Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Prévost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (130), e56086, doi:10.3791/56086 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De hervorming van het celmembraan is een integraal onderdeel van vele cellulaire fenomenen, zoals endocytose, mensenhandel, de vorming van filopodia, enz. Veel verschillende eiwitten associëren met een gebogen membraan omwille van hun vermogen om zin of induceren membraan kromming. Deze processen zijn gewoonlijk een veelheid aan eiwitten waardoor ze te ingewikkeld om te studeren kwantitatief in de cel. We beschrijven een protocol om te reconstrueren een gebogen membraan in vitro, het nabootsen van een gebogen cellulaire structuur, zoals de endocytotische nek. Een gigantische unilamellar blaasje (GUV) wordt gebruikt als een model van een celmembraan, waarvan de interne druk en oppervlaktespanning worden geregeld met micropipet streven. Een punt trekken kracht toe te passen op de GUV met optisch pincet creëert een nanobuis hoge kromtestraal verbonden met een platte membraan. Deze methode heeft van oudsher gebruikt voor het meten van de fundamentele mechanische eigenschappen van lipide membranen, zoals het buigen van stijfheid. In de afgelopen jaren heeft het uitgebreid bestuderen hoe eiwitten interactie met membraan kromming en de manier waarop zij invloed op de vorm en de mechanica van membranen. Een combinatie van micromanipulation, microinjection, optisch pincet en confocale microscopie systeem maakt meting van membraan kromming, membraan spanning, en de oppervlakte dichtheid van eiwitten, gelijktijdig. Uit deze metingen, kunnen vele belangrijke mechanische en morfologische eigenschappen van de eiwit-membraan systeem worden afgeleid. Bovendien, lay we-out een protocol voor het maken van GUVs in aanwezigheid van fysiologische zoute concentratie en een methode voor de kwantificering van de oppervlakte dichtheid van eiwitten op het membraan van de intensiteit van de fluorescentie van gelabelde proteïnen en lipiden.

Introduction

Veel cellulaire processen, zoals endocytose, mensenhandel, de vorming van filopodia, infectie, enz., worden begeleid door een dramatische verandering in de vorm van celmembranen1,2. In de cel deelnemen een aantal eiwitten aan deze processen door te binden aan het membraan en veranderen hun vorm. De opmerkelijkste voorbeelden behoren tot de familie van de Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) eiwit, met een karakteristiek intrinsiek gebogen BAR domein3,4,5,6,7. Typisch, ze interageren met het membraan door het domein van de BAR aan de oppervlakte en, in veel gevallen ook ondiep invoegen amphipathic helices in de dubbelgelaagde vast te houden. De vorm, grootte en kosten van het domein van de BAR samen met het aantal amphipathic helices bepaalt: (1) de richting van membraan kromming (d.w.z., of zij zal induceren invaginations of uitsteeksels), en (2) de omvang van het membraan kromming5,8. Van de nota, is hier positieve kromming gedefinieerd als de convexe kant van het gebogen membraan, dat wil zeggen, de Ardennen richting de interagerende deeltjes, en negatieve anders. Bovendien, kwantitatieve studies van BAR eiwitten bleek dat hun effect op het membraan hangt af van een aantal fysieke parameters: dichtheid van eiwitten, membraan spanning en membraan vorm (platte versus buisvormige versus sferisch oppervlak vorm)7. Afhankelijk van deze parameters BAR eiwitten kan: (1) fungeren als sensoren van membraan kromming, (2) buigen membranen of (3) induceren membraan splitsing7.

Vanwege het enorme aantal onderdelen die betrokken zijn bij het membraan omvormen in de cel, het bestuderen van de kwantitatieve aspecten van de verschijnselen, zoals endocytose, is in vivo zeer uitdagend. In vitro reconstitutie van minimale onderdelen nabootsen van gebogen membranen in de cel de mogelijkheid biedt een mechanistische begrip van hoe membraan-gebogen eiwitten werken te krijgen. Dit artikel beschrijft een protocol om te reconstrueren een membraan nanobuis in vitro met micromanipulation, confocal microscopie en optisch pincet. De aanpak kan worden gebruikt om te studeren, op een kwantitatieve manier, eiwitten, lipiden, of kleine moleculen interactie met een gebogen membraan. Lipide-GUVs worden gebruikt als model van een celmembraan, waarvan de kromming te verwaarlozen in vergelijking met de grootte van interagerende membraan-gebogen moleculen is. Ze zijn bereid met behulp van de electroformation methode9 waarin de blaasjes worden gevormd door een lipide-film hydraterende en zwelling het in GUVs onder een wisselstroom (AC)10. Meest voorkomende ondergronden waarop GUVs worden geteeld zijn beide semi-geleidend platen bedekt met indium tin oxide (ITO) of platina draden (Pt-draden)11. In dit werk worden GUVs gekweekt op Pt-draden zoals deze methode gebleken te werken veel beter dan het alternatief bij het maken van GUVs in aanwezigheid van zouten in de buffer12. Hoewel het electroformation-protocol hier in voldoende detail beschreven wordt te reproduceren, verwijzen we de lezer naar eerdere artikelen waarin vergelijkbare en andere methoden van het maken van GUVs zijn beschreven in detail13,14. In onze handen, heeft electroformation op Pt-draden met succes opgeleverd GUVs uit een mix van synthetische lipiden of uit natuurlijke lipide extracten in een buffer met ~ 100 mM NaCl. Bovendien was het ook mogelijk om in te kapselen eiwitten binnen GUVs tijdens groei. Een kamer van de electroformation in het volgende voorbeeld wordt getoond in figuur 1A; het bestaat uit twee ~ 10-cm lange Pt-draden ingevoegd in een houder gemaakt van polytetrafluorethyleen (PTFE) dat kan worden verzegeld aan beide zijden met glas coverslips ~ 1-2 cm uit elkaar (figuur 1A).

Figure 1
Figuur 1: experimentele opzet. (A) de GUV-electroformation kamer met elektrische aansluitingen op Pt-draden aangesloten. (B)-links: de experimenteel systeem tonen de Microscoop, de experimentele kamer boven de doelstelling en twee micropipetten (links en rechts) aan de micromanipulators en ingevoegd in de experimentele zaal voor buis trekken en eiwit injectie. Rechts: een vergrote weergave van de experimentele kamer gemonteerd boven de doelstelling met de toppen van de ambitie en de injectie micropipetten ingevoegd. (C) A injectiespuit voorzien van een dunne dispenser ingevoegd in een micropipet op de back-end. De onderkant is een vergrote weergave van de dispenser binnen de micropipet met de blauwe stippellijn overzichten van de micropipet. Dit systeem wordt gebruikt voor het vullen van de micropipet met caseïne om te passivate het glasoppervlak en ook om opvulling met minerale olie wanneer nodig. (D) een systeem gebruikt om µL hoeveelheden van de eiwit-oplossing gecombineerd. De naald is verbonden aan een injectiespuit en slang die is aangesloten op de micropipet van de injectie. De micropipet tip is zorgvuldig ondergedompeld in de eiwit-oplossing en aanzuiging dus om te vullen de micropipet tip. De micropipet is vervolgens weer gevuld met minerale olie met behulp van het systeem dat is afgebeeld in deelvenster C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Een membraan nanobuis, variërend in straal van 7 nm tot enkele honderden nm, bij een GUV kan worden opgevraagd door een externe kracht. Deze methode was in eerste instantie bedoeld voor het meten van de elastische eigenschappen van celmembranen en blaasjes, zoals de buigende stijfheid15,16. In de meest recente producties, werd de methode uitgebreid bestuderen de interactie van eiwitten met een gebogen membraan door de eiwitten in de buurt van de getrokken nanobuis7,17microinjecting. Andere methoden zijn ontwikkeld voor het bestuderen van de membraan-gebogen eiwitten. In één methode, worden eiwitten geïncubeerd met verschillend formaat liposomen vastgebonden aan een speciaal oppervlak. Confocale microscopie wordt gebruikt voor het meten van de binding aan eiwitten als een functie van liposoom diameter, die kromming-geïnduceerde sorteren18,19kunt aangeven. Een andere methode, worden eiwitten geïnjecteerd in de buurt van een micro-aanzuiging GUV voor het meten van hun vermogen om spontaan induceren tubuli20,21. De in dit protocol beschreven methode is uniek geschikt om te studeren membraan-gebogen eiwitten die betrokken zijn in endocytose, waar de meeste eiwitten meestal tegenkomen voorgevormde membraan nanotubes aansluiten van de lading-bevattende membraan-invagination met de onderliggende platte plasma membraan. Bovendien, in deze methode, in tegenstelling tot in de test met vastgebonden kleine liposomen, het membraan nanobuis is voortdurend in verbinding staan op het membraan; Daarom is het in mechanisch evenwicht met de GUV, een situatie verwacht in vivo. Vandaar, fundamentele membraan Natuurkunde geldt en we kunnen een overvloed aan mechanische eigenschappen afleiden uit onze metingen22,23,24.

Voor een volledige implementatie van deze methode omvat de benodigde apparatuur een confocal microscoop, optisch pincet en één of twee micropipetten, aangesloten op een waterreservoir (figuur 1B). Door de combinatie van alle drie, kan men meten membraan spanning, membraan kromming, oppervlakte dichtheid van eiwitten en tegelijkertijd tube kracht25. Micropipet aspiratie is essentieel en het gemakkelijk is gebouwd door het invoegen van een glazen micropipet in een houder die is aangesloten op een waterreservoir, dat via de hydrostatische druk, de aspiratie druk26 controleert. De micropipet en de houder worden gecontroleerd door een micromanipulator en, idealiter in één richting door een piezo-actuator voor precisie beweging. Te trekken een nanobuis, de GUV is kort vast aan een micron-en kleinbedrijf kraal vervolgens trok weg het creëren van een nanobuis microaspirated. In deze uitvoering, wordt de parel gehouden door optisch pincet, die kan worden geconstrueerd door het volgen van een gepubliceerde protocol27. Het is mogelijk af te zien van de optisch pincet en pull nanotubes op verschillende manieren, hoewel ten koste van nauwkeurige kracht metingen. Als het is ook uitdagend om te bouwen van een optische trap of als kracht metingen zijn niet onontbeerlijk, zoals men wil gewoon om te controleren de voorkeur van eiwitten voor gebogen membranen, een buis kan worden getrokken met behulp van een kraal aanzuiging op het puntje van een tweede micropipet28. Het is ook mogelijk voor het trekken van buizen met behulp van de zwaartekracht29 of30,31te stromen. Bovendien is confocale microscopie niet noodzakelijk echter bij voorkeur wordt dus voor het meten van de oppervlakte dichtheid van eiwitten. Het maakt het ook mogelijk de nanobuis straal van intensiteit van de fluorescentie van lipiden in de buis, dus onafhankelijk van de membraan kracht en spanning te meten. Afgeleid van buis straal van fluorescentie is vooral belangrijk als de relatie tussen deze hoeveelheden van de gevestigde vergelijkingen als gevolg van de aanwezigheid van eiwitten membraan-nageleefd25 afwijkt. Nog belangrijker is, kan niet een afzien van zowel de optische val en confocale microscopie, zoals het zal niet mogelijk zijn om te meten de kromming van de buis.

De methode zoals beschreven in dit protocol is gebruikt voor het bestuderen van de kromming-geïnduceerde sorteren van verschillende perifere membraaneiwitten op nanobuisjes, vooral degenen uit de BAR familie25,32,33,34 . Het was ook te zien dat het kanaal van de conically gevormde transmembraan kalium dat kvap wordt verrijkt op gebogen nanotubes op dezelfde manier als BAR eiwitten35. Door het optimaliseren van de methode voor het inkapselen van eiwitten binnen GUVs, is de interactie van eiwitten met negatieve kromming onlangs onderzocht als goed36. Bovendien, deze methode is gebruikt te verhelderen van de vorming van eiwitten steigers25,37 en te bestuderen van het mechanisme van membraan splitsing door ofwel lijn spanning38, eiwit dynamin39, of door BAR eiwitten40,41. Naast eiwitten, kunnen kleine moleculen of ionen ook veroorzaken kromming. Met deze methode werden calciumionen getoond voor het opwekken van positieve kromming onder voorwaarden zoutloos42. Interessant, is het ook aangetoond dat lipiden kromming sorteren, hoewel alleen voor composities die in de buurt van een demixing punt43,44 zijnkunnen ondergaan. Kortom, de methode kan worden gebruikt door onderzoekers kochten onderzoeken hoe beide integraal membraan componenten (bv, lipiden of transmembraan eiwitten) of ook bindende moleculen (hetzij binnen of buiten GUVs) ermee cilindrische gebogen membranen, uit oogpunt van mechanische en kwantitatieve. Het is ook bedoeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het meten van de mechanische eigenschappen van het membraan zich22,23,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van GUVs door Electroformation op Pt-draden

  1. Schoonmaken van de kamer van electroformation (Zie Inleiding en figuur 1A) en de Pt-draden met een organische oplosmiddelen zoals ethanol of aceton om weg te wassen de lipiden en met water weg te wassen de zouten.
    Opmerking: We raden grondig veegde weg het residu met ethanol doordrenkte weefsel dan sonicating in aceton, ethanol, dan water, elk gedurende 5 minuten.
  2. Bereiden een lipide mix van een gewenste lipide compositie bij 1 mg/mL in chloroform. De mix moet bevatten ~ 0.05% molaire fractie van een lipide geconjugeerd met biotine (bijvoorbeeld, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) en ~ 0,5% molaire fractie van een lipide geconjugeerd met een fluorophore () b.v.BODIPY-TR-C5-ceramide).
    Opmerking: In onze ervaring, het was moeilijk om GUVs te produceren op een hoge opbrengst met meer dan 30 gewichtspercenten lipiden in rekening gebracht.
    Let op: Chloroform moet worden behandeld binnen een chemische kap geschikte handschoenen dragen.
  3. Plaats een paar Pt-draden in de electroformation-zaal. Storten van de lipide-mix op de Pt-draden in druppels gescheiden door ~ 2-3 mm (totale ~ 4 µL van het mengsel).
  4. Droog de draden onder drukvermindering voor 30-60 min bij kamertemperatuur.
  5. Het zegel van de bodem van de kamer door het dekglaasje aan over de kamer met behulp van silicium vet vast te houden. Vul de zaal met een gebufferde oplossing met NaCl, sacharose, en een buffer agent (b.v., 70 mM NaCl, sacharose van 100 mM en 10 mM Tris, met een pH van 7,4). Dit medium zal worden binnen de GUVs in het experiment. Het is essentieel dat de osmolariteit van dit medium overeenkomen met de osmolariteit van het experimentele medium binnen ~ 10%. Gebruik sacharose te passen de osmolariteit. Eiwitten aan de oplossing bij een gewenste concentratie toevoegen als het doel is om in te kapselen hen in de GUVs.
    Let op: Verschillende zouten en suikers in de buffer kunnen beïnvloeden de buigende starheid en de spontane kromming van membranen24,42,46,47.
  6. Het zegel van de bovenkant van de kamer door een dekglaasje aan vast te houden met siliconen vet zorgen voor minimale lucht in de kamer. Toepassing van een sinus AC-stroom door de Pt-draden op 500 Hz en 280 mV.
    Opmerking: De groei tijd- en temperatuurdisplays moeten worden geoptimaliseerd afhankelijk van de samenstelling van lipide en de gevoeligheid van het eiwit. Bij het gebruik van natuurlijke lipide extracten, en ook wanneer het inkapselen van eiwitten in de GUVs, de beste opbrengst werd bereikt door de groeiende GUVs bij 4 ° C's nachts. In de afwezigheid van proteïnen, en voor synthetische lipide composities, groei bij kamertemperatuur voor ~ 2 h was voldoende.

2. voorbereiding van de experimentele zaal en de micropipetten

  1. Trek om te bereiden micropipetten, een glazen viscometerbuizen met behulp van een pipet trekker. Er is voorgesteld om het gebruik van een glazen viscometerbuizen met interne en externe stralen van, respectievelijk, 0.7 mm en 1 mm. Vervolgens, verfijnen van het topje van de micropipet, zodat de inwendige diameter 5-is 7 µm, met behulp van een microforge. Als eiwitten of andere moleculen zullen worden ingespoten in het experiment, trek een andere micropipet en verfijnen van de tip om een inwendige diameter van 8-15 µm.
  2. Bouw van een experimentele kamer door het plaatsen van twee rechthoekige microscopie coverslips op een metalen basis zoals aangegeven in Figuur 1. De coverslips moeten worden gescheiden door ~ 1 mm. De kamer moeten openingen langs de lange randen (Zie Figuur 1). De open zijkanten moeten passen het topje van de micropipet waar het uiteinde moet bereiken ten minste het midden van de kamer.
  3. De experimentele buffer wier osmolariteit moet niet van elkaar verschillen door meer dan 10% van de buffer die wordt gebruikt om te groeien van GUVs voor te bereiden. Aanpassen van de osmolariteit met glucose. Een voorbeeld van een experimentele buffer die werd gebruikt bij het bestuderen van de interactie van endophilin met nanobuisjes is 100 mM NaCl, 40 mM glucose, met Tris is gebufferd op een pH van 7,4. Een combinatie van sacharose binnen / glucose buiten zorgt voor: (a) voldoende fase contrast met het observeren van GUVs met heldere veld microscopie, en (b) hogere dichtheid binnen de GUVs waardoor ze te vestigen op de bodem van de kamer. Aanpassen van zoute concentratie, gebaseerd op experimentele eis.
    Opmerking: Naast het beïnvloeden van de mechanische eigenschappen van het membraan, in onze ervaring, hoge glucose concentratie (> 300 mM) negatieve gevolgen voor de oprichting van streptavidine-Biotine obligaties, vereist voor het trekken van een nanobuis. Daarnaast te weinig zout remt streptavidine-Biotine obligaties, terwijl te hoog van een concentratie schermen eiwit-membraan interacties. In het geval van eiwit inkapseling, met behulp van zeer hoge zoutconcentratie in de externe buffer (b.v.> 200 mM NaCl) kan worden gebruikt als een truc om het loskoppelen van de eiwitten uit de buitenste leaflet36. Het is noodzakelijk om te experimenteren met een aantal zoute concentratie te vinden van de optimale bindende voorwaarden voor de molecule van belang.
  4. 30 tot 60 min vóór het verzamelen van GUVs voor het experiment, passivate de glazen oppervlakken door zowel de experimentele zaal en de aspiratie micropipet vullen met een oplossing van 5 mg/mL van een zeer zuivere β-caseïne (b.v., opgelost in de experimentele buffer). Β-caseïne wordt gemaakt van een beschermende laag op de glazen oppervlakken, voorkomen van de GUVs te onderschrijven ook sterk, die ze veroorzaken zou te barsten. Incubeer met β-caseïne voor 30-60 min.
    Opmerking: Er mag geen luchtbellen binnen het micropipet dat interfereren zou met membraan spanning beheersen.
    1. Om te bouwen een dispenser voor het vullen van micropipetten, het breken van een naald van de spuit dicht bij de plastic connector en lijm erin een capillair dunne silica (zoals die worden gebruikt voor vloeibare chromatografie) (Figuur 1 c).
  5. Tijdens de incubatie met β-caseïne, monteren van de kamer op de Microscoop en centreren boven de doelstelling. Breng de tip van de aspiratie-micropipet via de opening langs de lange zijde en breng de tip hierboven de Microscoop doelstelling. Het water tank niveau zodanig aanpassen dat de aspiratie druk in de buurt van nul is (er moet geen zware stroom in of uit de pipet, die kan worden gezien onder de Microscoop).
  6. In het geval dat de eiwitten of andere moleculen zullen tijdens het experiment worden ingespoten, vullen de micropipet van de injectie met het gewenste molecuul ontbonden in de experimentele buffer bij een concentratie van keuze, mount de micropipet binnen een micromanipulator, en invoegen via de andere kant van de experimentele kamer.
    1. Voor het gebruik van een minimale hoeveelheid eiwitten, Vul slechts het topje van de micropipet met het eiwit door aspiratie. Wikkel om dat te doen, het einde van een naald op een injectiespuit met kunststof slang aangesloten. Plaats de buis in de achterkant van de injectie micropipet.
    2. Zeer zorgvuldig onderdompelen van het topje van de micropipet in de eiwit-oplossing en gecombineerd om te vullen het topje van de micropipet.
      Opmerking: Deze eenvoudige setup wordt weergegeven in Figuur 1 d en in onze ervaring, hierdoor zuigen uit zo weinig als een paar µL van de eiwit-oplossing.
    3. Aanvulling funderingsput de rest van de micropipet van de injectie met minerale olie ter voorkoming van de vermenging van de eiwit-oplossing en het water uit het waterreservoir (met behulp van de instellingen in Figuur 1 c).
    4. Wees voorzichtig niet te introduceren van luchtbellen in de injectie Pipet, zoals het unstable injectie onder druk induceren zal. Als alternatief, als de hoeveelheid eiwit voldoende is, vul de micropipet met de eiwitten net als vulling met β-caseïne zoals beschreven in stap 2.4. Pas het niveau van de tank water om te minimaliseren van de druk van de aspiratie in de pipet injectie.
      Opmerking: De concentratie van de geïnjecteerde molecuul of het ion in de buurt van de nanobuis is gonna be lager als gevolg van verdunning en kan worden geschat door het meten van de daling van de intensiteit van de fluorescentie als een functie van de afstand van de pipet afslag42. Het is echter belangrijker te weten de dubbelgelaagde-gebonden dichtheid van de geïnjecteerde molecule, die kan precies worden gemeten (zie punt 4).
  7. Na incubatie met β-caseïne, verwijder de oplossing uit de zaal en spoel met de experimentele buffer meerdere malen. Vul met de experimentele buffer.
  8. Stop electroformation van GUVs en verzamelen ze direct van de Pt-draden. Voeg een paar µL van de GUV-oplossing aan de experimentele kamer. Gebruik alleen vers bereide GUVs.
  9. Voeg een paar µL van daar beklede parels aan de experimentele kamer om een eindconcentratie van parels in de kamer op rond 0.1 x 10−3% (m/v) of minder. Polystyreen kralen ~ 3 µm in diameter worden aanbevolen (polystyreen kralen in water hebben een in de buurt van-optimale brekingsindex contrast met betrekking tot het maximaliseren van de kleurovergang kracht met betrekking tot de kracht van de verstrooiing in de optische val). De kraal concentratie kan worden aangepast op basis van het experiment: een zeer lage concentratie maakt het moeilijk om ze te vinden in de zaal, en een te hoge concentratie loopt het risico van meerdere kralen vallen van de optisch pincet.

3. het trekken van een nanobuis membraan van een GUV

  1. Laat de GUVs en de kralen regelen naar de bodem van de kamer. De GUVs door een beetje te laten leeglopen van de experimentele buffer verdampen, voor ongeveer ~ 15 min. deflatie van de GUVs is van essentieel belang om te produceren wat overtollige gebied dat kan worden aanzuiging met de micropipet. GUVs zichtbaar moet golven (d.w.z., verschijnen plomp) onder de lichte Microscoop. Als ze gespannen wordt weergegeven, zodat meer tijd van de verdamping.
    Opmerking: De snelheid van het wijzigen van de osmolariteit hangt het verdampende oppervlak, de temperatuur, etc., en moet nauwlettend worden gevolgd. In principe de osmolariteit verschil kon worden ingesteld vanaf de start door de concentratie van sacharose/glucose passen, echter moet oppassen niet voor het opwekken van een osmotische schok.
  2. Vind een floppy GUV en het gecombineerd in de pipet. De lengte van de aspiratie tong (het gedeelte van het membraan binnen de pipet) moet gelijk zijn aan of groter is dan de straal van de pipet voor de theoretische analyse als toepassing15,16,22,23 ( Figuur 2). Probeer verschillende GUVs. Als geen van de GUVs kan worden aanzuiging te produceren een lang genoeg tong, wacht een paar minuten. Als GUVs plomp genoeg zijn, gaat u verder met de volgende stap.
  3. Het zegel van de zaal met minerale olie, om te voorkomen dat verdere verdamping van de buffer. Doen door zorgvuldig pipetteren de olie langs de open randen van de experimentele kamer.
  4. Als u wilt instellen van de nulpositie van de aspiratie druk, eerst zoekt een kraal in de zaal en plaats de aspiratie Pipetteer afslag in de buurt van de parel. De hoogte van het waterreservoir zodanig aanpassen dat de parel is noch aangezogen en weggeblazen door de aspiratie pipet. Hoewel de minerale olie verdamping en daarom verdere wijzigingen van de druk binnen de zaal voorkomt, nul de aspiratie druk vóór elke GUV meten.
  5. Vind een GUV en het gecombineerd. Verplaats de micropipet omhoog en onscherp (te houden de GUV uit de buurt van het oppervlak waar het zou kunnen worden getrokken uit de pipet door shear stress wanneer de kamer wordt verplaatst).
  6. Zoekt u een kraal door zorgvuldig te verplaatsen naar de kamer. Plotselinge bewegingen kunnen de GUV uitwerpen. Vangen met optisch pincet op afstand ~ 20 µm weg van de onderkant van de kamer. Ervoor zorgen dat de regio van belang schoon met geen andere kralen of membranen in zicht is. Om het even wat die vallen in het optisch pincet dan de parel zal de meting verstoren.
  7. Terug te brengen de GUV in focus, en uit de buurt van de kraal met de micropipet die zijn afgestemd op de optische val (Figuur 2).
  8. Het opnemen van het verkeer van de kraal voor 1-2 min voor het meten van de positie van de evenwicht (vereist voor kracht metingen).
  9. Verminder de druk binnen de micropipet zoveel mogelijk zonder verlies van de GUV zo te verminderen van de spanning van het membraan. Zorgvuldig Breng de GUV in contact met de kraal voor rond een seconde, tot vaststelling van streptavidine-Biotine obligaties, dan zachtjes trekken terug maken een nanobuis. De motie van de GUV richting van of weg van de parel moet idealiter moet gebeuren met een piëzo-bedieningssleutel minimaal verstoren de parel in het optisch pincet.
    Opmerking: Als de nanobuis geen vormt, dit kan worden veroorzaakt door slechte daar coating van de kraal, onvoldoende hoeveelheid biotinyleerd lipiden in de GUV, onvoldoende concentratie van zout of buitensporige concentratie van glucose in de experimentele buffer, of het membraan spanning in de GUV is te hoog48.
  10. De druk van de aspiratie om opnieuw de aspiratie tong te vergroten. Hiermee lijnt u de buis te liggen in de as van de aspiratie pipet en maximaal de focus op de buis (Figuur 2).
  11. Ervoor zorgen dat de evenaar GUV en de buis in focus. Opnemen van het verkeer van de kraal met heldere veld microscopie gedurende een paar minuten (hier, de camera acquisitie snelheid is 30 Hz). Record de hoogte h, van de watertank met betrekking tot de nulpositie. Neem een paar confocal beelden van het systeem (Figuur 2).
  12. Herhaal de vorige stap bij verschillende aspiratie druk, impliciet membraan spanningen. Typische spanning bereik is 0,015 – 0,2 mN/m, met een stap grootte van circa 0,02 mN/m.
  13. Als het injecteren van proteïnen of moleculen in de buurt van het systeem, brengen de injectie micropipet in de buurt van de nanobuis, ervoor te zorgen dat de parel in de optische val niet wordt verstoord. Zachtjes injecteren bij een druk van rond 1 – 2 Pa.
  14. Nadat de binding aan eiwitten heeft geëquilibreerd (de intensiteit van de fluorescentie van het geïnjecteerde eiwit op de membraan blijft ongewijzigd op de GUV), herhaalt u de stapsgewijze metingen zoals met de blote membraan (stappen 3.11 en 3.12).
    Opmerking: Omdat de metingen worden verricht terwijl het injecteren van eiwitten in de buurt van de GUV bij constante druk, de concentratie van de bulk van het eiwit blijft ongeveer in de buurt van de GUV; aldus, moet eiwit desorptie zijn te verwaarlozen tijdens de meting.
    1. Anderzijds kan het broeden van de GUVs samen met de eiwitten voor het uitvoeren van experimenten om ervoor te zorgen een constante bulk eiwitconcentratie buis-pulling. Gezien het feit dat de Fractie van de relatieve membraan van eiwitten op de buis en op de GUV is gemeten, de manier waarop eiwitten zijn geleverd heeft geen invloed op de berekening van kromming-sorteren (zie punt 4).

Figure 2
Figuur 2: buis-pulling experiment. (A) schema van het experiment. (B) een confocal afbeelding van een getrokken buis zoals beschreven in dit Protocol. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

4. metingen en Data-analyse

  1. Membraan spanning meten
    1. De hydrostatische druk voor elke stap bij constante aspiratie druk berekenen:
      ΔP = pgh
      waar p is de dichtheid van het water, de valversnelling g en h de hoogte van de waterreservoir uit stap 3.11.
    2. Meten van de confocal beelden, de straal van de GUV, rGUV, en de straal van de aspiratie Pipet, rpip (Figuur 2).
    3. Bereken de spanning van de membraan, σ, met behulp van Laplace vergelijking49:
      Equation 1
  2. Meten van de kracht van het membraan
    1. De stijfheid van de optisch pincet, k, bepalen met behulp van een van verschillende kalibratie methoden27. In deze opstelling meten k met behulp van de methode viskeuze slepen27.
    2. Berekenen van de positie van het evenwicht van de kraal, een0, als een gemiddelde van een meting vóór het trekken van de buis (stap 3.8).
    3. Voor elke constante spanning meten, berekenen de evenwicht membraan force, F, van de wet van Hooke:
      F = k(een - een0)
      waar een is de gemiddelde positie van de parel tijdens die meting.
  3. Meten buis straal
    1. In het geval van een kale membraan (geen extra membraan-gebogen moleculen), berekent u de buis straal R, van de kracht als:
      R = F/(4πσ)
      (verwijst naar22,23).
    2. Voor het meten van de straal van de buis in de aanwezigheid van membraan-gebogen moleculen en onafhankelijk van stap 4.3.1, ten eerste record de lipide fluorescentie intensiteit langs de buislengte, ikBad, en langs de GUV contour, ikGUV. Meet de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van een fluorophore in of gebonden aan het membraan als een gemiddelde intensiteit langs de helderste lijn van een buis of een GUV contour. Selecteer een rechthoekige doos met een horizontale sectie van de GUV contour of de buis en berekenen van de som van de intensiteit van de fluorescentie van elke horizontale lijn in het vak.
      1. Deelt u elk bedrag door het aantal pixels van de horizontale lijn (dat wil zeggen, de breedte van de doos). Merk op dat in het geselecteerde vak, moet er geen andere membranen aanwezig. De fluorescentie intensiteit profiel langs de lengte van het geselecteerde vak wordt verkregen.
      2. Na het aftrekken van de intensiteit van de achtergrond, neemt de intensiteit van de fluorescentie gemiddelde pixel van de helderste lijn. De straal van de buis is lineair gerelateerd aan de verhouding van de fluorescentie langs de omtrek van de buis en de GUV als:
        R = KBadikBad/ikGUV
        waar KBad is een kalibratie factor25.
        Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van de straal van de buis in het 10-80 nm-bereik (tijdens de buis smal genoeg om te liegen binnen één confocal voxel breedte is) en met een iets grotere onzekerheid in de 80 nm en een hoger bereik. De gevoeligheid van de meting is afhankelijk van de instelling.
    3. Ktub bepalen door onafhankelijke RADIUS-metingen uit te voeren in stappen 4.3.1 en 4.3.2 over de samenstelling van een eenvoudige membraan met behulp van ongeladen lipiden. Dergelijke eenvoudige membraan samenstelling zorgt ervoor dat de straal en de kracht de enkelvoudige relatie gegeven in stap 4.3.1 hebben. Herhaal het experiment meerdere malen en plot R, afgeleid van de kracht (stap 4.3.1) versus ikBad/ikGUV (stap 4.3.2). Bereken KBad van de pasvorm. In deze opstelling, KBad = 200 ± 50 nm met behulp van eiceldonatie L-α-dunlaag (PC-ei) membraan en een fluorescerende lipide waarvan fluorescentie minimaal afhankelijk van polarisatie25.
      Opmerking: K-tub moet worden gemeten voor verschillende doelstellingen, als gevolg van hun verschillende confocal voxel-volumes. Het lipide-fluorophore moet niet communiceren met de ingespoten proteïnen/molecules. De fluorescerende lipide aanbevolen hier, BODIPY TR ceramide, niet naar verwachting hebben alle interacties met de eiwitten. Deze veronderstelling werd bevestigd met eerdere studies van BAR en -BAR domeinen25,36,,37, die hebben aangetoond dat bij een eiwitrijk oppervlakte dekking, de straal van de buis wordt bevestigd door de eiwitten, ongeacht de spanning in de GUV. Als eiwitten interactie met de lipide-fluorophore, zal een uitputting of de verrijking van de fluorophore worden waargenomen in de buis op gevarieerde hoge oppervlakte eiwitfracties.
  4. Het meten van de oppervlakte dichtheid van eiwitten
    1. Bereiden van lipide mixen met behulp van een eenvoudige ongeladen lipide (b.v., ei-PC) aangevuld met ongeveer vijf verschillende mol fracties van een fluorescerende lipide (van dezelfde golflengte als de kleurstof gebruikt voor het label van het eiwit, b.v. BODIPY-FLC5-hexadecanoyl-phosphatidylcholine (HPC *) voor bv, het Alexa488-label eiwit) in het bereik: XHPC * = 0,01 – 1%. GUVs in bereiden 100 mM sacharose door electroformation op ITO platen (Volg stap 1 van een eerdere publicatie13).
    2. GUVs verzamelen en overbrengen naar een experimentele kamer gepassiveerd met β-caseïne. Gebruik bijvoorbeeld100 mM glucose voor de experimentele oplossing. Wacht een paar minuten voor de GUVs te regelen.
    3. Confocale fluorescentie beelden van GUVs nemen en record de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde langs de GUV contouren als een functie van de molaire fractie van de fluorescerende lipide (zie stap 4.3.2). Voor elke samenstelling, het berekenen van de dichtheid van het gebied van de fluorescerende lipide, φHPC*. Bijvoorbeeld door de veronderstelling dat de oppervlakte per lipide is 0.7 nm2, φHPC* 1,43 x 10 =6 XHPC * per folder. Uitzetten van HPC * intensiteit van de fluorescentie in de GUV, ikHPC *, GUV, versus φHPC*. Pasvorm geeft de kalibratie constant, A, gegeven door φHPC* = AIHPC *, GUV. A is afhankelijk van de instellingen van de microscopie, zoals de macht van de laser en de gevoeligheid van de detector (dwz, winst), dus A opnemen voor diverse veelgebruikte microscopie instellingen (zie voorbeeld in Figuur 3).
    4. Bereiden van verschillende oplossingen van HPC * opgelost in wasmiddel, bijvoorbeeldnatrium dodecyl-sulfaat (SDS), bij verschillende concentraties in het bereik van ~ 1 tot en met 10-50 µM. opnemen van de intensiteit van de fluorescentie van elke oplossing in bulk en berekenen van de helling van de intensiteit versus concentratie (Figuur 3). Herhaal de meting met de fluorophore die zullen worden geconjugeerd met de proteïne in een soortgelijke concentratiebereik (Zie het voorbeeld met Alexa488 in Figuur 3). Deze meting moet betrekking hebben op de intensiteit van de fluorescentie van de eiwit-label en het label van het lipide, ikA488, bulk / ikHPC *, bulk, zoals zij kunnen niet noodzakelijkerwijs op dezelfde manier op dezelfde bulk concentratie uitstoten.
    5. Meet het aantal fluorophores per eiwit molecuul gebruikmakend van een fluorospectrometer. Bijvoorbeeld, voor het geval van Alexa488, kan het aantal Alexa488 moleculen per eiwit, nA488, worden berekend met de volgende relatie:
      n A488 = (A494A488) / ((A280 - 0.11per494) / εprot)
      waar A494 en A280 zijn de waarden van de extinctie per eenheid lengte op 494 nm en 280 nm, respectievelijk, en εA488 en εprot zijn de coëfficiënten van de moleculaire absorptie van Alexa488 en het eiwit, respectievelijk.
    6. Berekenen van de oppervlakte dichtheid van het eiwit op de GUV, φprot, GUV, volgens de volgende formule:
      Equation 2
      Houd in gedachten de staat van de polymerisatie van het eiwit. Bijvoorbeeld BAR proteïnen dimerize, derhalve de berekende dichtheid zal zijn dat van het monomeer BAR per gebied als met behulp van de coëfficiënt van de extinctie van de monomere vorm.

Figure 3
Figuur 3: een voorbeeld van eiwit oppervlakte dichtheid kalibratie. Gemeten worden de HPC * lipide fluorescentie intensiteit in bulk (links) en GUVs (midden). Ook de intensiteit van de fluorescentie bulk van Alexa488 (gebonden aan een BAR-domein) gemeten zijn (rechts). Intensiteit van de fluorescentie schalen lineair met concentratie. Verticale maten te worden voor de specifieke detectie winst en vermogen laser. Percelen gegenereerde gebaseerd op gegevens uit referentie37. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het experiment van buis-pulling kan geven essentiële mechanische informatie over het membraan. Bij gebrek aan eiwitten of andere moleculen die paar met membraan kromming, het membraan dwingen en straal van de buis kan worden gerelateerd met membraan spanning door het toepassen van de Hamiltoniaan boekje-Helfrich vergelijking tot een koker getrokken uit een GUV50,51

Equation 3(Vergelijking 1)

waar Equation 4 is de membraan vrije energie van de buis, K membraan buigen rigiditeit, r en R0 zijn, respectievelijk, het gemiddelde en de spontane kromtestralen, σ membraan spanning, A het gebied van de buis, L de lengte van de buis, en f de punt kracht uitgeoefend door de buis op de kraal. Bij het evenwicht, r is de straal van de buis, wordt aangeduid met R, en f wordt de buis-retractie force, F, dat wil zeggen, de kracht van de evenwicht waarbij de buis is trekken de parel in de optische val. Berekenen F en R, we minimaliseren Equation 4 oplevert met betrekking tot de L en r,22,23

Equation 5(Vergelijking 2)

Equation 6(Vergelijking 3)

R 0 is verwaarloosd als beide folders van het membraan dezelfde samenstelling hebben, hoewel het is gespeculeerd dat andere factoren, zoals de gratis repulsions kunnen veroorzaken sommige spontane kromming42. Kracht en RADIUS-metingen op buizen getrokken uit 100% DOPC GUVs zijn uitstekende eens met theoretische voorspellingen in vergelijking 2 en vergelijking 3 (Figuur 4). De twee metingen zijn onafhankelijk als de kracht wordt gemeten vanaf de verplaatsing van de parel in de optische val en de straal van de intensiteit van de fluorescentie, dus die twee manieren voor de berekening van het membraan buigen van stijfheid. Montage van vergelijking 2 en 3 van de vergelijking op de opbrengsten van de getoonde gegevens: K = (25.1 ± 1.4) (gemiddelde ± SD) kBT en (22.1 ± 1.5) kBT, respectievelijk, zoals eerder gemeten42 .

Als experimenteren met kromming-koppeling eiwitten, het gebruik van de meer geavanceerde Hamiltoniaan de vergelijking dan degene in vergelijking 1, als de enige accounts vergelijking 1 voor een effectieve spontane kromming wordt voorgesteld en houdt geen rekening met de effect van eiwitten op het membraan van de mechanische eigenschappen of mogelijk eiwit-eiwitinteractie. Zie, bijvoorbeeld,25,35,,36,,52,53. Hoewel geavanceerde theoretische modellen essentieel voor een diepgaand inzicht in een specifiek eiwit-membraan systeem, zijn zonder toevlucht te nemen tot hen, is het nog steeds mogelijk is zeer nuttig om informatie te verkrijgen van de buis-pulling methode.

Bijvoorbeeld, om te testen als eiwitten zin kromming, wordt de relatieve intensiteit van eiwitten op de buis gemeten ten opzichte van de GUV, die wordt beschouwd als plat. De interactie met positieve kromming wordt bestudeerd door het injecteren van de eiwitten in de buurt van de buis met de tweede micropipet25. De interactie met negatieve kromming of het gedrag van transmembraan eiwitten wordt bestudeerd door encapsulating of eiwitten tijdens GUV vorming35,36bijenpopulatie. De relatieve verrijking van BAR en KvAP eiwitten op membraan buizen over de onderliggende GUVs geeft aan dat ze liever gebogen membranen (Figuur 5). Om meer kwantitatieve, kan deze verrijking als een sorteer coëfficiënt, S, worden berekend volgens:

Equation 7(Vergelijking 4)

waar ikprot, badkuip en ikprot, GUV zijn de intensiteit van de fluorescentie van eiwitten op de buis en op de GUV, respectievelijk, en iklip, badkuip en iklip, GUV zijn de intensiteit van de fluorescentie van lipiden op de buis en op de GUV, respectievelijk.

Een ander voorbeeld is het meten van de kracht van de buis als het eiwit aan het membraan bindt. Figuur 5B, C toont aan dat een N-BAR eiwit endophilin die a2 geleidelijk de kracht van de buis, vermindert het daalt tot nul, die aangeeft dat het een driedimensionale structuur die de buis stabiel houdt, dat een steiger heet heeft gevormd. Dergelijke structuren spelen een belangrijke rol in endocytose, door de vaststelling van de straal van de buis, maar ook in staat te stellen van splitsing7,41. Meting van S, evenals de mechanische en morfologische effecten die eiwitten opleggen van membranen biedt belangrijke inzichten in hoe ze in de membraan-buigen verschijnselen in de cel werken.

Figure 4
Figuur 4: representatieve resultaten van mechanische metingen in de afwezigheid van eiwitten. Weergegeven zijn gelineariseerde kracht en buis RADIUS-afhankelijkheid van membraan spanning voor een 100% DOPC membraan, uit drie onafhankelijke metingen, publiceerde eerder42. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: representatieve resultaten van kromming sensing en steiger vorming door BAR eiwitten. (A) kromming sensing door de eiwit-BAR IRSp53. Het eiwit zintuigen negatieve membraan kromming en is gebonden aan de binnenkant van de GUV, met te verwaarlozen hoeveelheid eiwit aanwezig op de bijsluiter van de buitenmembraan. Schaal bar = 5 µm. herdrukt van36, onder de Creative Commons CC-BY-licentie, Copyright 2015 natuur Publishing Group. (B) vorming van een steiger eiwit door de N-BAR eiwit endophilin. Eiwitten worden geïnjecteerd in de buurt van de buis en dus aan de buitenmembraan bijsluiter worden gebonden. Zoals beschreven in37, endophilin bindt aan de buis van base en vormt een steiger die voortdurend langs de buis van de GUV richting de optische val (OT, witte cirkel groeit). (C) A kymogram van endophilin de groei van de steiger van de GUV naar de kraal, met de kanalen van het lipide en eiwit bedekt. De plot geeft buis kracht, F, als functie van tijd, t. De termijnen in de kymogram en de plot zijn hetzelfde (x-as wordt gedeeld). In de B en C, schaal bar = 2 µm. herdrukt met toestemming van referentie37, Copyright (2016) Nationale Academie van Wetenschappen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methode van het trekken van buizen van GUVs geeft rijke informatie op het membraan-eiwit-systeem, maar het is niet alleen de middelen voor het meten van de fundamentele mechanische eigenschappen van het membraan, helpt het om licht werpen op de koppeling tussen eiwitten en membraan kromming. Zoals besproken in de inleiding, andere technieken bestaan voor het meten van de effecten van membraan-gebogen eiwitten, door de eiwitten aan het broeden met sub micron liposomen vastgebonden aan een speciaal oppervlak18,-19 of door het observeren van de spontane vorming van tubuli in micropipet-aanzuiging GUVs na de injectie van een eiwit20,21. De hier beschreven methode biedt directe geometrische verbinding met endocytose en is uniek in het verstrekken van de belangrijke fysieke metingen van het systeem op dezelfde tijd, bijvoorbeeld eiwit dichtheid, membraan spanning en kracht van de membraan.

Een belangrijke beperking van de methode is dat het niet triviaal te construeren en kalibreren van alle onderdelen die betrokken zijn bij de bepaling. Echter, terwijl een combinatie van confocale microscopie, optisch pincet en micromanipulation biedt maximale informatie, sommige onderdelen kunnen worden vervangen, zoals besproken in de inleiding, afhankelijk van de informatie die worden geleerd moet over de systeem. De minimale onderdelen die vereist zijn om met succes de koppeling van de kromming van een eiwit, of elke andere potentiële kromming-coupled molecuul, sonde zijn een aspirator micropipet en een confocal microscoop, met de optisch pincet wordt overbodig. Nog belangrijker is, zijn veel van de kalibraties (zoals de kalibratie voor membraan buis radius en voor de bepaling van eiwit oppervlakte dichtheid) doorgaans alleen nodig om eenmaal worden uitgevoerd. Een andere beperking van de methode is dat het slechts één GUV kan meten op een moment, ten bedrage van twee tot drie GUVs per uur (met praktijk); echter elke meting biedt een schat aan gegevens.

Voor hogere doorvoer metingen of als het is essentieel dat de studie van de interactie van eiwitten met bolvormig en niet buisvormige geometrieën, moet andere tests worden onderzocht of ontwikkeld. Toekomstige inspanningen zal worden besteed aan: (1) het ontwerpen van een hogere gegevensdoorvoer systeem waarin meerdere buizen (van meerdere GUVs) konden worden getrokken en gemeten op hetzelfde moment, en (2) integratie van super resolutie microscopie dus om te bestuderen van de details van de eiwit-steiger die formulieren op de nanobuisjes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur en Gil Toombes voor hun essentiële bijdragen methode vast te stellen de nanobuis in de groep. De P.B. groep behoort aan het CNRS consortium CellTiss, de Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), en Parijs Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai werd gefinancierd door de EMBO op lange termijn fellowship (ALTF 1527-2014) en de Marie Curie-acties (H2020-MSCA-IF-2014, project membraan-ezrin-actine). M.S. is een Junior Fellow van de samenleving van Fellows van Simons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC) Avanti 850375 Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin] Avanti 880129 biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide Molecular Probes (ThermoFisher) D7540 fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*) Molecular Probes (ThermoFisher) fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC) Avanti 840051 used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%) Sigma Aldrich C6905 used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose Sigma Aldrich S7903
D(+) glucose Sigma Aldrich G7021
NaCl Sigma Aldrich S7653
Tris Sigma Aldrich 10708976001
osmometer Loser n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure Goodfellow USA PT005139 used for GUV electroformation
function generator n/a used to create current for GUV electroformation
putty sealant Vitrex (from CML France) CRIT 140013 used to seal the electroformation chamber
bath sonicator n/a useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany) an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively) Harvard apparatus 30-0036
micropipette puller Sutter Instrument P-2100
microforge Narishige MF-800
piezoelectric actuator Physik Instrumente n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm) Spherotech SVP-30-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438, (7068), 590-596 (2005).
  2. Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build endocytic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6, (1), (2014).
  3. Dawson, J. C., Legg, J. A., Machesky, L. M. Bar domain proteins: a role in tubulation, scission and actin assembly in clathrin-mediated endocytosis. Trends Cell Biol. 16, (10), 493-498 (2006).
  4. Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends Biochem Sci. 37, (12), 526-533 (2012).
  5. Qualmann, B., Koch, D., Kessels, M. M. Let's go bananas: revisiting the endocytic BAR code. EMBO J. 30, (17), 3501-3515 (2011).
  6. Rao, Y., Haucke, V. Membrane shaping by the Bin/amphiphysin/Rvs (BAR) domain protein superfamily. Cell Mol Life Sci. 68, (24), 3983-3993 (2011).
  7. Simunovic, M., Voth, G. A., Callan-Jones, A., Bassereau, P. When Physics Takes Over: BAR Proteins and Membrane Curvature. Trends Cell Biol. 25, (12), 780-792 (2015).
  8. Safari, F., Suetsugu, S. The BAR Domain Superfamily Proteins from Subcellular Structures to Human Diseases. Membranes (Basel). 2, (1), 91-117 (2012).
  9. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Progress in Colloid and Polymer Science Vol. 89: Trends in Colloid and Interface Science VI. Helm, C., Lösche, M., Möhwald, H. 89, Steinkopff. Ch. 29 127-131 (1992).
  10. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  11. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93, (10), 3548-3554 (2007).
  12. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophys J. 70, (3), 1112-1121 (1996).
  13. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  14. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
  15. Hochmuth, R. M., Evans, E. A. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. I. Analysis. Biophys J. 39, (1), 71-81 (1982).
  16. Hochmuth, R. M., Wiles, H. C., Evans, E. A., McCown, J. T. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. II. Experiment. Biophys J. 39, (1), 83-89 (1982).
  17. Bassereau, P., Sorre, B., Levy, A. Bending lipid membranes: experiments after W. Helfrich's model. Adv Colloid Interface Sci. 208, 47-57 (2014).
  18. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature chemical biology. 5, (11), 835-841 (2009).
  19. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO J. 28, (21), 3303-3314 (2009).
  20. Shi, Z., Baumgart, T. Membrane tension and peripheral protein density mediate membrane shape transitions. Nat Commun. 6, 5974 (2015).
  21. Chen, Z., Shi, Z., Baumgart, T. Regulation of membrane-shape transitions induced by I-BAR domains. Biophys J. 109, (2), 298-307 (2015).
  22. Cuvelier, D., Derenyi, I., Bassereau, P., Nassoy, P. Coalescence of membrane tethers: experiments, theory, and applications. Biophys J. 88, (4), 2714-2726 (2005).
  23. Derenyi, I., Julicher, F., Prost, J. Formation and interaction of membrane tubes. Phys Rev Lett. 88, (23), 238101 (2002).
  24. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
  25. Sorre, B., et al. Nature of curvature coupling of amphiphysin with membranes depends on its bound density. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (1), 173-178 (2012).
  26. Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Phys Rev Lett. 64, (17), 2094-2097 (1990).
  27. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, (6), 491-505 (2008).
  28. Capraro, B. R., Yoon, Y., Cho, W., Baumgart, T. Curvature sensing by the epsin N-terminal homology domain measured on cylindrical lipid membrane tethers. J Am Chem Soc. 132, (4), 1200-1201 (2010).
  29. Bo, L., Waugh, R. E. Determination of bilayer membrane bending stiffness by tether formation from giant, thin-walled vesicles. Biophys J. 55, (3), 509-517 (1989).
  30. Rossier, O., et al. Giant Vesicles under Flows: Extrusion and Retraction of Tubes. Langmuir. 19, (3), 575-584 (2003).
  31. Borghi, N., Rossier, O., Brochard-Wyart, F. Hydrodynamic extrusion of tubes from giant vesicles. EPL (Europhysics Letters). 64, (6), 837 (2003).
  32. Zhu, C., Das, S. L., Baumgart, T. Nonlinear sorting, curvature generation, and crowding of endophilin N-BAR on tubular membranes. Biophys J. 102, (8), 1837-1845 (2012).
  33. Ramesh, P., et al. FBAR syndapin 1 recognizes and stabilizes highly curved tubular membranes in a concentration dependent manner. Sci Rep. 3, 1565 (2013).
  34. Knorr, R. L., et al. Membrane morphology is actively transformed by covalent binding of the protein Atg8 to PE-lipids. PLoS One. 9, (12), e115357 (2014).
  35. Aimon, S., et al. Membrane shape modulates transmembrane protein distribution. Dev Cell. 28, (2), 212-218 (2014).
  36. Prévost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. (2015).
  37. Simunovic, M., et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (40), 11226-11231 (2016).
  38. Allain, J. M., Storm, C., Roux, A., Ben Amar, M., Joanny, J. F. Fission of a multiphase membrane tube. Phys Rev Lett. 93, (15), 158104 (2004).
  39. Morlot, S., et al. Membrane shape at the edge of the dynamin helix sets location and duration of the fission reaction. Cell. 151, (3), 619-629 (2012).
  40. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517, (7535), 493-496 (2015).
  41. Simunovic, M., et al. Friction Mediates Scission of Tubular Membranes Scaffolded by BAR Proteins. Cell. 170, (1), 172-184 (2017).
  42. Simunovic, M., Lee, K. Y., Bassereau, P. Celebrating Soft Matter's 10th anniversary: screening of the calcium-induced spontaneous curvature of lipid membranes. Soft Matter. 11, (25), 5030-5036 (2015).
  43. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (14), 5622-5626 (2009).
  44. Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (16), 7208-7213 (2010).
  45. Dasgupta, R., Dimova, R. Inward and outward membrane tubes pulled from giant vesicles. Journal of Physics D: Applied Physics. 47, (28), 282001 (2014).
  46. Vitkova, V., Genova, J., Mitov, M. D., Bivas, I. Sugars in the aqueous phase change the mechanical properties of lipid mono- and bilayers. Molecular Crystals and Liquid Crystals. 449, 95-106 (2006).
  47. Bouvrais, H. Mechanical properties of giant vesicle membranes investigated by flickering technique. University of Southern Denmark. (2011).
  48. Koster, G., Cacciuto, A., Derenyi, I., Frenkel, D., Dogterom, M. Force barriers for membrane tube formation. Phys Rev Lett. 94, (6), 068101 (2005).
  49. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophys J. 35, (3), 637-652 (1981).
  50. Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 28, (11), 693-703 (1973).
  51. Canham, P. B. The minimum energy of bending as a possible explanation of the biconcave shape of the human red blood cell. J Theor Biol. 26, (1), 61-81 (1970).
  52. Marcerou, J. P., Prost, J., Gruler, H. Elastic Model of Protein-Protein Interaction. Nuovo Cimento Della Societa Italiana Di Fisica D-Condensed Matter Atomic Molecular and Chemical Physics Fluids Plasmas Biophysics. 3, (1), 204-210 (1984).
  53. Leibler, S. Curvature Instability in Membranes. J Phys-Paris. 47, (3), 507-516 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics