タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

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Summary

レーザー microirradiation は、細胞の DNA 修復の研究のための便利なツールです。様々 な DNA 損傷を誘発する UVA レーザーの使用のための方法論的アプローチが表示されます。正常な細胞周期; を維持するローカルの microirradiation のメソッドを最適化します。したがって、照射された細胞は有糸分裂を続行します。

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Legartová, S., Suchánková, J., Krejčí, J., Kovaříková, A., Bártová, E. Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions. J. Vis. Exp. (129), e55999, doi:10.3791/55999 (2017).

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Abstract

レーザーでローカル microirradiation は、生きた細胞の DNA 修復関連プロセスの研究のための有用なツールを表します。ここでは、ローカル microirradiated クロマチンの時間または蛋白質蛋白質の相互作用の上で DNA 蛋白質の動力学を分析する方法論的アプローチについて述べる。また Fucci セルラ システムを使用して DNA の病変の細胞周期依存性蛋白質の動力学を研究する細胞周期の個々 の段階を認識する方法を示します。2 つの UV レーザーの使用の方法論的説明 (355 nm、405 nm) また提示異なるタイプの DNA 損傷を誘発します。405 nm 半導体レーザによる細胞 microirradiated のみ通常の有糸分裂を通って進んで行くとシクロブタン ピリミジン二量体 (チミン) を欠いています。また興味の内因性の蛋白質のバイオアセッテイを実行する指定された時点での microirradiated セルの修正方法を示します。DNA 修復研究には自発的に発生すると細胞内 FRAP (退色後蛍光回復)、FLIM (蛍光寿命イメージング顕微鏡) を含む生物物理方法の使用を記述するさらに DNA 損傷病巣。タンパク質間相互作用の実験的研究の FLIM フレット (蛍光共鳴エネルギー移動) のアプリケーションを表示します。

Introduction

シクロブタン ピリミジン ダイマー (チミン)、8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine と一本鎖の DNA 病変の出現につながる DNA 損傷または二重鎖切断1,2。Γ 線は高浸透の最高のエネルギーと放射線のフォーム、放射のこの源は放射線療法3に広く利用します。その一方で、紫外線を UV レーザー mimics 自然暴露によって引き起こされる DNA 損傷が実験。UVA microirradiation 顕微鏡法、個々 の細胞における DNA 損傷を研究するため実験的なツールを表します。Microirradiation は、染色体の地域45の組織を明らかにするために 40 年前の最初の時間に使われました。この手法は、共焦点顕微鏡の機能プロパティのどちらかまたは現代 nanoscopy の技術的な限界に大きく依存。DNA 損傷を誘発するには、細胞を 5' ブロモデオキシウリジン (BrdU) またはヘキスト 33342 UV 照射前にプレハブプレートベーすることができます。Bártová6前述 presensitization ステップ、最近我々 は細胞死やアポトーシスを避けるためにこの microirradiation 技術を最適化します。たとえば、(ヘキスト 33342 前) なし 405 nm の紫外線レーザーの使用は、シクロブタン ピリミジン二量体 (チミン) を犠牲にして 53BP1 正二重鎖切断 (Dsb) の誘導につながります。UV microirradiation と組み合わせる presensitization の手順、他の一方で、同時にチミンと Dsb の非常に高いレベルを誘発する7,8。この方法は、単一の DNA 修復経路の研究に適用することは困難です。

Microirradiation、蛋白質の募集、速度、および細胞内 DNA 損傷における相互作用を分析することが可能です。このメソッドの例が Luijsterburgによって出版されました。ヘテロクロマチン蛋白質 1 β と私たちの9は最近紫外線による DNA 病変6,10多能性因子 Oct4 と coilin、カハール体に関連付けられている蛋白質を募集初めて示した。これらの DNA 損傷で蛋白質の動力学 FRAP (退色後蛍光回復)11,12,13を使用して学ぶことがまたは (蛍光共鳴エネルギー移動) 技術14 フレット ,15。これらのメソッドには、DNA 損傷または蛋白質蛋白質の相互作用の蛋白質の単純な拡散を明らかにする可能性があります。蛋白質のさらに特性評価のための便利なツールは、FLIM (蛍光寿命イメージング顕微鏡) やフレット技術 (フレット FLIM)16との組み合わせです。これらのメソッドは、一過性でタグ付けされた蛍光分子17興味の蛋白質を表現する安定細胞のプロセスの研究を有効にします。ここでは、GFP 付けられた p53 タンパク質と DNA 損傷応答18,19に重要な役割を果たして相互作用パートナー、mCherry タグ 53BP1 の指数関数的減衰時間 (τ) の例を示します。パラメーター τ FLIM 計算によって提供される螢光色素の寿命は、与えられた蛍光染料、そのバインド能力とその細胞環境の特定です。したがって、このメソッド私たちを見ること蛋白質の集団、その結合能力と機能特性の違い、たとえば、DNA 損傷の後。

ここでは、時間特定の蛋白質の募集、動態、拡散、および microirradiated クロマチンのサイトでタンパク質間相互作用を検討する私たちの研究室で使用されている高度の顕微鏡検査の技術の方法論的アプローチの概要表示されます。ローカル DNA 傷害、細胞の誘導とローカル誘発 DNA 損傷紫外線レーザーによって引き起こされる DNA 損傷関連イベントの研究方法論の説明のステップバイ ステップの方法論を提供しています。

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Protocol

1 細胞培養

  1. HeLa 由来細胞株
    注: 使用 HeLa 癌細胞: ヒストン H2B を安定に発現するいずれかの HeLa 細胞が GFP または Fucci HeLa 細胞 RFP Cdt1 を表現するタグ。G1、S の初期の段階と S/G2 M 段階 ( 図 1) で GFP geminin。
    1. すべての hela 細胞由来細胞の培養、使用ダルベッコ ' s 変更イーグル ' s 培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清と 37 ° c 5% CO 2 を含む加湿雰囲気で適切な抗生物質を添加しました。中 2 - 1 週あたりの 3 回を置き換えます
    2. は培養培地を削除し、血清トリプシン阻害剤が含まれているのすべての痕跡を除去するために 1x PBS を使用してセルをすすいでください。室温でバイオハザードのフードでこの手順を実行します
    3. 細胞層をカバーする prewarmed のトリプシン EDTA 溶液の 1 mL を追加し、細胞層分散 (通常 3-5 分) まで 37 ° c. の Trypsinize セルでセルを保持します
    4. トリプシン-EDTA を不活化する prewarmed の完全な成長培地 3 mL を追加し、軽く数回をピペッティングによる媒体を分散します
      。 注: この手順を実行するバイオハザード フードでの汚染物質からオペレーターを保護するために、最適な細胞培養条件を維持するために.
    5. セルの自動カウンターまたは Bürker チャンバーを使用してセルを数える。新しい皿に 1 × 10 5 セル/mL ピペット 5 mL に細胞懸濁液を希釈します。37 ° C と 5% の CO 2 のセルをインキュベートします
  2. マウス胚性幹細胞 (mESCs)、D3 セル行の栽培
    1. セルの文化 mESCs 文化料理ゼラチンと mESC 保守メディアは 0.2% 塗布します。37 ° C と 5% の CO 2 のセルをインキュベートします
      。 注: mESCs 栽培/メンテナンス中 50 ml を準備し、2-8 ° C で 2 週間保管することを推奨します。MESC 中 75 mL ES 細胞 FBS 5 mL ペニシリン G とストレプトマイシン、5 mL を含む非本質的なアミノ酸 (10 mM) (最終濃度 0.1 mM)、50 μ L マウス白血病阻害因子 (mLIF; 100 μ g/mL) (最終濃度 10 ng/mL)、430 μ MTG (1-チオグリセ;DMEM で 1: 100 希釈) (最終濃度 100 μ M) と高グルコース DMEM 培地 500 mL.
    2. 培養皿から mESC 培地を吸引、1 × PBS で 1 回細胞をすすいでください
    3. は、0.5 mL のトリプシン-EDTA を追加し、セルがお皿からデタッチし始める直前まで、37 ° C で孵化させなさい。その後、2 mL mESC で 15% 牛胎児血清を添加した培地で細胞を洗浄することにより、トリプシンを不活化します
    4. は培養皿から残りのセルを除去するピペットを使用します
      。 注: それは単細胞、細胞の分化を促進するため単一のセルを取得することが重要です
    5. 分割細胞 1:10 mESC メンテナンス中糊皿にします
      。 注: mESC 細胞の密度が低すぎる場合、彼らはよく成長しない;密度が高すぎる、分化が昇格されます
    6. 4 つの新しい料理の 1 つのシャーレから細胞の分割によって mESC 通路 1 日おきを実行して mESCs が未分化の状態で維持されていることを確認します。倒立顕微鏡 100 倍や 200 倍の倍率の下で mESC コロニーを検査し、細胞の分化の自発的な mES の証拠がある、Oct4 タンパク質枯渇を評価するために西部のしみを実行します
      。 注: 最適な細胞継、mESCs の in vitro 分化削減できます

2。細胞のトランスフェクション

  1. シード セル グリッド顕微鏡料理実験前に 48 h (直径 35 mm) ペトリ皿上の座標によると microirradiated 細胞を見つけるためにします
    。 注: これは、実験の最初のステップは、どの microirradiation 例、免疫染色が 2 番目 ( 図 2 a)。
    1. シード、HeLa 由来細胞株 (または mL D3 mES セル/1 × 10 4 セル) に 5 × 10 4 セル/mL の濃度を使用します。最大皿あたり 2 mL の完全培地に使用します。栽培と microirradiation の間に 37 ° C、5% CO 2 でサーモスタットや栽培室で細胞を維持します
    2. セルの自動カウンターを使用してセルを数える
      。 注: セルの高濃度を使用しないでください。D3 mESCs の密集コロニーは、特に細胞密度の高い染色後のローカル microirradiated 細胞の同定を防ぎます
  2. 次のように選択のプラスミド DNA、トランスフェクション試薬を準備します。選択したプラスミド DNA の 2-3 μ g を使用した 溶液 を準備 (詳細については 表の材料 を参照) および 150 μ L 1 × PBS。ソリューション B 150 μ L 1 × PBS で 3.5 μ L のトランスフェクション試薬を使用して準備します。各ソリューションは慎重なピペッティングでよく混合ことを確認します
    。 注: DNA、トランスフェクション試薬の比率が最適決定されなければならず経験的各セルラインおよび個々 のプラスミドです
  3. で 24 h 一時的に transfected 生活の実験的観察する前にセルを結合溶液とボルテックスせずソリューション B。15 〜 20 分間室温で混合溶液を孵化させなさい。滴状の方法で均一分散この顕微鏡皿に成長している細胞層にトランスフェクション混合物 (に記載されているポイント 2.2 として 300 μ L) を完了します
  4. 。 37 ° C で 4-6 時間、5% CO 2
  5. 加温セルは、新鮮な媒体にトランスフェクション混合物を置き換えます。標準的な条件下で細胞を養う
    。 注: 405 nm レーザーを使用している場合どの試薬で細胞を presensitize ないが、355 nm のレーザーを使用する場合実行 10 μ m 5-ブロモ-2 セルの前 ' - デオキシ - ウリジン (BrdU) 7 , 8.Presensitization の時間は細胞の種類や細胞周期の長さに依存します。HeLa 細胞は、ローカル microirradiation する前に 16 に 20 h BrdU を追加します。MESCs の場合追加 BrdU microirradiation 前に 6 に 8 h.

3。ローカルの DNA 損傷と共焦点顕微鏡の誘導

セルの座標は、さらに分析に必要となる;
  1. 顕微鏡ステージに皿を置き、皿を選択したセルの位置を記録 ( 図 2 a の ç).
  2. は、数字または文字 ( 図 2 a d f セルの位置は Ae や Af のパネルで拡大広告表示の矢印) の付いた正方形の transfected セルを検索します。明視野顕微鏡を用いたセルのイメージを取得し、セルとラベルの付いた正方形 ( 図 2 a) の位置を識別するために蛍光画像を取得します
  3. 照射前に画像を取得する (または conf に接続されている別の使用可能なレーザー共焦点顕微鏡に接続されている白色光レーザー (WLL) (1 nm 刻みで 470 670 nm) を使用して、自治顕微鏡).
  4. は、次の設定を使用: 512 × 512 ピクセルの解像度、ピクセル サイズ 64 nm、400 Hz (2 方向に走査) 双方向モード、8 に平均設定を行、x. 12 ズーム 8 x
    注: 線平均を表す指定されたスキャン数同じ行を次の行に進む前に複数回スキャンします。すべての行のスキャンを生成イメージの最後のフレームを繰り返す
  5. 画像観察と買収は、1.4 の開口で 63 × 石油目的を使用して、順番に蛍光画像を取得します。適切なソフトウェアの逐次スキャン モードを使用して 2 つの蛍光色素間のクロストークを排除します
    。 注: すべての顕微鏡のソフトウェアいわゆるシーケンシャル スキャン モードの設定が可能。 にします。オペレーターは、螢を取得するかどうかを選択できます ' 情報同時に (例えば 赤、緑、青の蛍光性の) または、前述のここでは、個別に (順に)、螢光色素による螢光色素。395/509、GFP の最大励起/蛍光は、一般的な情報を考慮 nm と mCherry の最大励起/蛍光は 587/610 nm ( 図 2 b でここで使用される螢光色素を参照)。この情報に基づいて、最適な励起と必要な蛍光色素の発光フィルターを選択します。選択フィルターと手順をスキャンは、各共焦点顕微鏡の最適化が必要です
  6. DNA 斑、スキャン モード、使用 64 行の誘導のためのスイッチを切る、WLL (で ' 獲得 ' モード)、UV の外部ソースに切り替えます (に " UV レーザー " ボタン)、利益 (率 ROI) の領域を設定 (で ' 獲得 ' モード)、355 nm を設定し、100% 電源レーザーか, また、405 nm レーザー ソースを使用します
    。 注: 一般にレーザー パワー イメージ ・ アクイジション ・ モードの適切なレーザー調整ボタンによる調整です
  7. ローカル microirradiation の近くの uva を発するレーザーを使用します。核における ROI の microirradiation およびキャプチャ イメージの場合は、投資収益率; 外レーザー強度を調節するイメージ ・ アクイジション ・ モードでゼロに背景を設定します。セルは正しく照射、GFP ヒストン H2B の信号が消えるし、たとえば、mCherry タグ PCNA タンパク質は DNA 損傷に募集する照射直後場合 ( 図 2 bビデオ 1).
    注: 共焦点セクションはまた (を参照してください 3 D 回転、x と y、x z、y z 投影 図 2 ビデオ 2) 三次元 (3 D) の投影に表示される 1 つの投資収益率で DNA 損傷が誘導されます。355 nm、405 nm レーザーの完全な技術的なパラメーターの説明については、Stixová を参照してください。 7
  8. 後の ROI が照射されて、外部の紫外光源をオフ、ROI をオフ、WLL のスイッチ、8、スキャンの行を変更、照射のための別のセルを見つけます。投資収益率の選択、ソフトウェアの該当するボタンを使用して、' s 画像集録モード
    。 注: mCherry PCNA は、2 と 20 分 ( 図 2 b) 間の DNA 損傷で最大蓄積のピークを持っています。外因性タンパク質のレベルで結果を確認するには、ローカル microirradiation の直後に染色蛍光を続行します。関心に応じて照射の時間間隔を選択します
  9. Microirradiated セルの大半で外因性タンパク質の蓄積を検出できることを確認します。この検証のためには、次の手順で条件を使用します。
    1. チェック一時的に transfected セルの外因性蛋白質の過剰発現はありません。可能な解決策として蛍光蛋白質 (例えば、mCherry PCNA または mCherry 53BP1) の式が弱いセルを選択します
    2. は、画像の取得に使用される WLL 露出の光毒性を評価します
      。 注: 光毒性テストは、長期にわたるレーザー microirradiation を transfected セルを公開し、 図 3 a に示すように細胞が有糸分裂に進むことを確認 -B。スキャンの時間と共焦点スライスのセル数を削減可能な解決策として、最適な軸ステップ (0.3 μ m を推奨) の選択による 3 D スキャンを最適化およびレーザーの設定 ' の最低の力。また、培地の溶解トロロックス (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic 酸、ビタミン E の水溶性アナログ) を使用して、光毒性を排除できます。DNA 損傷関連実験のためそれトロロックスの紫外線に対する保護効果のために使用する勧めしません
    3. 355 nm レーザーを照射、BrdU 取り込みから適切な BrdU 検出抗体を用いた BrdU の十分な定款を検証キット (材料の表 を参照してください)。BrdU は、細胞周期の S 期に DNA に組み込まれ、以来細胞の大半が S 段階によって前に進まなければなりません。携帯型である細胞周期の長さを考慮可能な解決策として特定します
    4. 分析、DNA 修復興味の蛋白質かどうかフェーズ特定の細胞周期に DNA 損傷を認識する能力を持っています。可能な解決策:選択したタンパク質が DNA 損傷に募集が細胞周期の特定の段階 (G1、S、G2) に制限されていることを確認、Fucci HeLa 細胞を使用します。これらの細胞表現 G1 と S の初期の段階で RFP Cdt1 と S/G2 M 細胞周期段階 22 ( 図 1) GFP タグ geminin
    5. 。 アポトーシス、細胞死を避けるために
    6. は適切な光源を選択し、レーザーのパワー設定 23。有糸分裂細胞を照射した覚えておいてください ( 図 3 a -B、ビデオ 3).
      注: アネキシン V 陽性、カスパーゼ 3、またはヒトラミン B 胸の谷間で不要なアポトーシスを検出できます。形態学的レベルでの剥離細胞し、アポトーシス小体の形成が表示されます

4。蛍光抗体染色

  1. 1 × PBS (顕微鏡の料理成長) 細胞層を簡単にリンス、洗浄した後、室温で 4% のホルムアルデヒド (HeLa 由来細胞株) の 10 分や 20 分 (D3 ES 細胞) を使用してセルを修正します。1 × PBS と皿をすすぎします
    注意:ホルムアルデヒド眼に対する重篤な損傷を引き起こす、アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります、また潜在的な発がん性物質;抽出器フードではホルムアルデヒドの実験手順ですべてを実行したがって、.
    注: 蛍光信号の不要な漂白を避けるため、保存料理暗い区域の免疫蛍光染色に必要な潜伏時
  2. 0.1% トリトン X-100 は H 2 O、8 分間に溶解とセルを permeabilize し、1 × PBS 0.1% 0.1% サポニンを含むと 12 分のセルを孵化トリトン X-100。インキュベーション後、2 回の 15 分の 1 × PBS のセルを洗浄
  3. 1 × 選択した抗体の非特異的結合をブロックする 60 分の PBS で 1 %bsa を用いた加温細胞。孵化後 15 分の 1 × PBS のセルを洗うです
  4. 。 1: 100 (または 1: 200) の比率で
  5. Dilute 一次抗体 (この手順必要があります o個々 の抗体のマイクロプロジェクター) 1 × PBS で 1 %bsa、一皿、このソリューションの 25 μ L を使用して、観察と細胞をカバーします。細胞を 4 で一晩加湿チャンバーの一次抗体を含む溶液とインキュベート ° C
  6. 1 × 5 分の 2 回の PBS のセルを洗って次の日に
  7. の 1: 100 または 1: 200) 1 × PBS で 1 %bsa の一皿、この溶液 100 μ L を使用して比率で二次抗体を希釈し、観察と細胞をカバーします。60 分二次抗体溶液をセルを孵化させなさい。インキュベーション後、3 回の 5 分の 1 × PBS のセルを洗浄
  8. は実装中のドロップで coverslip をマウントし、マニキュアや顕微鏡観察中に乾燥や動きを防ぐために接着剤で coverslip のシールします。4 暗闇の中で保管して皿 ° C

5。蛍光寿命イメージ (FLIM) 顕微鏡

  1. スタート FLIM ソフトウェア。オープン、" アプリケーション スイート " のソフトウェアにそれを切り替えると、" FLIM " モード。WLL がパルス モードで動作しているかどうかを確認します
    。 注: オペレーターは、パルス モードに到達するためのハードウェア ボタンを切り替える必要があります
  2. は、ローカル microirradiation 中と同じ向きで顕微鏡ステージ上 (セクション 4 で染色) 陽性細胞を含んでいる皿を置き、ペトリ皿にグリッドに従って照射セルを検索します。共焦点顕微鏡による画像の取得を実行します
    。 注: は、次の設定を使用: 1024 × 1024 ピクセル、400 Hz、双方向モード、16 行ズーム 8 x 12 x.
  3. FLIM の測定を開始する前にクリックして指数関数的減衰のリアルタイムのレコードを表示する予備的なテストを実行する " セットアップ FLIM " と " 取得 " を押すと " FLIM の実行テスト "。次のように 2 つの主要なパラメーターを評価することによってサンプルの FLIM パラメーターを最適化します。
    1. サンプルの有効期間の買い方、励起波長と WLL の繰り返し最適化 (下のメモを参照してください)。共焦点顕微鏡のソフトウェアで適切なボタンで、一般的と呼ばれるレーザー強度を調整 " レーザーの調整の設定 " で、' 画像取得 ' メニュー。その後、FLIM のソフトウェアを使用して崩壊曲線 (またはすべての光子数を示すヒストグラム) を計算する ( 図 4 a を参照してください -B).
      注: は、励起パルス モードで、WLL を使用します。ソフトウェア パルス ピッカー WLL、繰り返し率の選択ができるを装備する必要があります (80、40、20、または 10 MHz)。GFP 蛍光ドナー場合励起波長は 488 nm。減衰曲線は、FLIM ソフトウェア] ワークスペースを使用して記録されます。パラメーター (τ D τ DA) は、指数関数的減衰時間を示しています (例えば, 螢光色素の有効期間);(A) 螢光減衰の振幅を表すパラメーター (GFP 付けられた p53 および 図 4 a に mCherry タグ 53BP1 の FLIM データの例を参照してください -B).
    2. は、ソフトウェア取得ツール (選択の繰り返しレート モード) を使用して繰り返し率のカウントを確認します。サンプルとしての最も明るいピクセルを選択します。最も明るいピクセルの曲線が全体的な蛍光強度の 10% 以下にする必要があります
  4. をクリックして " 測定 " 押し " FLIM の実行 ".

6 FLIM スクリプトとフレットの計算効率を使用してドナー生涯

  1. フレット FLIM ソフトウェアを起動し、開く、' ドナー ' ワークスペース。
  2. 選択、" 解析 "/" イメージング " メニューのタブをクリックして FLIM スクリプトを起動して " を開始 "。最適なフレット FLIM の設定、よく知られている相互作用の蛋白質のパートナーを使用します
    。 注: フレット FLIM 効率よく知られている相互作用のパートナー GFP p53 と mCherry 53BP1 があった (34.1 ± 2.3) % ( 図 4).
  3. ドナー放出チャネル (チャネル 1 または 2) とプレスのみを使用して、" 計算の高速の FLIM " です
    。 注: 画像とグラフの両方が更新されます
  4. フレット FLIM のソフトウェア、設定、インテンシティ ・ スケール (0 - 4000 カウント) と有効期間のスケール (0 - 5 ns) ソフトウェアの手動で。このアプローチの興味のセルを視覚化し、フレット FLIM の数値を設定します
    。 注: この設定セル人口のそれぞれのセル間の蛍光強度の違いがなくなります
  5. 崩壊形でフィッティング モデルを選択します
    。 注: お勧めします n 指数 reconvolution、モデル パラメーターの選択 " n "。最適なフィットが次の条件: フィットよく減衰曲線と χ 2 オーバーレイを曲線 - 値 1 ( 図 4 b) と同じです
  6. を選択、" のしきい値 "/" しきい値を使用する " のしきい値を 75 に設定と。開始 " フィットの初期 ".
    注: SPT64 ソフトウェアは、フレットのない状態でドナーの平均寿命を計算します (" 振幅重み付き平均寿命 "、τ Av.Amp)

7。FRET 効率 FLIM は、フレットのスクリプトを使用して

  1. ドナー/アクセプター ワークスペースを選択し、オープン " 解析 " | " 画像 " | " イメージ生涯心配 ".
  2. は、アクティブなチャネルとして寄付者のみを選択し、光子数/ピクセルによってピクセルビニングを調整します。呼ばれるソフトウェア モードを実行して、" を計算する FastFLIM "。画像の光子数/ピクセルが低い場合は増加 4 ポイントにピクセルビニングします
  3. - 200 カウントと有効期間を 0 - 0 に強度を設定 5 ns
  4. をアクティブにする " しきい値を使用する " と 75 のしきい値を入力します
  5. フィッティング モデルを設定 " マルチ Exp. ドナー "、モデル パラメーターを入力 " n "、τ を入力 Av.Amp (ステップ 6.6)、τ D、およびアクティブ化 " 初期フィット ".
  6. 設定パラメーター Bkgr 12 月 シフト IRF と Bkgr マークを削除することによって一定の値に IRF
    。 注: は、可能な限り一定にパラメーターの大部分を設定します。このアプローチは、統計的な振れを低減します。この場合、押さないで " フィットの初期 " 再び。上記パラメーターの説明に従ってください: IRF = 楽器応答関数、BkgrDec 指数フィット、ShiftIRF からバック グラウンドを = = 指数 reconvolution フィット、BkgrIRF から IRF シフト = IRF の背景を合わせて指数 reconvolution から。すべての 3 つのパラメーターが計算され、詳細な分析ソフトウェアを使用して固定することができます
  7. プレス " 計算 FRETŔ フレット (FLIM の画像エリアにプロット) イメージと FRET 効率ヒストグラムの計算し、フレットの距離ヒストグラムをプロット ( 図 4)。画像解析が終了したらを押して " 結果を保存 ".
    注: フレット実験中だ蛍光タンパク質蛍光 (明るい) と非蛍光性 (ダーク) 状態の元に戻せる状態遷移を示すことを考慮する必要。この特性は呼ばれる " 点滅 "、FRET 効率は (この効果の説明は Vogerl によって提供されたこの現象の影響を受けると 24).

8。FRAP 解析

  1. 場所 dis顕微鏡ステージ上 h、関心の蛍光タグ蛋白を発現する transfected セルを見つけるし、ランプを標準的な顕微鏡明視野顕微鏡を用いた画像集録を実行 ( 図 2 aa を参照してください-b)、蛍光顕微鏡モード。
    1. 画像取り込み、共焦点顕微鏡 (または選択した螢光色素によると選択のレーザー) に接続されている白色光レーザー (WLL) を使用します。次の設定を使用: x. 12 線平均 1、512 × 512 ピクセル、1000 Hz、双方向モード ズーム 8 x
    2. (~ 10% レーザー パワー) で、少なくとも 15 の prebleaching 画像を取得し、画像集録メニュー (ROI) への関心の領域を定義します
  2. 退色実験用アルゴン レーザー (488 nm)。次の設定を適用: x. 10 フレーム解像度 512 × 512 ピクセル、1000 Hz、双方向モード、ズーム 8 x
    注: 488 勤務アルゴン レーザーによる GFP、mCherry、RFP など蛍光色素を励起できること nm または 514 nm
  3. は、選択の顕微鏡の FRAP ソフトウェア モードを使用します。退色、中にアルゴン レーザーを設定 ' レーザーの調整ボタンを使用して最大の力。10% のレーザー パワーでの 0.256 s 間隔で画像の取得を実行します
    。 注: 手順を postbleaching、選択の共焦点顕微鏡の標準画像集録モードを使用します。 退色後
    1. モニターの蛍光回復時間 (ホワイトニング後 45-50 のまで).
      注: 図 4 に示すように、mCherry タグ 53BP1 の退色後回復時間は自発的な DNA 損傷と UVA 照射の巣で異なる。mCherry-53BP1 UVA 病変では DNA 修復巣; 自然発生時 mCherry 53BP1 の蓄積と比較すると急速に回復しました。 図 4 と Foltankova を参照してください。 25
  4. 顕微鏡のソフトウェア (または任意のソフトウェア) からのデータをスプレッドシートにエクスポートし、統計分析を実行します

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Representative Results

高度な共焦点顕微鏡を用いた DNA 損傷で mCherry タグ 53BP1 と PCNA mCherry 蛋白質の蓄積を見ました。解析は、生きている細胞のローカル microirradiation によって行われました。個々 の細胞周期段階で DNA 修復関連蛋白質の核の分布パターンを認識する我々 は G1、初期 S を決定することが、Fucci セルラ システムを使用し、セル G2 段階サイクル (図 1)。Suchankovaに公開した Fucci セルラー モデルの生物学的応用26に示しますその 53BP1 は非相同末端結合 (NHEJ) 中にこのタンパク質の機能に関連付けられた、細胞周期の G1、S、G2 段階でローカルで誘導される DNA 損傷に採用されましたにつながる主要なメカニズムの 1 つ二重鎖切断修復。その一方で、この実験システム PCNA タンパク質相同組換え修復経路 (HRR) にリンクされているが27細胞周期の S および G2 の後期の Dsb を認識している個々 の細胞レベルを見せてくれた。DNA 修復機構に関する研究, 我々 はまた培養細胞が有糸分裂を受ける紫外線レーザー (図 3) への露出の後を続けていることを確認するために照射条件を最適化します。Microirradiated 細胞の有糸分裂を経ること、これらの実験条件で比較的生理学的方法と細胞 DNA 修理代金がで負傷されていないより高い強度でアポトーシスを誘導するレーザーを証明します。ここで、DNA 修復タンパク質のキャラクタリゼーションにフレット FLIM 解析を適用する方法を紹介します。この先進技術により、細胞核内のローカルのタンパク質間相互作用あるいは核小体の地域核小体、核ラミナや異質染色質のクラスターなどの蛋白質の相互作用を研究すること。この技術で初心者のため我々 は p53、53BP1 などよく知られている相互作用タンパク質のパートナーを使用して、このフレット FLIM 手法を最適化することをお勧めしたい (図 4 aC)。一般に、蛋白質蛋白質の相互作用の知識は蛋白質の複合体がレプリケーション、遺伝子の活性化、黙らせる、または DNA の修復のようなプロセスを調整する方法を理解することにつながります。さらに、蛋白質の動力学の研究のための非常に便利なツールはローカル蛋白質拡散・移動 (図 4) の特性を示す縛る方法です。一緒に取られて、ここで提供方法論について DNA の高度な共焦点顕微鏡技術を適用修復研究。

Figure 1
図 1: DNA 修復病巣の形成は細胞周期の S/G2 段階で GFP geminin (緑) と S の G1/初期段階で RFP cdt1 (赤) を発現する Fucci HeLa 細胞で学ぶことができます。自発的に発生する DNA 損傷 53BP1 タンパク質 (青正Alexa 405 染色)、(赤)、G1 で調べた初期 S (オレンジ; RFP cdt1 の GFP geminin 式) と G2 (緑) 細胞周期の段階。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 時間をかけて DNA 損傷で mCherry タグ PCNA の募集。(A) mCherry PCNA (赤) を発現する細胞は、選択された領域 (グレー) でグリッド顕微鏡お皿に位置していた。固定と染色の後照射細胞 (黄色の矢印) が登録されている座標 (例として K の灰色の文字を参照) によると置かれた (Aa c)。黄色のフレームと矢印 (Ad) は、microirradiated と拡大したパネル Ae f セルを示しています。(B) mCherry PCNA (赤) の蓄積は GFP タグ ヒストン H2B (緑) を安定して発現 HeLa 細胞で調べた。細胞は、35 分のローカル microirradiation の直後に監視された (ビデオ 1参照)。(C) 3 D 共焦点顕微鏡による Microirradiated 細胞を分析し、DNA 損傷 (例えば、mCherry 53BP1) で蛋白質の蓄積がすべての 3 つの次元 (x と yz xy z) で発見されたが唯一細胞核の中央部は microirradiated (図 2ビデオ 2 3 D 投影の 3D セル回転を参照してください)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 405 nm レーザー ダイオードを用いた細胞 microirradiated は細胞周期を正常に続行します(A) 405 nm のダイオード レーザーを用いた照射後 HeLa 細胞 (安定して表現する GFP ヒストン H2B; グリーン) 経る有糸分裂 (ビデオ 2を参照してください)。黄色の矢印とフレームは、選択したセルに照射された投資収益率を示します。ホワイトのフレームを有糸分裂。(B)同じ実験条件下で照射された細胞の有糸分裂が認められた GFP H2B (緑) を安定に発現して一過性発現 mCherry PCNA (赤) の HeLa 細胞における時間経過顕微鏡による。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: GFP p53 および mCherry 53BP1 の FLIM とフレット FLIM 解析します。蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) FLIM と退色後蛍光回復のアプリケーションによって検出された(FRAP) 様々 な DNA 損傷で (A ~ C)平均 (n = 10) 全体 nonreplicating HeLa 細胞核における測定 (mCherry-53BP1) 受容体の存在と不在での GFP タグの p53 の寿命。(A) 代表的な蛍光減衰曲線と残差を GFP p53 (ドナー専用 τD) または GFP p53 および mCherry 53BP1 を一過性発現 HeLa 細胞の検討 (ドナー-アクセプター、τDA).(B) 平均寿命 (τ1 τ-3) と振幅 (1 -3) () GFP p53 および (b) mCherry 53BP1 の全体の HeLa 細胞核で測定します。Χ2値を算出、表示されます。(C) よく知られている相互作用のパートナー GFP p53 と mCherry 53BP1 の FRET 効率の概要です。スケール バー = 4-5 μ m フレット FLIM 結果表示 〜 35 %fret 効率よく知られている相互作用パートナー p53 の GFP タグと mCherry タグ 53BP1。(D)MCherry 53BP1 の回復速度は、自発的に発生する DNA 損傷 (緑の曲線) と UVA による DNA 病変 (青の曲線) で学んだ。DNA 損傷で mCherry 背景 (mCherry 53BP1 蛋白質の蛋白質の分散形) のレベルに漂白された、背景の蛍光性は各値から差し引かれます。DmCherry-53BP1 の相対的な蛍光強度として示されている ata は、平均 ± 標準誤差として表されます。スチューデントの t 検定は、DNA 損傷の 2 種類の統計的に有意な違いを明らかにした (* p 0.05 を示しています)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Video 1
ビデオ 1: HeLa 細胞安定発現 GFP タグ ヒストン H2B のローカル microirradiation (蛍光グリーン) による DNA 損傷に mCherry タグ PCNA 蛋白質 (赤い蛍光性) の募集ですこのビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

Video 2
ビデオ 2: mCherry タグ 53BP1 蛋白質 (赤色蛍光) DNA 損傷の蓄積が HeLa 細胞におけるローカル microirradiation によって誘導される。細胞の核は、セル空間における回転の可視化を可能にするソフトウェア モードを使って 3 D 空間に表示されます。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

Video 3
ビデオ 3: Microirradiated HeLa 細胞 GFP タグ ヒストン H2B (蛍光グリーン) 有糸分裂を通して進んでください。照射領域は、GFP H2B (黒の領域が細胞核内照射のストリップ) の枯渇が特徴です。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

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Discussion

顕微鏡検査の技術は、研究室での基本的なツールを表します。ここでは、タンパク質募集の検討用の方法の簡単な説明と DNA 損傷で速度が表示されます。我々 は特に生きている細胞のローカル microirradiation の分野で我々 の実験的経験を指摘し、アクセプタ漂白フレット28による DNA 損傷とその高度な縛ると蛋白質-蛋白質の相互作用蛋白質の動力学の研究について論じるフレット FLIM (図 4 a~ D) の変更。ここに示す方法は、高度な共焦点顕微鏡6,7,8、によって検査 DNA 修復プロセス、特に生体細胞の蛋白質の動力学の真の理解のための必携ツール 28。これらのメソッドは、組織や腫瘍細胞の形態の特性に及ぼす放射線対処未来医療へ莫大なユーティリティの。このメソッドを最適化するためにたいと思いますよく知られている蛋白質相互作用で始まるをお勧めします図 4に示すように。

それはよく知られている、DNA 損傷にタンパク質募集中です非常に動的かつ時間に依存します。したがって、細胞照射後時間経過の共焦点顕微鏡のアプリケーションは基礎科学の分野では診療所26だけで必要です。レーザー microirradiation9,28,29のためのローカル誘導の DNA 損傷を表すゲノム領域蛋白質の募集、蛋白質、または蛋白質 DNA の結合を検討することが可能だと相互作用。これらのメソッドの開始点は、外因性タンパク質の募集が内因性のレベルに適切な抗体による検証が必要です。次に、そのような実験の重要なステップは過剰 transfected セルは、偽陽性の結果を提供できることしたがって、最高の意思決定は興味の蛍光タグ付きタンパク質を安定に発現する細胞株を確立します。また、画像の取得に使用されるレーザーの光毒性の効果により撮影条件を最適化する必要があります。 またはトロロックス化合物は、細胞培養培地で溶解しなければなりません。さらに照射をお勧めする前に presensitization ステップの除去。ローカル microirradiation 後 DNA 修復は細胞が有糸分裂(図 3 aBを受けることなどを進める必要があるとビデオ 3)。レーザー照射は最適な DNA の視点から貴重な少ないプロセス後のアポトーシスの誘導は、23を修復します。それはまた細胞周期の特定の段階 (例えば、Bártováでのみいくつかの DNA 修復タンパク質が DNA 損傷を認識するは明白30). したがって、中間期の個々 の段階のセルを示す HeLa Fucci セルラ電話の使用は、便利なツール研究 DNA 損傷応答。また、PCNA タンパク質31原子力分布によると細胞周期の段階を認識できます。

縛るとフレットのメソッドを表す DNA 病変7,8,32に補充される蛋白質の特性を調査するための非常に便利なツールが知られています。また、FLIM 技術32は DNA 損傷の蓄積蛋白質の動的構造変化に関する情報を公開できます。FLIM は動的な細胞プロセスを直接測定するため、このメソッドの使用は重要ですしたがって、定常状態の蛍光強度を測定して、時間をかけて。FLIM のアプローチは、背景の蛍光性を排除することによっての画像のコントラストを増加します。これは従来のアクセプター漂白フレットと比較してフレット FLIM 測定の利点です。FLIM で測定した蛍光寿命蛍光付けられた蛋白質の一部分についての情報を提供してどのようにというヘテロなプローブを示す環境条件が原因です。FLIM も最高、体内の蛋白質蛋白質の相互作用のフレットを実行する最も信頼性の高い生物物理アプローチ細胞32,33

記述されている方法のすべて一緒に取られて、組み合わせのアプローチのために特に重要である新しいひと細胞における DNA 損傷応答機構を明らかにする可能性があります。たとえば、多光子 FLIM は、多光子断層撮影34をいう医学では、高解像度の画像を取得する適用されています。この高度な顕微法は組織化学的試料を用いた癌診断のための診療所で適用でき、高解像度で解析。FLIM メソッドはさらに、蛍光によると腫瘍細胞表面の正確な分析を提供できます。FLIM は、フレットのメソッドの 1 つの欠点は非常に洗練されたソフトウェアの背景については、顕微鏡の演算子によって完全に理解する必要があります。さらに FLIM データの生物学的関連性一般に、DNA 修復プロセス、確かに明らかにされる近い将来に。

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Disclosures

著者は、利害の対立がないことを宣言します。

Acknowledgments

この作業は、プロジェクト P302 12 G157 チェコ共和国の助成金機構によって支えられました。実験はまたノルウェーの資金によって、文部省、青少年とチェコ共和国のスポーツによって監督されているチェコ語ノルウェー語研究プログラム CZ09 によって支えられた (許可番号: 7F14369)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell cultivation
HeLa ATCC CCL-2TM
ES-D3 [D3] ATCC CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM PAN-Biotech P03-0710
DMEM high glucose Sigma-Aldrich D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SV30180.03
ES Cell FBS Gibco 16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) Merck Millipore ESG1107
MTG (1-Thioglycerol) Sigma-Aldrich M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution Biosera XC-A4122/100
Trypsin - EDTA Biosera XC-T1717/100 dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes Sigma-Aldrich P7866 cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 Ibidi GmbH 81166 microscopic dish
0.2% Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G dilute in destille water and autoclaved
Name Company Catalog Number Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid Addgene 12091
mCherry-PCNA plasmid generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid Addgene 19835
Metafecetene Biontex Laboratories GmbH T020–2.0
10 × PBS Thermo Fisher Scientific AM9625 for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine Sigma-Aldrich 11296736001
Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
White-light laser Leica Microsystems
355-nm laser Coherent Inc. laser power 80 mW
405-nm laser Leica Microsystems laser power 50 mW
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip VWR International Ltd 631-1580
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943 1 LT
Triton X100 MP Biomedicals 2194854
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A2153
53BP1 Abcam ab21083 primary antibody
AlexaFluore 647 Thermo Fisher Scientific A27040 secondary antibody
Vectashield Vector Laboratories Ltd H-1000 mounting medium

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References

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