PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Çok sayıda hücresel protein, temel hücre proseslerini etkilemek için membran yüzeyleriyle etkileşir. Bu etkileşimler, spesifik subselüler lokalizasyon ve / veya aktivasyonu sağlamak için, fosfoinositidler (PIPs) durumunda olduğu gibi bir zar içerisinde spesifik bir lipid bileşenine yönlendirilebilir. PIP'ler ve hücresel PIP bağlanma alanları, hücresel fizyolojideki rollerini daha iyi anlamak için kapsamlı olarak incelenmiştir. Protein-PIP etkileşimlerini incelemek için bir araç olarak desteklenen lipid bilayerlere (SLB'ler) bir pH modülasyon testi uyguladık. Bu çalışmalarda, pH'ye duyarlı orto- Sülohodamin B konjuge fosfatidiletanolamin, protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılmıştır. Bir proteinin bir PIP içeren membran yüzeyine bağlanmasının ardından ara yüzey potansiyeli, probun proton durumunu değiştirerek modüle edilir ( yani , yerel pH'daki değişim). PH modülasyon tahlilinin başarılı bir şekilde kullanılmasına ilişkin bir vaka çalışması, fosfolipaz C delta1 PleckstrHomoloji (PLC-δ1 PH) etki alanı ve bir örnek olarak fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) etkileşim içinde. Bu etkileşim için görünür çözülme sabiti ( Kd , app ) , diğerleri tarafından elde edilen Kd , app değerlerine benzer olarak 0.39 ± 0.05 μM idi. Daha önce gözlemlendiği gibi, PLC-δ1 PH alanı, PI (4,5) P 2 spesifiktir, fosfatidilinositol 4-fosfata karşı daha zayıf bağlar ve saf fosfatidilkolin SLB'ye bağlanma göstermez. PIP-on-a-chip testi, düşük örnek hacmi ve ligand / reseptör işaretleme gereksinimleri olmaksızın, geleneksel ve düşük PIP bağlanma deneyleri karşısında avantajlıdır, yüksek ve düşük afiniteli membran etkileşimlerini hem küçük hem de Büyük moleküller ve geliştirilmiş sinyal / gürültü oranı. Buna göre, çip üzerinde PIP'in kullanılması, çok çeşitli membran etkileşim mekanizmalarının aydınlatılmasını kolaylaştıracaktır. Dahası, bu yöntem muhtemelenProteinlerin membranlarla etkileşime geçme kapasitesini modüle eden terapötiklerin belirlenmesinde sed.

Introduction

Sayısız etkileşimler ve biyokimyasal işlemler iki boyutlu sıvı zar yüzeylerinde gerçekleşir. Ökaryotik hücrelerdeki zarla kapalı organeller, sadece biyokimyasal süreçlerde ve bunlarla ilişkili proteomda değil aynı zamanda lipit kompozisyonlarında da eşsizdir. Fosfolipidlerin olağan dışı bir sınıfı fosfoinositidlerdir (PIP'ler). Hücresel lipidomun sadece% 1'ini oluşturmalarına rağmen, bunlar 1 , 2 , 3 , 4 diğerleri arasında sinyal iletiminde, otofajiyede ve zar ticaretinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Hücresel PIP kinazlar tarafından inositol baş grubunun dinamik fosforilasyonu yedi PIP mono- ana grupları, bis- veya tris-fosforile 5 yol açar. Ek olarak, PIP'ler membranların subselüler kimliğini tanımlar ve bir veya daha fazla fosfoin içeren protein / enzimler için özel membran yerleştirme siteleri olarak görev yaparlarÖrneğin Pleckstrin Homolojisi (PH), Phox Homoloji (PX) ve epsin N-terminal Homolojisi (ENTH) 6 , 7 . En çok çalışılan PIP bağlayıcı bölgeleri biri, özellikle yüksek nanomolar düşük mikromolar afinite 8 içinde fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) ile etkileşime giren fosfolipaz C (PLC) -δ1 PH olan , 9 , 10 , 11 .

Bu etkileşimlerin mekanizması, termodinamiği ve özgüllüğünü incelemek için çeşitli nitel ve nicel in vitro yöntemler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. En sık kullanılan PIP bağlanma deneyleri arasında, yüzey plazmon rezonansı (SPR), izotermal kalorimetre (ITC), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, lipozom flotasyonu / sedimentasyon testi ve lipid lekeleri (Yağ-lekeleri / PIP-şeritleri)12 , 13 . Bunlar yaygın olarak kullanılsa da, hepsinin dezavantajları var. Örneğin, SPR, ITC ve NMR, büyük numuneler, pahalı aletler ve / veya eğitilmiş personel 12 , 13 gerektirir . Antikor bazlı lipid lekeleri gibi bazı tahlil formatları, suda çözünür PIP'leri kullanır ve onları fizyolojik olmayan bir şekilde 12 , 14 , 15 , 16 olarak sunar . Buna ek olarak, lipid blotlar güvenilir miktarı edilemez ve sık sık yanlış pozitif / negatif gözlem 12, 17, 18 ile sonuçlanmıştır. Bu zorlukların üstesinden gelmek ve mevcut takım setini geliştirmek için am bağlamında desteklenen bir lipid katmanına (SLB) dayalı yeni bir etiketsiz yöntem geliştirildi Protein-PIP etkileşimlerinin çalışmasına başarıyla uygulanan bir mikroakışkan platform ( Şekil 1 ) 19 .

Protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılan strateji pH modülasyon algılamaya dayanmaktadır. Bu, fosfatidiletanolamin lipid başı grubu 20'ye direkt olarak konjuge edilmiş orto- Sulforhodamin B ( o SRB) içeren pH'ye duyarlı bir boya içerir. O SRB-POPE probu (Şekil 2A), düşük pH değerinde yüksek floresan ve% 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS (Şekil 5B) içinde yaklaşık 6.7 bir pKa'ya sahip yüksek bir pH değerinde söndürülür. PLC δ1 PH nedeniyle PI (4,5) P2 (Şekil 5A) karşı yüksek özgüllük 21, 22 için yaygın olarak protein PIP bağlama yöntemleri doğrulamak için kullanılmıştır"> 23 , 24 , 25. Dolayısıyla, PLC-δ1 PH alanının PIP-on-a-chip analizi yoluyla PI (4,5) P 2'ye yapıştığını test etmek için kullanılabileceğini düşünüyoruz PH etki alanı yapısı Bu çalışmada kullanılan bir net pozitif yüke (pl 8.4) sahiptir ve bu nedenle, OH çeken -. iyonları - PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS bağlanma üzerine iyonları (Şekil 5C), PH, OH getirir bu da ara yüzey potansiyel modüle ve o SRB-Pope (Şekil 5C) 26. PH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, floresan söndürülür (Şekil 6A) protonasyon durumunu değiştirir zar yüzeyi. Son olarak, normalleştirilmiş verileri PH-PI (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 6B, 6C). afinitesini belirlemek için bir bağlanma izoterm uyacak </ P>

Bu çalışmada, mikroakışkan bir platformda PIP içeren SLB'lere proteinin bağlanmasını gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu protokol, okuyucuyu, mikroakışkan cihaz ve vezikül hazırlamadan SLB oluşumuna ve protein bağlamaya monte etmekten alıyor. Buna ek olarak, veri analizi için tarifi PLC δ1 PH-PI (4,5) P2 etkileşimi sağlanır için afinite bilgileri elde etmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cam Kapak Halkalarını Temizleme

  1. 7x Temizleme Çözeltisini ( Malzeme Tablosuna bakın) seyreltin, 100 mm derinliğinde borosilikatlı bir cam tabakasında deiyonize suyla 7 kez seyreltin ve düz bir tabanı olan bir tabakta 95 ° C'ye kadar 20 dakika boyunca veya bulutlu çözelti berraklaşana kadar ısıtın .
    NOT: Çözüm sıcak olacaktır, bedensel yaralanmaları önlemek için dikkatli olun. 7x Temizleme Çözeltisi, hekzasodyum [oksido- [oksido (fosfonatooksi) fosforil] oksifosforil] fosfat, 2- (2-bütoksietoksi) etanol, sodyum 1,4-bis (2-etilheksoksi) -1,4-dioksobütan'ın tescilli bir harmanıdır. -2-sülfonat ve zararlı olmayan ilaveler.
  2. Cımızı kullanarak, lamelleri (40 mm x 22 mm genişlik x 0.16-0.19 mm yükseklik), alüminyum bir lekelenme rafına alternatif yönlerde yerleştirin. Birbirlerine dokunmalarını önlemek için her lamel arasına boş bir yer tutun.
  3. Boyama rafını, temizleme solüsyonundaki lamelleri kullanarak tamamen suya daldırın. Lamelleri içeri saklamaya devam et1 saat süreyle çözüm.
    NOT: Su buharlaştıkça, çözelti konsantrasyonunu değiştirmek için taze deiyonize su eklemeye devam edin.
  4. Temizleme solüsyonundan lekelenme raflarını çıkarın ve deterjanı çıkarmak için lamelleri bol miktarda deiyonize suyla yıkayın.
  5. Azot gazı (1 boyama rafı başına yaklaşık 5 dakika) ile lamelleri kurutun ve tavlama için 550 ° C'de 6 saat boyunca lamelleri bir fırın yerleştirin.
    NOT: Bu, cam yüzeyindeki kaba özelliklerin yumuşatılması için önemli bir adımdır.
  6. Lamelleri plastik bir kapta yerleştirin ve tozdan uzak tutun.

2. Mikroişlemci PDMS Bloklarının Hazırlanması

  1. Büyük bir plastik tartım teknesinde polidimetilsiloksan (PDMS) ön polimeri ve sertleştirici ajanı 10: 1 (w / w) oranda karıştırın ve 500 Torr veya daha düşük vakum kuvveti ile 1 saat boyunca vakumda buharlaştınn.
    NOT: PDMS şeffaf ve inert bir silikon polimerdir. İstenen PDMS bloğunu almak için tKalınlık (0,5 cm), 55 g ön polimerin 5.5 g sertleştirici ajan ile karıştırılması.
  2. Aynı SU-8 mikro modelinin çok sayıda kopyasını içeren silikon kalıbı büyük (10 cm taban çapında) bir plastik tartım teknesine yerleştirin ve gazdan arınmış PDMS'ye dökün. Ardından gece boyunca 60 ° C'de kuru bir fırında tedavi edin.
    NOT: Mikro modeller çıplak gözle görülecek kadar büyüktür. Her model, arasında 40 μm aralık bulunan 8 mikro kanal (100 μm genişlik x 40 μm yükseklik x 1 cm uzunluk) içerir ( Şekil 1A , 1B ). Sabit bir şekilde pişirilmiş SU-8 fotorezistten oluşan silikon wafer kalıp bir nanofabrikasyon tesisinde 27 imal edilmiştir. Ana hazırlanması için diğer yaklaşımlar, hidroflorik asit (HF) aşındırma, yüksek sıcaklıkta su aşındırma, xurography ve 3D 28, 29, 30, 31 baskı içerir. CommercSilikon ana preparasyon için ial kaynakları da kullanılabilir. Mikroakışkan cihazın modelleri, bir çizim yazılımı ile tasarlandı (materyal tablosuna bakınız). Desen tasarımını içeren orijinal dosya, doğrudan üreticiye tedarik edilebilecek "Pattern Design.dwg" bir tamamlayıcı dosyası olarak sağlanmaktadır.
  3. Nazikçe PDMS'yi elle silikon ustadan soyun. Her mikro modelin sınırlarını, cerrahi bir neşrubat ve cetvel kullanarak dikdörtgenler halinde işaretleyin. Ardından PDMS'yi bloklara ayırın.
  4. Her mikrokanalın her iki ucundaki Şekil 3B'de gösterildiği gibi bir biyopsi zımba (1.0 mm delik çapı) ile 16 delik (8 giriş ve 8 çıkış) yerleştirin.
  5. Zarar ve tozdan mikro kalıpları korumak için her PDMS bloğunun üzerine bant uygulayın. Onları plastik bir kapta saklayın.

3. Küçük tek katmanlı veziküllerin (SUV'lerin) hazırlanması

NOT: Negatif kontrol çift katmanlı bileşim99.5 mol% 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glisero-3-fosfokolin (POPC) ve% 0.5 mol orto -Sulforhodamin B-1-palmitoil-2-oleoil- sn -gliseroo-3-fosfoetanolamin ( o SRB- PAPA). Deney iki tabakalı bileşimdir 92.0 mol% 'si POPC,% 0.5 mol o SRB-POPE ve her iki L-α-fosfatidilinositol-4-fosfat, 7.5 mol%' si (PI4P) ya da L-α-fosfatidilinositol-4,5-bifosfat (PI ( 4,5) P 2 ). Aşağıda,% 0.5 mol o SRB-POPE ve% 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SUV 92.0 mol% 'si POPC hazırlanması için bir işlemdir. Bu çalışmada kullanılan o SRB-POPE sentezi, daha önce 20 tarif edilmiştir.

  1. Karıştırılması gereken POPC, PI (4,5) P 2 ve o SRB-POPE hacmini aşağıdaki toplam miktarları hesaplar: 2.22 mg POPC, 0.26 mg PI (4,5) P 2 , ve o SRB-POPE 2.1 x 10 -5 mg.
  2. Hesaplanmış POPC hacmini pipetleyin, PI (4,5) P 2 ,Em> o SRB-POPE'yi tek bir 20 mL'lik cam sintilasyon şişesine yerleştirin.
    Not: metanol: su PI (4,5) P2 (ve diğer fosfoinositidler) hazır bir kloroform gelir oysa POPC ve O SRB-POPE stok çözeltileri, bir kloroform çözeltisi içinde gelir (20: 9: 1) çözücü karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Doğruluk için, pipet ucunu kullanmadan önce kloroformla ıslatın. Güvenlik için bu adım bir kimyasal duman davlumbazının içinde yapılmalıdır.
  3. Karışımı 10 dakika boyunca kimyasal bir duman kabı içine azot gazı akışı içinde veya çözücü buharlaşıncaya ve şişenin altında ince bir lipid film oluşana kadar kurutun.
  4. Karışımı, kalıntı organik çözücüyü çıkarmak için 10 mTorr'lik bir vakum mukavemeti ile vakum altında ≥ 3 saat kurutun.
    NOT: 3 saat kuruma süresi, 50 deney için yeterli olan, bu protokolde açıklanan SUV preparatının ölçeği için yeterlidir. SUV hazırlamanın daha büyük bir ölümü gerekiyorsa, gecede kurutulma yapılabilir.
  5. Dr'yi tekrar canlandırın(20 mM HEPES, 100 mM NaCI, pH 7.0'da) 5 mL'lik lipid filmi ile kapatıp oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 35 kHz'lik bir çalışma frekansında bir ultrasonik banyoda yerleştirin.
    NOT: Adım 3.1'de belirtilen lipid miktarlarının karıştırılması ve adım 3.5'te 5 mL akışlı tamponun eklenmesi, 0.5 mg / mL'de vezikül süspansiyonu verir. Bu aşamada vezikül süspansiyonu tek katmanlı ve çok katmanlı veziküllerin bir karışımıdır ( Şekil 2B ). Çözüm pembe / mor renkte ve nispeten bulanık görünür.
  6. Tek katmanlı vezikülleri elde etmek için vezikül süspansiyonunu sıvı azot ve su banyosu ile 40 ° C'de dondurarak çözdürün. Dondurarak-çözülmeyi 10 kere tekrarlayın.
    NOT: (İsteğe bağlı) Süspansiyonda tek katmanlı olmayan veziküllerin bulunmamasını sağlamak için santrifüj adımı 32 , 33 uygulanabilir.
  7. Vesikül süspansiyonunu, bir lipid ekstruder kullanarak 0.10 um iz izoleli polikarbonat zar içinden haddeleyin (bkz.Malzeme tablosu) SUV'ları zenginleştirecek. Ekstrüzyonu 10 kez tekrarlayın.
    NOT: Ekstrüzyona uğrayan veziküllerin toplanması için 15 mL'lik konik bir boru kullanılabilir. Çözüm, bu aşamada bulanıklığın geçersiz kalması gerekir. SUV çapı, dinamik ışık saçılması (DLS) ile teyit edilebilir ( Şekil 2C ). SUV iyi SLBS 34 oluşturulması için uygundur.
  8. Konik boruyu alüminyum folyo ile örtün ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.

4. Mikroakışkan Cihazı Birleştirme

  1. PDMS bloğunun giriş ve çıkışlarını tıkanıklık açısından test edin, deiyonize suyu deliklere suyla yıkama şişesi kullanarak püskürterek test edin. Ardından PDMS bloğunu azot gazı ile kurutun.
    NOT: Bu adım aynı zamanda kanallar içinde ve / veya kanallar arasında sıkışmış olabilecek toz parçacıklarını da giderir. Gerekirse toz parçacıklarını gidermek için toz öncesi lamine camları azot gazı ile temizleyin.
  2. PDMS bloğunu ve önceden temizlenmiş75 Watt güç ayarı, 10 cm 3 / dak oksijen akış hızı ve 200 mTorr değerindeki vakum kuvveti ile 45 s boyunca oksijen plazması ile maruz bırakmak için oksijen plazma sistemi (bkz. Malzeme tablosu) içindeki örnek lamelini (bakınız bölüm 1) .
  3. Oksijen plazma muamelesinden hemen sonra, PDMS bloğunun desenli yüzeyini kaplamayla temas halinde yerleştirin. Temas noktalarındaki hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe basın.
  4. Yapışmayı artırmak için cihazı 100 ° C'de 3 dakika düz bir sıcak plakaya yerleştirin.
  5. Cihazın tepesinden (PDMS) ve alttaki (camdaki) toz parçacıklarını gidermek için% 100 etanol içeren ıslak tüy bırakmayan bir bezle ( örn. Kimwipe) kullanın. Ardından cihazı cam mikroskop lamı üzerine bantlayın.
    NOT: Aşırı miktarda etanol kullanmayın ve etanolün giriş ve çıkış kanallarına girmesini önleyin. Aygıt hala sıcakken bu adımı uygulamak, etanın derhal buharlaşmasını sağlamak için önerilir. Cam micrOscopy slaytlar, toz ve diğer bulaşıkları temizlemek için% 100 etanol çözeltisi içinde saklanabilir.

5. Desteklenen Lipid Bilayerlerin (SLB'lerin) Oluşturulması

  1. Adım 3.8'den 100 uL PI (4,5) P 2 ihtiva eden SUV'ları 0.65 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6.4 μL 0.2 N hidroklorik asit ilave ederek çözeltinin pH'ını ~ 3.2'ye ayarlayın.
    NOT: Çözeltinin pH'sını bir mikro pH probu ile donatılmış bir pH metre ile teyit edin (materyal tablosuna bakın).
  2. PH ayarlı SUV solüsyonundan 10 μL'lik bir miktarı girişten geçirerek her bir kanala pipetleyin ve solüsyon çıkışa gelene kadar pipeti kullanarak basıncı uygulayın. Ucu pipetten çıkarın ve cihaza bağlı bırakın.
  3. Her kanal için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve ardından cihazı RT'de 10 dakika inkübe edin.
    NOT: Vesiküllerin mikrokanallara enjeksiyonu, cihaz montajından hemen sonra yapılmalıdır.
  4. Giriş ve çıkış borularının kesme takımları eaSırasıyla 60 cm (giriş tüpü) ve 8 cm uzunluğunda (çıkış borusu).
    NOT: Borunun çapraz kesilmesi ve keskin bir kenar oluşturulması, boruların giriş ve çıkışlara kolayca yerleştirilmesini sağlar. Çıkış tüpünün yay biçimi olmalıdır. Giriş borusunun uzunluğu, mikroskop kurulumuna bağlı olarak değişebilir. Borunun iç çapı 0,05 cm'dir.
  5. Cımleyi kullanarak, çıkış tüpü setini cihaza bağlayın ve ardından cihazı mikroskop sahnesine bantlayın.
  6. Giriş borusunun bir ucunu, konik bir boru içinde bulunan 25 mL'lik akan tampon içine batırın ve borunun güvenli olduğundan emin olmak için bantlayın.
  7. Yerçekimi akışı yoluyla çözeltiyi mikrokanallardan itmek için konik tübü cihazdan daha yüksek bir zemine (~ 20 cm) yerleştirin; Bunu başarmak için bir laboratuvar girişi kullanılabilir.
  8. Her bir giriş borusu için, hortumun serbest ucundan 1 mL'lik akan tamponu çizmek için bir şırınga kullanın. Pipet ucunu girişten çıkarın veGiriş borusunun cihazın içine serbest ucunu yerleştirin.
    NOT: Bu adım esnasında kanalın içine hava kabarcıklarının çıkma ihtimalini azaltmak için girişe bir miktar akan tampon koyun. Giriş tüpü cihaza bağlandıktan sonra, fazla tamponu çıkarmak için havsız bir bez kullanın.
  9. Tüm giriş boru parçalarını cihaza bağlamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Kanallar vasıtasıyla akan çalışma tamponu fazla vesiküllerin çıkarılmasına ve çift tabakanın deneye tabi tutulmasına yardımcı olur.
  10. Mikroskop kontrol yazılımını açın (materyal tablosuna bakın). Sol panelde, "Mikroskop" sekmesini tıklayın ve "10X" hedefi seçin.
  11. Araç çubuğunda "Canlı" ve ardından "Alexa 568" resim simgelerini tıklayın. İnce ve yol ayar düğmelerini kullanarak, mikrokanallara odaklanın.
  12. SLB'lerin ve kanalların kalitesini kontrol etmek için cihazı tarayın ( Şekil 8 ). Sonra,Araç çubuğundaki "FL Deklanşör Kapalı" resim simgesini tıklayın.
  13. "Edinme" sekmesini tıklayın ve "Temel ayarlamalar" ın altında "Pozlama zamanı" nı seçin. Pozlama süresini "200 ms" olarak ayarlayın.
  14. Sol panelde, "Çok Boyutlu Edinme" yi tıklayın ve filtreler menüsünün altındaki kırmızı kanalı seçin ("Alexa 568" olarak işaretlenmiştir). Ardından, "zaman aşımı" menüsünü tıklayın, zaman aralığını 5 dk olarak, süreyi 30 dk olarak ayarlayın ve "Başlat" ı tıklayın.
    NOT: Süre (30 dakika) ve akış hızı (~ 1.0 μL / dakika) temelinde SLB'yi bir kanal içinde dengelemek için 30 μL çalışma tamponu kullanılır; diğer bir deyişle , 8 kanalın tamamında 240 μL çalışma tamponu kullanılır.
  15. "Ölçme" sekmesinin altındaki "Daire" aracını seçin ve herhangi bir kanalda bir daire çizin. Daire seçilirken sağ tıklayın ve "Özellikler" i seçin. "Profil" sekmesinde, "all T" yı kontrol ederekFloresan yoğunluğu zamanın bir fonksiyonu olarak.
    1. Bir sonraki adıma geçmeden önce bu eğrisin denge olduğunu gösteren bir platona ulaştığından emin olun.
  16. Akışı durdurmak için tampon çözeltisini cihaz olarak eşit bir zemine indirin.
  17. Zaman atlamalı dosyayı kaydedin.

6. PI (4,5) P 2 ihtiva eden SLB'ler ile PLC-δ1 PH alanı etkileşiminin test edilmesi

  1. Seyreltici olarak çalışan tamponu kullanarak PH alanının seyreltiklerini hazırlayın.
    NOT: Cihazın içinde sekiz kanal olduğundan, boş kontroller için bunlardan en az ikisini kullanın. Her iki taraftaki uzak uçları seçin ve kalan kanalları protein seyreltmeleri için kullanın. Aşağıdaki PH alanı konsantrasyonları test edildi: 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 ve 2.50 uM. Her dilüsyondan yaklaşık 200 mcL, 30 dk içinde denge elde etmek için yeterliydi.
  2. Bir seferde bir tane, her çıkış tüpünü sökün ve her bir protein seyreltisinin 200 μL'iniBir pipet kullanarak çıkış kanalı. Herhangi bir baskı uygulamayın, yerçekimi işi yapın. Ucunu pipetten ayırın ve mikroakışkan aygıta tutturun.
  3. Her kanal için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve bu işlem sırasında hava kabarcıklarının kanallara girmediğinden emin olun.
  4. Mikro kanallar yoluyla proteinin akmasını sağlamak için giriş borusunu mikroakışkan cihazın altındaki bir zemine indirin. Borunun serbest ucunu atık kabına bantlayın. Protein seyreltmelerini 30 dakika boyunca akıtır.
    NOT: Bu, akışın tersine çevrilmesi ve proteinin kanallara dahil edilmesine izin verir. Dengeleme zamanı ve gerekli protein seyreltik hacmi, etkileşimin afinitesine bağlı olacaktır.
  5. Yazılımın sol panelinde, "Time Lapse" sekmesinde, tekrar görüntülemeye başlamak için "Start" düğmesine tıklayın.
  6. Dengeye ulaşıldığından emin olmak için adım 5.15'i tekrarlayın. Deneme tamamlandığında, zamandan tasarruf edindosya.

7. Membran Akışkanlığını Değerlendirme

NOT: SLB'lerin akışkan olduğundan emin olmak için Flüoresan Geri Kurtarma Sonrası Fotobloklama (FRAP) deneyleri her yeni SUV grubuyla ve temizlenmiş cam lamellerle gerçekleştirilmelidir.

  1. Mikroplaşmış PDMS blokları (2.1-2.5) imal etmek, SUV'ları (3.1-3.8) hazırlamak, mikroakışkan cihazı (4.1-4.5) monte etmek ve daha önce olduğu gibi SLB'leri (5.1-5.17) oluşturmak için cam lamelleri temizlemek için (1.1-1.6) tanımladı.
  2. Mikroskopu iki tabakaya odaklayın, maruz kalma süresini 200 ms'ye ve bölmeyi 1'e ayarlayın.
  3. Fotoğraf çamaşır suyu, 532 nm, 2 mW lazer ışını (13 μM yarıçapı) kullanarak dairesel bir nokta. Fotoblokajdan hemen sonra, ilk 45 saniyede bir her 3 saniyede bir bir dizi görüntü yakalamaya başlayın, ardından kalan süre için 30 saniye ara verin (toplam süre 15 dakika). Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra zaman aşımı dosyasını kaydedin.
  4. Ağartıcıyı seçin veZamanın bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluk değerlerini çıkarmak için daire çizim aracını kullanmayı öğrenin. Buna ek olarak, yakındaki iki tane daha alan seçin; biri suni olmayan bir bölgeye ve biri de herhangi bir SLB içermeyen bir bölgeye karşılık gelir.
  5. Aşağıdaki denklemi kullanarak flüoresans iyileşmesini ( y ) hesaplayın:
    Denklem
    NOT: Burada F t , zamanın bir fonksiyonu olarak ağartılmış bölgenin yoğunluğunu temsil eder, F i ağartmadan önce flüoresans yoğunluğunu temsil eder (bu durumda normalleştirilmiş bir değer olarak "1" kullanınız); F 0 arka plan yoğunluğudur.
  6. Bir FRAP eğrisi oluşturmak için zamanın (x ekseni) bir fonksiyonu olarak floresan geri kazanımını (y ekseni) çizin. Ardından verileri aşağıdaki gibi tek bir üstel fonksiyona uydurun,
    Denklem
    NOT: Burada A mobil fraksiyonu ve t 1/2 ) hesaplamak için kullanılan mobil fraksiyon için kinetik sabittir:
    Denklem
  7. Difüzyon sabitini ( D ) hesaplamak için t 1/2 değerini kullanın:
    Denklem
    NOT: Buradaki R , lazer ışını yarıçapını (13 um) temsil eder. Bir akışkan çift-katlı difüzyon sabit ≥1.0 um2 / s olmalıdır.

8. Verileri İşleme

NOT: Veri analizinin rutini, kullanılan mikroskop, görüntü işleme yazılımı ve eğri uydurma yazılımına bağlı olacaktır.

  1. PH etki alanını titreşimden önce (adım 5.17'den) ve sonra (6.6. adımdan) zaman aşımı dosyalarını açın. Her zaman atım dosyasının son karesine gidin ve fluoresc elde etmek için tüm mikro kanallar boyunca bir çizgi taraması yapınPiksel cinsinden uzaklığın bir fonksiyonu olarak yoğunluk verilerini gösterir ( Şekil 6A ). Verileri bir elektronik tablo yazılımına aktarın.
  2. Her mikrokanal için (PH alan eklemeden önce ve sonra), kanal ve bazal çizgiyi temsil eden kanalın her iki yanındaki bazı verileri örnekleyin ( Şekil 7A ).
    NOT: Boş kanal floresan yoğunluğu değişmeden kalmalıdır. Diğer tüm kanallar boş kanala normalize edildiğinden, iki boş kanala sahip olmak ve floresan yoğunluğunun birbiriyle tutarlı olmasını sağlamak çok önemlidir.
  3. Veriyi boş kanala normalleştirmek için aşağıdaki formülü uygulayın; Şekil 7B'de örnek bir hesaplama yapılmıştır.
    Denklem
    NOT: Burada ΔF proteini , protein kanalının arka plan çıkarılan floresan yoğunluğunu, ΔF boşluğu , boş kanala ait arka plan çıkarılan floresans yoğunluğunu, öncesi ve sonrası , protein titrasyon adımlarından önce ve sonra ifade eder ve α , protein kanalı ve boş kanala ait flüoresan yoğunluklarının oranı olan düzeltme faktörünü temsil eder ([ F proteini / F boşluğu ] pre ) bir ön-protein titrasyon adımında. Floresan yoğunluğu PH alan konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak düştüğünden, normalleştirilmiş veriler değer açısından negatif olacaktır.
  4. Eğri uydurma bir yazılım (bkz. Malzeme Tablosu ) kullanarak, normalleştirilmiş flüoresan PH alan konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir ve bir Langmuir izoterma uyarlar ( Şekil 6C ):
    Denklem
    NOT: Burada ΔF fluo'daki maksimum değişime göre floresan yoğunluğundaki değişimi temsil ederproteinin bir doyma konsantrasyonu, bu (Af max) olduğu zaman Kd ise, uygulama dökme protein konsantrasyonu ([PLC δ1 PH]) 'ye eşittir, sabit, endojen temsil eder, yoğunluk rescence olan% 50 kapsam (en Membrana bağlı kompleks) elde edilir. Bu denge tabanlı bir bağlama ölçümüdür, böylece normalize edilmiş veriler görünen bir deneysel parametre Kd , app çıkarmak için basit bir Langmuir izoterma uymaktadır. Uydurma yazılımı Kd, PLC δ1 PH-PI (4,5) P2 etkileşim için uygulama göre 0.39 ± 0.05 nM (Şekil 6B) 'dir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir PIP-on-a-chip mikrocihazda içinde (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 1), PLC-δ1 PH-PI çalışma pH modülasyon deneyi kullanılmıştır. Ayrıntılı bir protokol aracılığıyla, mikroakışkan aygıt bileşenlerini hazırlamak ve bir araya getirmek, küçük tek katmanlı vezikülleri (SUV'ler) yapmak ( Şekil 2 ), bir aygıt içinde SLB'ler oluşturma ( Şekil 3 ) ve PIP içeren SLB'lere protein bağlanmasını test ettik. Tipik bir SLB bağlama deneyinin akış şeması Şekil 4'te gösterilmektedir. PH, modülasyon deneyi ilkesi, örnek olarak bağlayıcı PH-PI (4,5) P2 kullanılarak Şekil 5'te gösterilmektedir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, PH PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS bağlandığım göstermiştir. Daha spesifik olarak, bağlandıktan sonra, yerel pH'ın daha temel hale geldiğini gözlemledik. Bu Lokal pH değişimi SLB'ler içinde bulunan o SRB-POPE floresan probu tarafından algılanır ve ardından buna göre söndürülür ( Şekil 6A , 6C ). Söndürme, konsantrasyona bağlı ve doyurulabilirdi, bu nedenle verileri bir Langmuir izoterma uydurmak, 0.39 ± 0.05 uM'lik bir Kd , app verdi ( Şekil 6B , 6D ). PH yana PI (4,5) P2 doğru seçiciliği gösterdi (Şekil 6B) bir POPC (zitteriyonik lipit) doğru gözlendi bağlanması ve zayıf (= Kd, uygulama 1.02 ± 0.20 uM) PI4P içeren SLBS için bağlayıcı. Floresan verilerin nasıl işlendiğini göstermek için örnek bir hesaplama dahildir ( Şekil 7 ). Şekil 8'de , SLB'lerin ve mikro kanalların kalitesinin belirlenmesinde görsel ipuçları sağlamak için mikrokanal görüntü serileri sunulmuştur.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Şekil 1
Şekil 1: protein-PIP etkileşimlerini incelemek için çip üzerinde mikropluidik bir cihaz. ( A ) Mikroakışkan cihaz, 8 giriş ve 8 çıkışlı 8 mikrokanal içerir. Kanalları bu görüntüde görünür kılmak için renkli solüsyonlar akıtıldı. Cihazın genişliği (x) 2.0 cm, yüksekliği (y) 0.5 cm, uzunluğu 3.0 cm'dir (z). ( B ) Mikro kanalların zemini camdır, duvarlar ve tavanlar ise polidimetilsiloksandan (PDMS) oluşur. Her mikrokanalın genişliği 100 μm, yüksekliği 40 μm ve uzunluğu 1 cm'dir. İki bitişik mikro kanal arasındaki boşluk 40 μm'dir. Desteklenen lipit çift tabakalar (SLB) cam yüzeyin üstünde oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Küçük unilamellar vezikül (SUV) hazırlama ve kalite kontrol çalışmaları. ( A ) veziküllerin yapımında kullanılan lipid bileşenleri: orto -Sulforhodamin B-POPE ( o SRB-POPE), L-a-fosfatidilinositol-4-fosfat (PI4P), L-a-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfat PI (4,5) P2) ve 1-palmitoil-2-oleoil -sn-glisero-3-fosfokolin (POPC) vb. ( B ) Lipit vezikül türleri: SUV, büyük unilamellar vezikül (LUV), dev tek tabakalı vezikül (GUV) ve multilamellar vesikül (MLV). SUV'lar, SLB'lerin hazırlanması için en uygun 34 . ( C ) Dinamik ışık saçılımı (DLS), lipid sonrası eksipiyesin veziküllerin boyutunu teyit eder (0.1 μm filtre ile). 53.9 nm hidrodinamik yarıçapı (Rh), m Vezikül büyüklüğü dağılımının ean ~ 100 nm'dir. Sonuçlar (4,5) P2-içeren SUV PI ölçümü temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: Bir cam desteğinde SLB oluşumu. ( A ) Arzu edilen lipit kompozisyonu içeren veziküller hazırlanır ve daha sonra mikro kanallar vasıtasıyla akıtılır. Vesiküller cam yüzeyine adsorbe edilir ve deforme olur. Kritik bir yüzey kaplaması sağlandığında, veziküller SLB'leri oluşturmak için kendiliğinden kopar. Referanslar 35 , 36'dan uyarlanmıştır. ( B ) 10X'lik bir hedefin altındaki bir cihaz içindeki SLB'ler gösterilir. Alexa 568 filtre seti (uyarılma / emisyon 576/603 nm'de) kullanılır.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: Tipik bir SLB bağlama deneyinin akış şeması. Mikroakışkan cihaz parçaları, PDMS blok ve temizlenmiş lamelleri desenli yani hem hidrofilik hem de daha sonra monte edilmiş yüzeyleri yapmak için oksijen plazma ile muamele edilmiştir. SUV'ler, SLB'leri oluşturmak için mikro kanallardan akar. Fazla vesiküller çıkarılır ve SLB'ler, bir çalışan tampon çözeltisi akıtılarak deneysel koşullara dengelenir. Daha sonra, protein seyreltileri mikro kanallar boyunca akıtılır. Son olarak, floresan yoğunluğu verileri analiz edilir, normalleştirilir ve protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir. Normalize edilmiş veriler, belirgin bir ayrışma sabiti ( Kd , app ) va çıkarmak için bir işleve uygundurlue. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5
Şekil 5: pH modülasyonuna dayalı algılamanın ilkeleri. Ile kompleks PLC-δ1 PH alanının (A) X-ışını kristal yapısı PI (4,5) P2 baş grubu inositol 1,4,5-trifosfat (Atışı (1,4,5) P3) (PDB Kimliği: 1MAI) 37 . (B) O SRB-POPE sonda yüksek, düşük pH floresan ve% 7.5 mol PI, pH, titrasyon eğrisinin belirtildiği gibi SLBS ihtiva eden (4,5) P2 içinde 6.7 bir pKa değerine sahip yüksek bir pH değerinde söndürülür. ( C ) Bu çalışmada kullanılan PH alanı, 8.4 izoelektrik noktasına (pI) sahip olduğundan, deney pH'ında (7.0) protein pozitif yüklüdür. Bir net pozitif c taşımakHarge, protein OH - iyonları çekiyor. PH PI bağlandığında (4,5) p SLBS ihtiva eden 2, bu OH getirir - membran yüzeyine iyonları, ara yüzey potansiyel da o SRB-POPE protonasyon durumunu değiştirdiği modüle ve floresans olduğu PH alan konsantrasyona bağlı bir tarzda söndürülür. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 6
Şekil 6: PLC-δ1 pH-modülasyonu yoluyla gözlemlenen PH-membran bağlanması. ( A ) Belirtilen konsantrasyonlarda PH alanını eklemeden önce ve sonra mikrokanalların görünümü. (B), POPC, PI4P doğru afiniteler karşılaştırılması, ve PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS. PH etki alanı bağlama % 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS Kd, 0.39 ± 0.05 uM uygulamayı vermiştir. Daha zayıf bağlanma,% 7.5 mol PI4P içeren SLB'ye ( Kd , 1.02 ± 0.20 uM uygulaması ) bakıldı ve saf POPC SLB'ler için bağlanma gözlenmedi. Hata çubukları SEM'i gösterir (n = 3). (* P = 0,0396) bağlama PI4P ve PI (4,5) P2 arasındaki afinitelerinin mukayese etmek için kullanılmıştır -test t İki kuyruklu. ( C ) POPC, PI4P ve PI (4,5) P 2 bağlanma deneyleri için piksel olarak uzaklığın bir fonksiyonu olarak, mikrokanallar arasındaki çizgi taramasından gelen floresan yoğunlukları çizilmiştir. (D) Normalize ve POPC, PI4P ve PI ortalaması (4,5) P2 bağlanma verileri PLC δ1 PH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir ve daha sonra, uygulamayı Kd'yi ayıklamak için bir Langmuir izotermine seçimdir. Ayrıntılar için 8.4. Adımdaki denkleme bakın."Target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 7
Şekil 7: Veri işleme için örnek hesaplama. ( A ) Protein titrasyon çizgisinden önceki (siyah) ve sonra (kırmızı protein) protein kanalı ve protein kanalı için tarama verisi (burada floresans yoğunluğu verileri piksel cinsinden uzaklığın bir fonksiyonu olarak sunulmaktadır). Gölgeli alanlar, hesaplamalar için veri çıkarmak için kullanılan bölgeleri temsil eder. Temel floresans yoğunluğu verileri her kanaldan önce ve sonra çıkarılır. ( B ) Veriler, protein titrasyonundan önce ve sonra, boş ve protein kanalları için çıkarılır. Ortalamalar, taban çizgisi ve bir kanal floresans verileri dahilinde alınır. Bazal çıkarma işleminden sonra, flüoresan verileri boş kanala normalize edilmiştir. Ayrıntılar için 8.3. Adımdaki denkleme bakın. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 8
Şekil 8: SLB'lerin ve mikro kanalların bütünlüğünü değerlendirmek. ( A ) Yüksek kaliteli SLB'leri ve mikro kanalları gösteren bir resim. ( B ) Eksik füzyon. ( C ) Füzyon mikrokanalları. ( D ) Bir mikro kanal içinde sıkışan toz parçacığı. ( E ) Mikro kanallar içine sıkışan hava kabarcığı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Pattern_Design.dwgBoş "> Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her bir PIP varyantı, düşük konsantrasyonlarda olsalar da, organel membran 1'in eşsiz bir fiziksel bileşimi ve fonksiyonel özgünlüğünün tesis edilmesine katkıda bulundukları belirli organellerin sitosolik yüzeyi üzerinde bulunur. PIPs en önemli kullanım alanlarından biri, belirli bir hücre içi lokalizasyonu ve / veya aktivasyonunu 6, 7 gerektiren protein sayıda için belirli bir yerleştirme platformu gibidir. Hücresel fizyoloji ve hastalıktaki rolleri nedeniyle, protein-PIP etkileşimlerini in vitro fizyolojik olarak ilgili bağlamda inceleme kabiliyeti önemlidir. Burada tarif edilen tahlil biçimi, bir fosfolipidlerin bir karışımının mevcudiyetinde bir sıvı lipid çift tabakası bağlamında protein-PIP etkileşimlerini kutup başı grubunun normal sunumu ile ve doğal uzunluktaki yağlı asil zincirleriyle göz önüne almasına izin verir.

Bu test, kombinasyondaAlgılama sistemi olarak pH modülasyonu ve bir mikroakışkan platformda ayarlanmış bir model membran sistemi olan SLB'ler, diğer membran bağlama teknikleriyle karşılaştırıldığında benzersiz avantajlar sağlar. Her şeyden önce, mikro-akışkan bir platform, kullanılan protein ve lipid (; 1.0 mm2 SLB yüzey alanı 40 nL, toplam kanal hacmi) için hem düşük hacim gereksinimlerini malzeme tasarrufu sağlar. Yine iki boyutlu membran akışkanlığını (≥1.0 um2 / s) 28 38 tutulurken Buna ek olarak, fizyolojik olarak ilgili lipit kompozisyonları kullanılabilmektedir. Algılama sistemi, sadece protein-membran etkileşimlerini değil aynı zamanda iyon, küçük molekül, peptit-membran etkileşimlerini test etmeye izin veren ITC, SPR ve dağılma ile kuvartz kristal mikro dengesine kıyasla gelişmiş sinyal / parazit oranı sağlar (QCM-D) Kuyu 19 , 20 , 39 , 40 yaş üstü Ayrıca, pH duyarlı flüoresans probu oldukça kararlıdır ve deneysel koşullar altında test edilmiş 19 , 20 , 41'de fotobakamsız değildir. Bu platformun bir diğer avantajı, membran yüzeylerini görsel olarak gözlemleme yeteneğidir. Belirli etkileşimler, sırasıyla fotoblokaj sonrası flüoresans iyileştirme (FRAP) yoluyla doğrudan görselleştirilebilen ve / veya test edilebilen, lipit mikro alanı oluşumunu indükleyebilir ve / veya membran akışkanlığını etkileyebilir 42 . Burada tarif edilen tahlil, flüoresans mikroskopunun ötesinde herhangi bir pahalı enstrümantasyon gerektirmez. Son olarak ve en önemlisi, ligand / reseptör işaretlemesinin yokluğunda membran etkileşimlerinin değerlendirilmesi PIP-on-a-chip testini geleneksel yöntemler üzerinde tercih edilen yöntem haline getirir.

Her ne kadar PIP-on-a-chip testi güçlü bir teknik olsa da, periferik membran proteinleri farklı olabilirKatyonik ve anyonik kalıntıların genel bileşimi ve bağlanma bölgesi içindeki / çevresindeki dağılımı bazı zorluklar yaratır. Bazı proteinlerin pek çok temel kalıntıdan oluşan PIP bağlama alanları bulunurken diğerlerinde sadece birkaçı vardır. Bu nedenle, bağlanma sahasındaki H + / OH - oranı farklı olacak ve bağlanma üzerine yerel pH'daki değişikliğin büyüklüğü de aynı olacaktır. Etkileşimin stoikiometrisi ve PIP-bağlanmasının diğer lipidler ile etkileşimler yoluyla stabilize edilip edilmediği durumu daha da karmaşık hale getirmektedir. Buna göre, bir proteinin, özellikle büyük bir protein için pI, beklenen flüoresans değişiminin tek göstergesi olmayabilir. Bazı protein-PIP etkileşimleri büyük floresan değişiklikleri ile sonuçlanırken, geri kalanlar küçük floresans değişikliklerine neden olabilir. İkinci durumda, sinyalin gürültü oranını arttırmak için en az iki eylem yapılabilir: 1) proteinlerin sayısını artırmak için çift katman üzerinde daha büyük PIP seviyeleri kullanmak rYüzeye çıkar, yani işe alınan OH - iyonlarının sayısını ve söndürülmüş o SRB-POPE moleküllerinin sayısını arttırmak; 2) sinyal / gürültü oranını arttırmak için o SRB-POPE düzeylerini arttırma.

Mevcut platform, periferik membran proteinlerinin incelenmesi için birçok avantaj sağladığı halde, transmembran proteinlerin çalışılması için bazı zorluklara sahiptir. SLB-cam destek yakınlığı nedeniyle (su tabakası, lipid kompozisyonuna bağlı olarak yaklaşık 1-2 nm'dir), transmembran protein-cam desteği etkileşimi, protein denatürasyonunu teşvik edebilir, fonksiyon kaybına yol açabilir ve immobilizasyon 34 , 43 , 44 , 45 . Daha katı olsalar da, cam destek maddesinin polimer yastığı sağlamak üzere yüzey modifikasyonu veya lipopolim dahil olmak üzere bu zorlukların üstesinden gelmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştirSLB-cam destek mesafesini 34 , 46 , 47 , 48 arttırmak için çift katman içinde r dişler (örneğin PEG ile birleştirilmiş lipitler).

Yüksek kaliteli SLB'ler oluşturmak, çip üzerinde PIP testinin en kritik yönüdür ( Şekil 8A ). Yenilenebilirliği sağlamak için temiz lamelleri ve taze SUV'ları kullanmanız önerilir. Nedeniyle, örneğin, PI (4,5) P2 gibi anyonik lipidler, varlığına bağlı olarak, SUV olumsuz SUV yırtılma etkinliğini düşürür, yüklü membran akışkanlığını (Şekil 8B) etkilemektedir. Bu nedenle, SUV çözeltisinin pH ayarlaması, PI (4,5) P 2 kafa grubu fosfatlarının protonlanması için önemlidir ve kırılma verimliliğini artırmak için cam ile elektrostatik iticili azaltmaktadır 49 , 50 . Anyonik l içermeyen SUV'lerIpids, herhangi bir pH ayarlaması gerektirmez. İlaveten, cam örtücü yüzey hala SLB oluşumu için gerekli hidrofilik ise, SUV'ler oksijen plazma muamelesinden ve bağlandıktan hemen sonra kanallara enjekte edilmelidir. SLB kalitesinin yanı sıra toz parçacıkları da bir başka meseleyi temsil etmektedir. Cihaz üretme işlemi sırasında kanallar arasında sıkışan bir toz parçacığı kanal füzyonuna neden olurken, bir kanal içine sıkışan bir toz parçacığı SLB'ye zarar verebilir ve / veya solüsyon akış hızını düşürebilir ( Şekil 8C, 8D ). Tozları gidermek için çalışma alanı periyodik olarak temizlenmelidir. Benzer şekilde, herhangi bir adımda bir hava kabarcığının bir kanala maruz kalmasından kaçınılmalıdır, aksi takdirde SLB'ye geri döndürülemez hasar verecektir ( Şekil 8E ).

PIP-on-a-chip deneyi planlanırken dikkate alınması gereken bir başka parametre, protein saklama tamponudur. Yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, tek tek bileşenler (Stabilize edici ajanlar, indirgeyici ajanlar, tuzlar, antimikrobiyal maddeler, kenetleme reaktifleri vs. ) floresan ve / veya SLB bütünlüğünü etkileyebilir. Bu nedenle, depolama tamponunun etkisini test etmek için titre edilmelidir. Bir etki gözlemleniyorsa, floresandaki bir kaymayı önlemek için protein titrilmeden önce SLB'ler depolama tamponu koşullarına dengelenmelidir. Bu, pH modülasyonuna dayalı bir deney olduğunu göz önüne alındığında, mümkünse, saflaştırılmış protein, tampon uyumsuzluğunun neden olduğu flüoresan sürüklenmesini en aza indirgemek için, çalışan tampon maddesi (bu durumda, pH 7.0'da 20 mM HEPES) ile aynı tamponlama bileşenini içermelidir.

Sonuç olarak, pH modülasyon testinin protein-PIP etkileşimlerini araştırmak için başarıyla kullanılabileceğini gösterdik. PIP'lere ağırlık verilmesine rağmen bu platform, fosfatidilser gibi diğer fizyolojik olarak alakalı lipidleri içeren daha kompleks membranlarla etkileşimleri test etmek için kullanılabilirNe, fosfatidiletanolamin, fosfatidik asit ve kolestrol, diğerleri arasında 28 , 39 , 42 , 51 . Hücresel proteinlerin ötesinde, bu tahlil platformu insan patojenlerine bakanlar için faydalı olabilir. Örneğin, virüsler ve bakteriler tarafından kodlanan proteinlerin hücresel membranlarla ve bazıları özellikle PIP'ler 52 , 53 , 54 , 55 , 56 ile etkileşime girdiği gösterilmiştir. Buna göre, PIP-on-a-chip testi, protein-PIP etkileşimlerinin küçük moleküllü inhibitörlerini keşfetmek ve karakterize etmek için bir araç sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

DS ve MSK, kısmen hibe AI053531 (NIAID, NIH) tarafından desteklendi; SS ve PSC hibe N00014-14-1-0792 (ONR) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590, (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6, (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371, (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34, (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39, (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4, (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286, (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282, (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17, (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13, (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131, (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85, (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277, (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38, (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83, (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11, (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88, (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12, (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6, (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138, (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15, (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38, (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16, (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61, (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90, (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5, (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83, (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28, (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137, (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120, (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8, (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30, (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59, (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437, (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112, (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79, (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87, (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29, (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877, (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86, (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141, (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22, (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89, (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148, (3), 616-625 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics