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आरएनए द्वारा टिड्ड एंटीना में गंधी रिसेप्टर जीन का स्थानीयकरण

Neuroscience

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Summary

इस पत्र में डिस्कोॉक्सिजेनिन (डीआईजी) -बेलेबेल्ड या बायोटिन-लेबल जांच के उपयोग से कीट एंटीना में, निम्न स्तर की ओर से गंधुर रिसेप्टर (या) जीनों के साथ-साथ अन्य जीनों के लिए स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में एक विस्तृत और अत्यधिक प्रभावी आरएनए का वर्णन किया गया है।

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Xu, X., You, Y., Zhang, L. Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (125), e55924, doi:10.3791/55924 (2017).

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Abstract

कीटनाशकों ने एक्सोजेन्सिस के रासायनिक संकेतों को समझने के लिए परिष्कृत घ्राण रिसेप्शन सिस्टम विकसित किया है। इन रासायनिक संकेतों को एंटीना के केमोसेंसिया नामक बालों जैसे संरचनाओं में रखे ओल्फेन्टर रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ओआरएन) द्वारा ट्रांसड्यूस किया जाता है। ORNs के झिल्ली पर, गंधक रिसेप्टर्स (ओआरएस) को गंध कोडिंग में शामिल माना जाता है। इस प्रकार, ORN को स्थानीयकरण करने वाले जीन की पहचान करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है या पहचानें या जीन, और सीटू स्टूड्स में आगे कार्यात्मक के लिए मौलिक आधार प्रदान करता है। कीट एंटीना में विशिष्ट ORs के आरएनए अभिव्यक्ति के स्तर बहुत कम हैं, और ऊतक विज्ञान के लिए कीट ऊतक के संरक्षण चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार, स्वस्थानी संकरण में आरएनए का उपयोग करके किसी विशिष्ट प्रकार की संवेदी को या तो स्थानीय या स्थानीय बनाना संभव है। इस पत्र में, स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में एक विस्तृत और अत्यधिक प्रभावी आरएनए विशेषकर नीच व्यक्त या कीड़ों के जीन को पेश किया जाता है। इसके अतिरिक्त, एक विशिष्ट या जीन वाएक मार्कर के रूप में एक सह-व्यक्त रिसेप्टर जीन, ओरको का उपयोग करते हुए स्वस्थानी संकरण प्रयोगों में दोहरे रंग के फ्लोरोसेंट का आयोजन करके पहचाना जाता है।

Introduction

कीट एंटीना, जो सबसे महत्वपूर्ण रसायनसूर्य अंग हैं, कई बाल-जैसे संरचनाओं से जुड़े होते हैं - जिन्हें संवेदी कहा जाता है - जो ओल्फेन्टर रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ओआरएन) द्वारा उपयोग किया जाता है। कीट ORN के झिल्ली पर, odorant रिसेप्टर्स (ओआरएस), सात ट्रांसमैमब्रन डोमेन युक्त प्रोटीन का एक प्रकार एक कोरसिप्टर (ORCO) के साथ अभिव्यक्त किया जाता है, जो एक ऑटरोरर बनाने के लिए होता है जो एक गंधग्रस्त आयन चैनल 1 , 2 , 3 के रूप में कार्य करता है। अलग-अलग रासायनिक संयुग्म 4 , 5 , 6 के विभिन्न संयोजनों के अनुसार विभिन्न संगठनों का जवाब है।

टिड्डियां ( टिड्डुटा माइग्रेटोरिया ) मुख्य रूप से घृणित संवेदनाओं पर निर्भर करती है जो कि 7 के महत्वपूर्ण व्यवहार को ट्रिगर करती हैं। टिड्डी ओआरएस आणविक घ्राण तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। एक विशिष्ट टिड्डी या जीन को न्यूरॉन में स्थानांतरित करनासीआरईए हाइब्रिडिजेशन (आरएनए आईएसएच) में आरएएन द्वारा आकृति विज्ञान के विशिष्ट संवेदी प्रकार ओआरएस फ़ंक्शन की खोज में पहला कदम है।

शाही सेना ईश को मापने और ऊतक, कोशिकाओं या सीटू पूरे माउंट की धारा में एक विशिष्ट शाही सेना अनुक्रम स्थानीय बनाना, शारीरिक प्रक्रियाओं और रोग रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान एक लेबल पूरक आरएनए जांच उपयोग करता है। डीएनजीआईजीनिन-लेबल (डीआईजी-लेबल) और बायोटिन-लेबल वाली आरएनए जांच का व्यापक रूप से आरएनए संकरण में उपयोग किया गया है। डीपीओसीजीनिन -11-यूटीपी या बायोटिन -16-यूटीपी के साथ आरएनए लेबलिंग इन विट्रो प्रतिलेखन में एसपी 6 और टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ तैयार किया जा सकता है। डीआईजी- और बायोटिन-लेबल वाले आरएनए जांच में निम्न लाभ हैं: गैर-रेडियोधर्मी; सुरक्षित; स्थिर; अत्यधिक संवेदनशील; अत्यधिक विशिष्ट; और पीसीआर और इन विट्रो प्रतिलेखन का उपयोग करना आसान है। डीआईजी- और बायोटिन लेबल वाला आरएनए जांच क्रोमोोजेनिक और फ्लोरोसेंट रूप से पता लगा सकते हैं। डीआईजी-लेबल वाली आरएनए जांचों का पता लगाया जा सकता है कि एंटी-डिगॉक्सिजेन अल्कली के साथनेफ फॉस्फेट (एपी) - संयुग्मित एंटीबॉडी जिन्हें ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप या 2 के साथ बेहद संवेदनशील रसायनयुक्त सब्ट्रेट्स नाइट्रोब्लेयू टेट्राज़ोलियम क्लोराइड / 5-ब्रोमो -4-क्लोरो-3-इंडोलिल-फॉस्फेट टोलुइडिन नमक (एनबीटी / बीसीआईपी) के साथ देखा जा सकता है 4-क्लोरो-2-मेथिलबेन्जेनियाज़ोनियम हेमी-जस्ता क्लोराइड नमक (फास्ट रेड) के साथ एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके -हाइड्रोक्सी-3-नाफ्टोलिक एसिड-2'-फेनिलाइलाइड फॉस्फेट (एचएनपीपी)। बायोटिन-लेबल वाली आरएनए जांचों से पता लगाया जा सकता है कि एंटी-बायोटिन स्ट्रेक्टिविडिन हार्स मूली पेरोक्साइड (एचआरपी) -कॉन्जुगेटेड एंटीबॉडी जो कि इन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसिसिन-टाइरामाइड्स के साथ कल्पना की जा सकती हैं। इस प्रकार, डीआईजी और बायोटिन-लेबल वाली आरएनए जांचों का उपयोग करते हुए एक टुकड़ा में दो लक्ष्य जीनों का पता लगाने के लिए स्वस्थानी संकरण में दोहरे रंग का फ्लोरोसेंट किया जा सकता है।

डीआईजी और / या बायोटिन-लेबल वाले जांच के साथ आरएनए आईएसएच का उपयोग घ्राण-संबंधी जीनों को स्थानीय करने के लिए किया गया है, जैसे कि, या ionotropic रिसेप्टर, odorant-binding प्रोटीनऔर संवेदी न्यूरॉन झिल्ली प्रोटीन, के कीट एंटीना, लेकिन नहीं करने के लिए, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एनोफ़ेलीज़ gambiae, एल migratoria और रेगिस्तान टिड्डी Schistocera gregaria 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 तक ही सीमित है। हालांकि, कीट ओआर के लिए आरएनए आईएसएच का प्रदर्शन करते समय दो महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं: (1) या जीन ( ओआरसी को छोड़कर) कम स्तर पर और केवल कुछ कोशिकाओं में व्यक्त की जाती हैं, जिससे संकेत का पता लगाना बहुत मुश्किल होता है, और (2) कीट के ऊतकों को संरक्षित करने के लिए ऊतक विज्ञान, जैसे आकारिकी संरक्षित है और पृष्ठभूमि का शोर कम है, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस पत्र में एक विस्तृत और प्रभावी प्रोटोकॉल आरटीए आईएसएच को स्थानीयकरण या कीट में जीन के लिए वर्णित करता हैएंटेना प्रस्तुत किया गया है, जिसमें क्रोमोजेनिक और टाइरामाइड सिग्नल एम्प्लीफिकेशन (टीएसए) दोनों का पता लगाया गया है।

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Protocol

नोट: आरएनए गिरावट को सीमित करने के लिए गीला-आटोक्लेव डिस्टिल्ड वॉटर (121 डिग्री सेल्सियस से 60 मिनट के लिए) और गीला-आटोक्लेव सामग्री का उपयोग करके समाधान तैयार करें।

1. आरएनए आईएसएच Antisense और भावना जांच की तैयारी

  1. लक्ष्य जीन प्रवर्धन और शुद्धि
    1. पूर्ण लंबाई कि टुकड़े के दोनों सिरों को adenines कहते हैं एक Taq डीएनए पोलीमरेज़ साथ LmigOR1 की सीडीएनए युक्त प्लाज्मिड से: सबसे पहले, एल migratoria OR1 (JQ766965 LmigOR1, GenBank) के एक 387 बीपी दोहरे धागे टुकड़ा का उत्पादन।
      1. 100 μL अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा का उपयोग करें, जिसमें 50 μL 2x प्रतिक्रिया मिश्रण, 4 μL प्रत्येक अर्थ और एंटीसेन्स प्राइमरों ( तालिका 1 ), 1 μL प्लास्मिड टेम्पलेट, और 41 μL आरएनज मुक्त एच 2 ओ का उपयोग करें। प्रोटोकॉल: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, उसके बाद 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट
      2. इन चरणों को दोहराएं LmigOR2 की 1,303 बीपी दोहरे धागे टुकड़ा निर्माण करने के लिए (GenBank: JQ766966) और LmigORco की 1251 बीपी दोहरे धागे टुकड़ा (GenBank: JN989549)। इन प्रयोगों में प्रयुक्त प्राइमरों को तालिका 1 में प्रस्तुत किया गया है।
      3. 1.2% agarose gels पर 1x Tris-acetate-EDTA बफर पर पीसीआर उत्पादों को चलाने और ethidium ब्रोमाइड धुंधला का उपयोग कल्पना।
    2. एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके इन पीसीआर उत्पादों को निकालें।
      1. निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन, जेल से एक्साइज डीएनए बैंड और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जेल स्लाइसें रखें। फिर, 0.1 ग्राम जेल टुकड़े के लिए 100 μL बाध्यकारी बफर (बफर पीएन) जोड़ें। भंवर और 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते जब तक जेल का टुकड़ा पूरी तरह से भंग न हो।
      2. संग्रह ट्यूब में एक CA2 सोखना स्तंभ डालें और 500 μL शेष बफर (बफर बीएल) जोड़ें। इससे सिलिका झिल्ली की अवशोषण क्षमता और स्थिरता में सुधार होता है। Centri1 मिनट के लिए 12,400 xg पर फ्यूज
      3. सोखना स्तंभ विधानसभा में भंग जेल मिश्रण स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। फिर, 1 मिनट के लिए 12,400 xg पर अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रवाह-थ्रू को त्यागें और संग्रह ट्यूब में सोखना स्तंभ को पुन: सम्मिलित करें।
      4. 600 μL धोने के समाधान (इथेनॉल जोड़ा गया, बफर पीडब्ल्यू) दो बार जोड़ें। 1 मिनट के लिए 12,400 xg पर अपकेंद्रित्र प्रवाह-दर-बाहर निकालें और संग्रह ट्यूब में सोखना स्तंभ को पुन: सम्मिलित करें।
      5. संग्रह ट्यूब खाली करें और 12,400 xg पर 2 मिनट के लिए स्तंभ असेंबल को किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल के वाष्पीकरण की अनुमति दें।
      6. सावधानीपूर्वक सोखना स्तंभ को एक साफ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5-10 मिनट के लिए गोली मारो और एक उपयुक्त मात्रा में डीएनए को विसर्जित करें ( जैसे, 30 μL) nuclease-free पानी की।
      7. 2 मिनट के लिए आरटी पर सेते 2 मिनट के लिए 12,400 xg पर अपकेंद्रित्र सोखना स्तंभ को त्यागें और डीएनए को 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  2. पुनः संयोजक प्लास्मिड का निर्माण
    1. एलएमआईजीआर 1 के 387 बीपी टुकड़े, एलएमआईजीआर 2 के 1,303 बीपी टुकड़े और एलएमगरोर्को के 1,251 बीपी टुकड़े को एक टी वेक्टर में अलग-अलग रूप से लपेटें जिसमें टी -7 (अपस्ट्रीम) और एसपी 6 (डाउनस्ट्रीम) आरएनए पोलीमरेज़ के प्रवर्तनकर्ता शामिल हैं जो टी -4 डीएनए लेगेज का इस्तेमाल करते हुए सम्मिलित डीएनए के निकट हैं। निम्नलिखित 10 μL प्रतिक्रिया तैयार करें: 5 μL 2x ligation बफर, 1 μL टी वेक्टर, 3 μL (~ 100 एनजी) डाला जीन के डीएनए और 1 μL टी 4 डीएनए ligase, और 4 / डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते हैं।
    2. प्रत्येक पुनः संयोजक LmigOR1 के 387 बीपी टुकड़ा, LmigOR2 की 1,303 बीपी टुकड़ा और बाँझ 1.5 एमएल ट्यूबों में सक्षम Escherichia कोलाई DH5α कोशिकाओं के 50 μL में LmigORco की 1251 बीपी टुकड़ा अलग से युक्त प्लाज्मिड के 5 μL जोड़ें।
      1. धीरे से मिलाएं और ट्यूबों को बर्फ में 30 मिनट के लिए रखें और फिर उन्हें 42 से 9 0 के लिए सेते हैंसी। उन्हें 3 मिनट के लिए बर्फ में वापस स्थानांतरित करें
      2. प्रत्येक ट्यूब के बिना ल्यूरी-बर्टानी (एलबी) तरल माध्यम के 450 μL तरल माध्यम को बिना किसी एम्बीसीलिन के लिए जोड़ दें और ई। कोलाई DH5α को पुनर्स्थापित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 150 आरपीएम पर एक प्रकार के बरतन में सेते हैं।
      3. प्रत्येक ट्रांसफॉर्मेंट के 100 μL विभाज्य ले लो और उन्हें 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन, 24 μg / mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (आईपीटीजी), और 40 माइक्रोग्राम / एमएल 5-ब्रोमो -4 युक्त एलबी ठोस सब्सट्रेट प्लेटों को टीका करने के लिए उपयोग करें। -चलोरो-3-इंडोलाइल-बीटा-डी-गैलेक्टोपीरॉनोसैड (एक्स-गैल)।
      4. 18 घंटे में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए लगातार इनक्यूबेटर में इन प्लेटों को सेते हैं। नीली-सफेद स्क्रीनिंग विधि का उपयोग करके लक्ष्य पुनः संयोजक प्लास्मिड को स्क्रीन करें। सेंगर सिकेंजिंग का उपयोग करके लक्ष्य पुनः संयोजक प्लास्मिड को अनुक्रमित करें और तीन या जीन डालें निर्देशों को पहचानें।
  3. पुनः संयोजक प्लास्मिड को रेखांकित करने के लिए प्रतिबंध अंतोन्यूक्लिज़ का चयन करें
    1. प्रतिबंध endonucleases टी का उपयोग करेंटोपी केवल वेक्टर के एकाधिक क्लोनिंग साइट में पचाने के लिए नहीं बल्कि डीएनए डालें। इस प्रयोग में, सभी 3 जीन टी वेक्टर में सदिश की तरफ की दिशा में डाली जाती हैं।
    2. LmigOR1 के 387 बीपी टुकड़ा, LmigOR2 की 1,303 बीपी टुकड़ा और LmigORco की 1251 बीपी टुकड़ा युक्त एंटिसेंस जांच उत्पादन करने के लिए पुनः संयोजक प्लास्मिड linearize को NCO मैं प्रतिबंध endonuclease का प्रयोग करें। स्पै इ I प्रतिबंध का प्रयोग करें इन्सुलेशन को इंप्रेशन जांचने के लिए।
      नोट: यदि डालने की दिशा सदिश के साथ होती है, तो टी 7 के अंत से एक अनन्य प्रतिबंध साइट को रीकॉम्बनेंट प्लास्मिड और एसपी 6 आरएनए पोलीमरेज़ को लाइनरीज करने के लिए चुना जाता है जो एंटीसेंस जांच तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है। SP6 के अंत से एक अनन्य प्रतिबंध साइट को रीकॉम्बाइनैंट प्लास्मिड को रैखिक बनाने के लिए चुना गया है, और T7 आरएनए पोलीमरेज़ का अर्थ जांच तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है। अन्यथा, यदि सम्मिलित दिशा टी के अनुरूप नहीं हैवेक्टर की दिशा, फिर SP6 के अंत से एक अनन्य प्रतिबंध साइट को रीकॉम्बनेंट प्लास्मिड और टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ को लाइनरीइज करने के लिए चुना जाता है जो एंटिसेंस जांच तैयार करने के लिए किया जाता है। T7 के अंत से अनन्य प्रतिबंध साइट को पुनः संयोजक प्लाज्मिड को रेखांकित करने के लिए चुना गया है, और एसपी 6 आरएनए पोलीमरेज़ का इस्तेमाल समझ से तैयार करने के लिए किया जाता है।
  4. लाइनरीकृत रीकॉंकिनेंट प्लास्मिड को शुद्ध करना
    1. डाइजेस्ट 20 माइक्रोग्राम प्रति तीन पुनः संयोजक LmigOR1 के 387 बीपी टुकड़ा, LmigOR2 की 1,303 बीपी टुकड़ा और एक 100 μL प्रतिक्रिया है कि 10x बफर के 10 μL शामिल में NCO मैं प्रतिबंध endonuclease का उपयोग कर LmigORco की 1251 बीपी टुकड़ा, के 40 μL युक्त प्लास्मिड के प्रत्येक 0.5 μg / μL प्लाज्मिड, एनओसी I के 3 μL और आरएनज मुक्त एच 2 ओ के 47 μL, 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के ऊष्मायन के बाद।
    2. इसी तरह, इन तीन रीकॉम्बनिन प्लास्मिड में से प्रत्येक में 20 माइक्रोग्राम डाइजेस्ट करेंस्पी मैं प्रतिबंध endonuclease गाना
    3. 1.1.2 में बताए अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके इन पचाने वाले प्लास्मिड को शुद्ध करें। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा इन निकाले गए रेखीय रीकॉंबिनेंट प्लास्मिड की सांद्रता निर्धारित करें और 0.5 μg / μL में समायोजित करें।
  5. Antisense और भावना जांच तैयार करें
    1. Antisense और भावना जांच उत्पन्न करने के लिए T7 / SP6 आरएनए ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम का उपयोग करें। एसपी 6 आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग इन तीन या जीन के लिए डीआईजी और बायोटिन-लेबल एंटिसेंस जांच के लिए डबल-फंसे हुए आरएनए के लिए किया जाता है, जो कि इन विट्रो में टेम्प्लेट के रूप में रैखिक रीकॉम्बनेंट प्लास्मिड का इस्तेमाल करते हैं। T7 आरएनए पोलीमरेज़ का अर्थ जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 20 μL अंतिम मात्रा में प्रतिक्रिया, 10x एनटीपी मिश्रण के 2 μL, 10 एक्स प्रतिलेखन बफर के 2 μL, आरएनस अवरोध करने वाले के 1 μL, T7 या SP6 आरएनए पोलीमरेज़ के 2 μL, 0.5 μg / μL लाइनरीकृत प्लाज्मिड के 4 μL युक्त, और प्रतिक्रिया करें। 9 μL RNase मुक्त एच 2 हे, पीछा किया37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के ऊष्मायन द्वारा
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 μL डीएनस के साथ 30 मिनट के लिए डीआईजी और बायोटिन लेबल एंटीसेन्स और इन्सट जांच सेते हैं। 2.5 μL 5 एम लीकिल और 75 μL पूर्ण एथेनॉल जोड़ें, फिर -70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 xg पर अपकेंद्रित्र ध्यान से सतह पर तैरनेवाला छानना तेज़ धोने के लिए 150 μL 70% इथेनॉल जोड़ें। 70% इथेनॉल (1 एल) 95% इथेनॉल (736.8 एमएल) को बाँझ आसुत जल (263.2 एमएल) से जोड़कर तैयार करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 xg पर अपकेंद्रित्र और आरटी पर 5-10 मिनट के लिए गोली मारो। शाही सेना एंटिसेंस और भावना जांच को भंग करने के लिए 25 μL आरएनज मुक्त एच 2 ओ जोड़ें।
    5. यदि डाला जीन की लंबाई 1 केबी से अधिक है, बाद में आरएएनए एंटिसेंस का टुकड़ा और एक बायकार्बोनेट-कार्बोनेट बफर समाधान में ऊष्मायन द्वारा ~ 300 बीपी की औसत लंबाई के लिए भावना जांच। 50 μL अंतिम मात्रा, सी में प्रतिक्रिया करेंआरएनए जांच के 25 μL और 60 डिग्री सेल्सियस पर बायकार्बोनेट-कार्बोनेट बफर समाधान (80 एमएम नाहोको 3 , 120 एमएम ना 2 सीओ 3 , पीएच 10.2) के 25 μL से युक्त आवश्यक हाइड्रोलिस का समय पहले प्रकाशित सूत्र 17 द्वारा दिया गया है।
    6. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 5 μL 10% एसिटिक एसिड जोड़ें। इस प्रयोग में, क्रमशः 24 और 23 मिनट के लिए Lmigor2 और Lmigorco antisense और भावना जांच का टुकड़ा।
      टी = (एल ओ- एल एफ ) / केएक्सएल एक्सएल एफ
      एल = केबी में प्रारंभिक टुकड़ा लंबाई
      एल एफ = केबी में अंतिम टुकड़ा लंबाई
      K = हाइड्रोलिसिस के लिए दर स्थिर, लगभग 0.11 केबी -1 मिनट -1
      टी = मिनट में हाइड्रोलिस का समय
    7. अंत में, -80 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL संकरित बफर और स्टोर जोड़ें

Cryostat अनुभागों की तैयारी

  1. प्रीकोल फ्रीजीएनजी माइक्रोटोम -24 डिग्री सेल्सियस
  2. नए molting वयस्क टिड्ज का चयन करें जो सक्रिय हैं और एंटीना को बरकरार हैं। बाँझ रेज़र का उपयोग करके 2-3 मिमी के टुकड़ों में ऐन्टेना काटा।
  3. फ्रीजिंग माइक्रोोटॉम धारक पर ओसीटी परिसर डालें और क्षैतिज रूप से मिश्रित पर एक या दो नमूने डाल दें। फिर, धारक को फ्रीजिंग माइक्रोटोम में -24 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण करें जब तक कि मिश्रित जमा न हो जाए। धारक को बाहर निकालें और नमूनों को थोड़ी मात्रा के साथ कवर करें। कम से कम 10 मिनट ( चित्रा 1 ) के लिए फिर से -24 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजरिंग माइक्रोोटिम में धारक को स्थानांतरित करें।
    नोट: यौगिक में बुलबुले प्राप्त करने से बचें।
  4. नमक के साथ धारक को फ्रीजिंग माइक्रोटोम में ठीक करें, फिर जमे हुए नमूनों को -24 डिग्री सेल्सियस पर 12 माइक्रोन-मोटी स्लाइस में विभाजित करें
  5. स्लाइस स्लाइड्स पर स्लाइड्स पर एक एक करके माउंट करें (25 x 75 मिमी; एनयूकेलीज-फ्री) और 10 मिनट के लिए हवा सूख

3. फिक्सिंग सेक्शन

  1. क्रिस्टोस्ट तैयार करने के बादस्लाइड्स को एक प्लास्टिक कंटेनर (~ 100 x 40 x 80 मिमी) में डाल दिया, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड समाधान (पीएफए) में स्लाइड्स को मिलाकर ऊतकों को ठीक कर दें।
  2. 1 मिनट में स्लाइड्स को 1 एक्स फास्फेट-बफररलाइन (पीबीएस) में 1 मिनट के लिए धो लें।
  3. क्षारीय प्रोटीन को खत्म करने के लिए, स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए 0.2 एम एचसीएल में स्थानांतरित करें।
  4. न्यूक्लिक एसिड की सतह प्रोटीन को खत्म करने के लिए, स्लाइड्स को 1 एक्सपीबीएस के साथ 1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ 2 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
  5. 1x पीबीएस में 30 एस में दो बार स्लाइड करें।
  6. अंत में, स्लाइड्स को फार्ममाइड समाधान में 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक कुल्ला।

4. संकरण

  1. एंटिसेंस और भावना जांच तैयार करें
    1. 1.5 एमएल एन्यूकेला-मुक्त ट्यूबों में आरएनए एंटिसेंस या भावना जांच को पतला करने के लिए संकरित बफर का उपयोग करें। इस प्रयोग में, सभी एंटीसेन्स और अर्थ जांच ( एलएमआईजीआर 1, एलएमआईजीआर 2 और एलएमआईजीओआरको ) के लिए, 1 μ एल की जांच 99 μ में जोड़ेंप्रति स्लाइड एल संकरण बफर आम तौर पर, एंटिसेंस जांच के 1: 100 ड्रिलन्स का उपयोग इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके महत्वपूर्ण सकारात्मक संकेत और कम पृष्ठभूमि का उत्पादन करता है।
    2. क्रोमोजेनिक डिटेक्शन के लिए, व्यक्तिगत रूप से डीआईजी लेबल वाली जांचें कम करें।
    3. टीएसए का पता लगाने के लिए, डीआईजी लेबल वाले एलएमआईजीआर 1 बायोटिन लेबल वाली एलएमआईजीओआरको जांच या डीआईजी लेबल वाले एलएमआईजीआर 2 के साथ बायोटिन लेबल वाली एलएमआईजीआर 1 के साथ हाइब्रिडिजेशन बफर में जांच की गई।
    4. 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मंथन को गरम करें और उन्हें बर्फ पर कम से कम 5 मिनट में डाल दें।
  2. संकरण
    1. स्लाइड्स को निकालें और ऊतक वर्गों के लिए 100 μL पतला एंटिसेंस और भावना जांच (चरण 4.1) जोड़ें। उसके बाद, ऊतक वर्गों पर कवच के टुकड़े (24 मिमी x 50 मिमी; न्युकले-फ्री) रखें।
    2. कवर वाली स्लाइड्स क्षैतिज रूप से एक नम बॉक्स में रखें (~ 3 x x 180 x 50 मिमी 3 ; चित्रा 2 ) और एक सेते22 डिग्री सेल्सियस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस वातावरण को नम रखने के लिए बॉक्स के निचले भाग में फार्ममाइड समाधान या 1X पीबीएस जोड़ें, लेकिन तरल में स्लाइडों को डूब नहीं करते।
  3. धुलाई और अवरुद्ध।
    1. संकरण के बाद, कवरलीप को सावधानी से निकाल दें 60 डिग्री सेल्सियस पर 0.1x लवण सोडियम साइटेट (एसएससी) में 30 मिनट में स्लाइड दो बार धो लें
      नोट: वॉशिंग का अर्थ है कि स्लाइड्स को एक स्लाइड धारक में डाल दिया जाए, जिसे एक प्लास्टिक कंटेनर में रखा जाता है और धीरे-धीरे एक घुमाव (~ 50 आरपीएम; चित्रा 2 ) पर उत्तेजित होता है।
    2. 30 एस के लिए 1x Tris-Buffered Saline (TBS) में स्लाइड्स को कुल्ला।
    3. प्रत्येक स्लाइड पर 0.03% ट्राइटन एक्स -100 के साथ पूरक टीबीएस में 1% अवरुद्ध अभिकर्मक के 1 एमएल जोड़ें और 30 मिनट के लिए सेवन करें। फिर, ब्लॉकिंग समाधान को त्यागें।
  4. इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री।
    1. क्रोमोजेनिक डिटेक्शन के लिए, टीबीएस में अवरोधक अभिकर्मक का उपयोग 750 यूनिट (यू) / एमएल एंटी-डिगॉक्सिजेनिन एपी संयुग्मित एंटीबो को पतला करने के लिए करेंडीयू से 1.5 यू / एमएल एपी समाधान। प्रति कवर की 100 μL एपी समाधान (24 मिमी x 50 मिमी) स्लाइड जोड़ें।
    2. टीएसए का पता लगाने के लिए, एपी / एचआरपी समाधान के लिए एंटी-डिगॉक्सिजेनिन एपी-संयुग्मित एंटीबॉडी और एंटी-बायोटिन स्ट्रेप्टिविडिन एचआरपी-संयुग्मित एंटीबॉडी को 750 यू / एमएल पतला करने के लिए टीबीएस में ब्लॉकिंग अभिकर्मक का उपयोग करें। प्रति कवर (24 मिमी x 50 मिमी) स्लाइड के एपी / एचआरपी समाधान के 100 μL जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए एक नम बॉक्स ( चित्रा 2 ) में स्लाइड्स को सेते हैं फार्ममाइड समाधान या 1 एक्स पीबीएस का इस्तेमाल बॉक्स को नम रखने के लिए करें लेकिन गीला नहीं।

5. धुंधला हो जाना

  1. कसौटी को ध्यान से निकालें स्लाइड्स को तीन बार 5 मिनट में 1x टीबीएस को 0.05% ट्विनल -20 के साथ पूरक करें। 5 मिनट के लिए डीएपी-बफर (क्रोमोजेनिक डिटेक्शन: पीएच 9.5; टीएसए डिटेक्शन: पीएच 8.0) में स्लाइड्स को कुल्ला।
  2. धुंधला हो जाना (क्रोमोजेनिक डिटेक्शन)
    1. 100 μL एनबीटी (375 माइक्रोग्राम / एमएल) / बीसीआईपी (188 माइक्रोग्राम / एमएल) सब्सट्रेट समाधान जोड़ें (डीएपी में पतला;पीएच 9.5) प्रत्येक स्लाइड के लिए स्लाइड्स पर सावधानीपूर्वक कवरलाप (24 x 50 मिमी) रखें।
    2. 10 मिनट के लिए सब्सट्रेट समाधान के साथ एक नम बॉक्स में स्लाइड्स को सेते हैं - ओ / एन 37 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: माइक्रोस्कोप के तहत समय-समय पर स्लाइड देखकर विकास की जांच करें।
    3. जब विकास तैयार हो जाता है, तो स्लाइडों को पानी में स्थानांतरित करके प्रतिक्रिया को रोकें
  3. धुंधला हो जाना (टीएसए का पता लगाने)
    1. सिरिंज फिल्टर (0.22 माइक्रोन; चित्रा 2 ) से एचएनपीपी (100 माइक्रोग्राम / एमएल) / फास्ट लाल (250 माइक्रोग्राम / एमएल) सब्सट्रेट को स्थानांतरित करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें।
    2. एक कवरलिप (24 x 50 मिमी) के साथ कवर प्रति स्लाइड 100 μL एचएनपीपी / फास्ट लाल सब्सट्रेट जोड़ें। आरटी पर एचएनपीपी / फास्ट रेड सब्सट्रेट के साथ 30 मिनट के लिए स्लाइड्स सेते हैं।
    3. कवरलाप को ध्यानपूर्वक निकालें, और स्लाइड को तीन बार 5 मिनट के लिए 1X टीबीएस में 0.05% ट्विनल -20 के साथ पूरक करें।
    4. टीएसए सब्सट्रेट / कवर के 100 μL का उपयोग करें (24 x 50 मिमी 2 ) स्लाइड टीएसए सब्सट्रेट के साथ स्लाइड आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. कवरलाप को सावधानी से निकालें, और स्लाइड्स को तीन बार 5 मिनट में 1x टीबीएस को 0.05% ट्विनल -20 के साथ पूरक करें।
  4. पीबीएस / ग्लिसरॉल (1: 3) में स्लाइड्स को एम्बेड करें
    नोट: इन प्रक्रियाओं को पूरा करने के बाद, स्लाइड को जितनी जल्दी हो सके देखा जाना चाहिए क्योंकि फ्लोरोसेंट सिग्नल जल्दी से बुझ जाएगी

6. अवलोकन

  1. क्रोमोजेनिक पहचान
    1. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ऊतक अनुभाग देखें क्रोमोजेनिक डिटेक्शन के परिणामों का निरीक्षण करने के लिए 10 एक्स, 20 एक्स, और 40 एक्स उद्देश्य लेंस चुनें।
    2. डीपी-बीएसडब्लू सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ताकि परिणाम का विश्लेषण किया जा सके और छवियों को कैप्चर किया जा सके।
  2. टीएसए का पता लगाने
    1. एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर ऊतक वर्गों का निरीक्षण करें डीआईजी लेबल वाले जीन को 543 एनएम प्रकाश के तहत देखा जाना चाहिए, लाल रंग पेश करना चाहिए, और बायोटिन-लेबल वाले जीन होना चाहिए488 एनएम प्रकाश के तहत मनाया, एक हरे रंग का रंग पेश। जब वे उभरकर आते हैं, तो वे पीले रंग का रंग देते हैं।
    2. क्रमशः टीएसए का पता लगाने के परिणामों का निरीक्षण करने के लिए 20 एक्स और 40 एक्स उद्देश्य लेंस चुनें।
    3. परिणामों का विश्लेषण करने और छवियों को कैप्चर करने के लिए FV1000 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

क्रोमोजेनिक डिटेक्शन के साथ, प्रत्येक वयस्क एंटेनाल अनुभाग में एंटेनाल कोशिकाओं का एक छोटा सा समूह डीआईजी लेबल वाली एलएमआईजीआर 1 और एलएमआईजीआर 2 एंटिसेंस जांच ( चित्रा 3 ) द्वारा चिह्नित किया गया था। Lmigor1 और Lmigor2 को स्थानांतरित करने के लिए लगातार खंडों पर आरएनए आईएसएच से पता चला है कि दो जीनों को व्यक्त करने वाले एंटेनल कोशिकाएं एलएमआईजीओआरको व्यक्त करने वाले ओआरएन समूहों में स्थित थीं , जो दर्शाती है कि पात्र एलएमआईजीआर 1 और एलएमआईजीआर 2 वास्तव में ओआरएन ( चित्रा 4 ए -4 डी ) में व्यक्त की गई थी। कभी-कभी, वृक्ष के समान-जैसे संरचनाओं का लेबल देखा गया था ( चित्रा 4e- 4f )। Lmigor1 और Lmigor2 दोनों मूलभूत संवेदी ( चित्रा 5 ए -5 बी ) में न्यूरॉन्स के लिए स्थानीयकृत थे, लेकिन वे व्यक्तिगत संवेदी में सह-व्यक्त नहीं थे, यह दर्शाते हैं कि वे अलग-अलग बेसिक में मौजूद थे Nic sensillium subtypes ( चित्रा 5 सी -5 डी )।

टीएसए का पता लगाने में, स्वस्थानी संकरण में दोहरे रंग के फ्लोरोसेंट से पता चलता है कि एलएमआईजीआर 1-एस्प्रेसिंग कोशिकाएं (लाल रंग) एलएमआईघोरको (हरे रंग का रंग) व्यक्त करने वाले ओआरएन क्लस्टरों में स्थित थीं, यह दर्शाती है कि पात्र एलएमआईजीआर 1 को ओआरएन ( चित्रा 6 ए ) में व्यक्त किया गया था। चित्रा 6 ए में बॉक्सिंग वाले क्षेत्रों का करीब से दृश्य चित्र 6b में दिखाया गया है। एलएमआईजीआर 1 - न्यूरॉन्स (हरे रंग का रंग, चित्रा 7 ए ) और एलएमआईजीआर 2 - एक्सप्रेसिंग न्यूरॉन (लाल रंग, चित्रा 7 बी ) को अलग-अलग मूलभूत संवेदी क्षुधा ( चित्रा 7 सी ) में स्थित था।

4 / 55924fig1.jpg "/>
चित्रा 1: स्थिति संकरण में आरएनए के लिए कीट एंटेनाल अनुभाग की तैयारी। ( ) फ्रीजिंग माइक्रोोटॉम; ( बीसी ) नमूनों को ओसीटी कम्पाउंड में जमा कर दिया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्र 2: आरएनए स्वस्थानी संकरण में लिए प्रायोगिक आइटम। ( ) स्लाइड धारक और प्लास्टिक कंटेनर ( बी ) आर्मी बॉक्स ( सी ) झूली कुरसी ( डी ) झिल्ली फिल्टर ( ) कन्फोकल माइक्रोस्कोप .jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: ओल्टरफार्म अंगों में एलएमआईजीआर 1 और एलएमआईजीआर 2 का सेलुलर स्थानीयकरण। ( ) एक टिड्डी ऐन्टेनल सेगमेंट में एलएमआईजीआर 1-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं का अवलोकन ( बी ) एक टिड्डी ऐन्टेनल सेगमेंट में एलएमआईजीआर 2-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं का अवलोकन Arrowheads Lmigor1 ( ) और Lmigor2 ( बी ) व्यक्त कोशिकाओं से संकेत मिलता है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन (ए और बी) आंकड़े एक्स एट अल से अनुकूलित किए गए थे 12 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

"> चित्रा 4
चित्रा 4: Chromogenic Detection द्वारा एलमिगोरस व्यक्त करने वाले एंटेनल सेल की न्यूरोनल पहचान ( एबी ) एलमिगोर 1 ( ) और एलमिगोरको ( बी ) के एंटीना के लगातार वर्गों पर एंटिसेंस जांच के लेबलिंग पैटर्न। ( सीडी ) एलमिगोरको ( सी ) और एलएमआईजीआर 2 ( डी ) की लेबलिंग पैटर्न टिड्डी ऐन्टेना के लगातार खंडों पर एंटीसेन्स जांच। ( एफईएफ ) कभी-कभी लेबल वाले वृक्षारोपण संबंधी संरचनाओं का चित्रण (लाल तीर द्वारा इंगित) स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन (विज्ञापन); 20 सुक्ष्ममापी (ई और च) आंकड़े एक्स एट अल से अनुकूलित किए गए थे 12 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

NT "fo: keep-together.within-page =" 1 "> चित्रा 5
चित्रा 5: एलएमआईजीआर 1 और एलएमआईजीआर 2 मूलभूत संवेदी में स्थित ORN में व्यक्त किया गया है। ( एबी ) बेसिकोनिक सेंसेलम या एलएमआईजीआर 1 ( ) और एलएमआईजीआर 2 ( बी ) को व्यक्त करने वाले ओआरएन । ( सीडी ) एंटीनल ORN के अलग-अलग उपट्स में एलएमआईजीआर 1 और एलएमआईजीआर 2 की अभिव्यक्ति को लगातार खंड (सीडी) पर सत्यापित किया गया था। एरोहेड्स एलएमआईजीआर 1 (ए, सी) और एलएमआईजीआर 2 (बी, डी) को व्यक्त करने वाले एंटेनल कोशिकाओं को दर्शाते हैं। बा: मूलभूत संवेदी स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन (ए और बी); 50 माइक्रोन (सी और डी) आंकड़े एक्स एट अल से अनुकूलित किए गए थे 12 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 6: टीएसए जांच द्वारा एलएमआईजीआर 1 को व्यक्त करने वाले एंटेनल सेल की न्यूरोनल पहचान। ( ) सीटू संकरण में दो रंग अनुदैर्ध्य antennal अनुभाग पर LmigOR1 (लाल) और Lmigorco (ग्रीन) की अभिव्यक्ति को स्पष्ट करने के लिए किया गया था। LmigOR1 LmigORco व्यक्त कोशिका समूहों में कोशिकाओं -expressing का स्थानीयकरण अपने तंत्रिका पहचान की पुष्टि की। ( बी ) बॉक्सिंग क्षेत्रों को एक में देखें कभी-कभी डायनेड्रिटिक जैसे संरचनाओं का लेबल तीर द्वारा दर्शाया गया था। मंडल वाले क्षेत्रों में ओआरएन क्लस्टर जो एलमिगोरको को व्यक्त करते हैं और समान संवेदना साझा करते हैं। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन (ए); 20 माइक्रोन (बी) आंकड़े एक्स एट अल से अनुकूलित किए गए थे 12 कृपया देखेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ चाटना

चित्रा 7
चित्रा 7: एलएमआईजीआर 1 और एलएमआईजीआर 2 टीएसए डिटेक्शन द्वारा विभिन्न बेसिकोनिक सेन्सिला ORN में स्थित थे। फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने सिस्टम का उपयोग कर कल्पना कर रहे थे, यह दर्शाता है LmigOR1 हरी प्रतिदीप्ति (क) और LmigOR2 सकारात्मक कोशिकाओं द्वारा न्यूरॉन्स -labeled लाल प्रतिदीप्ति (ख) द्वारा अलग basiconic sensilla उपप्रकार (ग) में व्यक्त किया गया। एरोहेड्स एलएमआईजीआर 1 और एलएमआईजीआर 2 को व्यक्त करने वाले एंटेनल कोशिकाओं को दर्शाते हैं । स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन आंकड़े एक्स एट अल से अनुकूलित किए गए थे 12 कृपया एक को देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का बड़ा संस्करण

नाम दृश्यों
Lmig OR1- जांच-एस 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3 '
Lmig OR1- जांच के रूप में 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3 '
Lmig OR2- जांच-एस 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3 '
Lmig OR2- जांच के रूप में 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3 '
Lmig Orco- जांच एस 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3 '
Lmig Orco- जांच के रूप में 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3 '

तालिका 1: पीसीआर प्राइमर्स के दृश्य

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Discussion

कीट एंटीना में जीन या स्थानीयकरण करने के लिए आरएनए आईएसएच को करना मुश्किल है क्योंकि ओआरए को छोड़कर या जीन के अभिव्यक्ति के स्तर बहुत कम होते हैं और कीट एंटीना के हिस्टोलॉजिकल स्लाइस को संरक्षित करना बहुत मुश्किल है। इसके अलावा, टीएसए का पता लगाने भी बहुत मुश्किल है। इन समस्याओं का समाधान करने के लिए, निम्नलिखित उपाय किए जाने चाहिए। ऐन्टेना को नए molting वयस्क टिड्डियों से चुना जाता है जो पतली और नरम ऐन्टेनल कटिकल्स होते हैं, जो स्लाइड पर उनके आकारिकी को बनाए रखते हैं। जमे हुए नमूनों को 12 माइक्रोन-मोटे स्लाइस में विभाजित किया जाता है। अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट बायोटिन- और डीआईजी लेबल वाले जांच का उपयोग किया जाता है। डिटर्जेंट, जैसे कि टवीन -20 और ट्राइटन एक्स -100, कई चरणों में पृष्ठभूमि को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है। टीएसए का पता लगाने में, एक अन्य व्यक्तित जीन के सापेक्ष एक अत्यधिक व्यक्त जीन को बायोटिन -16-यूटीपी के साथ लेबल किया जाना चाहिए। स्लाइडों को जल्द से जल्द देखे जाने चाहिए क्योंकि फ्लोरोसेंट संकेतों को जल्दी से बुझाना होगा

डीआईजी- एएन डी बायोटिन लेबल वाले जांच में लंबे शेल्फ जीवन के लाभ, शोर अनुपात को उच्च संकेत और रेडियोधर्मी जांच 18 , 1 9 से बेहतर सेलुलर संकल्प हैं। इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल में स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट पर कुछ फायदे हैं। यह प्रोटोकॉल सेलुलर स्तर पर जीन के स्थानीयकरण को आसानी से पहचानता है, लेकिन आसानी से जीन वितरण पैटर्न की जांच करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है, जो स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट के साथ आसानी से किया जाता है।

एक या जीन की पहचान करने के लिए, दो तरीकों को लिया गया। एक लगातार खंडों में क्रोमोजेनिक डिटेक्शन था, और दूसरा एक खंड में फ्लोरोसेंट डिटेक्शन था। ORCO को किसी विशिष्ट या एक ORN 10 , 20 , 21 के साथ सह-व्यक्त किया गया है। Lmigor1 या Lmigor2 व्यक्त कोशिकाओं दोनों स्थित थेएलमिगोरको-एस्प्रेसिंग कोशिकाओं के समूहों के लिए जो अनिश्चित रूप से उन्हें ओआरएस ( चित्रा 4 और चित्रा 6 ) के रूप में सत्यापित करते हैं। उसी दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए हमने पाया है कि एलमिगोर 1 और एलएमआईजीआर 2 एक संवेदी में सह-व्यक्त नहीं हैं। इन दो दृष्टिकोणों के परिणाम संवेदी हैं।

टिड्डु ऐन्टेना 10 , 14 में एलमिगोरको, सग्ररोको, एसग्रिएर 8 ए और एसग्रिएर 25 ए को स्थानांतरित करने के लिए इस प्रोटोकॉल का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था। हाल ही में एलएमआईजीओआर 3 को एल। माइग्रेटोरिया में ट्राइकोएड संवेदी न्यूरॉन्स में स्थानांतरित किया गया था, जो उसी प्रोटोकॉल 15 का उपयोग कर रहा था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग दो संवेदी तंत्रिका झिल्ली प्रोटीन को स्थानांतरित करने के लिए किया गया था एस ग्रेगरी 16 की एंटीना में SgreSNMP1 और SgreSNMP2 इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में टिड्डु एंटीना में कैमोसेंसरी से संबंधित जीनों को विश्वसनीय रूप से स्थानांतरित किया जाता है, जो न केवल इन्हें सत्यापित करता हैउम्मीदवार जीन, लेकिन इन जीनों को विभिन्न प्रकार की संवेदी में रखी विशिष्ट कोशिकाओं के लिए स्थानीयकृत किया गया

अंत में, आरएनए आईएसएच का यह बेहद प्रभावी प्रोटोकॉल विशेष रूप से स्थानीयकरण या जीन, साथ ही कीट एंटीना में कम स्तर पर व्यक्त अन्य जीनों के लिए वर्णित है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने या ब्याज के किसी अन्य संघर्ष के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

यह काम चीन के नेशनल नॅचुरल साइंस फाउंडेशन (नं। 1372037) से अनुदान द्वारा समर्थित है। इस लेख में व्यापारिक नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य से है और सिफारिश नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
2×TSINGKETM Master Mix TSINGKE, China TSE004
RNase-free H2O TIANGEN, China RT121-02
REGULAR AGAROSE G-10 BIOWEST, SPAIN 91622
Binding buffer TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
Balance buffer TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
Wash solution TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
T Vector Promega, USA A362A
T4 DNA Ligase Promega, USA M180A
Escherichia coli DH5α TIANGEN, China CB101
Ampicillin Sigma, USA A-6140
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Inalco, USA 1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside SBS Genetech, China GX1-500
Nco I BioLabs, New England R0193S
Spe I BioLabs, New England R0133M
DIG RNA Labeling Kit Roche, Switzerland 11175025910
Biotin RNA Labeling Kit Roche, Switzerland 11685597910
DNase DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland 11175025910
LiCl Sinopharm, China 10012718
Ethanol Sinopharm, China 10009257
Acetic acid BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China 10000292
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands 4583
Slides TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China FISH0010
HCl Sinopharm, China 80070591
Millex Millipore, USA SLGP033RS
Tween 20 AMRESCO, USA 0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt Roche, Switzerland 11175041910
Glycerol Sinopharm, China 10010618
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
1×Tris-acetate-EDTA Sigma, USA V900483-1KG 0.04 mol/L Tris-Base
1×Tris-acetate-EDTA BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China 10000292 0.12% acetic acid
1×Tris-acetate-EDTA Sigma, USA 03677 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)
Luria-Bertani (LB) liquid medium Sinopharm, China 10019392 10 g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) liquid medium MERCK, Germany VM335231 10 g/L Peptone from casein (Tryptone)
Luria-Bertani (LB) liquid medium MERCK, Germany VM361526 5 g/L Yeast extract
LB solid substrate plate Sinopharm, China 10019392 10 g/L NaCl
LB solid substrate plate MERCK, Germany VM335231 10 g/L Peptone from casein (Tryptone)
LB solid substrate plate MERCK, Germany VM361526 5 g/L Yeast extract
LB solid substrate plate WISENT ING, Canada 800-010-CG 15 g/L Agar Bacteriological Grade
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sinopharm, China 10019392 8.5% NaCl
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sigma, USA V900041-500G 14 mM KH2PO4
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sigma, USA V900268-500G 80 mM Na2HPO4
10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) Sigma, USA V900483-1KG 1 M Tris-Base
10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) Sinopharm, China 10019392 1.5 M NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sigma, USA V900483-1KG 100 mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sinopharm, China 10019392 100 mM NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sigma, USA V900020-500G 50 mM MgCl2·6H2O
20×saline-sodium citrate (pH 7.0) Sinopharm, China 10019392 3 M NaCl
20×saline-sodium citrate (pH 7.0) Sigma, USA V900095-500G 0.3 M Na-Citrate
4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) Sigma, USA V900894-100G 4% paraformaldehyde
Sodium Carbonate Buffer Sigma, USA V900182-500G 0.1 M NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) Sigma, USA V900182-500G 80 mM NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) Sigma, USA S7795-500G 120 mM Na2CO3
Formamide Solution (pH 10.2) MPBIO, USA FORMD002 50% Deionized Formamide
Formamide Solution (pH 10.2) 5×saline-sodium citrate
Blocking Buffer in TBS Roche, Switzerland 11175041910 1% Blot
Blocking Buffer in TBS AMRESCO, USA 0694-500ML 0.03% Triton X-100
Blocking Buffer in TBS 1×Tris buffered saline
Alkaline phosphatase solution Roche, Switzerland 11175041910 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase solution Blocking Buffer in TBS
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution Roche, Switzerland 11175041910 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution Blocking Buffer in TBS
Hybridization Buffer MPBIO, USA FORMD002 50% Deionized Formamide
Hybridization Buffer 2×saline-sodium citrate
Hybridization Buffer Sigma, USA D8906-50G 10% dextran sulphate
Hybridization Buffer invitrogen, USA AM7119 20 µg/mL yeast t-RNA
Hybridization Buffer Sigma, USA D3159-10G 0.2 mg/mL herring sperm DNA
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Roche, Switzerland 11758888001 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Roche, Switzerland 11758888001 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Detection Buffer
Tyramide signal amplification substrate TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT 2% fluorescein-tyramides
Tyramide signal amplification substrate TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT Amplification Diluent
Name Company Catalog Number Comments
Instrument
Freezing microtome Leica, Nussloch, Germany Jung CM300 cryostat
Spectrophotometer Thermo SCIENTIFIC, USA NANODROP 2000
Optical microscope Olympus, Tokyo, Japan Olympus IX71microscope
Confocal microscope Olympus, Tokyo, Japan Olympus BX45 confocal microscope

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References

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