Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

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Biology

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Summary

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

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Legartová, S., Suchánková, J., Krejčí, J., Kovaříková, A., Bártová, E. Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions. J. Vis. Exp. (129), e55999, doi:10.3791/55999 (2017).

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Abstract

Microirradiation locale con laser rappresenta uno strumento utile per gli studi del DNA-riparazione-processi in cellule vive. Qui, descriviamo un approccio metodologico per l'analisi cinetica della proteina alle lesioni del DNA nel corso del tempo o proteine interazioni su localmente microirradiated della cromatina. Mostriamo anche come riconoscere le singole fasi del ciclo cellulare usando il sistema cellulare di Fucci per studiare la cinetica di cellula-ciclo-dipendente della proteina alle lesioni del DNA. Una descrizione metodologica dell'uso di due laser UV (355 nm e 405 nm) per indurre diversi tipi di danno del DNA inoltre è presentata. Solo il microirradiated di cellule dal laser del diodo di 405 nanometro procedeva normalmente attraverso mitosi ed erano privi di dimeri di pirimidina cyclobutane (CPDs). Mostriamo anche come cellule di microirradiated possono essere risolto in un punto determinato momento per eseguire immunodetection di proteine endogene di interesse. Per gli studi di riparazione del DNA, descriviamo inoltre l'uso di metodi biofisici compreso FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) e FLIM (fluorescenza Lifetime Imaging microscopia) nelle cellule con spontaneamente d'avvenimento i fuochi di danni del DNA. Mostriamo anche un'applicazione di FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) negli studi sperimentali delle interazioni proteina-proteina.

Introduction

Danno del DNA porta alla comparsa di lesioni del DNA che consiste della pirimidina del cyclobutane (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine e single-strand o double-strand breaks1,2. Γ-raggi sono la forma di radiazione ionizzante con la più alta energia e alta penetranza, così questa fonte di radiazione è ampiamente usata in radioterapia3. D'altra parte, sperimentalmente indotto danni al DNA causati da UV laser imita naturale esposizione ai raggi UV. Microirradiation UVA, come un metodo microscopico, rappresenta uno strumento sperimentale per lo studio di danno del DNA in cellule viventi individuali. Microirradiation è stato usato per la prima volta 40 anni fa per rivelare l'organizzazione delle regioni del cromosoma4,5. Questa tecnica è altamente dipendente le proprietà funzionali di microscopi confocali o i limiti tecnici di nanoscopia moderno. Per indurre lesioni del DNA, le cellule possono essere presensitized da 5' bromodeossiuridina (BrdU) o Hoechst 33342 prima dell'irradiazione UV. Bártová et al. 6 precedentemente descritto il passo presensitization e recentemente abbiamo ottimizzato questa tecnica microirradiation al fine di evitare la morte cellulare o apoptosi. Ad esempio, l'uso di un laser UV 405 nm (senza Hoechst 33342 presensitization) porta all'induzione del doppio-filo di 53BP1-positivi (DSBs) a scapito di dimeri di pirimidina cyclobutane (CPDs). D'altra parte, presensitization passi combinati con UV microirradiation inducono livelli molto elevati di CPDs e DSBs contemporaneamente7,8. Questa metodologia è difficile da applicare allo studio di una singola via di riparazione del DNA.

Con microirradiation, è possibile analizzare l'assunzione di proteine, cinetica e interazione alle lesioni del DNA in cellule viventi. Un esempio di questo metodo è stato pubblicato da Luijsterburg et al. 9 per eterocromatina proteina 1 β e ci ha mostrato recentemente per la prima volta che il fattore di pluripotenza Oct4 e una proteina connessa con corpi di Cajal, coilina, sono reclutati per le lesioni del DNA indotto da UV6,10. Cinetica della proteina in queste lesioni del DNA possono anche essere studiati utilizzando il FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)11,12,13 o FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) tecniche14 ,15. Questi metodi hanno il potenziale per rivelare semplice diffusione delle proteine alle lesioni del DNA o interazioni proteina-proteina. Uno strumento utile per ulteriore caratterizzazione delle proteine è FLIM (fluorescenza Lifetime Imaging microscopia) o la sua combinazione con FRET tecnologia (FRET-FLIM)16. Questi metodi consentono lo studio dei processi in cellule che sono stabilmente viventi o transitoriamente esprimenti la proteina di interesse contrassegnati da una molecola fluorescente17. Qui, è riportato un esempio del tempo di decadimento esponenziale (τ) per proteina GFP-etichettato p53 e il suo partner di interazione, mCherry-etichetta 53BP1, giocando un ruolo importante nel DNA danni risposta18,19 . Il parametro τ, la durata del fluorocromo fornito da calcoli di FLIM, è specifico per una tintura di fluorescenza determinata, le sue abilità di associazione e il suo ambiente cellulare. Pertanto, questo metodo può mostrarci distinzioni tra sottopopolazioni di proteina, le loro capacità di associazione e le loro proprietà funzionali dopo, ad esempio, il danno del DNA.

Qui, un contorno di approcci metodologici delle tecniche di microscopia avanzata che viene utilizzato nel nostro laboratorio per studiare il reclutamento di proteine specifiche del tempo, cinetica, diffusione e interazioni proteina-proteina nel sito della cromatina microirradiated è presentato. La metodologia dettagliata per l'induzione di lesioni locali del DNA in cellule viventi e una descrizione delle metodologie utili per studi di eventi relativi a DNA-danno alle lesioni del DNA localmente indotte causate da laser UV sono forniti.

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Protocol

1. coltura di linee cellulari

  1. linee cellulari derivate da HeLa
    Nota: le cellule di carcinoma cervicale HeLa uso: sia le cellule HeLa che esprimono istone H2B taggati con cellule GFP o HeLa-Fucci che esprimono RFP-Cdt1 nel G1 e prime fasi S e GFP-geminina nelle fasi S/G2-M ( Figura 1).
    1. Per la coltivazione di tutte le linee cellulari derivate da HeLa, utilizzare Dulbecco ' s modificato Eagle ' medium s (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale e gli antibiotici adatti a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% CO 2. Sostituire il supporto di 2 - 3 volte a settimana.
    2. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare le celle utilizzando 1X PBS per eliminare tutte le tracce di siero che contiene inibitore della tripsina. Eseguire questo passaggio in una cappa biohazard a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA preriscaldata a coprire lo strato delle cellule e mantenere le cellule alle cellule di Trypsinize 37 ° C. fino a quando strato delle cellule è disperso (solitamente 3-5 min).
    4. Aggiungere 3 mL di terreno di crescita completa preriscaldata per inattivare tripsina-EDTA e disperdere il mezzo pipettando delicatamente più volte.
      Nota: Questa procedura deve essere eseguita in una cappa biohazard per proteggere l'operatore dai contaminanti e mantenere condizioni di coltura cellulare ottimale.
    5. Conteggio celle utilizzando un contatore di cellule automatico o una camera di Bürker. Diluire 1 × 10 5 cellule/mL e pipettare 5 mL sospensione di cellule in un piatto nuovo. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
  2. Coltivazione di cellule staminali embrionali del topo (mESCs), D3 linea cellulare
    1. mESCs cultura sulla cella cultura piatti rivestiti con 0,2% di gelatina e mESC di mezzo di manutenzione. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
      Nota: È consigliabile preparare il mezzo di coltura/manutenzione mESCs in aliquote da 50 mL e conservarlo a 2-8 ° C fino a 2 settimane. Il supporto di mESC contiene 75 mL ES cella FBS, 5 mL penicillina G e streptomicina, 5ml aminoacidi Non essenziali (10 mM) (concentrazione finale 0,1 mM), 50 µ l del mouse fattore inibitore della leucemia (mLIF; 100 µ g/mL) (concentrazione finale di 10 ng/mL), µ l 430 MTG (1- Thioglycerol; diluizione 1: 100 in DMEM) (concentrazione finale 100 µM) e medium DMEM alto glucosio fino a 500 mL.
    2. Medium di coltivazione mESC dalla piastra di coltura di aspirare e lavare le cellule una volta con PBS 1X.
    3. Aggiungere 0,5 mL di tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C fino a quando le cellule iniziano a staccare dal piatto. Quindi, inattivare la tripsina lavando le cellule con 2 mL di medium di coltivazione mESC completati con 15% di siero fetale bovino.
    4. Utilizzare una pipetta per sloggiare le celle rimanenti dalla piastra di coltura.
      Nota: È importante ottenere cellule singole, perché cella ciuffi promuovono la differenziazione delle cellule.
    5. Split cells 01:10 piatti gelatinizzato con mezzo di manutenzione mESC.
      Nota: Se la densità delle cellule mESC è troppo bassa, non crescono bene; Se la densità è troppo alta, la differenziazione è promosso.
    6. Assicurarsi che mESCs sono mantenuti in uno stato indifferenziato eseguendo mESC passaggio ogni secondo giorno suddividendo le cellule da una capsula di Petri in quattro nuovi piatti. Ispezionare le colonie mESC con un microscopio invertito sotto 100 X o ingrandimento X 200 e, se c'è evidenza di mES spontanea differenziazione cellulare, eseguire Western blot per valutare lo svuotamento di proteina Oct4.
      Nota: Con cellulare ottimale passaggio, differenziazione spontanea delle mESCs in vitro può essere ridotto.

2. Transfezione di cellule

  1. seme cellule 48h prima esperimenti su piatti di microscopia gridded (diametro 35 mm) al fine di trovare le cellule microirradiated in base alle loro coordinate sul piatto Petri.
    Nota: Questo è un esempio che in cui microirradiation è il primo passo sperimentale e immunostaining è il secondo ( Figura 2A).
    1. Per il seeding, è necessario utilizzare una concentrazione di 5 × 10 4 cellule/mL per linee cellulari derivate da HeLa (o 1 × 10 4 cellule/mL per le celle D3 mES). Utilizzare fino a 2 mL di terreno completo per ogni piatto. Durante la coltivazione e microirradiation, mantenere le cellule in una camera termostato o coltura a 37 ° C e 5% CO 2.
    2. Conteggio celle utilizzando un contatore di cellule automatico.
      Nota: Non utilizzare una maggiore concentrazione di cellule. Soprattutto nel caso di colonie densamente imballati di D3 mESCs, densità cellulare alta impedisce un'identificazione delle cellule di microirradiated localmente dopo che immunostaining.
  2. Preparazione del plasmide DNA e transfezione reagente di scelta come segue. Preparare soluzione A usando 2-3 µ g di DNA plasmidico selezionato (vedere la Tabella materiali particolari) e 150 µ l 1X PBS. Preparare Soluzione B utilizzando 3,5 µ l di reagente di transfezione in 150 µ l 1 × PBS. Garantire che ogni soluzione è ben amalgamato pipettando attenta.
    Nota: Il rapporto ottimale di DNA e transfezione reagente deve essere determinato empiricamente per ogni linea cellulare e singolo plasmide.
  3. A 24 h prima osservazione sperimentale di vivere transitoriamente transfected le cellule, combinare soluzione A e soluzione B senza Vortex. Incubare le soluzioni combinate a temperatura ambiente per 15-20 min. In modo goccia a goccia, in modo omogeneo disperdere questo completare transfezione composto (300 µ l, come descritto al punto 2.2) sullo strato di cellule in crescita nel piatto microscopia.
  4. Cellule di incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 4-6 h, quindi sostituire la miscela di transfezione con medium fresco. Coltivare le cellule in condizioni standard.
    Nota: Quando si utilizza un laser a 405 nm, non presensitize le cellule con qualsiasi reagente, ma quando si utilizza un laser 355 nm, eseguire presensitization delle cellule con 10 µM 5-bromo-2 ' - deossi - uridina (BrdU) 7 , 8 . Presensitization tempo dipende il tipo di cella e la lunghezza del ciclo cellulare. Per le cellule HeLa, aggiungere BrdU 16 a 20 h prima microirradiation locale. Nel caso di mESCs, aggiungere BrdU 6 a 8 h prima microirradiation.

3. Induzione di lesioni del DNA locale e microscopia confocale

  1. mettere il piatto sulla fase di microscopio e registrare la posizione delle celle selezionate sul piatto; le coordinate delle celle saranno necessari per ulteriori analisi ( Figura 2A a-c).
  2. Trovare celle transfected in una piazza con l'etichetta con un numero o una lettera ( Figura 2A d-f, frecce in Visualizza annuncio la posizione della cella ingrandita in pannelli Ae e Af). Ottenere un'immagine delle celle utilizzando la microscopia a campo luminoso e acquisire un'immagine di fluorescenza al fine di identificare la posizione di entrambi le celle e la piazza con etichetta ( Figura 2A).
  3. Per acquisizione di immagini prima di irradiamento, utilizzare un laser a luce bianca (WLL) (470-670 nm in incrementi di 1 nm) collegato al microscopio confocale (o un altro laser disponibile collegato al confocal microscopio).
  4. Utilizzare le seguenti impostazioni: 512 × 512 pixel di risoluzione, pixel size 64 nm, 400 Hz, modalità bidirezionale (scansione in due direzioni), linea media insieme a 8, zoom 8 x 12 x.
    Nota: Media Line rappresenta un dato numero di scansioni; la stessa riga viene analizzata più volte prima di proseguire alla riga successiva. Ripetute scansioni di tutte le linee producono il frame finale dell'immagine.
  5. Per l'osservazione di immagine e acquisizione, è necessario utilizzare un obiettivo di olio 63 × con un'apertura numerica di 1,4 e acquisire in sequenza immagini di fluorescenza. Eliminare il cross-talk tra i due fluorocromi utilizzando la modalità di scansione sequenza del software appropriato.
    Nota: Tutti i software di microscopio consente di impostare una modalità di scansione sequenza cosiddetta. L'operatore può scegliere se acquisire i fluorocromi ' informazioni contemporaneamente (ad esempio, in fluorescenza rosso-verde-blu) o, come già detto qui, individualmente (in sequenza), fluorocromo di fluorocromo. Prendere in considerazione le informazioni di carattere generale che l'eccitazione/emissione massima per GFP è 395/509 nm e la massima eccitazione/emissione per mCherry è 587/610 nm (Vedi fluorocromi utilizzati qui in Figura 2B). Basate su tali informazioni, selezionare adatta eccitazione e filtri di emissione per i fluorocromi desiderati. Filtro di selezione e le procedure di scansione deve essere ottimizzati per ogni microscopio confocale.
  6. Per induzione di lesioni del DNA, USA 64 linea scansione modalità, spegnere il WLL (in ' acquisizione ' modalità), accendere la sorgente UV esterna (il " laser UV " pulsante), impostare l'area di interesse (ROI) (in ' acquisizione ' modalità) e impostare il 355-nm laser al 100% di potenza o, in alternativa, utilizzare una sorgente laser di 405 nm.
    Nota: Generalmente, potere del laser è regolata da pulsante di regolazione laser appropriato in modalità di acquisizione immagine.
  7. Per microirradiation locale, utilizzare il laser che emettono nello spettro UVA vicino. Per microirradiation del ROI nel nucleo e per acquisizione immagine, impostare lo sfondo a zero in modalità di acquisizione immagine per regolare l'intensità del laser fuori il ROI; Se la cella è irradiata correttamente, il segnale di GFP-istone H2B scomparirà e, ad esempio, mCherry-etichetta proteina PCNA sarà reclutata a lesioni del DNA immediatamente dopo l'irradiazione ( Figura 2B e Video 1 ).
    Nota: Una lesione del DNA indotto nel ROI di una sezione confocale appare anche nella proiezione tridimensionale (3D) (Vedi rotazione 3D e la x-y, x-z, y-z proiezioni in Figura 2 e Video 2). Per una descrizione dei parametri tecnici completi per laser 355 nm e 405 nm, vedere Stixová et al. 7
  8. dopo il ROI è stato irradiato, spegnere la sorgente UV esterna, spegnere il ROI, accendere il WLL, cambiare linea di scansione a 8 e trovare un'altra cella per irradiazione. Per la selezione di ROI, utilizzare il pulsante applicabile nel software ' modalità di acquisizione immagine di s.
    Nota: mCherry-PCNA ha un picco di massima accumulazione a lesioni del DNA tra 2 e 20 min ( Figura 2B). Per verificare il risultato sui livelli della proteina esogena, procedere con l'immunofluorescenza che macchia immediatamente dopo microirradiation locale. Selezionare l'intervallo di tempo di irradiazione secondo interesse.
  9. Verifica che un accumulo di proteine esogene possa essere rilevato nella maggior parte delle cellule di microirradiated. Per questa verifica, è possibile utilizzare i criteri nei passaggi seguenti.
    1. Check che non c'è nessun sovraespressione della proteina esogena in cellule trasfettate transitoriamente. Come una possibile soluzione, scegliere celle con solo una debole espressione della proteina fluorescente (per esempio, mCherry-PCNA o mCherry-53BP1).
    2. Valutare la fototossicità dell'esposizione WLL utilizzato per l'acquisizione immagine.
      Nota: Per il test di fototossicità, esporre cellule trasfettate per prolungato laser microirradiation e verificare che cellule proseguono alla mitosi come mostrato in Figura 3A -B. Come una possibile soluzione, ridurre scansione tempo e numero di fette confocale per cella, ottimizzare la scansione 3D di selezione del passo assiale ottimo (0,3 µm è consigliato) e impostare il laser ' s potere al suo minimo. In alternativa, fototossicità può essere eliminato utilizzando Trolox (acido 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic, un analogo solubile in acqua della vitamina E) dissolto nel medium di coltivazione. Per esperimenti di DNA-danno-correlato, non è consigliabile utilizzare di Trolox grazie al suo effetto protettivo contro le radiazioni UV.
    3. In caso di irradiazione con laser 355 nm, verifica sufficiente incorporazione di BrdU usando un anticorpo di rilevazione di BrdU appropriato dall'incorporazione di BrdU kit (Vedi Tabella materiali). Poiché BrdU è incorporato nel DNA durante la fase S del ciclo cellulare, la maggior parte delle celle deve procedere attraverso la fase S durante presensitization. Come una possibile soluzione, considerare la lunghezza del ciclo cellulare, che è il tipo di cella specifici.
    4. Analizza se il DNA riparare le proteine di interesse hanno una capacità di riconoscere le lesioni del DNA nel ciclo cellulare specifico o più fasi. Una possibile soluzione: Per verificare che il reclutamento di proteine selezionate per lesioni del DNA è limitato alle fasi di ciclo cellulare specifico (G1/S/G2), utilizzare le cellule HeLa-Fucci. Queste cellule esprimono RFP-Cdt1 nella G1 e prime fasi S e GFP-etichettato geminina nel ciclo cellulare S/G2-M fasi 22 ( Figura 1).
    5. Per evitare l'apoptosi, la morte delle cellule, selezionare una fonte appropriata laser e laser potenza impostazione 23. Tenete a mente che irradiati cellule dovrebbe procedere alla mitosi ( Figura 3A -B, Video 3).
      Nota: Apoptosi indesiderato possono essere rilevato di positività Annessina V, caspasi 3 o fenditura B lilo. Sul piano morfologico, cella distacco e formazione di corpi apoptotici sarà visibile.

4. Colorazione di immunofluorescenza

  1. risciacquare brevemente lo strato di cellule (crescendo in piatti microscopio) con 1 × PBS e dopo il risciacquo, Difficoltà celle utilizzando 4% formaldeide per 10 min (per linee cellulari derivate da HeLa) o 20 min (per celle D3 ES) a temperatura ambiente. Risciacquare il piatto con 1 × PBS.
    Attenzione: Formaldeide provoca gravi lesioni oculari, può causare una reazione allergica cutanea ed è anche un potenziale cancerogeno; così, tutti i passaggi sperimentali con formaldeide devono essere eseguiti in una cappa di aspirazione.
    Nota: Per evitare inutili imbianchimento dei segnali di fluorescenza, conservare il piatto in una camera oscura durante il tempo di incubazione necessario per immunofluorescenza.
  2. Permeabilize le cellule con 0,1% Triton X-100 disciolto in H 2 O per 8 min e poi incubare le cellule per 12 min con 1 × PBS contenente saponina 0,1% e 0,1% Triton X-100. Dopo l'incubazione, lavare le cellule in 1 × PBS due volte per 15 min.
  3. Cellule Incubate con BSA 1% in PBS per 60 min per bloccare il legame non specifico degli anticorpi selezionati di 1 ×. Lavare le cellule in 1 × PBS per 15 min dopo incubazione.
  4. Anticorpo primario
  5. diluito in un rapporto di 1: 100 (o 1: 200) (questo passaggio deve essere oottimizzato per gli anticorpi individuali) in 1% BSA in 1X PBS, utilizzando 25 µ l di questa soluzione per ogni piatto e coprire le cellule con un vetrino coprioggetti. Incubare le cellule con la soluzione contenente l'anticorpo primario in una camera umidificata durante la notte a 4 ° C.
  6. Il giorno seguente, lavare le cellule in 1 × PBS due volte per 5 min.
  7. Diluire l'anticorpo secondario ad un rapporto di 1: 100 (o in alternativa 1: 200) in 1% BSA in 1X PBS, utilizzando 100 µ l di questa soluzione per ogni piatto e coprire le cellule con un vetrino coprioggetti. Incubare le cellule con la soluzione contenente l'anticorpo secondario per 60 min. Dopo l'incubazione, lavare le cellule in 1 × PBS tre volte per 5 min.
  8. Montare il vetrino coprioggetto con una goccia di mezzo di montaggio e sigillare il coprioggetto con smalto o colla per evitare secchezza e movimento durante l'osservazione al microscopio. Conservare il piatto al buio a 4 ° C.

5. Microscopia di fluorescenza Lifetime immagine (FLIM)

  1. Start il FLIM software. Aperto il " Application Suite " del software e impostare il " FLIM " modalità. Assicurarsi che il WLL sta funzionando in modalità pulsata.
    Nota: L'operatore deve passare un pulsante hardware per raggiungere pulsazione.
  2. Il piatto contenente le cellule marcate (macchiate nella sezione 4) sul palco microscopio nello stesso orientamento come durante microirradiation locale e di ritrovare cellule irradiate secondo le griglie di Petri. Effettuare l'acquisizione immagine al microscopio confocale.
    Nota: Utilizzare le seguenti impostazioni: modalità di 1024 × 1024 pixel, 400 Hz, bidirezionale, 16 linee, zoom 8 x 12 x.
  3. Prima di iniziare la misurazione di FLIM, eseguire un test preliminare per visualizzare un record in tempo reale di decadimento esponenziale, facendo clic su " Setup FLIM " e " acquisizione " e premendo " test di FLIM eseguire ". Ottimizzare i parametri FLIM per l'esempio valutando i due parametri principali come segue.
    1. Ottimizza il tasso di ripetizione di WLL con la lunghezza d'onda di eccitazione sintonizzato per la durata del campione (Vedi nota sotto). Nel software microscopio confocale, regolare l'intensità del laser con l'apposito tasto, che è generalmente chiamato " regolazione del laser " alla ' acquisizione immagini ' menu. Quindi, calcolare una curva di decadimento (o istogramma che Mostra tutti i conteggi di fotoni) utilizzando il software FLIM (Vedi Figura 4A -B).
      Nota: Utilizzare il WLL in modalità impulso per l'eccitazione. Il software deve essere dotato di un selettore di impulso per la volontà, che consente la selezione del tasso di ripetizione (80, 40, 20 o 10 MHz). È la lunghezza d'onda di eccitazione nel caso il donatore di fluorescenza, GFP, 488 nm. La curva di decadimento viene registrata utilizzando l'area di lavoro software FLIM. Il parametro (τ D, τ DA) sono riportati i tempi di decadimento esponenziale (ad es., vita di fluorocromo); parametro (A) rappresenta l'ampiezza del decadimento del fluorocromo (vedere esempi di FLIM dati per GFP-etichettato p53 e 53BP1 mCherry-etichetta in Figura 4A -B).
    2. Controllare il tasso di ripetizione di conteggio utilizzando lo strumento di acquisizione del software (modalità di velocità selezionare ripetizione). Selezionare i pixel più luminosi nel campione; la curva per il pixel più luminoso deve essere inferiore al 10% dell'intensità di fluorescenza globale.
  4. Fare clic su " misura " e premere " eseguire FLIM ".

6. Lifetime donatore utilizzando uno Script di FLIM e calcolo di FRET efficienza

  1. avviare il software FRET-FLIM e aprire il ' donatore ' area di lavoro.
  2. Selezionare la " analisi " / " Imaging " scheda nel menu e avviare lo script FLIM cliccando " Start ". Per le impostazioni ottimali di FRET-FLIM, utilizzare ben noto interattori della proteina.
    Nota: L'efficienza della FRET-FLIM per l'interazione ben noto partner GFP-p53 e mCherry-53BP1 era (34,1 ± 2.3) % ( Figura 4).
  3. Utilizzare solo il donatore emissione canale (1 o 2) e premere " calcolare velocemente FLIM ".
    Nota: L'immagine e il grafico verrà entrambi aggiornati.
  4. Software in the FRET-FLIM, impostare la scala di intensità (0 - 4000 conteggi) e la scala della vita (0 - 5 ns) manualmente nel software. Con questo approccio, visualizzare la cella di interesse e impostare la misurazione di FRET-FLIM.
    Nota: Questa impostazione Elimina le differenze nell'intensità di fluorescenza tra le singole celle nella popolazione cellulare.
  5. In forma di decadimento, scegliere il modello di montaggio.
    Nota: Si consiglia di reconvolution n-esponenziale e la selezione del parametro modello " n ". Una vestibilità ottimale ha i seguenti criteri: il componibile curva sovrapposizioni, la curva di decadimento ben e il χ 2 - valore è uguale a 1 ( Figura 4B).
  6. Seleziona il " soglia " / " uso soglia " e impostare la soglia a 75. Avviare " iniziale Fit ".
    Nota: Il software di SPT64 calcola la durata media dei donatori in assenza di FRET (" durata media ponderata di ampiezza ", τ Av.Amp)

7. FRET efficienza utilizzando lo Script di FLIM-FRET

  1. selezionare l'area di lavoro di donatore/accettore e quindi aprire " analisi " | " Imaging " | " immagine vita FRET ".
  2. Selezionare solo il donatore come il canale attivo e regolare Pixelbinning a seconda del numero di fotoni/pixel. Quindi, eseguire il software in modalità chiamata " calcolare FastFLIM ". Se il numero di fotoni/pixel nell'immagine è basso, aumentare il Pixelbinning a 4 punti.
  3. Impostare l'intensità a 0 - 200 conteggi e la durata di 0 - 5 ns.
  4. Attiva " soglia di uso " e impostare la soglia di 75.
  5. Impostare il modello di raccordo " Multi-exp. donatore ", immettere il parametro di modello " n ", immettere τ Av.Amp (punto 6.6) come una τ D e attivare " Fit iniziale ".
  6. Impostare i parametri Bkgr Dec, Shift IRF e Bkgr IRF a valori costanti rimuovendo il segno di.
    Nota: Impostare la maggior parte dei parametri rimanga costante per quanto possibile. Questo approccio riduce le fluttuazioni statistiche. In questo caso, non si preme " iniziale fit " nuovamente. Seguono le descrizioni dei parametri citati: IRF = funzione di risposta dello strumento, BkgrDec = sfondo dal fit esponenziale, ShiftIRF = IRF shift da esponenziale reconvolution fit, BkgrIRF = IRF sfondo da esponenziale reconvolution in forma. Tutti i tre parametri sono calcolati e può essere risolto utilizzando il software per ulteriori analisi.
  7. Press " FRETŔ calcolare un FRET immagine (tracciati nell'area dell'immagine FLIM) istogramma efficienza FRET sono calcolati e viene tracciato un istogramma di distanza FRET ( Figura 4). Una volta terminata l'analisi dell'immagine, premere " risultato di salvare ".
    Nota: Durante gli esperimenti FRET, è necessario considerare che le proteine fluorescenti esibiscono reversibile transizioni tra fluorescenti (luminoso) e Stati non fluorescente (scuro). Questa caratteristica viene chiamata " lampeggiante ", e l'efficienza FRET è interessato da questo fenomeno (una spiegazione di questo effetto è stata fornita da Vogerl et al. 24).

8. FRAP analisi

  1. posto del dish sul tavolino del microscopio, trovare le cellule transfettate esprimenti la proteina fluorescente con tag di interesse ed effettuare l'acquisizione immagine usando microscopia luminosa del campo con la lampada microscopio standard (vedere Figura 2Aa-b) e modalità di microscopia di fluorescenza.
    1. Per acquisizione di immagini, utilizza il laser a luce bianca (WLL) collegato al microscopio confocale (o un laser di scelta, secondo il fluorocromo selezionato). Utilizzare le seguenti impostazioni: 512 × 512 pixel, 1000 Hz, in modalità bidirezionale, media di linea 1, zoom 8 x 12 x.
    2. Acquisire almeno 15 immagini prebleaching (al potere del laser di ~ 10%) e definire l'area di interesse (ROI) nel menu di acquisizione immagine.
  2. Per photobleaching esperimenti, utilizzare un laser ad argon (488 nm). Applicare le seguenti impostazioni: telaio 512 × 512 pixel, 1000 Hz, in modalità bidirezionale, zoom 8 x 10 x.
    Nota: Fluorocromi incluse GFP e mCherry RFP possono essere eccitati da un laser ad argon lavorando a 488 nm o 514 nm.
  3. Utilizzare il software in modalità FRAP del microscopio di scelta. Durante il photobleaching, impostare il laser di argon ' potere d' massimo utilizzando il pulsante di regolazione del laser. Effettuare l'acquisizione immagine a 0,256 intervalli di s, al potere del laser di 10%.
    Nota: Per postbleaching passaggi, utilizzare la modalità di acquisizione di immagine standard del microscopio confocale di scelta.
    1. Fluorescenza di monitor tempo di recupero dopo photobleaching (fino a 45-50 s dopo la procedura di sbiancamento).
      Nota: Come mostrato in Figura 4, il tempo di recupero dopo photobleaching per mCherry-etichetta 53BP1 è distinto alle lesioni del DNA spontanee ed indotto da irradiazione UVA i fuochi. mCherry-53BP1 alle lesioni UVA ha recuperato velocemente rispetto alle accumulazioni di mCherry-53BP1 presso spontaneamente d'avvenimento di riparazione del DNA i fuochi; vedere la Figura 4 e Foltankova et al. 25
  4. esportare i dati dal software di microscopio (o software di scelta) in un foglio di calcolo ed eseguire analisi statistiche.

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Representative Results

Usando la microscopia confocal avanzata, abbiamo osservato un accumulo di proteine 53BP1 e mCherry-PCNA mCherry-etichettate alle lesioni del DNA. Analisi sono state eseguite da microirradiation locale di cellule viventi. Per riconoscere i modelli di distribuzione nucleare delle proteine correlate a DNA-repair in fasi del ciclo cellulare individuale, abbiamo usato il sistema cellulare di Fucci, mediante il quale è possibile determinare il G1, primi S, e G2 fasi della cella ciclo (Figura 1). L'applicazione biologica del modello cellulare Fucci che abbiamo pubblicato in Suchankova et al. 26 dimostra che 53BP1 è stato reclutato per lesioni del DNA localmente indotte nelle fasi G1, S e G2 del ciclo cellulare, che è stato associato con la funzione di questa proteina durante fine non-omologo unendo (NHEJ), uno dei principali meccanismi responsabili del riparazione di rotture a doppio filamento. D'altra parte, questo sistema sperimentale ci ha mostrato il livello cellulare individuo che la proteina PCNA, che è legata alla via riparazione per ricombinazione omologa (HRR), riconosce DSBs nelle fasi di fine S e G2 del ciclo cellulare 27. Per gli studi sulle macchine di riparazione del DNA, abbiamo ottimizzato anche condizioni di irraggiamento al fine di garantire che le colture cellulari hanno continuato a subiscono la mitosi dopo l'esposizione a laser UV (Figura 3). Microirradiated cellule che subiscono la mitosi dimostrano che, in queste condizioni sperimentali, proventi di riparazione del DNA in maniera relativamente fisiologica e le cellule non sono stati feriti dai laser, che a più alta intensità inducono apoptosi. Qui, indichiamo anche come applicare analisi FRET-FLIM alla caratterizzazione delle proteine di riparazione del DNA. Questa tecnologia avanzata permette di studiare locale interazioni della proteina-proteina nel nucleo della cellula o, in alternativa, interazioni della proteina nelle regioni nucleolare come il nucleolo, lamina nucleare o cluster di eterocromatina. Per i principianti in questa tecnologia, vorremmo consigliamo di ottimizzare questa tecnica FRET-FLIM utilizzando ben noto interattori della proteina come p53 e 53BP1 (fig. 4A-C). In generale, una conoscenza dell'interazione proteina-proteina conduce alla comprensione di come i complessi della proteina regolano processi come replica, attivazione del gene, silenziamento o la riparazione del DNA. Inoltre, uno strumento molto utile per gli studi di cinetica della proteina è il metodo FRAP, che mostra le caratteristiche di diffusione locale della proteina e mobilità (Figura 4). Presi insieme, qui forniamo istruzioni metodologiche per l'applicazione di tecniche di microscopia confocale avanzata nel DNA riparazione studi.

Figure 1
Figura 1: formazione di foci di riparazione del DNA può essere studiata in cellule HeLa-Fucci che esprimono RFP-cdt1 (rosso) nelle fasi G1/inizio S e GFP-geminina (verde) nelle fasi S/G2 del ciclo cellulare. Lesioni del DNA spontaneamente d'avvenimento positive per proteina 53BP1 (blu; Alexa 405 colorazione), sono stati studiati in G1 (rosso), primi S (arancio; espressione di GFP-geminina e RFP-cdt1) e G2 (verde) fasi del ciclo cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: reclutamento di PCNA mCherry-etichetta alle lesioni del DNA nel corso del tempo. (A) cellule che esprimono mCherry-PCNA (rosso), si trovavano su un piatto di griglia microscopio in regioni selezionate (grigio). Dopo la fissazione e immunostaining, cellule irradiate (frecce gialle) sono state situate in base alle coordinate registrate (vedere la lettera grigia K come esempio) (Aa-c). La cornice gialla e frecce (annuncio) Visualizza la cella che è stata ingrandita in pannelli Ae-f e microirradiated. (B) accumulo di mCherry-PCNA (rosso) è stato studiato in cellule HeLa, che esprimono GFP-etichettato istone H2B (verde). Le cellule sono state controllate immediatamente dopo microirradiation locale per fino a 35 min (Vedi Video 1). (C) Microirradiated cellule sono state analizzate mediante microscopia confocale 3D e accumulo di proteine alle lesioni del DNA (per esempio, mCherry-53BP1) è stato trovato in tutte le tre dimensioni (x-y, - z, x e y-z), anche se solo la parte centrale del nucleo della cellula era microirradiated (vedere rotazione 3D-cell nelle proiezioni 3D Video 2 in Figura 2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: cellule microirradiated da un diodo laser 405 nm procedere normalmente durante il ciclo cellulare. (A) dopo irradiazione utilizzando un laser a diodi di 405 nm, cellule HeLa (stabilmente esprimenti GFP-istone H2B; verde) subiscono la mitosi (Vedi anche Video 2). Cornici e frecce gialle indicano irradiati ROI nelle celle selezionate. Cornici bianche Visualizza mitosi. (B) alle stesse condizioni sperimentali, mitosi in cellule irradiate inoltre è stata osservata da microscopia di lasso di tempo in cellule HeLa che esprimono GFP-H2B (verde) e transitoriamente esprimendo mCherry-PCNA (rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: analisi FLIM e FRET-FLIM di GFP-p53 e mCherry-53BP1. Fluorescenza risonanza Energy Transfer (FRET) rilevato da FLIM e applicazione di Fluorescence Recovery After Photobleaching(FRAP) alle varie lesioni del DNA. ( A-C) Media (n = 10) vite di GFP-etichettato p53 in assenza e in presenza di acceptor (mCherry-53BP1), misurata in tutta nonreplicating nuclei delle cellule HeLa. (A) curve di decadimento fluorescenza rappresentativo e residui studiato in cellule HeLa transitoriamente che esprimono GFP-p53 (solo donatore, τD) o GFP-p53 e mCherry-53BP1 (donatore-accettore, τDA). (B) media durata (τ1 - τ3) e ampiezze (A1 -3) di (un) GFP-p53 e (b) mCherry-53BP1 misurato nei nuclei delle cellule HeLa intero. Χ2 valori inoltre sono stati calcolati e sono mostrati. (C) sintesi di efficienza di apprensione per il ben noti interattori GFP-p53 e mCherry-53BP1. Scala bar = 4-5 µm. FRET-FLIM risultato visualizzando ~ 35% FRET efficienza per interazione ben noto partner GFP-etichettato p53 e 53BP1 mCherry-etichetta. (D) Cinetica di recupero di mCherry-53BP1 studiato alle lesioni del DNA spontaneamente (curva verde) e lesioni del DNA indotto UVA (curva blu). mCherry alle lesioni del DNA era sbiancato al livello dello sfondo (disperso forma di proteina di mCherry-53BP1 protein), e la fluorescenza di fondo è stato sottratto da ogni valore. DATA, mostrato come intensità di fluorescenza relativa di mCherry-53BP1, sono presentati come mezzi ± errore standard. Test t di Student ha rivelato una differenza statisticamente significativa tra i due tipi di lesioni del DNA (* Mostra p ≤ 0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1: assunzione della proteina PCNA mCherry-etichetta (fluorescenza rossa) a lesioni del DNA indotte da microirradiation locali in HeLa cellule stabilmente esprimenti GFP-etichettato dell'istone H2B (fluorescenza verde). Per favore clicca qui per scaricare questo video.

Video 2
Video 2: accumulo di proteina mCherry-etichetta 53BP1 (fluorescenza rossa) alle lesioni del DNA indotte da locale microirradiation in cellule HeLa. Il nucleo cellulare è mostrato nello spazio 3D utilizzando una modalità di software che consente la visualizzazione di rotazione delle cellule nello spazio. Per favore clicca qui per scaricare questo video.

Video 3
Video 3: Microirradiated HeLa delle cellule che esprimono GFP-etichettato istone H2B (verde fluorescenza) procedere attraverso mitosi. La regione irradiata è caratterizzata dallo svuotamento di GFP-H2B (regioni nere sono irradiati strisce all'interno dei nuclei delle cellule). Per favore clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

Tecniche di microscopia rappresentano strumenti fondamentali in laboratori di ricerca. Qui, una breve descrizione dei metodi utilizzati per lo studio del reclutamento di proteine e cinetica alle lesioni del DNA è presentato. Abbiamo notato soprattutto la nostra esperienza sperimentale nel campo della locale microirradiation di cellule viventi, e discutiamo lo studio della cinetica della proteina di interazione proteina-proteina e FRAP alle lesioni del DNA di candeggio accettore FRET28 e sua avanzata modifica FRET-FLIM (Figura 4A-D). I metodi qui illustrati sono strumenti essenziali per una vera comprensione di processi di riparazione del DNA, soprattutto la cinetica della proteina in sistemi cellulari viventi, come controllato da avanzati microscopi confocali6,7,8, 28. Questi metodi sono di immensa utilità per la medicina del futuro nel trattare con gli effetti della radioterapia su tessuti o che caratterizza la morfologia delle cellule del tumore. Per ottimizzare questo metodo, ci piacerebbe consigliamo di iniziare con ben noto interattori della proteina, come mostrato in Figura 4.

È noto che il reclutamento di proteine a lesioni del DNA è altamente dinamico e tempo-dipendente; così, l'applicazione di time-lapse microscopia confocale dopo irradiazione delle cellule è necessaria non solo nel campo della scienza di base, ma anche in cliniche26. Lesioni del DNA localmente indotte a causa di laser microirradiation9,28,29 rappresentano regioni genomiche, dove è possibile studiare il legame proteico di reclutamento, proteina-proteina o proteina-DNA e interazione. Il punto di partenza di questi metodi è che l'assunzione di proteine esogene deve essere verificata dagli anticorpi adatti a livello endogeno. Successivamente, il passaggio fondamentale di tali esperimenti è che over-transfected le cellule in grado di fornire risultati falsi-positivi; così, la decisione migliore è quello di stabilire linee cellulari che esprimono stabilmente le proteine fluorescente con tag di interesse. Inoltre, a causa degli effetti fototossici dei laser utilizzati per acquisizione di immagini, o le condizioni per la scansione devono essere ottimizzate o Trolox composto deve essere dissolto nel medium di coltura delle cellule. Inoltre l'eliminazione del passo del presensitization prima di irradiazione si consiglia. Dopo microirradiation locale, riparazione del DNA deve procedere tale che le cellule subiscono la mitosi (Figura 3A-B e Video 3). Induzione di apoptosi dopo irradiazione del laser è un processo meno prezioso dalla vista del DNA ottima riparazione23. È anche evidente che alcune proteine di riparazione del DNA riconoscano il danno del DNA solo nelle fasi di ciclo cellulare specifico (ad es., Bártová et al. 30). Pertanto, l'uso del sistema cellulare HeLa-Fucci, mostrando le cellule nelle singole fasi di interfase, è uno strumento utile per gli studi del DNA danno risposta. Inoltre, le fasi del ciclo cellulare possono essere riconosciuti secondo il modello di distribuzione nucleare della proteina PCNA31.

È noto che i metodi FRAP e FRET rappresentano strumenti molto utili per indagare le caratteristiche delle proteine che vengono reclutate per DNA lesioni7,8,32. Inoltre, la tecnica FLIM32 possono rivelare informazioni sui dinamici cambiamenti conformazionali delle proteine che si accumulano a lesioni del DNA. L'utilizzo di questo metodo è importante perché FLIM misura dinamici processi cellulari direttamente; quindi, l'intensità di fluorescenza allo steady-state è misurato nel tempo. FLIM approcci aumento del contrasto dell'immagine eliminando la fluorescenza di fondo. Questo è un vantaggio di misura FRET-FLIM rispetto ai convenzionali candeggio accettore FRET. Le durate di fluorescenza misurate di FLIM fornire informazioni circa le frazioni di proteine fluorescente e mostrare come eterogenico sonde sono dovuti a condizioni ambientali. FLIM è anche il migliore e più affidabile approccio biofisico all'esecuzione FRET per interazione proteina-proteina in vita cellule32,33.

Presi insieme, tutti i metodi descritti hanno il potenziale per rivelare nuovi meccanismi di risposta al danno del DNA in cellule umane, che è importante soprattutto per approcci radioterapeutici. Ad esempio, FLIM multifotonica è stato applicato per ottenere immagini ad alta risoluzione in medicina, dove si chiama tomografia multifotonica34. Questo metodo altamente sofisticato al microscopio può essere applicato nelle cliniche per la diagnosi di cancro utilizzando campioni di istochimici e analizzato con alta risoluzione. Metodi FLIM possono inoltre fornire una precisa analisi delle superfici delle cellule del tumore secondo loro autofluorescenza. Uno svantaggio del metodo di FLIM-FRET è lo sfondo di un software altamente sofisticato, che deve essere pienamente compreso da parte dell'operatore di microscopio. Ulteriore rilevanza biologica dei dati FLIM, in generale e nei processi di riparazione del DNA, sarà certamente rivelato nel prossimo futuro.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non esistono senza conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dall'Agenzia della Repubblica Ceca, progetto P302-12-G157 Grant. Esperimenti sono stati supportati anche dalla CZ09 di programma di ricerca ceco-norvegese, che è sorvegliato da fondi norvegesi e dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e Sport della Repubblica Ceca (concessione numero: 7F14369).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell cultivation
HeLa ATCC CCL-2TM
ES-D3 [D3] ATCC CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM PAN-Biotech P03-0710
DMEM high glucose Sigma-Aldrich D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SV30180.03
ES Cell FBS Gibco 16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) Merck Millipore ESG1107
MTG (1-Thioglycerol) Sigma-Aldrich M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution Biosera XC-A4122/100
Trypsin - EDTA Biosera XC-T1717/100 dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes Sigma-Aldrich P7866 cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 Ibidi GmbH 81166 microscopic dish
0.2% Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G dilute in destille water and autoclaved
Name Company Catalog Number Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid Addgene 12091
mCherry-PCNA plasmid generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid Addgene 19835
Metafecetene Biontex Laboratories GmbH T020–2.0
10 × PBS Thermo Fisher Scientific AM9625 for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine Sigma-Aldrich 11296736001
Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
White-light laser Leica Microsystems
355-nm laser Coherent Inc. laser power 80 mW
405-nm laser Leica Microsystems laser power 50 mW
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip VWR International Ltd 631-1580
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943 1 LT
Triton X100 MP Biomedicals 2194854
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A2153
53BP1 Abcam ab21083 primary antibody
AlexaFluore 647 Thermo Fisher Scientific A27040 secondary antibody
Vectashield Vector Laboratories Ltd H-1000 mounting medium

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References

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