PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nous présentons ici une bicouche lipidique supportée dans le contexte d'une plate-forme microfluidique pour étudier les interactions protéines-phosphoinositides en utilisant une méthode sans étiquette basée sur la modulation du pH.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De nombreuses protéines cellulaires interagissent avec les surfaces membranaires pour affecter les processus cellulaires essentiels. Ces interactions peuvent être dirigées vers un composant lipidique spécifique dans une membrane, comme dans le cas des phosphoinositides (PIP), pour assurer une localisation et / ou une activation sous-cellulaires spécifiques. Les PIP et les domaines de liaison cellulaire PIP ont été largement étudiés pour mieux comprendre leur rôle dans la physiologie cellulaire. Nous avons appliqué un test de modulation du pH sur les bicouches lipidiques supportées (SLB) comme outil pour étudier les interactions protéines-PIP. Dans ces études, la phosphatidyléthanolamine conjuguée à l' ortho -Sulforhodamine B est utilisée pour détecter les interactions protéine-PIP. Lors de la liaison d'une protéine à une surface de membrane contenant du PIP, le potentiel interfacial est modulé ( c.-à-d. Le changement du pH local), en déplaçant l'état de protonation de la sonde. Une étude de cas de l'utilisation réussie du test de modulation de pH est présentée en utilisant la phospholipase C delta1 PleckstrDans le domaine de l'homologie (PLC-δ1 PH) et de l'interaction phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) à titre d'exemple. La constante de dissociation apparente ( K d, app ) pour cette interaction était de 0,39 ± 0,05 μM, similaire à K d, valeurs d' application obtenues par d'autres. Comme précédemment observé, le domaine PLC-δ1 PH est PI (4,5) P 2 spécifique, montre une liaison plus faible au phosphatidylinositol 4-phosphate et ne se lie pas aux SLB de phosphatidylcholine pure. Le dosage PIP-on-a-chip est avantageux par rapport aux essais traditionnels de liaison au PIP, y compris, mais sans s'y limiter, le faible volume de l'échantillon et les exigences d'étiquetage du ligand / récepteur, la capacité de tester des interactions membranaires à haute et faible affinité avec les petits et les petits De grandes molécules et un rapport signal / bruit amélioré. En conséquence, l'utilisation de l'approche PIP-on-a-chip facilitera l'élucidation des mécanismes d'une large gamme d'interactions membranaires. En outre, cette méthode pourrait être possibleDans l'identification des agents thérapeutiques qui modulent la capacité des protéines à interagir avec les membranes.

Introduction

De nombreuses interactions et processus biochimiques se déroulent sur des surfaces à membrane bidimensionnellement fluides. Les organites membranaires dans les cellules eucaryotes sont exclusives non seulement dans les procédés biochimiques et leur protéome associé, mais également dans leur composition lipidique. Une classe exceptionnelle de phospholipides est la phosphoinositide (PIP). Bien qu'ils ne représentent que 1% du lipidome cellulaire, ils jouent un rôle crucial dans la transduction du signal, l'autophagie et le trafic de la membrane, entre autres 1 , 2 , 3 , 4 . La phosphorylation dynamique du groupe de tête d'inositol par les PIP kinases cellulaires donne naissance à sept groupes de tête PIP mono-, bis- ou tris-phosphorylés 5 . En outre, les PIP définissent l'identité subcellulaire des membranes et servent de sites d'ancrage membranaire spécialisés pour les protéines / enzymes contenant un ou plusieurs phosphoinosItide-binding domains, par exemple, Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) et epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . L'un des domaines de liaison au PIP le mieux étudié est le domaine de phospholipase C (PLC) -δ1 PH qui interagit spécifiquement avec le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) dans une affinité de gamme micromolaire élevée à haut nanomolaire 8 , 9 , 10 , 11 .

Une variété de méthodes qualitatives et quantitatives in vitro ont été développées et utilisées pour étudier le mécanisme, la thermodynamique et la spécificité de ces interactions. Parmi les tests de liaison au PIP les plus couramment utilisés, on trouve la résonance plasmonique de surface (SPR), la calorimétrie isotherme (ITC), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), le test de flottation / sédimentation de liposomes et les transferts de lipides (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Bien que ceux-ci soient largement utilisés, ils ont tous de nombreux inconvénients. Par exemple, le SPR, l'ITC et la RMN nécessitent de grandes quantités d'échantillons, d'instruments coûteux et / ou de personnel formé 12 , 13 . Certains formats de dosage tels que des lipides à base d'anticorps utilisent des formes hydrosolubles de PIP et les présentent de manière non physiologique 12 , 14 , 15 , 16 . En outre, les transferts de lipides ne peuvent être quantifiés de manière fiable et ils ont souvent abouti à des observations fausses positives / négatives 12 , 17 , 18 . Pour surmonter ces défis et améliorer l'ensemble d'outils actuel, une nouvelle méthode sans étiquette a été établie sur la base d'une bicouche lipidique supportée (SLB) dans le contexte d'am Icrofluidic platform, qui a été appliquée avec succès à l'étude des interactions protéine-PIP ( figure 1 ) 19 .

La stratégie utilisée pour détecter les interactions protéines-PIP est basée sur la détection de la modulation du pH. Cela implique un colorant sensible au pH qui a ortho -Sulforhodamine B ( o SRB) directement conjugué au groupe 20 de tête de lipide de phosphatidyléthanolamine. La sonde o SRB-POPE (figure 2A) est hautement fluorescent à faible pH et désactivé à un pH élevé avec un pKa d' environ 6,7 à moins de 7,5% en moles de PI (4,5) P2 contenant SLBS (figure 5B). Le domaine de PLC-δ1 PH a été largement utilisé pour valider les méthodologies de liaison aux protéines-PIP en raison de sa spécificité élevée vis-à-vis de PI (4,5) P 2 ( Figure 5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Par conséquent, nous avons estimé que le domaine PLC-δ1 PH peut être utilisé pour tester sa liaison à PI (4,5) P 2 à travers le test PIP-on-a-chip. La construction de domaine PH utilisé dans cette étude a une charge positive nette (pI 8,4) et attire ainsi OH -. ions (Figure 5C) Lors de la liaison de PI (4,5) P2 contenant SLBS, le domaine PH apporte les ions OH - au surface de la membrane, ce qui module le potentiel interfacial et déplace l'état de protonation de o SRB-POPE (Figure 5C) 26. en fonction de la concentration PH de domaine, la fluorescence est éteinte (Figure 6A). Enfin, les données normalisées est S'adapter à une isotherme de liaison pour déterminer l'affinité de l'interaction PH-PI (4,5) P 2 ( Figure 6B , 6C ). </ P>

Dans cette étude, un protocole détaillé est fourni pour effectuer la liaison des protéines aux SLB contenant du PIP dans une plate-forme microfluidique. Ce protocole permet au lecteur d'assembler le dispositif microfluidique et la préparation des vésicules à la formation de SLB et à la liaison des protéines. De plus, le mode d'analyse de données pour extraire des informations affinité pour le domaine de PH PI-PLC-δ1 (4,5) P 2 interaction sont fournis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nettoyage des couvertures de verre

  1. Diluez la solution de nettoyage 7x (voir la table des matériaux ) 7 fois avec de l'eau désionisée dans un plat en verre de borosilicate de 100 mm de profondeur avec un fond plat et chauffez-le jusqu'à 95 ° C sur une plaque chauffante chaude pendant 20 minutes ou jusqu'à ce que la solution trouble devienne claire .
    REMARQUE: la solution sera chaude, faites attention pour éviter les blessures corporelles. La solution de nettoyage 7x est un mélange exclusif d'hexasodium [oxido- [oxido (phosphonatooxy) phosphoryl] oxyphosphoryl] phosphate, 2- (2-butoxyéthoxy) éthanol, 1,4-bis (2-éthylhexoxy) -1,4-dioxobutane -2-sulfonate et ajouts non dangereux.
  2. À l'aide de pincettes, organiser les lamelles (40 mm de longueur x 22 mm de largeur x 0,16-0,19 mm de hauteur) sur une crémaillère en aluminium dans des directions alternées. Gardez une tache vide entre chaque lamelle pour éviter qu'elles ne se touchent.
  3. Enlevez complètement la crémaillère avec les lamelles dans la solution de nettoyage. Gardez les lamelles dansLa solution pendant 1 h.
    REMARQUE: À mesure que l'eau s'évapore, continuez à ajouter de l'eau désionisée fraîche pour maintenir inchangée la concentration de la solution.
  4. Retirez les supports de coloration de la solution de nettoyage et lavez les lamelles avec de grandes quantités d'eau désionisée pour enlever le détergent.
  5. Séchez les lamelles avec de l'azote gazeux (environ 5 min par support de teinture), puis placez les lamelles dans un four pendant 6 h à 550 ° C pour le recuit.
    REMARQUE: Il s'agit d'une étape cruciale qui lisse les fonctions grossières sur la surface du verre.
  6. Placez les lamelles dans un récipient en plastique et retirez-les de la poussière.

2. Fabrication de blocs PDMS micropatternés

  1. Mélanger le prépolymère de polydiméthylsiloxane (PDMS) et l'agent de durcissement à 10: 1 (p / p) dans un grand bateau de pesage en plastique et le dégager sous vide pendant 1 h avec une résistance au vide à 500 Torr ou moins.
    REMARQUE: PDMS est un polymère de silicone transparent et inerte. Pour obtenir le bloc PDMS souhaité tHickness (0,5 cm), mélanger 55 g du prépolymère avec 5,5 g de l'agent de durcissement.
  2. Placez le maître de silicium qui contient plusieurs répliques du même micropatteur SU-8 dans un grand bateau de pesée en plastique de diamètre de base de 10 cm et versez le PDMS dégazé. Ensuite, curez-le dans un four sec à 60 ° C pendant la nuit.
    REMARQUE: Les micropatrans sont assez grands pour être visibles à l'œil nu. Chaque motif contient 8 microcanaux (100 μm de largeur x 40 μm de hauteur x 1 cm de longueur) avec un intervalle de 40 μm entre ( Figure 1A , 1B ). On a fabriqué un moule en forme de plaquette de silicium constitué d'un photorésist SU-8 cuit au four dur dans une installation de nanofabrication 27 . D'autres approches pour la préparation de maître comprennent la gravure à l'acide fluorhydrique (HF), la gravure à l'eau à haute température, la xurographie et l'impression 3D 28 , 29 , 30 , 31 . CommercLes sources de préparation de silicium peuvent également être utilisées. Les modèles pour le dispositif microfluidique ont été conçus avec un logiciel de dessin (voir tableau de matériaux). Le fichier original contenant la conception du motif est fourni sous forme de fichier supplémentaire "Pattern Design.dwg", qui peut être fourni directement au fabricant.
  3. Doucement, retirez le PDMS du maître de silicium avec les mains. Marquez les limites de chaque micropattern dans des rectangles en utilisant un scalpel chirurgical et une règle. Puis, couper le PDMS en blocs.
  4. Punch 16 trous (8 entrées et 8 sorties par bloc) aux deux extrémités de chaque microcane avec un poinçon de biopsie (diamètre de trou de 1,0 mm) comme indiqué sur la figure 3B .
  5. Appliquer du ruban adhésif sur chaque bloc PDMS pour protéger les microprocesseurs des dommages et de la poussière. Rangez-les dans un récipient en plastique.

3. Préparation des petites vésicules unilamellaires (SUV)

REMARQUE: composition bicouche de contrôle négatifEst 99,5% en moles de 1-palmitoyl-2-oléoyl- sn -glycéro-3-phosphocholine (POPC) et 0,5% en moles d' ortho- Sulforhodamine B-1-palmitoyl-2-oléoil- sn -glycéro-3-phosphoéthanolamine ( o SRB- LE PAPE). Composition bicouche de test est de 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE, et 7,5% en moles soit de la L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) ou L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI ( 4,5) P 2 ). Ci - dessous, la procédure de préparation de 92,0% en moles de POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE, et 7,5% en mole PI (4,5) P2 VUS contenant. La synthèse de o SRB-POPE utilisée dans cette étude a été précédemment décrite 20 .

  1. Calculer le volume de POPC, PI (4,5) P 2 et o SRB-POPE qui doit être mélangé, ce qui représente les quantités totales suivantes: 2,22 mg de POPC, 0,26 mg de PI (4,5) P 2 , Et 2,1 x 10 -5 mg de o SRB-POPE.
  2. Pipettez le volume calculé de POPC, PI (4,5) P 2 , <Em> o SRB-POPE dans un seul flacon de scintillation en verre de 20 mL.
    REMARQUE: les solutions stock POPC et o SRB-POPE sont livrées dans une solution chloroforme, tandis que le stock PI (4,5) P 2 (et autres phosphoinositides) se trouve dans un mélange de solvants chloroforme: méthanol: eau (20: 9: 1). Pour une précision, mouillez la pointe de la pipette avec du chloroforme avant de l'utiliser. Pour plus de sécurité, cette étape doit avoir lieu dans une hotte chimique.
  3. Sécher le mélange dans un courant d'azote gazeux dans une hotte chimique pendant 10 min ou jusqu'à ce que le solvant s'évapore et un mince film lipidique se forme au fond du flacon.
  4. Desserrer le mélange sous vide pendant ≥ 3 h à une résistance au vide de 10 mTorr pour éliminer tout solvant organique résiduel.
    REMARQUE: Le temps de dessiccation de 3 h est suffisant pour l'échelle de la préparation SUV décrite dans ce protocole, ce qui est suffisant pour 50 expériences. Si une plus grande échelle de préparation SUV est nécessaire, une dessiccation peut être effectuée.
  5. Rehydrate le dr(20 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, à pH 7,0) et le placer dans un bain à ultrasons à une fréquence de fonctionnement de 35 kHz pendant 30 min à la RT.
    NOTE: Le mélange des quantités de lipides spécifiées à l'étape 3.1 et l'addition de 5 ml de tampon de roulement à l'étape 3.5 donne une suspension de vésicules à 0,5 mg / mL. À ce stade, la suspension de vésicules est un mélange de vésicules unilamellaires et multilamellaires ( figure 2B ). La solution apparaîtra en couleur rose / violet et relativement trouble.
  6. Congeler-décongeler la suspension de vésicule avec de l'azote liquide et un bain d'eau à 40 ° C pour obtenir des vésicules unilamellaires. Répétez le gel-décongélation 10 fois.
    REMARQUE: (Facultatif) Pour assurer l'absence de vésicules non-unilamellaires dans la suspension, l'étape de centrifugation peut être appliquée 32 , 33 .
  7. Extruder la suspension de vésicules à travers une membrane de polycarbonate gravée à la piste de 0,10 μm à l'aide d'une extrudeuse lipidique (voirTable des matières) pour enrichir les VUS. Répétez l'extrusion 10 fois.
    REMARQUE: Un tube conique de 15 ml peut être utilisé pour collecter les vésicules extrudées. La solution devrait être vide de turbidité à ce stade. Le diamètre du VUS peut être confirmé par diffusion dynamique de la lumière (DLS) ( Figure 2C ). Les VUS sont les mieux adaptés pour former des SLB 34 .
  8. Couvrir le tube conique avec du papier d'aluminium et le conserver à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.

4. Assemblage du dispositif microfluidique

  1. Testez les entrées et les sorties du bloc PDMS pour le blocage en jetant de l'eau désionisée à travers les trous à l'aide d'une bouteille de lavage à l'eau. Ensuite, sécher le bloc PDMS avec de l'azote gazeux.
    REMARQUE: Cette étape éliminera également toutes les particules de poussière qui auraient pu être piégées à l'intérieur et / ou entre les canaux. Si nécessaire, couvre-lits pré-nettoyés dépoussiérés avec de l'azote gazeux pour enlever les particules de poussière.
  2. Placez le bloc PDMS et le pré-nettoyéLamelle coulissante (voir la section 1) à l'intérieur du système de plasma d'oxygène (voir tableau de matériaux) échantillon pour exposer avec du plasma d'oxygène pendant 45 s avec réglage de puissance à 75 Watts, vitesse d'écoulement d'oxygène à 10 cm 3 / min et résistance au vide à 200 mTorr .
  3. Placez la surface à motifs du bloc PDMS en contact avec la lamelle immédiatement après le traitement par plasma à l'oxygène. Appuyez doucement pour éliminer les bulles d'air sur les sites de contact.
  4. Placez l'appareil sur une plaque chauffante à 100 ° C pendant 3 min pour améliorer la liaison.
  5. Utilisez un chiffon humide sans peluches ( p. Ex . Kimwipe) à 100% d'éthanol pour éliminer les particules de poussière du dessus (PDMS) et du fond (verre) de l'appareil. Ensuite, tapez le périphérique sur une glissière en verre.
    REMARQUE: N'utilisez pas une quantité excessive d'éthanol et évitez l'éthanol dans les canaux d'entrée et de sortie. Il est recommandé d'effectuer cette étape pendant que l'appareil est encore chaud pour s'assurer que l'éthanol s'évapore immédiatement. Micre de verreLes diapositives d'oscopie peuvent être stockées dans une solution à 100% d'éthanol pour éliminer la poussière et d'autres contaminants.

5. Création de bavures lipidiques supportées (SLB)

  1. Transférer 100 μL de VUS contenant PI (4,5) P 2 de l'étape 3.8 dans un tube de microcentrifugeuse de 0,65 ml. Ajuster le pH de la solution à ~ 3,2 en ajoutant 6,4 μl d'acide chlorhydrique 0,2 N.
    REMARQUE: Confirmer le pH de la solution avec un pHmètre équipé d'une sonde pH pH (voir tableau de matériaux).
  2. Pipeter 10 μL de la solution de SUV ajustée au pH dans chaque canal à travers l'entrée et appliquer une pression à travers la pipette jusqu'à ce que la solution atteigne la sortie. Détachez la pointe de la pipette et laissez-la attachée à l'appareil.
  3. Répétez l'étape ci-dessus pour chaque canal, puis incubez l'appareil pendant 10 min à la RT.
    REMARQUE: l'injection de vésicules dans les microcanaux doit être effectuée immédiatement après l'assemblage du dispositif.
  4. Couper les ensembles de tuyaux d'entrée et de sortieCh 60 cm (tube d'entrée) et 8 cm (tube de sortie) long, respectivement.
    REMARQUE: en coupant le tube en diagonale et en créant un bord tranchant, il est plus facile d'insérer le tube dans les entrées et sorties. Le tube de sortie devrait avoir une forme d'arc. La longueur du tube d'entrée peut varier en fonction de la configuration du microscope. Le diamètre intérieur du tube est de 0,05 cm.
  5. À l'aide de pinces, raccordez le tube de sortie au périphérique, puis tapez l'appareil sur un microscope.
  6. Immergez une extrémité de la tubulure d'entrée dans 25 ml de tampon de fonctionnement contenu dans un tube conique et tapez-le pour vous assurer que le tube est bien fixé.
  7. Placer le tube conique sur un sol plus élevé (~ 20 cm) que l'appareil afin de pousser la solution à travers les microcanaux par écoulement par gravité; Une prise de laboratoire peut être utilisée pour y parvenir.
  8. Pour chaque tube d'entrée, utiliser une seringue pour dessiner 1 mL de tampon courant à partir de l'extrémité libre de la tubulure. Retirez la pointe de la pipette de l'entrée et insérez laExtrémité libre du tube d'entrée dans l'appareil.
    REMARQUE: Introduire une baisse de la mémoire tampon en cours d'exécution sur l'entrée pour réduire la probabilité qu'une bulle d'air soit introduite dans le canal pendant cette étape. Une fois que le tube d'entrée est attaché à l'appareil, utilisez un chiffon sans peluches pour éliminer l'excès de tampon.
  9. Répétez l'étape ci-dessus pour connecter toutes les pièces d'entrée du tube à l'appareil.
    REMARQUE: Le flux de tampon de fonctionnement à travers les canaux permet d'éliminer les excès de vésicules et d'équilibrer la bicouche dans des conditions expérimentales.
  10. Ouvrez le logiciel de contrôle du microscope (voir la table des matières). Sur le panneau de gauche, cliquez sur l'onglet "Microscope" et choisissez l'objectif "10X".
  11. Cliquez sur "Live", puis sur les icônes d'image "Alexa 568" sur la barre d'outils. En utilisant les boutons de réglage fin et de course, mettez l'accent sur les microcanaux.
  12. Numérisez l'appareil pour vérifier la qualité des SLB et des canaux ( Figure 8 ). Alors,Cliquez sur l'icône d'image "Shutter Closed" sur la barre d'outils.
  13. Cliquez sur l'onglet "Acquisition", et sous "Réglages de base", sélectionnez "Temps d'exposition". Réglez le temps d'exposition sur "200 ms".
  14. Sur le panneau de gauche, cliquez sur «Acquisition multidimensionnelle» et, dans le menu des filtres, sélectionnez le canal rouge (marqué «Alexa 568»). Ensuite, cliquez sur le menu "time lapse", réglez l'intervalle de temps à 5 min, durée à 30 min, puis cliquez sur "Démarrer".
    REMARQUE: en fonction de la durée (30 min) et du débit (~ 1,0 μL / min), 30 μL de tampon de fonctionnement est utilisé pour équilibrer le SLB dans un canal, c'est-à - dire que 240 μL de tampon de fonctionnement sont utilisés pour les 8 canaux.
  15. Sélectionnez l'outil "Cercle" sous l'onglet "Mesurer" et tracez un cercle dans n'importe quel canal. Cliquez avec le bouton droit de la souris pendant que le cercle est sélectionné et choisissez "Propriétés". Sous l'onglet "Profil", cochez "tout T" pour afficher leIntensité de fluorescence en fonction du temps.
    1. Assurez-vous que cette courbe atteint un plateau, ce qui indique l'équilibre, avant de passer à l'étape suivante.
  16. Abaissez la solution tampon à un sol égal comme dispositif pour arrêter le flux.
  17. Enregistrez le fichier de temporisation.

6. Test PLC-δ1 interaction PH de domaine avec PI (4,5) P 2 -Contenant SLBS

  1. Préparer les dilutions du domaine PH à l'aide du tampon courant en tant que diluant.
    REMARQUE: Étant donné qu'il existe huit canaux dans l'appareil, utilisez au moins deux d'entre eux pour les contrôles vierges. Choisissez les extrémités de chaque côté et utilisez les canaux restants pour les dilutions de protéines. Les concentrations de domaine PH suivantes ont été testées: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 et 2,50 μM. Environ 200 μL de chaque dilution était suffisant pour atteindre l'équilibre dans les 30 minutes.
  2. Un à la fois, détachez chaque tube de sortie et appliquez 200 μL de chaque dilution de protéines dansLe canal de sortie en utilisant une pipette. N'appliquez aucune pression, laissez la gravité faire le travail. Détachez la pointe de la pipette et laissez-la attachée au dispositif microfluidique.
  3. Répétez l'étape ci-dessus pour chaque canal et assurez-vous que les bulles d'air ne sont pas introduites dans les canaux pendant ce processus.
  4. Abaissez le tube d'entrée à un sol sous le dispositif microfluidique pour commencer à écouler la protéine à travers les microcanaux. Tapez l'extrémité libre du tube dans un récipient à déchets. Réglez les dilutions de protéines pendant 30 min.
    REMARQUE: cela inversera le flux et permettra l'introduction de la protéine dans les canaux. Le temps d'équilibrage et le volume des dilutions de protéines nécessaires dépendent de l'affinité de l'interaction.
  5. Sur le panneau gauche du logiciel, sous l'onglet "Time Lapse", cliquez sur "Démarrer" pour recommencer l'imagerie.
  6. Répétez l'étape 5.15 pour vous assurer que l'équilibre est atteint. Lorsque l'expérience est terminée, enregistrez le laps de tempsfichier.

7. Évaluation de la fluidité des membranes

REMARQUE: les expériences de récupération de fluorescence Après Photobleaching (FRAP) doivent être effectuées avec chaque nouveau lot de SUV et lamelles de verre nettoyées pour s'assurer que les SLB sont fluides.

  1. Suivez la procédure de nettoyage des lamelles de verre (1.1-1.6), la fabrication de blocs PDMS micropatternés (2.1-2.5), la préparation de SUV (3.1-3.8), l'assemblage du périphérique microfluidique (4.1-4.5) et la formation de SLB (5.1-5.17) comme précédemment Décrit.
  2. Concentrez-vous sur le microscope sur la bicouche, réglez le temps d'exposition à 200 ms, et le passage à 1.
  3. Photo-blanchir un point circulaire à l'aide d'un rayon laser de 532 nm, 2 mW (rayon 13 μM). Immédiatement après le photoblanchage, commencez à capturer une série d'images toutes les 3 s pour les 45 premières s, suivies d'un intervalle de 30 s pour le reste du temps (durée totale de 15 minutes). Une fois l'acquisition de données terminée, enregistrez le fichier de temporisation.
  4. Sélectionnez le blanchi aRea en utilisant l'outil de dessin en cercle pour extraire les valeurs d'intensité de fluorescence en fonction du temps. En outre, sélectionnez deux autres zones à proximité, l'une correspondant à une région non blanchie et une correspondant à une région sans SLB.
  5. Calculer la récupération de fluorescence ( y ) en utilisant l'équation suivante:
    Équation
    NOTE: Ici F t représente l'intensité de la région blanchie en fonction du temps, F i représente l'intensité de fluorescence avant le blanchiment (utiliser "1" comme valeur normalisée dans ce cas); F 0 est l'intensité du fond.
  6. Reconstituez la récupération de fluorescence (axe des y) en fonction du temps (axe des abscisses) pour générer une courbe FRAP. Ensuite, ajustez les données à une seule fonction exponentielle comme suit,
    Équation
    REMARQUE: Ici A représente la fraction mobile et t 1/2 ):
    Équation
  7. Utilisez le t 1/2 pour calculer la constante de diffusion ( D ):
    Équation
    REMARQUE: ici R représente le rayon du rayon laser (13 μm). La constante de diffusion pour une bicouche fluide doit être ≥1,0 ​​μm 2 / s.

8. Traitement des données

REMARQUE: La routine de l'analyse des données dépend du microscope, du logiciel de traitement d'image et du logiciel d'ajustement des courbes utilisées.

  1. Ouvrez les fichiers de temporisation antérieurs (à partir de l'étape 5.17) et après (à partir de l'étape 6.6) en titrant le domaine PH. Passez à la dernière image de chaque fichier de temporisation et faites un balayage de ligne sur tous les microcanaux pour obtenir le fluorescEn fonction de la distance en pixels ( figure 6A ). Transférez les données vers une feuille de calcul.
  2. Pour chaque microcanal (avant et après l'ajout de domaine PH), échantillonner des données dans le canal et de chaque côté du canal représentant la ligne de base ( Figure 7A ).
    REMARQUE: L'intensité de fluorescence du canal vierge devrait rester inchangée. Tous les autres canaux sont normalisés sur le canal vierge, il est donc essentiel d'avoir deux canaux vierges et de s'assurer que leurs intensités de fluorescence restent cohérentes les unes avec les autres.
  3. Appliquer la formule ci-dessous pour normaliser les données sur le canal vierge; Un calcul d'échantillon est fourni à la figure 7B .
    Équation
    REMARQUE: Ici, la protéine ΔF représente l'intensité de fluorescence soustraite par le fond du canal protéique, Δ; F blanc représente l'intensité de fluorescence soustraite par le fond du canal vierge, avant et après se référer aux étapes de titrage avant et après, et α représente le facteur de correction qui est le rapport des intensités de fluorescence du canal protéique et du canal vierge ([ F protéine / F blanc ] pré ) à une étape de titrage pré-protéine. Comme l'intensité de la fluorescence diminue en fonction de la concentration du domaine PH, les données normalisées seront négatives.
  4. À l'aide d'un logiciel de montage en courbe (voir Tableau des matériaux ), tracer la fluorescence normalisée en fonction de la concentration du domaine PH et s'adapter à une isotherme de Langmuir ( Figure 6C ):
    Équation
    NOTE: Ici ΔF représente la variation de l'intensité de fluorescence par rapport au changement maximal de fluoIntensité de la fluorescence lorsqu'une concentration de saturation de la protéine est présente ( ΔF max ), alors que l'application K d, représente la constante de dissociation apparente, qui est égale à la concentration en protéine en vrac ( [PLC-δ1 PH] ) à laquelle 50% de couverture ( Complexe lié à la membrane) est atteint. Il s'agit d'une mesure de liaison basée sur l'équilibre, de sorte que les données normalisées sont adaptées à une simple isotherme de Langmuir pour extraire un paramètre expérimental apparent K d, application . Sur la base du logiciel de montage , l'application K d, application pour PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 est de 0,39 ± 0,05 μM ( Figure 6B ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nous avons utilisé le test de modulation du pH pour étudier l'interaction PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 dans un micro-dispositif PIP-on-a-chip ( Figure 1 ). Grâce à un protocole détaillé, nous avons démontré comment préparer et assembler les composants des dispositifs microfluidiques, fabriquer de petites vésicules unilamellaires (VUS) ( Figure 2 ), former des SLB dans un dispositif ( Figure 3 ) et lier des protéines testées aux SLB contenant des PIP. Un diagramme d'écoulement d'une expérience de liaison SLB typique est représenté sur la figure 4 . Le principe du dosage de modulation du pH est illustré sur la figure 5 en utilisant la liaison au domaine PH-PI (4,5) P 2 à titre d'exemple. Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent que le domaine de PH se lie à PI (4,5) P2 contenant SLBS. Plus précisément, nous avons observé que lors de la liaison, le pH local devenait plus basique. Ce changement de pH local a été détecté par la sonde fluorescente o SRB-POPE présent dans SLBS, qui a été ensuite désactivé en conséquence (figure 6A, 6C). La trempe était dépendante de la concentration et saturable, de sorte que l'adaptation des données à une isotherme de Langmuir donnait une application Kd de 0,39 ± 0,05 μM ( Figure 6B , 6D ). Le domaine de PH a montré une sélectivité vis-à-vis de PI (4,5) P 2 car aucune liaison n'a été observée avec la POPC (lipide zwitterionique) et une liaison plus faible aux SLB contenant PI4P ( K d, application = 1,02 ± 0,20 μM) ( figure 6B ). Un calcul d'échantillon est inclus pour montrer comment les données de fluorescence sont traitées ( Figure 7 ). Dans la figure 8 , des séries d'images de microcanaux sont présentées pour fournir des indices visuels dans la détermination de la qualité des SLB et des microcanaux.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 1
Figure 1: dispositif microfluidique PIP-on-a-chip pour l'étude des interactions protéines-PIP. ( A ) Le dispositif microfluidique comporte 8 microcanaux avec 8 entrées et 8 sorties. Des solutions colorées ont été écoulées pour rendre les canaux visibles dans cette image. L'appareil mesure 2,0 cm de largeur (x), 0,5 cm de hauteur (y) et 3,0 cm de longueur (z). ( B ) Le plancher des microcanaux est en verre, tandis que les murs et les plafonds sont constitués de polydiméthylsiloxane (PDMS). Chaque microcanal mesure 100 μm de largeur, 40 μm de hauteur et 1 cm de longueur. L'espacement entre deux microcanaux adjacents est de 40 μm. Des bicouches lipidiques supportées (SLB) sont formées sur le dessus de la surface du verre. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Petites études de préparation et de contrôle de la qualité des vésicules unilamellaires (SUV). ( A ) Composants lipidiques utilisés dans la fabrication des vésicules: ortho -Sulforhodamine B-POPE ( o SRB-POPE), L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P), L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate ( PI (4,5) P 2 ) et 1-palmitoyl-2-oléoyl- sn -glycéro-3-phosphocholine (POPC). ( B ) Types de vésicules lipidiques: SUV, grande vésicule unilamellaire (LUV), vésicule unilamellaire géante (GUV) et vésicule multilamellaire (MLV). Les VUS sont les mieux adaptés pour la préparation des SLB 34 . ( C ) Confirmation de diffusion dynamique de la lumière (DLS) sur la taille de l'extrusion post-lipidique des vésicules (par un filtre de 0,1 μm). Le rayon hydrodynamique (Rh) de 53,9 nm confirme que le m La distribution de la taille de la vésicule est de ~ 100 nm. Les résultats représentent la mesure de PI (4,5) P2 VUS -containing. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: formation SLB sur un support en verre. ( A ) Les vésicules de la composition lipidique souhaitée sont préparées puis écoulées à travers des microcanaux. Les vésicules sont adsorbées sur la surface du verre et se déforment. Une fois qu'une couverture de surface critique est atteinte, les vésicules se rompent spontanément pour former des SLB. Adapté des références 35 , 36 . ( B ) Les SLB dans un appareil sous un objectif 10X sont affichés. Le jeu de filtres Alexa 568 (excitation / émission à 576/603 nm) est utilisé.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Diagramme d'une expérience de liaison SLB typique. Les composants du dispositif microfluidique, c'est- à- dire le bloc PDMS à motifs et les lamelles nettoyées, sont traités avec du plasma d'oxygène pour rendre les deux surfaces hydrophiles et ensuite assemblées. Les VUS circulent à travers des microcanaux pour former des SLB. Les excès de vésicules sont éliminés et les SLB sont équilibrés dans des conditions expérimentales en écoulant une solution tampon de roulement. Ensuite, les dilutions de protéines s'écoulent à travers des microcanaux. Enfin, les données d'intensité de fluorescence sont analysées, normalisées et tracées en fonction de la concentration de protéines. Les données normalisées sont adaptées à une fonction pour extraire une constante de dissociation apparente ( K d, app ) vaLue. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Principes de la détection basée sur la modulation du pH. ( A ) Structure cristalline des rayons X du domaine PLC-δ1 PH dans le complexe avec PI (4,5) P 2 groupe tête inositol 1,4,5-trisphosphate (Ins (1,4,5) P 3 ) (PDB ID: 1MAI) 37 . (B) La sonde o SRB-POPE est hautement fluorescent à faible pH et désactivé à un pH élevé avec un pKa de 6,7 à moins de 7,5% en moles de PI (4,5) P2 contenant SLBS comme indiqué dans la courbe de titrage du pH. ( C ) Le domaine de PH utilisé dans cette étude a un point isoélectrique (pI) de 8,4, de sorte qu'au pH expérimental (7,0), la protéine est chargée positivement. Tenir un net positif charge, la protéine attire des ions OH -. Lorsque le domaine de PH se lie à PI (4,5) P2 contenant SLBS, il apporte ions OH - à la surface de la membrane, le potentiel interfacial est modulé qui à son tour déplace l'état de protonation de o SRB-POPE, et sa fluorescence Est désactivé en fonction de la concentration du domaine PH. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6: PLC-δ1 liaison à la membrane PH contrôlée par modulation de pH. ( A ) La vue des microcanaux avant et après l'ajout du domaine PH aux concentrations indiquées. (B) Comparaison des affinités vers POPC, PI4P et PI (4,5) P2 contenant SLBS. Liaison au domaine PH à 7,5% en moles de PI (4,5) P 2 SLBS -contenant a donné un K d, application de 0,39 ± 0,05 uM. Une liaison plus faible a été observée avec des SLB contenant 5,5% en moles de PI4P ( Kd, application de 1,02 ± 0,20 μM) et aucune liaison n'a été observée pour les SLB de POPC pur. Les barres d'erreur indiquent SEM (n = 3). Le test t à deux têtes a été utilisé pour comparer les affinités entre PI4P et PI (4,5) P 2 (* p = 0,0396). ( C ) Les intensités de fluorescence du balayage de la ligne à travers les microcanaux sont tracées en fonction de la distance en pixels pour les expériences de liaison POPC, PI4P et PI (4,5) P 2 . ( D ) Les données de liaison normalisées et moyennes de POPC, PI4P et PI (4,5) P 2 sont tracées en fonction de la concentration de domaine de PLC-δ1 PH, puis adaptées à une isotherme de Langmuir pour extraire l'application K d . Voir l'équation à l'étape 8.4 pour plus de détails."Target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7: Calcul de l'échantillon pour le traitement des données. ( A ) Avant (noir) et après (rouge) des données de balayage de la ligne de titrage de la protéine pour le canal vierge (sans protéine) et protéique, où les données d'intensité de fluorescence sont présentées en fonction de la distance en pixels. Les zones ombrées représentent les régions qui ont été utilisées pour extraire des données pour les calculs. Les données d'intensité de fluorescence de base sont extraites juste avant et après chaque canal. ( B ) Les données sont extraites pour les canaux blancs et protéiques, avant et après le titrage protéique. Les moyennes sont prises pour la ligne de base et dans les données de fluorescence d'un canal. Après la soustraction de base, les données de fluorescence sont normalisées au canal vierge. Voir l'équation à l'étape 8.3 pour plus de détails. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8: Évaluation de l'intégrité des SLB et des microcanaux. ( A ) Une image illustrant des SLB et des microcanaux de haute qualité. ( B ) Fusion incomplète. ( C ) Microchannels fusionnés. ( D ) Particule de poussière piégée dans un microcanal. ( E ) Des bulles d'air piégées dans les microcanaux. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Fichier supplémentaire 1: Pattern_Design.dwgVide "> Cliquez ici pour télécharger le fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chaque variante PIP, bien que faiblement concentrée, est présente sur la surface cytosolique d'organites spécifiques où elle contribue à l'établissement d'une composition physique unique et de la spécificité fonctionnelle de la membrane organellaire 1 . L'une des utilisations les plus importantes des PIP est une plate-forme d'amarrage spécifique pour la multitude de protéines nécessitant une localisation et / ou une activation sous-cellulaire spécifiques 6 , 7 . En raison de leur rôle dans la physiologie cellulaire et la maladie, la capacité d'étudier les interactions protéines-PIP in vitro , dans un contexte physiologiquement pertinent est importante. Le format de dosage décrit ici permet de considérer les interactions protéine-PIP dans le contexte d'une bicouche lipidique fluide, en présence d'un mélange de phospholipides, avec la présentation normale du groupe de tête polaire et des chaînes acyle gras de longueur naturelle.

Ce dosage, en combinaisonAvec la modulation du pH comme son système de détection, et les SLB comme système de membrane modèle mis en place dans une plate-forme microfluidique, offre des avantages uniques par rapport à d'autres techniques de liaison à la membrane. Tout d'abord, la plate-forme microfluidique permet d'économiser sur les matériaux en raison des exigences de faible volume à la fois pour les protéines et les lipides utilisés (40 nL de volume global du canal, 1,0 mm 2 surface SLB). En outre, des compositions lipidiques physiologiquement pertinentes peuvent être utilisées, tout en conservant une fluidité bidimensionnelle de la membrane (≥1,0 μm 2 / s) 28 , 38 . Le système de détection offre un rapport signal / bruit amélioré par rapport à la surveillance de la microbalance à cristaux liquides (ITC, SPR) et de quartz avec la dissipation (QCM-D), ce qui permet de tester non seulement les interactions protéine-membrane, mais les interactions ion, petites molécules, peptides-membranes Bien 19 , 20 , 39 , 40 . En outre, la sonde fluorescente sensible au pH est très stable et ne se décolle pas dans les conditions expérimentales testées 19 , 20 , 41 . Un autre avantage de cette plate-forme est la capacité d'observer visuellement les surfaces de la membrane. Certaines interactions peuvent induire une formation de microdomaines lipidiques et / ou affecter la fluidité de la membrane, qui peuvent être visualisées directement et / ou testées par récupération de fluorescence après photoblanchissement (FRAP), respectivement 42 . Le dosage décrit ici ne nécessite aucune instrumentation coûteuse au-delà d'un microscope à fluorescence. Enfin, et surtout, l'évaluation des interactions membranaires en l'absence d'étiquetage du ligand / récepteur rend le dosage PIP-on-a-chip la méthode préférée par rapport aux méthodes traditionnelles.

Bien que le test PIP-on-a-chip soit une technique puissante, les protéines de la membrane périphérique peuvent différerDans la composition globale des résidus cationiques et anioniques et leur répartition dans / autour du site de liaison, ce qui crée certains défis. Certaines protéines ont des sites de liaison PIP composés de nombreux résidus basiques, alors que d'autres en ont seulement quelques-uns. Par conséquent, le rapport H + / OH - au site de liaison sera différent, de même que l'ampleur de la variation du pH local lors de la liaison. La stoechiométrie de l'interaction et si oui ou non la liaison au PIP est stabilisée par des interactions avec d'autres lipides complique encore le cas. En conséquence, le pI d'une protéine, en particulier pour une grande protéine, peut ne pas être le seul indicateur du changement de fluorescence attendu. Bien que certaines interactions protéines-PIP entraînent de gros changements de fluorescence, le reste peut entraîner de petits changements de fluorescence. Dans ce dernier cas, au moins deux actions peuvent être prises pour améliorer le rapport signal / bruit: 1) en utilisant des niveaux PIP plus grands sur la bicouche pour augmenter le nombre de protéines recruited à la surface, à savoir l' augmentation du nombre de recrutés ions OH - et le nombre de molécules trempées o SRB-POPE; 2) l' augmentation des niveaux o SRB-POPE pour améliorer le rapport signal sur bruit.

Même si la plate-forme actuelle offre de nombreux avantages pour l'étude des protéines membranaires périphériques, elle présente certains défis pour l'étude des protéines transmembranaires. En raison de la proximité du support en verre SLB (la couche d'eau est d'environ 1-2 nm selon la composition lipidique), l'interaction transmembranaire protéine-verre peut favoriser la dénaturation des protéines, entraîner une perte de fonction et l'immobilisation 34 , 43 , 44 , 45 . Bien que plus impliqué, une variété d'approches ont été développées pour surmonter ces défis, tels que la modification de surface du support de verre pour fournir un coussin de polymère ou un lipopolymeR tethers (par exemple des lipides PEGylés) dans la bicouche pour augmenter la distance de support de verre SLB 34 , 46 , 47 , 48 .

La formation de SLB de haute qualité est l'aspect le plus critique du test PIP-on-a-chip ( Figure 8A ). Il est conseillé d'utiliser des couvre-lits propres et des VUS frais pour assurer la reproductibilité. En raison de la présence de lipides anioniques, tels que PI (4,5) P 2 , les VUS sont chargés négativement, ce qui diminue l'efficacité de rupture de SUV et affecte la fluidité de la membrane ( Figure 8B ). Par conséquent, le réglage du pH de la solution SUV est crucial pour protoner les phosphates du groupe PI (4,5) P 2 et diminuer la répulsion électrostatique avec le verre pour augmenter l'efficacité de rupture 49 , 50 . VUS qui ne contiennent pas de lions anioniquesIpids, ne nécessitent aucun ajustement de pH. En outre, les VUS devraient être injectés dans les canaux juste après le traitement et le collage par plasma d'oxygène, tandis que la surface de la lamelle de verre est encore hydrophile, ce qui est nécessaire pour la formation de SLB. Outre la qualité SLB, les particules de poussière représentent un autre problème. Au cours du processus de fabrication de l'appareil, une particule de poussière piégée entre les canaux peut provoquer une fusion de canal, alors qu'une particule de poussière piégée dans un canal peut endommager le SLB et / ou réduire la vitesse de circulation de la solution ( Figure 8C, 8D ). La zone de travail doit être nettoyée périodiquement pour éliminer les poussières. De même, l'exposition d'une bulle d'air dans un canal doit être évitée à n'importe quelle étape, ce qui endommage le SLB de façon irréversible ( figure 8E ).

Un autre paramètre à considérer lors de la planification d'un test PIP-on-a-chip est le tampon de stockage de protéines. Si on les utilise à des concentrations élevées, les composants individuels (Les agents stabilisants, les agents réducteurs, les sels, les agents antimicrobiens, les réactifs chélatants, etc. ) peuvent affecter l'intégrité de la fluorescence et / ou du SLB. Par conséquent, le tampon de stockage doit être titré pour tester son effet. Si un effet est observé, les SLB doivent également être équilibrés dans les conditions du tampon de stockage avant de titrer la protéine pour éviter une dérive de fluorescence. Considérant qu'il s'agit d'un dosage basé sur la modulation du pH, si possible, la protéine purifiée devrait également contenir le même composant tampon que le tampon courant (dans ce cas HEPES 20 mM à pH 7,0) pour minimiser la dérive dans la fluorescence causée par le désagrégement du tampon.

En conclusion, nous avons démontré que le dosage de la modulation du pH peut être utilisé avec succès pour étudier les interactions protéines-PIP. Même si l'accent était mis sur les PIP, cette plate-forme peut être utilisée pour tester les interactions avec des systèmes membranaires plus complexes qui incluent d'autres lipides physiologiquement pertinents tels que le phosphatidylseriNe, phosphatidyléthanolamine, acide phosphatidique et cholestérol, entre autres 28 , 39 , 42 , 51 . Au-delà des protéines cellulaires, cette plate-forme d'analyse peut également être bénéfique pour ceux qui étudient les agents pathogènes humains. Par exemple, on a montré que les protéines codées par des virus et des bactéries interagissaient avec les membranes cellulaires et certaines spécifiquement avec les PIP 52 , 53 , 54 , 55 , 56 . En conséquence, le test PIP-on-a-chip peut fournir un moyen de découvrir et de caractériser les inhibiteurs de petites molécules des interactions protéines-PIP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

DS et la CCE ont été soutenus, en partie, par la subvention AI053531 (NIAID, NIH); SS et PSC ont été soutenus par la subvention N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590, (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6, (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371, (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34, (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39, (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4, (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286, (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282, (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17, (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13, (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131, (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85, (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277, (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38, (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83, (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11, (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88, (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12, (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6, (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138, (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15, (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38, (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16, (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61, (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90, (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5, (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83, (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28, (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137, (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120, (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8, (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30, (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59, (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437, (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112, (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79, (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87, (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29, (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877, (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86, (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141, (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22, (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89, (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148, (3), 616-625 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics