PIP-on-a-chip assay. PH domæne konstrukt anvendt i denne undersøgelse har en netto positiv ladning (pI 8,4), og således tiltrækker OH -. ioner (figur 5C) ved binding til PI (4,5) P2-holdige SLBs, PH-domænet bringer OH - ioner til membranoverfladen, hvilket igen modulerer grænseflade-potentiale og forskyder protonering tilstand af o SRB-POPE (figur 5C) 26. som en funktion af PH-domæne koncentration, er fluorescensen quenches (figur 6A). Endelig er den normaliserede data er passe til en bindingsisoterm at bestemme affiniteten af PH-domænet-PI (4,5) P2 interaktion (figur 6B, 6C). </ P>

I denne undersøgelse gives der en detaljeret protokol til udførelse af proteinbindende til PIP-holdige SLB'er inden for en mikrofluidisk platform. Denne protokol tager læseren fra at samle den mikrofluidiske enhed og vesikelpræparatet til SLB dannelse og proteinbinding. Desuden til retninger til dataanalyse udtrække affinitet oplysninger til PLC-δ1 PH-domæne-PI (4,5) P2 vekselvirkning er tilvejebragt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengøring af glasdækslerne

  1. Fortynd 7x rengøringsopløsning (se materialetabellen ) 7 gange med deioniseret vand i en 100 mm dyb borosilikatglasskål med en flad bund og opvarm den op til 95 ° C på en varmeplade i 20 minutter eller indtil den uklare opløsning bliver klar .
    BEMÆRK: Løsningen bliver varm, pas på at undgå kropsskader. 7x Cleaning Solution er en proprietær blanding af hexasodium [oxido- [oxido (phosphonatooxy) phosphoryl] oxyphosphoryl] phosphat, 2- (2-butoxyethoxy) ethanol, natrium 1,4-bis (2-ethylhexoxy) -1,4-dioxobutan -2-sulfonat og ikke-farlige tilsætninger.
  2. Ved hjælp af pincet skal du sætte dækslerne (40 mm længde x 22 mm bredde x 0,16-0,19 mm højde) på et aluminiumfarvningsstativ i skiftende retninger. Hold et tomt sted mellem hver dæksel for at forhindre dem i at røre hinanden.
  3. Fyld fyldningsstativet helt ned med dækslipene i rengøringsopløsningen. Hold dækslerne iOpløsningen i 1 time.
    BEMÆRK: Når vandet fordamper, fortsæt med at tilføje frisk deioniseret vand for at holde opløsningskoncentrationen uændret.
  4. Tag farvestativene ud af rengøringsopløsningen og vask dækglasene med rigelige mængder afioniseret vand for at fjerne vaskemiddelet.
  5. Tør dækslisterne med nitrogengas (ca. 5 min pr. Farvestativ), og læg dækpladerne i en ovn i 6 timer ved 550 ° C til glødning.
    BEMÆRK: Dette er et afgørende skridt, der glatter ujævne funktioner på glasoverfladen.
  6. Læg dækslisterne i en plastikbeholder og hold dem væk fra støv.

2. Fremstilling af mikropatternerede PDMS-blokke

  1. Bland polydimethylsiloxan (PDMS) præpolymer og hærdningsmidlet ved 10: 1 (vægt / vægt) forhold i en stor plastvægbåd og afgass den i vakuum i 1 time med vakuumstyrke ved 500 Torr eller mindre.
    BEMÆRK: PDMS er en gennemsigtig og inert siliconepolymer. For at få den ønskede PDMS blok tHickness (0,5 cm), bland 55 g af præpolymeren med 5,5 g hærdningsmidlet.
  2. Placer siliciummesteren, der indeholder flere replikater af den samme SU-8 mikropattern i en stor (10 cm basis diameter) plastvægbåd og hæld den afgassede PDMS. Derefter helbredes den i en tør ovn ved 60 ° C natten over.
    BEMÆRK: Mikropatterner er store nok til at blive set med det blotte øje. Hvert mønster indeholder 8 mikrokanaler (100 μm bredde x 40 μm højde x 1 cm længde) med mellemrum på 40 μm ( figur 1A , 1B ). Siliciumskiveformet bestående af hårdt bagt SU-8 fotoresist blev fremstillet i en nanofabrikationsanlæg 27 . Andre fremgangsmåder til masterpræparation omfatter flussyre (HF) ætsning, højtemperatur vandetsning, xurografi og 3D-udskrivning 28 , 29 , 30 , 31 . commercIal kilder til fremstilling af siliciummester kan også anvendes. Mønstrene til den mikrofluidiske enhed blev designet med en drafting software (se materialeoversigt). Den originale fil, der indeholder mønsterdesignet, leveres som en supplerende fil "Pattern Design.dwg", som kan leveres direkte til producenten.
  3. Skal forsigtigt PDMS fra siliciummesteren med hænder. Markér grænserne for hver mikropattern i rektangler ved hjælp af en kirurgisk skalpel og en linjal. Derefter skær PDMS i blokke.
  4. Punch 16 huller (8 indløb og 8 udløb pr. Blok) i begge ender af hver mikrokanal med en biopsi stans (1,0 mm hul diameter) som angivet i figur 3B .
  5. Påfør tape over hver PDMS-blok for at beskytte mikropatternerne mod skader og støv. Opbevar dem i en plastikbeholder.

3. Forberedelse af små unilamellære vesikler (SUV'er)

BEMÆRK: Negativ kontrol dobbeltlags sammensætningEr 99,5 mol% 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-phosphocholin (POPC) og 0,5 mol% ortho- sulforhodamin B-1-palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-phosphoethanolamin ( o SRB- PAVE). Test-dobbeltlagssammensætning er 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE og 7,5 mol% af enten L-a-phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P) eller L-a-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI 4,5) P2). Nedenfor er fremgangsmåden til fremstilling 92,0 mol-% POPC,% o 0,5 mol SRB-POPE, og 7,5 mol% PI (4,5) P2-holdige SUV'er. Syntesen af o SRB-POPE anvendt i dette studie blev tidligere beskrevet 20 .

  1. Beregn mængden af POPC, PI (4,5) P2, og o SRB-POPE der skal blandes, som tegner sig for de følgende totale mængder: 2,22 mg POPC, 0,26 mg PI (4,5) P2, Og 2,1 x 10 -5 mg o SRB-POPE.
  2. Pipetter det beregnede volumen POPC, PI (4,5) P 2 , <Em> o SRB-POPE i et enkelt hætteglas med 20 ml glasscintillation.
    BEMÆRK: POPC og o SRB-POPE stamopløsninger kommer i en chloroformopløsning, mens PI (4,5) P 2 (og andre phosphoinositider) stamme kommer i en opløsningsmiddelblanding med chloroform: methanol: vand (20: 9: 1). For nøjagtighed, våd pipettespidsen med chloroform inden du bruger den. For sikkerheden skal dette trin finde sted inden i en kemisk dampplade.
  3. Tør blandingen i en strøm af nitrogengas inde i en kemisk dampplade i 10 minutter eller indtil opløsningsmidlet fordamper, og der dannes en tynd lipidfilm i bunden af ​​hætteglasset.
  4. Fortynd blandingen under vakuum i ≥ 3 timer ved en vakuumstyrke på 10 mTorr for at fjerne eventuelt resterende organisk opløsningsmiddel.
    BEMÆRK: 3 timers udtørringstid er tilstrækkelig til omfanget af SUV-præparat beskrevet i denne protokol, hvilket er tilstrækkeligt til 50 forsøg. Hvis en større skala af SUV-præparat er påkrævet, kan natten over udtørring udføres.
  5. Rehydrer drEn lipidfilm med 5 ml løbebuffer (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, ved pH 7,0) og anbring det i et ultralydbad ved en driftsfrekvens på 35 kHz i 30 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Blanding af mængderne af lipider specificeret i trin 3.1 og tilsætning af 5 ml løbende buffer i trin 3.5 giver en vesikelsuspension ved 0,5 mg / ml. På dette stadium er vesikelsuspensionen en blanding af unilamellære og multilamellære vesikler ( figur 2B ). Løsningen vises pink / lilla i farve og forholdsvis uklar.
  6. Frys-thaw vesikel suspensionen med flydende nitrogen og vandbad ved 40 ° C for at få unilamellære vesikler. Gentag frysning-optøningen 10 gange.
    BEMÆRK: (Valgfrit) For at sikre manglen på ikke-unilamellære vesikler i suspensionen, kan centrifugeringstrinet påføres 32 , 33 .
  7. Ekstruder vesikelsuspensionen gennem en 0,10 μm spor-ætset polycarbonatmembran ved anvendelse af en lipidekstruder (seBord af materialer) at berige for SUV'er. Gentag ekstruderingen 10 gange.
    BEMÆRK: Et 15 ml konisk rør kan bruges til at samle de ekstruderede vesikler. Løsningen skal være ugyldig på dette stadium. SUV diameter kan bekræftes via dynamisk lysspredning (DLS) ( figur 2C ). SUV'er er bedst egnet til dannelse af SLB 34 .
  8. Dæk det koniske rør med aluminiumsfolie og opbevar ved 4 ° C, indtil den er klar til brug.

4. Montering af den mikrofluidiske enhed

  1. Test indløbene og udløbene af PDMS-blokken for blokering ved at sprøjte deioniseret vand gennem hullerne ved brug af en vaskekandeflaske. Derefter tør PDMS-blokken med nitrogengas.
    BEMÆRK: Dette trin fjerner også støvpartikler, der måtte være fanget inden for og / eller mellem kanaler. Træk omhyggeligt dæksler med nitrogengas for at fjerne støvpartikler.
  2. Placer PDMS-blokken og den forrensededækglas (se afsnit 1) inden i oxygenplasma systemet (se tabel af materialer) prøvekammeret at eksponere med oxygenplasma i 45 sekunder med effektindstilling ved 75 watt, ilt flow hastighed på 10 cm3 / min, og vakuum styrke ved 200 mTorr .
  3. Placer den mønstrede overflade af PDMS-blokken i kontakt med afdækningen umiddelbart efter iltplasma-behandlingen. Tryk forsigtigt for at fjerne eventuelle luftbobler på kontaktsteder.
  4. Anbring enheden på en varmeplade på 100 ° C i 3 min for at forbedre bindingen.
  5. Brug en våd lintfri tørring ( f.eks. Kimwipe) med 100% ethanol for at fjerne støvpartikler fra toppen (PDMS) og bunden (glasset) på enheden. Tape derefter enheden oven på et glasmikroskop dias.
    BEMÆRK: Brug ikke en stor mængde ethanol og undgå at ethanol kommer ind i indløbs- og udløbskanalerne. Det anbefales at udføre dette trin, mens enheden stadig er varm, for at sikre, at ethanolet fordamper straks. Glas mikrOscopy dias kan opbevares i 100% ethanolopløsning for at fjerne støv og andre forurenende stoffer.

5. Fremstilling af understøttede lipid-bilayere (SLB'er)

  1. Overføre 100 pi PI (4,5) P2-holdige SUV'er fra trin 3.8 i en 0,65 ml mikrocentrifugerør. Juster opløsningens pH til ~ 3,2 ved at tilsætte 6,4 μL 0,2 N saltsyre.
    BEMÆRK: Bekræft pH-værdien af ​​opløsningen med en pH-meter udstyret med en mikro-pH-sonde (se tabel over materialer).
  2. Pipetter 10 μL af den pH-justerede SUV-opløsning i hver kanal gennem indløbet og påfør tryk gennem pipetten, indtil opløsningen når udgangen. Løsn spidsen fra pipetten og lad den være fastgjort til enheden.
  3. Gentag ovenstående trin for hver kanal og inkubér derefter enheden i 10 minutter ved RT.
    BEMÆRK: Injektion af vesikler i mikrokanaler skal udføres umiddelbart efter enhedens samling.
  4. Skær sæt indløbs- og udløbsslang ea60 cm (indløbsrør) og 8 cm (udløbsslang) lang.
    BEMÆRK: Skære slangen diagonalt og skabe en skarp kant, gør det lettere at indsætte slangen i indløb og udløb. Udløbsslangen skal have en bueform. Indløbsrørets længde kan variere afhængigt af mikroskopopsætningen. Den indre diameter af slangen er 0,05 cm.
  5. Ved brug af pincet skal du tilslutte udløbsslangen til enheden og derefter tape enheden på et mikroskop-trin.
  6. Dyk den ene ende af indløbsslangen ind i 25 ml løbende buffer indeholdt i et konisk rør og bånd det for at sikre, at slangen er sikret.
  7. Anbring det koniske rør på en højere jord (~ 20 cm) end enheden for at skubbe opløsningen gennem mikrokanalerne gennem tyngdekraftstrømmen; En lab jack kan bruges til at opnå dette.
  8. For hvert indløbsrør skal du bruge en sprøjte til at tegne 1 ml løbende buffer fra den ledige ende af slangen. Fjern pipettespidsen fra indløbet og indsætFri ende af indløbsslangen ind i enheden.
    BEMÆRK: Indfør en dråbe løbebuffer på indløbet for at reducere sandsynligheden for, at en luftboble introduceres i kanalen under dette trin. Når indløbsslangen er fastgjort til enheden, skal du bruge en fnugfri tørring for at fjerne overskydende buffer.
  9. Gentag ovenstående trin for at forbinde alle indløbsrørstykker til enheden.
    BEMÆRK: Flydende løbebuffer gennem kanalerne hjælper med at fjerne overskydende vesikler og ækvilibrere dobbeltlaget til eksperimentelle forhold.
  10. Åbn mikroskopstyringssoftwaren (se materialetabellen). På venstre panel klikker du på "Mikroskop" fanen og vælger "10X" målet.
  11. Klik på "Live" og derefter "Alexa 568" billedikoner på værktøjslinjen. Ved hjælp af fin- og kursjusteringsknapper fokuseres mikrokanalerne.
  12. Scan gennem enheden for at kontrollere kvaliteten af ​​SLB'erne og kanalerne ( Figur 8 ). Derefter,Klik på "FL Shutter Closed" billedikon på værktøjslinjen.
  13. Klik på fanen "Acquisition", og under "Grundlæggende justeringer" vælg "Eksponeringstid". Indstil eksponeringstiden til "200 ms".
  14. Klik på "Multidimensional Acquisition" i venstre panel, og vælg den røde kanal under "Filtreringsmenuen" (markeret som "Alexa 568"). Klik derefter på menuen "time lapse", indstil tidsintervallet til 5 minutter, varighed til 30 minutter, og klik på "Start".
    BEMÆRK: På basis af varigheden (30 min) og strømningshastigheden (~ 1,0 μL / min) anvendes 30 μl løbebuffer til at ligevægge SLB'en inden for en kanal, dvs. 240 μl løbebuffer anvendes til alle 8 kanaler.
  15. Vælg værktøjet "Cirkel" under fanen "Mål" og tegn en cirkel på en hvilken som helst kanal. Højreklik, mens cirklen er valgt, og vælg "Egenskaber". Under fanen "Profil" skal du tjekke "all T" for at seFluorescensintensitet som en funktion af tiden.
    1. Sørg for, at denne kurve når et plateau, som angiver ligevægt, før du går videre til næste trin.
  16. Sænk bufferopløsningen på lige fod som enheden for at stoppe strømmen.
  17. Gem filen for tidsforløb.

6. Afprøvning PLC-δ1 PH-domæne interaktion med PI (4,5) P2-holdige SLBs

  1. Forbered fortyndinger af PH-domænet ved anvendelse af løbebufferen som fortyndingsmiddel.
    BEMÆRK: Eftersom der er otte kanaler inden for enheden, skal du bruge mindst to af dem til tomme kontroller. Vælg de fjerne ender på hver side og brug de resterende kanaler til proteinfortyndinger. De følgende PH domæne koncentrationer blev testet: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 og 2,50 μM. Ca. 200 μl af hver fortynding var tilstrækkelig til at opnå ligevægt inden for 30 minutter.
  2. En ad gangen skal hver afgangsslange løsnes og 200 μl af hver proteinfortynding tilføresUdgangskanalen bruger en pipette. Anvend ikke pres, lad tyngdekraften gøre arbejdet. Løsn spidsen fra pipetten og lad den være fastgjort til den mikrofluidiske enhed.
  3. Gentag ovenstående trin for hver kanal og sørg for, at luftbobler ikke introduceres i kanalerne under denne proces.
  4. Sænk indløbsslangen til en jord under den mikrofluidiske enhed for at begynde at flyde proteinet gennem mikrokanalerne. Tape den frie ende af slangen til en affaldsbeholder. Flow proteinfortyndingerne i 30 minutter.
    BEMÆRK: Dette vil reversere strømmen og lade proteinet indføres i kanalerne. Tiden til ækvilibrering og mængden af ​​proteinfortyndinger, som er nødvendige, vil være afhængig af interaktionens affinitet.
  5. Klik på "Start" for at starte billedbehandling igen i venstre panel af softwaren under fanen "Time Lapse".
  6. Gentag trin 5.15 for at sikre ligevægt er nået. Når eksperimentet er færdigt, skal du spare tidsforløbetfil.

7. Vurdering af membranfluiditet

BEMÆRK: Fluorescensgendannelse Efter Photobleaching (FRAP) skal der udføres eksperimenter med hver ny serie SUV'er og rensede glasdæksler for at sikre, at SLB'erne er flydende.

  1. Følg proceduren for rensning af glasdæksler (1.1-1.6), fremstilling af mikropatternes PDMS-blokke (2.1-2.5), forberedelse af SUV'er (3.1-3.8), montering af mikrofluidisk enhed (4.1-4.5) og dannelse af SLB'er (5.1-5.17) som tidligere beskrevet.
  2. Fokus mikroskopet på dobbeltlaget, indstil eksponeringstiden til 200 ms, og bunken til 1.
  3. Foto-blek et cirkulært punkt ved hjælp af en 532 nm, 2 mW laserstråle (13 μM radius). Straks efter fotobleaching begynder du at fange en serie billeder hver 3. s for de første 45 s, efterfulgt af et 30 s interval for resten af ​​tiden (15 min total varighed). Når dataopsamlingen er færdig, skal du gemme tidsforløbsfilen.
  4. Vælg den blegede aRea ved hjælp af cirkel tegneværktøjet til at udvinde fluorescensintensitetsværdier som en funktion af tiden. Derudover skal du vælge to flere områder i nærheden, en der svarer til en ubleget region og en der svarer til en region uden SLB'er.
  5. Beregn fluorescensgenvinding ( y ) ved hjælp af følgende ligning:
    ligning
    BEMÆRK: Her F t repræsenterer intensiteten af det blegede region som en funktion af tiden, F i repræsenterer fluorescensintensitet inden blegning (brug "1" som en normaliseret værdi i dette tilfælde); F 0 er baggrundsintensiteten.
  6. Plot fluorescensgendannelse (y-akse) som en funktion af tid (x-akse) for at generere en FRAP-kurve. Derefter tilpasses dataene til en enkelt eksponentiel funktion som følger,
    ligning
    BEMÆRK: Her repræsenterer A den mobile fraktion og t 1/2 ):
    ligning
  7. Brug t 1/2 til at beregne diffusionskonstanten ( D ):
    ligning
    BEMÆRK: Her repræsenterer R laserstråleradiusen (13 μm). Diffusionskonstanten for et flydende dobbeltlag skal være ≥1,0 ​​μm 2 / s.

8. Behandlingsdata

BEMÆRK: Dataanalysens rutine afhænger af mikroskopet, billedbehandlingssoftwaren og den kurvepassende software, der anvendes.

  1. Åbn tidsladdesfiler fra før (fra trin 5.17) og efter (fra trin 6.6) titrerer PH-domænet. Gå til den sidste ramme af hver gang lapse fil og foretag en linjeskanning på tværs af alle mikrokanaler for at opnå fluorescensEnce intensitetsdata som en funktion af afstanden i pixels ( figur 6A ). Overfør dataene til en regnearksoftware.
  2. For hver mikrokanal (før og efter PH domæne tilføjelse), prøv nogle data i kanalen og hver side af kanalen, der repræsenterer baseline ( Figur 7A ).
    BEMÆRK: Fluorescensintensiteten af ​​blanke kanaler burde have forblev uændret. Alle de andre kanaler normaliseres til den tomme kanal, så det er afgørende at have to blanke kanaler og sørge for, at deres fluorescensintensiteter forbliver i overensstemmelse med hinanden.
  3. Anvend nedenstående formel for at normalisere dataene til den tomme kanal; En prøveberegning er tilvejebragt i figur 7B .
    ligning
    BEMÆRK: Her repræsenterer ΔF- protein den subtraherede fluorescensintensitet af proteinkanalen, ΔF- blanket repræsenterer baggrunds-subtraheret fluorescensintensitet af blindkanalen, præ og post henviser til før og efter proteintitreringstrin, og a repræsenterer korrektionsfaktoren, som er forholdet mellem fluorescensintensiteterne af proteinkanalen og blindkanalen ([ F- protein / F- blanke ] præ ) ved et pre-protein titreringstrin. Da fluorescensintensiteten falder som en funktion af PH-domæne-koncentrationen, vil normaliserede data være negative i værdi.
  4. Ved hjælp af en kurvefitting software (se Materialebord ), plot den normaliserede fluorescens som en funktion af PH domæne koncentration og passer til en Langmuir isotherm ( Figur 6C ):
    ligning
    BEMÆRK: Her repræsenterer ΔF ændringen i fluorescensintensitet i forhold til den maksimale ændring i fluoRescensintensitet, når en mætningskoncentration af protein er til stede ( ΔF max ), hvorimod Kd , app repræsenterer den tilsyneladende dissociationskonstant, som er lig med bulkproteinkoncentrationen ( [PLC-δ1 PH] ) ved hvilken 50% dækning Membranbundet kompleks) opnås. Dette er en ligevægtbaseret bindingsmåling, så de normaliserede data passer til en simpel Langmuir isotherm til ekstraktion af en tilsyneladende eksperimentel parameter K d, app . Baseret på tilpasningssoftwaren Kd, app til PLC-δ1 PH-PI (4,5) P2 interaktion er 0,39 ± 0,05 uM (figur 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi anvendte pH modulation assay at undersøge PLC-δ1 PH-domæne-PI (4,5) P2 interaktion inden for en PIP-on-a-chip mikroindretning (figur 1). Gennem en detaljeret protokol viste vi, hvordan man fremstiller og monterer mikrofluidiske komponenter, fremstiller små unilamellære vesikler (SUV'er) ( figur 2 ), danner SLB'er inden for en enhed ( figur 3 ) og testet proteinbinding til PIP-holdige SLB'er. Et rutediagram af et typisk SLB-bindingsforsøg er afbildet i figur 4 . Princippet af pH modulation assay er illustreret i figur 5 ved anvendelse PH-domænet-PI (4,5) P2-binding som et eksempel. Resultaterne af denne undersøgelse antydede, at PH-domænet binder til PI (4,5) P2-holdige SLBs. Mere specifikt bemærkede vi, at ved binding blev den lokale pH mere basisk. Det her Lokal pH-ændring blev detekteret af den o SRB-POPE fluorescerende probe til stede inden for SLB'er, som derefter blev slukket i overensstemmelse hermed ( figur 6A , 6C ). Quenchingen var koncentrationsafhængig og mættet, så montering af data til en Langmuir isotherm gav en Kd , app på 0,39 ± 0,05 μM ( figur 6B , 6D ). PH-domænet viste selektivitet over PI (4,5) P2, da ingen binding blev observeret i retning POPC (zwitterionisk lipid), og svagere binding dybt PI4P-holdige SLBs (Kd, app = 1,02 ± 0,20 uM) (figur 6B). En prøveberegning er inkluderet for at vise, hvordan fluorescensdata behandles ( figur 7 ). I figur 8 er serier af mikrokanalbilleder præsenteret for at tilvejebringe visuelle spor ved bestemmelsen af ​​kvaliteten af ​​SLB'er og mikrokanalerne.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 1
Figur 1: PIP-on-a-chip mikrofluidisk indretning til undersøgelse af protein-PIP-interaktioner. ( A ) Den mikrofluidiske enhed har 8 mikrokanaler med 8 indløb og 8 udløb. Farvede opløsninger blev gennemstrømmet for at gøre kanalerne synlige i dette billede. Enheden er 2,0 cm i bredden (x), 0,5 cm i højden (y) og 3,0 cm i længden (z). ( B ) Mikrokanalernes gulv er glas, mens væggene og lofterne består af polydimethylsiloxan (PDMS). Hver mikrokanal er 100 μm i bredden, 40 μm i højden og 1 cm i længden. Afstanden mellem to tilstødende mikrokanaler er 40 μm. Understøttede lipid-bilayere (SLB'er) dannes oven på glasoverfladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2. Små unilamellære vesikel (SUV) forberedelse og kvalitetskontrol undersøgelser. ( A ) Lipidkomponenter anvendt til fremstilling af vesikler: ortho- sulforhodamin B-POPE ( o SRB-POPE), L-a-phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P), L-a-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat PI (4,5) P2) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC). ( B ) Typer af lipidvesikler: SUV, stor unilamellær vesikel (LUV), giant unilamellær vesikel (GUV) og multilamellær vesikel (MLV). SUV'er passer bedst til forberedelse af SLB 34 . ( C ) Dynamisk lysspredning (DLS) baseret bekræftelse på størrelsen af ​​vesiklerne efter lipidekstrudering (gennem 0,1 μm filter). Hydrodynamisk radius (Rh) på 53,9 nm bekræfter, at m Ean af vesikelstørrelsesfordelingen er ~ 100 nm. Resultaterne repræsenterer måling fra PI (4,5) P2-holdige SUV'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: SLB dannelse på en glasstøtte. ( A ) Vesikler af ønsket lipidsammensætning fremstilles og strømmer derefter gennem mikrokanaler. Vesikler adsorberes til glasoverfladen og deformeres. Når en kritisk overflade dækning er opnået, spreder vesiklerne spontant for at danne SLB'er. Tilpasset fra referencer 35 , 36 . ( B ) SLB'er inden for en enhed under et 10X objektiv er vist. Alexa 568 filtersæt (excitation / emission ved 576/603 nm) anvendes.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Flowchart af et typisk SLB bindingseksperiment. Mikrofluidiske komponenter, dvs. mønstret PDMS-blok og rensede dækglas, behandles med oxygenplasma for at gøre begge overflader hydrofile og derefter monteret. SUV'er strømmer gennem mikrokanaler til dannelse af SLB'er. Overskydende vesikler fjernes, og SLB'er er ækvilibreret til forsøgsbetingelser ved at flyde en løbende bufferopløsning. Derefter strømmer proteinfortyndinger gennem mikrokanaler. Endelig analyseres, normaliseres og lyseres fluorescensintensitetsdataene som en funktion af proteinkoncentration. De normaliserede data passer til en funktion til ekstraktion af en tilsyneladende dissociationskonstant ( K d, app ) value. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5
Figur 5: Principper for pH-modulationsbaseret sensing. (A) x-ray krystalstruktur PLC-δ1 PH-domæne i kompleks med PI (4,5) P2 hovedgruppe inositol 1,4,5-trisphosphat (Ins (1,4,5) P3) (PDB ID: 1MAI) 37 . (B) o-SRB-POPE-proben er særdeles fluorescerende ved lav pH og standset ved høj pH med en pKa på 6,7 inden 7,5 mol-% PI (4,5) P2-holdig SLBs som anført i pH-titreringskurven. ( C ) PH-domænet anvendt i denne undersøgelse har et isoelektrisk punkt (pI) på 8,4, så ved forsøgs pH (7,0) er proteinet positivt ladet. Med en netto positiv cHarge, proteinet tiltrækker OH - ioner. Når PH-domænet binder til PI (4,5) P 2 -holdige SLB'er, bringer OH - ionerne til membranoverfladen, grænsefladespotentialet moduleres, som igen skifter protonationstilstanden af o SRB-POPE, og dens fluorescens Afbrydes i PH-domæne-koncentrationsafhængig måde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6
Figur 6: PLC-δ1 PH-membranbinding monitoreret via pH-modulering. ( A ) Mikrokanalernes synspunkt før og efter tilføjelse af PH-domænet ved angivne koncentrationer. Sammenligning (B) af affiniteterne mod POPC, PI4P, og PI (4,5) P2-holdige SLBs. PH domænebinding til 7,5 mol-% PI (4,5) P2-holdige SLBs gav en Kd, app på 0,39 ± 0,05 uM. Svagere binding blev observeret mod 7,5 mol% PI4P-holdige SLB'er ( K d, app på 1,02 ± 0,20 μM), og der blev ikke observeret nogen binding for rene POPC SLB'er. Fejlstænger angiver SEM (n = 3). Tohalet t-test blev anvendt til at sammenligne tilhørsforhold mellem PI4P og PI (4,5) P2 bindende (* p = 0,0396). ( C ) Fluorescensintensiteter fra linjeskanningen på tværs af mikrokanaler er plottet som en funktion af afstanden i pixels for POPC, PI4P og PI (4,5) P 2 bindingsforsøg. (D) Normaliseret og gennemsnit POPC, PI4P, og PI (4,5) P2 bindingsdata afbildes som en funktion af PLC-δ1 PH-domæne koncentration og derefter passe til en Langmuir isoterm at ekstrahere Kd, app. Se ligningen i trin 8.4 for detaljer."Target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7
Figur 7: Prøveberegning til databehandling. ( A ) Før (sort) og efter (rød) proteintitrering line scan data for tomt (nej protein) og proteinkanal, hvor fluorescensintensitetsdata præsenteres som en funktion af afstand i pixels. Skyggede områder repræsenterer de regioner, der blev brugt til at udvinde data til beregningerne. Baseline fluorescensintensitetsdata ekstraheres lige før og efter hver kanal. ( B ) Data ekstraheres for blanke og proteinkanaler, både før og efter proteintitrering. Gennemsnit er taget for basislinjen og inden for en kanalfluorescensdata. Efter baseline-subtraktion normaliseres fluorescensdataene til den blanke kanal. Se ligningen i trin 8.3 for detaljer. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8
Figur 8: Vurdering af integriteten af ​​SLB'er og mikrokanaler. ( A ) Et billede, der illustrerer højkvalitets SLB'er og mikrokanaler. ( B ) Ufuldstændig fusion. ( C ) smeltede mikrokanaler. ( D ) Støvpartikel fanget i en mikrokanal. ( E ) Luftbobler fanget i mikrokanaler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Pattern_Design.dwgBlank "> Venligst klik her for at downloade filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hver PIP-variant, omend i lave koncentrationer, er til stede på den cytosoliske overflade af specifikke organeller, hvor de bidrager til etablering af en unik fysisk sammensætning og funktionel specificitet af den organelle membran 1 . En af de vigtigste anvendelser af PIP'er er som en specifik dockingsplatform for de mange proteiner, der kræver specifik subcellulær lokalisering og / eller aktivering 6 , 7 . På grund af deres rolle inden for cellulær fysiologi og sygdom er evnen til at studere protein-PIP-interaktioner in vitro i en fysiologisk relevant sammenhæng vigtig. Det her beskrevne assayformat tillader at man overvejer protein-PIP-interaktioner i sammenhæng med et fluidlipid-dobbeltlag, i nærværelse af en blanding af phospholipider, med den normale præsentation af polarhovedgruppen og fedtsykkelkæder med naturlig længde.

Dette assay, i kombinationVidere med pH-modulation som dets detektionssystem og SLB'er som et modelmembransystem indstillet i en mikrofluidisk platform, giver unikke fordele i forhold til andre membranbindende teknikker. Først og fremmest sparer den mikrofluidiske platform på materialer på grund af de lave krav til både protein og lipider (40 nL samlet kanalvolumen, 1,0 mm 2 SLB overfladeareal). Derudover kan fysiologisk relevante lipidsammensætninger anvendes, mens der stadig opretholdes todimensional membranfluiditet (≥1,0 μm 2 / s) 28 , 38 . Detektionssystemet giver forbedret signal-støjforhold sammenlignet med ITC, SPR og kvartskrystalmikrobalance med dissipation (QCM-D) -overvågning, hvilket gør det muligt at teste ikke kun protein-membraninteraktioner, men ion, små molekyler, peptid-membraninteraktioner som Godt 19 , 20 , 39 , 40 . Den pH-følsomme fluorescerende probe er også meget stabil og gør ikke fotobleak under de eksperimentelle betingelser testet 19 , 20 , 41 . En anden fordel ved denne platform er evnen til at observere membranoverfladerne visuelt. Visse interaktioner kan inducere dannelse af lipidmikrodomæner og / eller påvirke membranfluiditet, som kan visualiseres direkte og / eller testes via fluorescensgenvinding efter fotobleaching (FRAP) henholdsvis 42 . Assayet beskrevet her kræver ikke nogen dyr instrumentation ud over et fluorescensmikroskop. Endelig og vigtigst ved at vurdere membraninteraktioner i fravær af ligand / receptor-mærkning gør PIP-on-a-chip-analysen den foretrukne metode over de traditionelle.

Selv om PIP-on-a-chip-analysen er en kraftig teknik, kan perifere membranproteiner diffEr i den samlede sammensætning af kationiske og anioniske rester og deres fordeling inden for / omkring bindingsstedet, hvilket skaber visse udfordringer. Nogle proteiner har PIP-bindingssteder sammensat af mange basiske rester, mens andre kun har få. Derfor vil H + / OH - forholdet på bindingsstedet være anderledes, og så er størrelsen af ​​forandringen i den lokale pH ved binding. Støkiometrien af ​​interaktionen og hvorvidt PIP-bindingen er stabiliseret ved interaktioner med andre lipider komplicerer yderligere sagen. Følgelig er pI'et af et protein, især for et stort protein, muligvis ikke den eneste indikator for den forventede fluorescensændring. Mens nogle protein-PIP-interaktioner vil resultere i store fluorescensændringer, kan resten medføre små fluorescensændringer. I sidstnævnte tilfælde kan der tages mindst to handlinger for at forbedre signal-støjforholdet: 1) ved at anvende større PIP-niveauer på dobbeltlaget for at øge antallet af proteiner rEkstruderet til overfladen, dvs. at øge antallet af rekrutterede OH - ioner og antallet af slukkede o SRB-POPE-molekyler; 2) Forøgelse af o SRB-POPE niveauerne for at forbedre signal-støjforholdet.

Selvom den nuværende platform giver mange fordele ved at studere perifere membranproteiner, har den nogle udfordringer for undersøgelsen af ​​transmembrane proteiner. På grund af SLB-glasstøtte nærhed (vandlag er ca. 1-2 nm afhængigt af lipidsammensætningen) kan transmembranproteinglasunderstøttelsesinteraktion fremme proteindenaturering, føre til funktionstab og immobilisering 34 , 43 , 44 , 45 . Selvom der er mere involveret, er der blevet udviklet en række tilgange til at overvinde disse udfordringer, såsom overflademodifikation af glasstøtten til tilvejebringelse af polymerpude eller indbefattende lipopolymerRer (for eksempel PEGylerede lipider) i dobbeltlaget for at øge SLB-glasunderstøttelsesafstanden 34 , 46 , 47 , 48 .

Udformning af SLB'er af høj kvalitet er det mest kritiske aspekt af PIP-on-a-chip-analysen ( figur 8A ). Brug af rene dækslip og friske SUV'er anbefales at sikre reproducerbarhed. På grund af tilstedeværelsen af anioniske lipider, såsom PI (4,5) P2, er SUV'er negativt ladet, hvilket sænker SUV bryde effektivitet og påvirke membranen fluiditet (figur 8B). Derfor er pH-justering af SUV-opløsningen afgørende for protonering af PI (4,5) P 2- hovedgruppefosfaterne og nedsættelse af elektrostatisk afstødning med glasset for at øge ruptureringseffektiviteten 49 , 50 . SUV'er, der ikke indeholder anioniske lIpids, kræver ikke nogen pH justering. Desuden bør SUV'er injiceres i kanaler lige efter iltplasma-behandling og -binding, medens glasdækslet overflade stadig er hydrofilt, hvilket er nødvendigt for SLB-dannelse. Udover SLB-kvalitet repræsenterer støvpartikler et andet problem. Under enheden fabrikationsproces kan en støvpartikel fanget mellem kanaler forårsage kanalfusion, hvorimod en støvpartikel fanget i en kanal kan beskadige SLB og / eller reducere opløsningens strømningshastighed ( figur 8C, 8D ). Arbejdsområdet bør rengøres periodisk for at fjerne støv. Tilsvarende bør eksponering af en luftboble i en kanal undgås ved ethvert trin, hvilket ellers vil skade SLB'et irreversibelt ( Figur 8E ).

En anden parameter, der skal overvejes, når man planlægger et PIP-on-a-chip-assay, er proteinlagerbufferen. Hvis de anvendes i høje koncentrationer, kan individuelle komponenter (Stabiliseringsmidler, reduktionsmidler, salte, antimikrobielle midler, chelateringsreagenser osv. ) Kan påvirke fluorescens- og / eller SLB-integriteten. Lagringsbufferen bør derfor titreres for at teste dens virkning. Hvis en effekt observeres, bør SLB'erne ligeledes equilibreres til lagringsbufferbetingelserne før titrering af proteinet for at forhindre drift i fluorescens. I betragtning af at dette er et pH-modulationsbaseret assay, bør det rensede protein, hvis det er muligt, også indeholde den samme buffringskomponent som løbebufferen (i dette tilfælde 20 mM HEPES ved pH 7,0) for at minimere driften i fluorescens forårsaget af buffer mismatchen.

Som konklusion har vi vist, at pH-modulationsassayet kan anvendes med succes til undersøgelse af protein-PIP-interaktioner. Selv om vægten var på PIP'er, kan denne platform bruges til at teste interaktioner med mere komplekse membransystemer, der indbefatter andre fysiologisk relevante lipider, såsom phosphatidylseriNe, phosphatidylethanolamin, phosphatidinsyre og cholesterol, blandt andet 28 , 39 , 42 , 51 . Udover cellulære proteiner kan denne analyseplatform også være gavnlig for dem, der studerer humane patogener. For eksempel har proteiner kodet af vira og bakterier vist sig at interagere med cellulære membraner og nogle specifikt med PIP 52 , 53 , 54 , 55 , 56 . Følgelig kan PIP-on-a-chip-analyse tilvejebringe et middel til at opdage og karakterisere småmolekyl-inhibitorer af protein-PIP-interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

DS og CEC blev delvist støttet af tilskud AI053531 (NIAID, NIH); SS og PSC blev støttet af tilskud N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590, (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6, (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371, (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34, (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39, (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4, (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286, (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282, (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17, (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13, (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131, (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85, (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277, (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38, (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83, (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11, (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88, (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12, (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6, (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138, (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15, (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38, (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16, (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61, (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90, (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5, (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83, (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28, (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137, (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120, (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8, (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30, (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59, (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437, (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112, (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79, (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87, (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29, (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877, (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86, (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141, (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22, (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89, (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148, (3), 616-625 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics