C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Meercellige buizen, fundamentele eenheden van alle interne organen, bestaan uit gepolariseerde epitheliale of endotheliale cellen, met een apicale membraan voering van de membranen van het lumen en basolaterale contact met elkaar en/of de extracellulaire matrix. Hoe deze onderscheidende membraan asymmetrie is vastgesteld en gehandhaafd tijdens orgel morfogenese is nog steeds een onopgeloste kwestie van biologie van de cel. Dit protocol beschrijft de darm C. elegans als een model voor de analyse van gepolariseerde biogenese tijdens buis morfogenese, met nadruk op de apicale membraan en lumen biogenese. De C. elegans twintig-cel single-gelaagde intestinaal epitheel is ingericht in een eenvoudige bilateraal symmetrisch buis, analyse op het niveau van een eencellige toelaat. Membraan polarisatie plaatsvindt gelijktijdig met gepolariseerde celdeling en migratie tijdens de vroege embryogenese, maar DOVO gepolariseerde biogenese blijft gedurende larvale groei, wanneer cellen niet meer vermenigvuldigen en verplaatsen. De laatste instelling maakt het mogelijk om te scheiden subcellular wijzigingen die tegelijkertijd deze verschillende polariserende processen, moeilijk bemiddelen te onderscheiden in de meeste modellen van de polariteit. Apicaal, basolaterale membraan-, regulates-, cytoskeletal- en endomembrane onderdelen kunnen worden aangeduid en bijgehouden in de gehele ontwikkeling door GFP fusion eiwitten of beoordeeld door in situ antilichaam kleuring. Samen met de genetische veelzijdigheid van het organisme biedt de C. elegans darm dus een unieke in-vivo model voor het visuele, ontwikkelingsstoornissen, en moleculaire genetische analyse van gepolariseerde membraan en buis biogenese. De specifieke methoden (alle standaard) hier beschreven hoe: label intestinale subcellular onderdelen door antilichaam kleuring; analyseren van genen die betrokken zijn in gepolariseerde biogenese door studies van de verlies-van-functie aangepast aan het meestal essentiële tubulogenesis genen; beoordelen van polariteit gebreken tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia; interpreteren van fenotypen door epifluorescence, differentiële interferentie contrast (DIC) en confocale microscopie; visuele gebreken te kwantificeren. Dit protocol kan worden aangepast aan een van de vaak zeer geconserveerde moleculen betrokken in epitheliale polariteit, de biogenese van organellen, buis en lumen genuitdrukking te analyseren.

Introduction

De generatie van cellulaire en subcellular asymmetrische situaties bestaan, zoals de vorming van gepolariseerde membraan domeinen, is van cruciaal belang voor de voedselproductie en de functie van cellen, weefsels en organen1. Studies over gepolariseerde biogenese van organellen in epithelen blijven een technische uitdaging, omdat wijzigingen in de toewijzing van subcellular componenten in de richting is afhankelijk van meerdere opeenvolgende en samenvallende extracellulaire en intracellulaire signalen die moeilijk te scheiden in de meeste modellen en sterk afhankelijk van het modelsysteem. Het model gepresenteerd hier - de single-gelaagde Caenorhabditis elegans darm - is een weefsel van verfijnde eenvoud. Samen met de eencellige C. elegans uitscheidingsmechanisme canal (zie bijbehorende papier op gepolariseerde biogenese van organellen in het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans )2, biedt verschillende unieke voordelen voor de identificatie en kenmerken van moleculen die nodig zijn voor de biogenese van organellen gepolariseerde. De instandhouding van de moleculaire polariteit signalen uit gist aan man maken dit eenvoudige-ongewervelde orgel een uitstekende"in vivo weefsel kamer" om vragen te stellen over de epitheliale polariteit die rechtstreeks verband houden met het menselijke systeem, dat nog steeds veel te is complex dat de visuele dissectie van deze gebeurtenissen op de single cell niveau in vivo.

Hoewel meerdere geconserveerde polariteit signalen van (1) de extracelluar matrix, (2) het plasmamembraan en zijn kruispunten, en (3) de intracellulaire vesiculaire handel geïdentificeerde3, de onderliggende beginselen van hun integratie in het proces van geweest gepolariseerde epitheliale membraan en weefsel biogenese is slecht begrepen4. De klassieke eencellige in vivo modellen (e.g.S. cerevisiae en de zygote C. elegans ) hebben bijgedragen bij de vaststelling van de beginselen van gepolariseerde celdeling en anterior-posterior polariteit en kritische hebben geïdentificeerd membraan-geassocieerde polariteit determinanten (de kleine GTPases/CDC-42, de partitionering-defecte PARs)5,6, maar ze afhankelijk van unieke symmetriebreking signalen (bud litteken, sperma ingang) en gebrek aan junction-beveiligd apicobasal membraan domeinen en, vermoedelijk, de bijbehorende intracellulaire apicobasal sorteren van machines. Onze huidige kennis over de organisatie van de gepolariseerde handel in epitheel, echter berust voornamelijk op zoogdieren 2D monoculturen7, die gebrek aan fysiologische extracellulaire en ontwikkelingsstoornissen signalen die standpunten van membraan kunnen wijzigen domeinen en richtingen van mensenhandel trajecten (een overgang van 2D naar 3D in vitro cultuur systemen alleen volstaat om het omkeren van de membraan polariteit in MDCK (Madin-Darby canine kidney) cellen)8. In vivo developmental studies over epitheliale polariteit in ongewervelde modelorganismen werden aanvankelijk uitgevoerd in platte epitheel, bijvoorbeeld in de Drosophila melanogaster opperhuid, waar ze de kritische bijdrage geïdentificeerd junction dynamiek voor gepolariseerde cel migratie en cel blad verkeer9en endocytotische mensenhandel voor polariteit onderhoud10. De 3D in vitro en in vivo analyse van lumen morfogenese in tubulaire epitheel in MDCK cellen en in de darm van C. elegans , respectievelijk, onlangs gebleken dat de eis van intracellulaire mensenhandel voor de Novo (apicaal) domein en lumen biogenese en positionering van11,12,13. De dikte van buisvormige (versus flat) epitheliale cellen is een voordeel voor de 3D analyse van subcellular asymmetrieën aangezien hierdoor een superieure visuele onderscheid van de apicale-lumenal membraan, apico-laterale kruispunten, het laterale membraan, en de standpunten van intracellulaire organellen. Aan deze visuele voordelen, de C. elegans model voegt de in vivo instelling developmental as, transparantie, eenvoud van lichaam plan, invariant en gedefinieerde cel bloedlijn, analytische (genetische) en extra voordelen die hieronder worden beschreven.

C. elegans zelf is een rondworm van buisstructuur waarvan transparantie en eenvoudige architectuur zijn eveneens buisvormige interne organen direct toegankelijk voor de visuele analyse van buis en lumen morfogenese maken. De twintig cellen van de darm (soms 21 of 22-cellen)14 zijn afgeleid van een enkele progenitor cel (E) en ontwikkelen van een dubbellaagse epitheel door één bekomt stap in een bilateraal symmetrisch buis van negen INT ringen (vier cellen in de eerste ring; Figuur 1 schematische)14,15,16. De darm van afkomst en weefsel analyse, in eerste instantie bepaald door Nomarski optica via nucleaire identiteiten17en later ook door fluorescentie microscopie via gelabelde membranen, heeft kritische inzichten in de voedselproductie, verstrekt in met name de cel-autonome en cel-niet-zelfstandige vereisten voor de directionele celdelingen en bewegingen (bijvoorbeeldbekomt, rechts-links asymmetrieën, anterior en posterior buis rotatie)14,18 . Vroege endodermal cel specificatie en het gene regelgevende netwerk beheersen van de ontwikkeling van dit orgel klonale model zijn goed gekarakteriseerd19,20. De nadruk ligt hier, echter, is op de analyse van gepolariseerde membraan en lumen biogenese in één tubulaire cellen en de intracellulaire asymmetrie van endomembranes, cytoskeletal structuren en organellen die gepaard gaan met dit proces. De analyse wordt vergemakkelijkt door de eenvoud van deze buis, waar alle apicale membranen (op ultrastructureel niveau DN door microvilli) gezicht de lumen en alle basale membranen geconfronteerd met het oppervlak van de buitenste buis, met zijdelingse membranen contact met elkaar, van de apicale membraan gescheiden door kruispunten (Figuur 1 schematische; zie verwijzingen (16,21) voor de C. elegans-specifieke organisatie van strakke en adherens junction componenten). Apicale membraan biogenese is dus samenvallen met lumen morfogenese. Bovendien, de grootte van volwassen intestinale cellen - de grootste cellen van dit kleine dier (met uitzondering van de uitscheidingsmechanisme cel) - onderlinge aanpassing van de grootte van een zoogdieren cel, waardoor het in vivo visuele volgen van subcellular elementen, bijvoorbeeld vesikel trajecten, die typisch geprobeerd in vitro in een cultuur schotel.

Met het oog op deze cellulaire en subcellular analyse is passende etikettering cruciaal. Intestinale endo - of plasma-membraan domeinen, kruispunten, cytoskeletalstructuren, kernen en andere subcellular organellen kunnen worden gevisualiseerd door het labelen van hun specifieke moleculaire componenten. Veel van dergelijke componenten hebben gekenmerkt en blijven om ontdekt te worden (tabel 1 geeft een paar voorbeelden en verwijst naar de middelen). Bijvoorbeeld, zijn verschillende moleculen de buizen en/of vesiculaire compartimenten van de intestinale endomembraansysteem, onderscheiden van het ER naar het Golgi via post-Golgi blaasjes aan het plasma-membraan, geïdentificeerde22. De specifieke eiwitten (evenals lipiden en suikers) kunnen ofwel gelabeld zijn direct of niet indirect via bindende eiwitten. Dit protocol is gericht op het in situ antilichaam kleuring van vaste specimens, één van de twee standaard labeling technieken (Zie het begeleidende document op uitscheidingsmechanisme kanaal tubulogenesis voor een beschrijving van de andere techniek2 - in-vivo labeling via fluorescent proteïne fusies - die rechtstreeks toepasselijk zijn aan de darm; Tabel 2 bevat voorbeelden van darm-specifieke initiatiefnemers die kunnen worden gebruikt om de uitdrukking van deze fusie-eiwitten rijden naar de darm). Double- of meerdere labelen met beide benadering, of met een combinatie van beide plus extra chemische kleuring, kan meer diepgaande visuele resolutie en het onderzoek van de ruimtelijke en temporele veranderingen in co lokalisatie en aanwerving van specifieke moleculen of subcellular onderdelen (Figuur 2). De fixatie en kleuring van de in dit protocol steun behoud van groen fluorescent proteïne (GFP) labeling tijdens immunokleuring procedures beschreven procedures. Voor imaging, belangrijke punten van de detectie en karakterisatie van tubulogenesis fenotypen via microscopische standaardprocedures (fluorescentie ontleden en confocal microscopie) zijn beschreven ()Figuur 3, , 4). Deze kunnen worden uitgebreid tot hogere resolutie imaging benaderingen, voor aanleg super-resolution microscopie en Transmissie Electronenmicroscopie (hier niet beschreven).

Een sleutelsterkte van dit systeem is de mogelijkheid om het analyseren van polariteit in afzonderlijke cellen in verschillende ontwikkelingsstadia, van embryogenese via volwassenheid. Bijvoorbeeld, kan apicale domein en de lumen biogenese worden bijgehouden in de gehele ontwikkeling op het niveau van eencellige via labelen met ERM-1, een zeer geconserveerde membraan-actine linker van de Ezrin-Radixin-Moesin familie23,24 . ERM-1 visualiseert apicale membraan biogenese (1) tijdens de embryonale buis morfogenese, wanneer deze gelijktijdig met gepolariseerde celdeling en migratie (cellen verplaatsen apically rond de lumen tijdens bekomt)15 optreedt; (2) tijdens late embryonale en larvale buis uitbreiding dat de opbrengsten in de afwezigheid van celdeling of migratie; en (3) in de volwassen darm, waar de gepolariseerde membraan domeinen worden onderhouden (Figuur 1). In de groeiende post mitotische larvale epitheel, DOVO gepolariseerde membraan biogenese kan dus worden losgekoppeld van de gepolariseerde weefsel morfogenese, wat niet mogelijk is in de meeste modellen voor in vivo en in vitro epitheliale polariteit, met inbegrip van die met eencellige resolutie (bijvoorbeeld de 3D MDCK cyste model8). Met etikettering voor andere componenten, deze instelling biedt de mogelijkheid (met name bij de L1 larvale stadium wanneer de cellen hebben een hogere cytoplasma/nucleus ratio) te onderscheiden van de intracellulaire wijzigingen die specifiek zijn voor gepolariseerde membraan biogenese () bijvoorbeeld de heroriëntering van mensenhandel trajecten) van die gelijktijdig voor gepolariseerde celdeling en migratie.

De genetische veelzijdigheid van C. elegans is goed-bekende25en maakt het een krachtig modelsysteem voor de moleculaire analyse van biologische vragen. Een studie over voedselproductie, bijvoorbeeld, kunt u beginnen met een wild-type stam, een transgene stam waar de structuur van belang (bijvoorbeeld een membraan) wordt aangeduid met een fluorescerende marker, of met een - of winst-van-verliesfunctie mutant met een defect in dit structuur. Een typische omgekeerde genetische studie kan het genereren van een mutant waar het gen van belang wordt verwijderd in de kiemcellen (bijvoorbeeld door een gerichte verwijdering), gewijzigd door mutagenese (meestal produceren puntmutaties met het daaruit voortvloeiende verlies, vermindering of winst in functie van het gen), of waar haar transcript door RNAi wordt verminderd. Het gemak van RNAi door voeding in C. elegans26 leent zich ook voor het ontwerp van gerichte schermen die onderzoeken van een grotere groep van genen van belang. Een genetisch modelorganisme misschien wel grootste sterkte is het vermogen om uit te voeren in vivo voorwaartse schermen (bijvoorbeeld mutagenese, systematische of genoom-brede schermen van RNAi) waarmee een onbevooroordeeld onderzoek naar de moleculaire oorzaak voor een fenotype van belang. Bijvoorbeeld, een onbevooroordeelde visual C. elegans RNAi tubulogenesis scherm, dat begint met een transgene dieren met ERM-1-geëtiketteerden apicale membraan, ontdekt een intrigerende omkeerbare intestinale polariteit conversie en ectopische lumen fenotype, gebruikt hier als voorbeeld voor dit soort analyse. Dit scherm de uitputting van de glycosphingolipids (GSLs; obligate membraan lipiden, geïdentificeerd met behulp van hun GLS-biosynthetic enzymen) en onderdelen van het vesikel vacht clathrin en de AP-1 adapter geïdentificeerd als de specifieke moleculaire defecten veroorzaakt deze polariteit conversie fenotype, waardoor het karakteriseren van deze handel van moleculen als in vivo cues voor apicale membraan polariteit en positionering van12,13lumen. Bij het starten met een specifieke genetische mutatie/morfogenese fenotype, kunnen dergelijke schermen (of één genetische/RNAi interactie experimenten) functionele interacties tussen twee of meerdere genen van belang (zie bijbehorende papier op het uitscheidingsmechanisme ook onderzoeken kanaal voor een voorbeeld van een dergelijke analyse)2. Dit protocol is gericht op RNAi waarmee, naast de mogelijkheid om direct het identificeren van het gen waarvan verlies het fenotype in voorwaartse schermen veroorzaakt, specifieke voordelen worden ingesteld voor de analyse van de voedselproductie. Aangezien genproducten regisseren van voedselproductie vaak in een dosis-afhankelijke manier werken, is RNAi gewoonlijk succesvol in het genereren van een spectrum van fenotypen. De mogelijkheid voor het genereren van informatieve partiële-verlies-van-functie fenotypen helpt ook om het probleem dat de meerderheid van de genen van de belangrijke tubulogenesis van essentieel belang zijn en dat hun verliezen steriliteit en vroege embryonale letaliteit veroorzaken. Dit protocol omvat voorwaardelijke RNAi strategieën om deze moeilijkheid te overwinnen en stelt manieren voor het optimaliseren van het genereren van een breder spectrum van fenotypen, zoals een allèlique serie, geproduceerd door mutagenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Labelen van de darm C. elegans

Opmerking: Zie het begeleidende document door de auteurs op de analyse van uitscheidingsmechanisme kanaal tubulogenesis 2 voor de bouw van de weefsel specifieke fluorescerende marker plasmiden en het genereren van transgene dieren, met inbegrip van discussies over transcriptionele en translationele fusion eiwitten (de laatste vereist voor de subcellular localisatie van een molecule van belang). Deze procedures kunnen worden aangepast met behulp van specifieke initiatiefnemers om te rijden de molecule van belang naar de darm. Zie tabel 1 voor voorbeelden van moleculen bewezen nuttig voor het visualiseren van C. elegans intestinale endo - en plasma membranen en hun kruispunten, tabel 2 voor voorbeelden van de initiatiefnemers voor de besturen van de expressie naar de darm, en tabel 3 voor middelen voor meer uitgebreide collecties van intestinale markeringen en promotors.

  1. Antilichaam kleuring van de darm C. elegans 27 , 28
    1. fixatie
      1. een schone glasplaatje en gebruik van poly-L-lysine om te het genereren van een dunne film voor wormen om op te plakken. Plaats 30 µL 0,1-0,2% poly-L-lysine op de dia en plaats een tweede dia op de daling van de poly-L-lysine om een " broodje ". Wrijf vervolgens de dia's zachtjes een paar keer het hele oppervlak van zowel nat en laten lucht droog voor 30 min. Label de matte zijde van de dia's met potlood.
        Opmerking: 0,2% poly-L-lysine aliquots van 200 µL werden gemaakt door de ontbinding van het poeder in dH 2 O; Dit kan worden opgeslagen bij-20 ° C. poly-L-lysine ultrahoog moleculair gewicht gebruik voor verbeterd steken van de wormen. De concentratie van poly-L-lysine is ook cruciaal. Ook lage concentraties niet zal toestaan dat wormen te houden maar ook hoge concentraties fluorescentie achtergrond signaal kunnen genereren. Een te dik film in zijn geheel kan losser.
      2. Plaats een platte metalen blok stevig op de bodem van een container (bijvoorbeeld een polystyreen container) gevuld met vloeibare stikstof.
        Opmerking: Men kan het gebruiken van droog ijs in plaats daarvan, maar vloeibare stikstof houdt een metalen blok meer stabiel op de bodem van de container en koelt goed.
      3. Verzamelen wormen ofwel wassen door ze uit hun platen met M9 29 of kies andere fase wormen (beide eieren, L1, L2, L3 en L4 larvale stadium worms) op elke dia. Meestal kies ~ 100 larven en embryo's of ~ 20 volwassenen aan elke dia. Plaats 10 µL afgewassen wormen op het midden van de dia of pick eieren/wormen in 10 µL M9 of 10 µL 1 x PBS 27 (fosfaatgebufferde zoutoplossing).
        1. Gebruik een pipet te spreiden van grote aantallen wormen te voorkomen samendoen.
          Opmerking: Gemengde bevolking van wormen afgewassen, als gevolg van verdringing en verschillende dikte van stadia, niet doen stick goed en zijn minder effectief freeze-gebarsten (zie hieronder), daarom plukken fase-specifieke wormen (of gesynchroniseerde populaties) geeft superieure resultaten. Larven stok beter dan volwassenen en kunnen meer dieren geplaatst worden per dia.
        2. Voordat plukken wormen in dia's, overbrengen naar een Nematode groei Medium (NGM) plaat 29 zonder OP50 bacteriën. Teveel bacteriën aanhanger voor de wormen kan ook verstoren steken. Zorg dat wormen niet doen uitdrogen.
      4. Voorzichtig plaats (druppel) een 22 mm × 22 mm dekglaasje aan cross-manieren bovenop de verzamelde wormen zodanig dat de randen hangen ten minste één zijde van de dia. Druk recht naar beneden zachtjes maar stevig met één of twee vingers op het dekglaasje aan. Vermijd afsnijden die schade aan weefsel integriteit toebrengen zal.
      5. Onmiddellijk en zachtjes de dia overbrengen in het metalen blok in vloeibare stikstof en laat het zitten voor ongeveer 5 minuten om te bevriezen. Vervolgens " flick uit " het dekglaasje aan in een swift verplaatsen met behulp van de overhangende rand.
        Opmerking: Deze stap moet resoluut worden gedaan en terwijl de dia wordt bevroren om te bereiken " kraken " van de cuticle bestaat. Let op: Volg de richtlijnen van de PPE (persoonlijke beschermingsmiddelen) bij het werken met vloeibare stikstof.
      6. Onderdompelen de freeze-gebarsten dia's in een methanol-gevuld glas Coplin pot voor 5 min bij-20 ° C. Vervolgens overbrengen naar een aceton-gevuld glas Coplin pot voor een andere 5 min bij -20 ° C.
        Opmerking: Methanol en aceton in moeten worden opgeslagen-20 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik. Na fixatie, dia's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C. voorzichtigheid: methanol en aceton zijn giftig.
      7. Dia's te verwijderen uit de pot en laat ze lucht droog, bij kamertemperatuur (RT) vóór gebruik.
    2. Staining
      1. omringen gebied van vaste wormen met een dun laagje vaseline op de dia. Teken een cirkel rond dit gebied aan de onderzijde van de dia te markeren de plek.
        Opmerking: Het is cruciaal dat de cirkel van de gelei intact gedurende de hele procedure blijft ter voorkoming van lekkage van de kleuring oplossingen kleuring.
      2. Voorbereiden een " natte kamer " in een kunststof bak met deksel door het plaatsen van natte papieren handdoeken erin. Plaats van de dia op een rek in dit " natte kamer " om te voorkomen dat het drogen van de dia's tijdens kleuring.
        Opmerking: Dia's mag niet in contact met water of met elkaar.
      3. Pipetteer zachtjes ongeveer 50 µL 1 x PBS in de cirkel met gelei, genoeg ter dekking van het gebied. Sluiten de " natte kamer " met het deksel. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
        Opmerking: Om te voorkomen dat verliezen van wormen bij deze stap, niet Pipetteer PBS rechtstreeks op de wormen. Voorzichtig plaats van pipette uiteinde aan de rand van de cirkel en laat vloeistof te soepel over de wormen verspreiden.
      4. Kantelen van de dia en langzaam gecombineerd de PBS met een pipet. Plaats de dia terug plat op het rek en voeg 50 µL (of het vereiste bedrag ter dekking van de vlek) blokkeren oplossing zorgvuldig. Incubeer dit in de natte kamer op RT gedurende 15 minuten. Terwijl we wachten, Verdun de primaire antilichamen in het blokkeren van de oplossing (Zie Tabel van materialen voor voorbeelden van primaire antilichamen en concentraties).
        Opmerking: Vers bereid met behulp van melkpoeder (0.2 g), 1 x PBS (10 mL) en 10% tween (50 µL)-blokkerende oplossing. De hoeveelheid wasmiddel en concentratie van melk kan variëren afhankelijk van antilichamen gebruikt en wellicht worden empirisch bepaald. Aspiratie van vocht uit de dia is een andere stap te gemakkelijk verliezen wormen. Voortgang controleren door het onderzoeken van de dia binnen de ontleden werkingssfeer, maar zorg dat de dia niet doet uitdrogen.
      5. Kantelen van de dia en gecombineerd weg de blokkerende oplossing, met behulp van dezelfde voorzorgsmaatregelen zoals hierboven beschreven. Plaats dia terug plat op rek en voeg langzaam 50 µL verdunde primair antilichaam, met behulp van dezelfde voorzorgsmaatregelen. Sluiten de " natte kamer " en Incubeer bij 4 ° C's nachts of voor kortere perioden op RT.
        Opmerking: Incubatietijd moet mogelijk worden empirisch bepaald voor een specifiek antilichaam.
      6. Aspirate uit het primaire antilichaam oplossing zoals gedaan voor de andere oplossingen. Daarna wassen de dia's met blokkerende oplossing voor 10 minuten, 3 keer, toevoegen en verwijderen van de oplossing op de zelfde manier zoals hierboven beschreven.
      7. Toevoegen secundair (fluorescently-label) antilichaam verdund in blokkerende oplossing, Incubeer bij RT gedurende 1 h. Zie Tabel van materialen voor voorbeelden van secundaire antilichamen en concentraties.
      8. Secundair antilichaam en wassen, zoals hierboven, met blocking oplossing 2 keer en duidelijk uit de blokkerende oplossing, met 1 x PBS, voor elke 10 min verwijderen.
      9. Gecombineerd weg zoveel PBS mogelijk zonder toelaat het specimen uitdrogen en verwijder voorzichtig de gelei rond het specimen.
      10. Toevoegen een druppel medium voor montage op het model, en plaats een dekglaasje aan zachtjes op bovenkant. Verzegel de rand van het dekglaasje aan met nagellak. Plaats van dia's in een donkere dia doos bewaren kleuring en opslaan in 4 ° C.
        Opmerking: Houd de dia's in het donker vanwege lichtgevoeligheid (fluorescentie kan vervagen met tijd) en het voorkomen van blootstelling van de lucht doordat ze verzegeld, om dezelfde reden. Dia's kunnen worden opgeslagen voor langere tijd bij 4 ° C of -20 ° C.

2. Interferentie met de functie van essentiële tubulogenesis genen in de darm C. elegans. Voorbeeld: RNAi.

Opmerking: C. elegans stammen worden gekweekt op OP50 bacteriën ontpit op NGM platen volgens standaardprotocollen 29. C. elegans waardplanten voor RNAi, HT115, RNAi bacteriën op RNAi platen aangevuld met 25 µg Mo/mL carbenicillin en 2 mM IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) voor de inductie van de bacteriële promotor die genereert de dubbele strandde RNA (dsRNA) van het geïntroduceerde gen C. elegans. Antibiotica en IPTG concentratie kunnen variëren volgens RNAi kloon/bibliotheek en gewenste RNAi kracht, resp. specifieke RNAi klonen kunnen worden verkregen uit commercieel beschikbare genoom-brede RNAi voederen van bibliotheken (zie ( 26 , 30 , 31) voor achtergrondinformatie over voeding van RNAi in C. elegans en Tabel van materialen voor materialen/reagentia en RNAi bibliotheken).

  1. Standaard RNAi door voeding 26 , 31
    1. Neem RNAi bibliotheek plaat van-80 ° C en zet het op droog ijs. Verwijder de afdichtende tape en gebruik van steriele pipette uiteinde aanhangend bacteriën van kloon van belang overbrengen naar LB (Luria Bouillon) agar platen 29 aangevuld met 100 µg/mL ampicilline en tetracycline van 15 µg/mL. Streak uit bacteriën op agarplaat. Verzegel de RNAi bibliotheek plaat met een nieuwe verzegeling tape. Groeien de bacteriën 's nachts bij 37 ° C.
      Opmerking: Deze agar platen kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor enkele weken. Nieuwe bacteriën kunnen worden gekweekt rechtstreeks van hen om te beschermen de oorspronkelijke bibliotheek RNAi.
    2. Volgende dag beënten RNAi bacteriën van LB agarplaat in 1 mL LB opgietvloeistof 29 met 50 µg Mo/mL ampicilline elke en schudden voor 14 h (8-18) of overnachting bij 37 ° C.
      Opmerking: Voor optimale resultaten gebruikt verse bacteriën telkens. Zie Referentie ( 30) voor vergelijking van verschillende kweekomstandigheden (bv. de timing van de cultuur).
    3. Volgende dag, zaad 200 µL per kloon van de gekweekte bacteriën RNAi op afzonderlijke RNAi platen. Laat de platen droog en laat op RT's nachts voor de inductie van de bacteriële promoter.
    4. Transfer 4-6 L4-fase larven op elk bord RNAi. Incubeer de geplaatste RNAi platen op RT of 22 ° C gedurende 3-5 dagen.
      Opmerking: Kies eerst L4 larven op een bord NGM zonder bacteriën te verwijderen van de aanhanger OP50 die zal interfereren met RNAi, of serieel overbrengen naar een nieuwe NGM plaat zonder OP50 drie keer. Zorg ervoor niet stammen zijn aangetast, aangezien contaminerende bacteriën - zoals OP50 de voorkeur voedsel voor de wormen - ook met RNAi interfereren zal. Pas desgewenst aan temperatuur: bijv. ontwikkeling versnelt met hogere temperatuur; stammen kunnen zijn temperatuur gevoelig.
    5. For developmental studies, controleren fenotypes van de F1 van nakomelingen vanaf dag 2.
      Opmerking: Het is cruciaal om te controleren dieren vaak om te voorkomen dat ontbreekt het uiterlijk of de progressie van een fenotype (bijvoorbeeld markering verplaatsing) wanneer gepolariseerde biogenese beoordelen tijdens de ontwikkeling. Verrijking van de bevolking van de F2 voor sterke fenotypen (bijvoorbeeld door het plukken van bovenliggende hermafrodieten aan een nieuwe plaat van RNAi op dag 2 om te kiezen voor de meest sterk beïnvloed midden gedeelte van hun nageslacht) is zelden nodig, omdat een scala van mild tot sterk fenotypen is wenselijk.
  2. Voorwaardelijke RNAi
    Opmerking: RNAi voorwaarden kunnen worden gewijzigd te verminderen ernstige of milde effecten verhogen, of om in te grijpen fase-specifiek; wijzigingen zijn nuttig voor de volledige evaluatie van fenotypische effecten van de vaak dodelijke tubulogenesis genen.
    1. Larval RNAi - evaluatie van RNAi effecten in dezelfde generatie (milde, fase-specifieke RNAi)
      Opmerking: te overwinnen steriliteit of embryonale letaliteit of verstoren van de genfunctie op een specifieke fase post embryogenese, RNAi wordt geïnduceerd larven, post embryonically. Plaats van onbehandelde eieren (2.2.1.1), gravid volwassenen (2.2.1.2) of gesynchroniseerd L1 (of, indien gewenst, later stadium) larven (2.2.1.3) op RNAi platen; evalueren de RNAi effecten in dezelfde generatie, bijvoorbeeld twee dagen later en vanaf, larven en/of volwassenen.
      1. Pick 30-50 gravid volwassenen in een druppel bleken oplossing (een 1: 4-oplossing van 10 M NaOH en huishoudelijke natriumhypochloriet) geplaatst aan de rand van een RNAi plaat. Laten drogen en toestaan L1s uitkomen en verplaatsen in de bacteriële gazon.
        Opmerking: Bleken oplossing, meestal gebruikt voor decontaminatie, alles behalve embryo's in hun eierschalen zal doden. Plaats daarom niet de bleken oplossing op of dichtbij de bacteriën RNAi.
      2. Kies zaad ~ 20 jonge gravid volwassenen op RNAi plaat en laat ze leggen eieren gedurende 2-3 uur, of totdat er ongeveer 300 eieren op de plaat, kies uit volwassenen.
        Opmerking: Deze methode kan besmetting van de RNAi bacteriën door OP50. Om dit risico, moet u eerst volwassenen op een bord NGM zonder bacteriën te verwijderen OP50 aanhanger voor de wormen overbrengen. Zorg dat volwassenen blijf niet te lang op RNAi platen te vermijden RNAi effect op embryo's.
      3. Kies of L1 fase wormen plaatsen direct op RNAi platen (Zie Referentie ( 29)-voor synchronisatie protocollen).
        Opmerking: Kan men een verkort synchronisatie protocol (bijvoorbeeld voor een matig grote schaal set-up) door het wassen van wormen van dichtbevolkte platen met M9 voor meerdere malen totdat alleen eieren blijven gebruiken. Na 2-3h broedeieren L1s kan dan worden verzameld in de M9 van deze platen, gereinigd door extra wasbeurten te verwijderen van bacteriën (3 x in M9), en op RNAi platen agarvoedingsbodem.
    2. Verdunning van RNAi bacteriën met lege vector RNAi bacteriën (milde RNAi)
      Opmerking: verlaging van dsRNA door verdunning van de hoeveelheid RNAi bacteriën kan volstaan om een milder effect hebben en kan ook het verminderen van embryonale letaliteit zonder de afschaffing van alle embryonale effecten. Verdunning van RNAi bacteriën wordt ook gebruikt voor dubbele RNAi experimenten en titreer voorwaarden voor genetische interactie experimenten (bijvoorbeeld voor het genereren van milde effecten voor de beoordeling van verbetering en sterke effecten voor de beoordeling van onderdrukking).
      1. Grow up RNAi en empty vector HT115 RNAi bacteriën in 1 mL LB medium met 50 µg Mo/mL ampicilline, zoals gedaan voor RNAi standaardomstandigheden.
      2. Verdun de RNAi bacteriën met lege vector RNAi bacteriën om een scala van verschillende concentraties, bijvoorbeeld, 5%, 15%, 30%, 50% en 70%. Meng de bacteriën goed door pipetteren omhoog en omlaag. Pipetteer 200 µL gemengd bacteriën op een bord van RNAi.
      3. 4-6 L4 larven te halen op elke plaat RNAi. Controleer het fenotype van dag 2 verder.
    3. RNAi gevoelige muizenstammen (sterke RNAi)
      1. beschikbaar RNAi-gevoelige stammen, bijvoorbeeld, de eri-1 (mg366), SRF-3 (pk1426) of de eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (de laatste supersensitive) en volg RNAi standaardprocedures in 2.1 31 , 32 , 33 omschreven.
        Opmerking: RNAi gevoelige muizenstammen (bijvoorbeeld SRF-3 en eri-1) kunnen hebben minder brood maten dan wild-type dieren en steriele bij 25 ° C. Zij kunnen ook een lage achtergrond van eigen fenotypen hebben, bijvoorbeeld lage penetrant embryonale letaliteit, die moet rekening worden gehouden bij de beoordeling van specifieke effecten van RNAi.

3. In vivo imaging van de C. elegans darm door fluorescentie microscopie ontrafeling

  1. Controleer voordat u deze dieren onder de fluorescentie licht visualiseren, RNAi platen onder fel licht op elke ontleden Microscoop. Beoordelen (en potentieel opnemen) fenotypen zichtbaar onder fel licht dat kan van invloed zijn op de analyse, zoals letaliteit, steriliteit (lagere aantal nakomelingen), ontwikkelingsstoornissen (bijvoorbeeld larvale arrestatie) en andere zichtbaar fenotypen die u kunnen helpen kenmerkend zijn voor de functie van een gen in gepolariseerde membraan biogenese en lumen morfogenese.
    Opmerking: Alleen score platen moeten voldoende nageslacht voor evaluatie (minstens 50), anders proberen alternatieve RNAi voorwaarden. Voor kwantitatieve evaluatie ervoor te zorgen dat de platen niet zijn aangetast of groeien OP50 (die interfereren met RNAi).
  2. Te visualiseren dieren onder tl-licht, en verwijder het deksel en plaats de plaat RNAi direct onder de ontleden fluorescentie Microscoop.
    Opmerking: Als u wilt detecteren subtiele intestinale fenotypen zal men moeten een ontleden Microscoop met een hogere macht stereo fluorescentie bijlage die het mogelijk voor een voldoende aanbod van vergroting maakt. Dit protocol beschrijft het gebruik van een scope met een 1.5 en 10 x doelstelling en een zoombereik van 3.5 tot en met 45.
  3. Eerst vinden dieren onder fel licht te concentreren. Vervolgens onderzoeken dieren onder tl-licht bij lage vergroting (bv onder de doelstelling 1.5 x) met behulp van het gewenste filter. Onderzoeken van de plaat systematisch van linksboven naar rechtsonder om te scannen hele plaat voor fenotypen.
  4. Selecteer dier van belang en verander in 10 x doelstelling. Focus op de darm en gebruik zoom om te beoordelen van de tubulogenesis/lumen morfogenese fenotype. Zie hoofdstuk 5 voor het scoren van fenotypen. Eerst, het nemen van beelden bij lage vergroting. Schakel over naar de hoge vergroting.
    Opmerking: Aangezien gezonde dieren snel bewegen, werken snel, met één hand op de computermuis voor Beeldacquisitie terwijl het concentreren van de microscoop met de andere hand. Vertragen van dieren (bijvoorbeeld door voorbijgaande plaatsing van de platen tot 4 ° C) kan niet worden verlangd wanneer embryo's en larven van de vroege werken met tubulogenesis fenotypen in meestal aangehouden. De beelden kunnen worden vastgelegd door een Microscoop gemonteerde CCD camera en image capture software.

4. Beeldvorming van de darm C. elegans met hogere resolutie door laser scannen confocale microscopie 34 , 35

  1. montage en immobilisatie
    1. gebruik vingertop te dun verspreiden een kleine hoeveelheid vet of vaseline in een cirkel op een glasplaatje (~ 6-8 mm in diameter).
      Opmerking: Dikte van vet cirkel is essentieel voor montage. Voor beste resultaten imaging, image slechts één of enkele larven tegelijk en gebruik van een uiterst dunne vet cirkel met als weinig vloeistof mogelijk zodanig dat het dier rechtstreeks tussen de glasplaatje en cover slip vastzit (als perfect gedaan, dier zal worden geïmmobiliseerd zonder verdoving). Montage van eieren en oudere dieren vereist een iets dikkere cirkel om te voorkomen vernietiging van monster bij het toevoegen van dekking slip.
    2. Toevoegen van een druppel doorgaans 3,5 µL 10 mM natrium azide oplossing in het midden van de cirkel en kies wormen in het onder de Microscoop ontleden.
      Opmerking: Bereiden van een stamoplossing van 1 M natrium azide door het oplossen van 65.01 mg NaN3 in 1 ml dH 2 O; Voeg 200 µL van deze oplossing van 1M in 20 mL M9 buffer. Kies wormen snel in drop van natrium azide oplossing om te voorkomen dat de oplossing voor uitdrogen. Kies fasen apart voor optimale montage, die gericht zijn op ongeveer 50 embryo's per dia en ongeveer 20 larven bij de behandeling van de grotere populaties. Men kan gebruik maken van M9 in plaats van natrium azide oplossing bij het afhalen van de embryo's. Als met behulp van natriumazide, dieren beeld moeten worden binnen 30 minuten om te voorkomen dat weefselschade van dit giftige chemische.
      Let op: natriumazide is toxisch.
    3. Zachtjes zetten een 22 mm × 22 mm dekglaasje aan dia. Wees voorzichtig niet te verpletteren de wormen. Gebruik milde druk en controleer onder de Microscoop om ervoor te zorgen dat de wormen worden opgelost tussen dia en cover slip ontleden. Label de dia.
      Opmerking: De juiste hoeveelheid druk is van cruciaal belang om te voorkomen beschadiging van het specimen (teveel druk) en niet de vaststelling van het goed (te weinig druk: dieren drijven in plaats van het vasthouden aan de dia). Zwevende dieren beletsel in wezen juiste beeldvorming.
  2. Imaging
    1. plaats dia onder de confocal microscoop. Zoek naar wormen met 10 x doelstelling en focus.
      Opmerking: Gebruik fel licht te richten waar mogelijk te vermijden photobleaching.
    2. Verandering aan 60 x of 100 x doelstelling en de focus op de darm.
      Opmerking: De darm kan gemakkelijk worden geïdentificeerd onder fel licht door haar lumen loopt door het midden van het dier, van de keelholte naar de anus in de buurt van het puntje van de staart. Wees voorzichtig met het toepassen van olie voor de 60 x of 100 x olie doelstelling. Mengen van verschillende soorten oliën kan interfereren met verdere imaging. Plaats kleine daling van olie naar dia bij het gebruik van een rechtop Microscoop of naar de doelstelling bij het gebruik van een omgekeerde scope, niet te besmetten andere doelstellingen of delen van de Microscoop verzorgen.
    3. Stellen Kohler DIC/Nomarski verlichting voor de doelstelling om te worden gebruikt voor het scannen van 36. Inspecteer dier onder tl-licht met juiste kanaal om te controleren met het labelen van de darm en/of fenotype, controleren om te kiezen van geschikt model voor imaging. Werk snel om te voorkomen dat bleken.
    4. Schakelaar aan laser scannen moet potentiële afbeelding aan de darm te beperken door te stellen grenzen aan de dorsale en ventrale zijde scannen.
      Opmerking: De darm hierdoor Bracketing is van cruciaal belang als fluorophore ook structuren buiten de darm etiketten. Tijdens deze pilot scan, werken met snel scannen voorwaarden op avOID photobleaching.
    5. Stopzetten van het scannen Schakel scannen parameters voor het experiment. 6-20 secties voor intestinale scannen langs de z-as, bijvoorbeeld tussenpozen 0,2 µm, afhankelijk van de fase van de dierlijke en/of technische overwegingen onderzoek instellen Instellen van de frame gemiddeld per beeld afhankelijk van de complexiteit van labeling en vereist resolutie geluiddempingsinrichtingen.
      NB: Gegevens van de instelling afhankelijk van de Microscoop en experimenteren. Men kan behoefte om de hoeveelheid secties om te voorkomen dat bleken als uitvoert sequentiële scannen van drie verschillende fluorophores te verminderen. Aantal frames aan aantal secties (moet lager dan het aantal secties om beeldvervorming; ook wegen in de toename van de photobleaching) aanpassen. 4-6 frames zijn meestal voldoende.
    6. Terug naar de scannen met definitieve (langzaam) laser scannen voorwaarden en aan te passen: helderheid (minimale winst gebruik te verminderen achtergrond); laser macht (zo hoog mogelijk vereist, zo laag als - verhogingen photobleaching; meestal minimuminstelling is voldoende); Pinhole (opening vermijden zo niet vereist, om te handhaven van resolutie).
      Opmerking: Scannen voorwaarden afhankelijk van model en moeten worden empirisch bepaald aan het begin van de scanning sessie. Zorg ervoor dat helderheid verzadiging (zal beperken vermogen om de afbeelding later wijzigen beeldbewerkingssoftware) niet overschrijdt. Bij de opzet scannen voorwaarden, ook overwegen dat identieke omstandigheden moeten worden gebruikt voor alle imaging in experimenten die proefdieren met besturingselementen vergelijken.
    7. Capture afbeelding serie. Afbeeldingen samenvoegen in een enkele projectie beeld.
      Opmerking: Mogelijk moet opslaan projectie beelden en/of overlays afzonderlijk afhankelijk van Microscoop.
    8. Als meerkanaals opnamen gebruiken sequentiële scannen om te voorkomen bloeden-via tussen kanalen (kritische voor co lokalisatie studies).
      Opmerking: Afbeeldingsinstellingen moet mogelijk worden verwisseld gezien verhoogde photobleaching verbonden met meer scannen tijd.
    9. Altijd verwerven overeenkomstige DIC/Nomarski beelden (secties) voor monumenten en de algehele staat van morfologie van gescande dier.

5. Kwantificering van gepolariseerde biogenese van gebreken in de darm C. elegans

Opmerking: voorbeeld: basolaterale verplaatsing van apicale ERM-1::GFP en ectopische laterale lumen vorming geïnduceerd door laat-767 en APS-1 RNAi.

  1. Scoren fenotypen onder de ontleden Microscoop ( Figuur 5 A, D, E)
    1. definiëren categorieën om te scoren. Voorbeeld: (i) wild-type (WT), (ii) de basolaterale verplaatsing van ERM-1::GFP (polariteit defect), en (iii) ectopische lumen vorming (ontwikkelt na basolaterale verplaatsing).
      Opmerking: De visuele analyse van een lage vergroting leent zich voor het scoren van aantallen dieren met of zonder een specifieke fenotype. Hier, wij hebben gekozen een voorbeeld van drie kwalitatief verschillende fenotypische categorieën die op de dezelfde tijd indicatieve zijn van een verslechtering van de polariteit fenotype dat wordt geanalyseerd. Echter een scala aan verschillende kwalitatieve en kwantitatieve fenotypen kan gescoord worden, zoals het lumen morfogenese gebreken, afwezigheid/aanwezigheid (of getallen) van GFP positieve cytoplasmatische vacuolen, lumen diameter en formaat of aantal intralumenal cysten (Zie < sterke class = "xfig" > figuur 3 voor voorbeelden).
    2. Afhankelijk van omvang van de verwachte verschillen, score ongeveer 100 levende wormen op hun agar platen onder de Microscoop ontleden in een tweevoudige of drievoudige reeks experimenten.
      Opmerking: Moet een score van elk dier dat in beeld komt wanneer u scant platen systematisch, bijvoorbeeld van linksboven naar het lagere recht van de plaat (zorg ervoor dat wormen hebben bevolkt platen gelijkmatig).
    3. Herhaal dit voor 3 onafhankelijke sets van experimenten. Staafdiagram genereren en betekenis van de resultaten evalueren.
  2. Scoring fenotypen onder de confocal microscoop ( Figuur 5 B)
    1. definiëren categorieën voor scoren, b.v. aantal ectopische lumen per dier
      Opmerking: een hogere vergroting visuele analyse leent zich voor het scoren van een meetbare marker of fenotype per dier en laat scoren van subcellular markeringen die mogelijk niet waarneembaar door de ontrafeling van microscopie. Het huidige voorbeeld van ectopische lumen per dier in een subset van worms van hetzelfde experiment eerder geëvalueerd door de ontrafeling van de microscopie (5.1.1, categorie 3) tellen verfijnt de evaluatie van het verslechterende polariteit fenotype dat hier wordt onderzocht. Echter een verscheidenheid van andere fenotypen of parameters kan worden gescoord, b.v. aantal blaasjes, aanwezigheid/afwezigheid of aantal subcellular onderdelen die mede lokaliseren, de intensiteit van de fluorescentie (de laatste gekwantificeerd door ImageJ; Zie begeleidend papier op de uitscheidingsmechanisme kanaal), 2.
    2. Afhankelijk van de omvang van de verwachte verschillen, kwantificeren fenotypische marker (hier, ectopische lumen) in ongeveer 20 dieren in een tweevoudige of drievoudige reeks experimenten onder de confocal microscoop.
    3. Herhaling voor 3 onafhankelijke sets van experimenten. Genereren van staafdiagrammen en betekenis van de resultaten evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol wordt beschreven hoe moleculair analyseren en visualiseren van gepolariseerde membraan biogenese en lumen morfogenese in de darm van C. elegans , de eencellige als subcellular niveau. De twintig-cel single-gelaagde C. elegans darm wordt gevormd door gestuurde celdeling en migratie tijdens mid embryogenese. In deze tijd, gepolariseerde membraan domeinen worden vastgesteld, nog DOVO gepolariseerde biogenese blijft in de volwassen maar uitbreiden epitheel in vier larvale stadia tot volwassenheid, waardoor de analyse te richten op gepolariseerd biogenese (figuur 1A).

Om te visualiseren C. elegans cellulaire en subcellular onderdelen, twee strategieën worden vaak gebruikt: immunofluorescentie (gedetailleerd in dit protocol, punt 1; Figuur 2 , Figuur 4 d -F) en de expressie van fluorescentie fusion eiwitten (Zie het begeleidende document op uitscheidingsmechanisme kanaal gepolariseerde membraan biogenese2; Figuur 1B, Figuur 2, Figuur 4, 5C van de figuur). Dubbele meerdere labelen, het combineren van verschillende etiketten van elke of beide methoden, kunt oplossen door en membraan asymmetrieën zoals apicale en basolaterale membraan domeinen en de relatie van verschillende subcellular componenten aan elkaar (Figuur 2, Figuur 4 d-E). De membraan-cytoskelet linker ERM-1::GFP wordt hier als een indicator van de apicale membraan biogenese die met lumen morfogenese in deze single-gelaagde epitheel samenvalt. Met behulp van deze markering, een matrix van intestinale apicale membraan/lumen biogenese gebreken en hun tekorten oorzakelijke gen kan worden geïdentificeerd door verlies-van-functie studies, bijvoorbeeld door onbevooroordeelde genoom-brede schermen met behulp van RNAi (RNAi benaderingen aangenomen om de generatie van dergelijke fenotypen) worden beschreven in sectie 2 van dit protocol. Figuur 3 en Figuur 4 voorbeelden van lage tot matige vergroting beelden van apicale membraan/lumen biogenese fenotypen overgenomen door een ontleden fluorescentie Microscoop uitgerust met de doelstelling van een hoog vermogen; en van hogere vergroting beelden overgenomen door een confocale laser scanning microscoop (deze microscopische benaderingen worden beschreven in de punten 3 en 4). Als een voorbeeld van het kwantificeren van de gepolariseerde membraan biogenese defecten, de effecten van RNAi met laat-767 (codering een steroïde dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA-reductase) en aps-1 (de codering van de sigma subeenheid van de clathrin AP-1 adapter) op ERM-1::GFP lokalisatie en lumen positionering zijn afgebeeld in Figuur 5.

Figure 1
Figuur 1 : Cellulaire en subcellular structuur en morfogenese van het wild-type C. elegans darm. (A) Schematische van C. elegans intestinale ontwikkeling, cellulaire samenstelling, en endo- en plasma membranen. De darm C. elegans is klonaal gegenereerd vanuit de E-kerntransfer geboren in het stadium van de 8-cel. Na vier ronden van de celdeling, de 16 cellen (E16 fase) vorm een radially symmetrisch verdubbeld-gelaagd epitheel15. In dit stadium het cytoplasma van elke cel polariseert, met kernen verhuizen naar de toekomstige apicale en cytoplasmatische onderdelen de tegenovergestelde richting (toekomst basale), membraan domeinen. In één stap bekomt gaan links en rechts ventrale cellen (parallel) de dorsale cellaag vormen de bilateraal symmetrisch buis van 9 INT ringen. Elke cel wordt geconfronteerd en bouwt de lumen met haar apicale/lumenal membraan (groene; structureel onderscheiden door specifieke membraan microdomains, microvilli) en naburige cellen of de lichaamsholte met de basolaterale membraan (blauw), met uitzondering van de eerste contacten INT ring die wordt gevormd door vier cellen. Apicale kruispunten (rood) scheiden apicale en basolaterale membraan domeinen. Na bekomt blijft biogenese van DOVO samen met de groei van de darm tijdens late embryogenese en de vier larvale stadia in de volwassenheid, waarbij slechts minimale verdere groei optreedt (fase van gepolariseerde membraan onderhoud ). De vergrote eencellige geeft het endomembraansysteem met ER en Golgi boven de nucleus (N) en de endosomal vesikels. (B) DIC/Nomarski en confocal overlapping microfoto van de ontwikkelingslanden C. elegans darm aangeduid met de apicale membraan-cytoskelet markering ERM-1::GFP. De darm in het stadium van de komma wordt beschreven door een witte lijn (ERM-1::GFP wordt al zwak uitgedrukt in de apicale membraan aan het begin van bekomt maar kan niet worden gewaardeerd in deze afbeelding). Dieren omlaag hier en hieronder zijn weergegeven met anterior (hoofd) links, posterior (staart) recht, dorsal up, ventrale. Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Voorbeelden van twee- en driepersoonskamers labeling van de ontwikkelingslanden wild-type C. elegans darm met behulp van antilichamen en fusie-eiwitten. (A, B) Embryo's. (A) komma fase. PAR-6::GFP (groen, onderdeel van de apicale PAR polariteit complex), anti-PAR-3 antilichaam (rood/TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanaat); een ander onderdeel van de apicale PAR polariteit complexe) en MH33 (blauw/Cy5 (Cyanine5), anti-IFB-2/intermediate gefilamenteerd). PAR-6::GFP en de PAR-3 antilichaam label de apicale membraan van de darm van de C. elegans (haakjes). IFB-2, een andere apicale marker in latere stadia, is panmembraneously gelokaliseerd in dit vroege stadium. PAR-6::GFP en anti-PAR-3 ook label de keelholte (links); de intestinale lumen wordt aangegeven door hun overlap met IFB-2 (turkoois) en de intestinale buis is geschetst door blauwe anti-IFB-2 (rechts). (B) 2-fold stadium. AJM-1::GFP (groene; junction component), ICB4 antilichaam (rood/Alexa, ICB4 detecteert een onbekend membraneous intestinale antigeen). AJM-1::GFP etiketten de apicale kruispunten van de C. elegans darm, zichtbaar als peri-lumenal ladder patroon (het ook etiketten hypoderme kruispunten; sinds de afbeelding niet zichtbaar is gericht op de darm; Zie sectie 4, confocal imaging). ICB4 kleurt alle membranen van de darm C. elegans . Pijlen wijzen naar de basolaterale membraan gekleurd door anti-ICB4. (C, D) L2-larven. (C) laat-413::GFP (groen), phalloidin (rood/Texas-rood, een phallotoxin binden aan F-actine) en MH33 (blauw/Cyanine5, anti-IFB-2). LAAT-413/Scribble is een onderdeel van de basale polariteit complexe en lokaliseert aan basolaterale membraan van de darm van de C. elegans (haakjes). Phalloidin en het antilichaam IFB-2 label het apicale submembraneous cytoskelet van de darm van C. elegans (paars). Phalloidin kleurt ook sterk lichaam muur spieren, overweldigend de intestinale kleuring. Inzet toont hogere vergroting van de doos gebied. (E) L3 larve. SLCF-1::GFP (groene; integraal membRane component/suiker vervoerder), ERM-1::mCherry (rood) en MH27 antilichaam (blauw/Cyanine5, anti-AJM-1). SLCF-1::GFP etiketten het basolaterale membraan, terwijl ERM-1::mCherry etiketten de apicale membraan van de darm van de C. elegans (haakjes); AJM-1 etiketten zijn apicaal kruispunten. (F-F''') L2-larve. (F, F') Enkele kleurenafbeeldingen. SLCF-1::GFP (groen) etiketten het basolaterale membraan (laterale membranen aangeduid met dunne witte pijlen). MH27 (blauw/Cyanine5) etiketten apicale kruispunten (korte gele pijlen). (F"F''') Overlay afbeeldingen met en zonder actine. Inzetstukken Toon hoger vergroting van vakken. Opmerking duidelijk onderscheid van apicolateral hoek van intestinale cellen door deze verschillende membraan/junction markeringen die oppervlakkig in één kleurenbeelden (F, F'lijken). Dikke witte pijlen in F'''wijs van het cytoskelet van de apicale/lumenal actine gelabeld door phalloidin (anders overweldigd door spier actine). Alle afbeeldingen zijn confocal projecties (z-stacks van 0,2 µm), overgenomen door sequentiële scannen om te voorkomen bloeden-via tussen kanalen. Schaal bars (voor A-E, F-F'' ' en alle inzetstukken): 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Voorbeelden van C. elegans intestinale gepolariseerde membraan en lumen morfogenese gebreken bij lage tot matige vergroting (ontleden fluorescentie microfoto). Alle afbeeldingen zijn verworven door een ontleden fluorescente microscoop uitgerust met een op maat gemaakte high-power stereo fluorescentie-bijlage (Tabel van materialen). Verschillende vergrotingen worden weergegeven. Alle fenotypen werden verkregen door RNAi met verschillende genen in een stam aangeduid met ERM-1::GFP (gelokaliseerd op intestinale en uitscheidingsmechanisme kanaal apicale/lumenal membranen in embryonale en vroege larvale stadia, hier weergegeven). De intestinale lumen en polariteit fenotypen zijn: (A, B) Wild type embryo (A) en larve (B); (C, D) basolaterale verplaatsing van ERM-1::GFP; intestinale cellen worden vergroot en opgeblazen verschijnen in deze embryo (C, pijlen wijzen naar één intestinale cellen), maar zijn van wild-type grootte en regeling in deze larven (D, pijl wijst naar de laterale membranen tussen INT II en III); (E) verbreed en ingewikkelde lumen in drie embryo's; (F) ERM-1::GFP verbreden in laterale junction gebied (zigzag lumen) en in de intestinale cytoplasma waarin GFP-negatieve vacuolen (pijlen); (G) lumenal cysten inbetween intralumenal verklevingen (pijlen wijs twee cysten). (H) Cytoplasmic en basolaterale ERM-1::GFP zuigerverplaatsing met ectopische lumen (pijlen); (ik) ERM-1::GFP verplaatsing naar GFP-positieve puncta (pijlen) in het cytoplasma. Uitscheidingsmechanisme grachten en uitscheidingsmechanisme kanaal fenotypen zijn hier niet beschreven (kanaal wordt weergegeven aan de linkerkant, darm in alle afbeeldingen naar rechts). Schaal bars: 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Voorbeelden van C. elegans intestinale gepolariseerde membraan en lumen morfogenese gebreken aan hogere vergroting (confocal afbeeldingen). (A, C, E, G, I, K) Embryo's. (B, D, F, H, J, L) Larven. Alle fenotypen werden verkregen door RNAi met verschillende genen in een stam aangeduid met ERM-1::GFP (groen in alle afbeeldingen). Imaging richt zich op de darm. Beelden van embryo's tonen ook uitscheidingsmechanisme kanalen (links van de afbeelding), met inbegrip van kanaal fenotypen (niet beschreven). (A, B) Wild type embryo (A) en larve (B). (C) basolaterale verplaatsing van apicale ERM-1::GFP (komma fase; laat bekomt). (D) polariteit conversie: basolaterale verplaatsing van apicale ERM-1::GFP en apicaal accumulatie van basolaterale ICB4, geopenbaard door dubbele etikettering. F-actine (aangeduid door phalloidin-TRITC) schetst de dieren door de kleuring van de Musculus longitudinalis bundels (dier is triple label). (E) basolaterale verplaatsing van ERM-1::GFP in laat 3-voudig embryo. De apicale IFB-2-antilichamen (blauw/Cyanine5) geeft aan intact lumen en peri-lumenal Intermediaire filamenten. (F) ectopische lumen gelabeld door anti-IFB-2 (blauw/Cyanine5). (G) ERM-1::GFP negatieve vacuolen in intestinale cytoplasma. (H) de positieve vacuolen ERM-1::GFP in intestinale cytoplasma. (I, J) Afwezigheid van lumen in embryo's en larven, respectievelijk. (K) breed gut. (L) Cystic en ingewikkelde gut. (A, D, H, I, J, K, L) confocal projecties. (B, C, E, F) zijn van de confocal secties. Helderheid werd verhoogd in G Markeer cytoplasmatische vacuolen van GFP-negatief. Schaal bars: 10 µm (dezelfde voor alle embryo's en larven, respectievelijk). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Intestinale polariteit conversie en terugkeer: een voorbeeld voor de kwantificering van gepolariseerde membraan en lumen biogenese gebreken. (A, B, C) laat-767en aps-1RNAi, beide veroorzaken ERM-1::GFP basolaterale verplaatsing (BL) en ectopische lumen vorming (EL), maar op verschillende ontwikkelingsstadia. (A) kwantificering door het ontleden van Microscoop: tellen van embryo's (links) en larven (rechts) met polariteit fenotypen 2 dagen na het zaaien van wormen op RNAi platen. Opmerking: alle mock en let-767(RNAi) dieren zijn uitgekomen op dit moment (dus er zijn geen embryo's, die had, echter, alle wild-type polariteit; gebroken lijn kolommen). APS-1 RNAi induceert polariteit gebreken al in embryo's, overwegende dat laat-767RNAi hen in larven induceert. Het hogere percentage van ectopische lumen (vs basolaterale verplaatsing) in aps-1RNAi embryo's versus larven is te wijten aan de arrestatie van embryo's met ectopische lumen. (B) kwantificering door confocale microscopie: tellen van ectopische lumen per dier aan het begin van ectopische lumen ontwikkeling van het larven. laat-767 RNAi induceert meer ectopische lumen in de larven dan aps-1(aps-1RNAi larven zijn "werd" moeten niet arres RNAiTed als embryo's). (C) Confocal beelden voor wild-type larven en larven met ERM-1::GFP basolaterale verplaatsing (BL) en ectopische lumen (EL); schaal bar: 5µm. (D, E) polariteit terugkeer in laat-767RNAi dieren (tellen van de dieren met en zonder polariteit defect [BL/EL] door het ontleden van Microscoop). 20 let-767(RNAi) dieren met milde ectopische lumen fenotypen werden overgebracht van een RNAi plaat naar een OP50 plaat op dag 4 en geëvalueerd na 40 uur. (D) meer dan 50% larven hebben reverted voor wild-type polariteit (ERM-1 op het apicale membraan). (E) 20% van de dieren opgroeien dan het larvale stadium van L1 (let-767(RNAi) resultaten in L1 arrestatie). Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde +/-SEM, n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: Voorbeelden van markers voor het systeem van de larven en de volwassen intestinale membraan C. elegans 1.
Eiwit naam Subcellular Localisatie Eiwit structuur/functie Verkrijgbare C. elegans specifieke antilichamen (DSHB2) Voorbeelden van stammen beschikbaar op de CGC
OPT-2/PEPT-1 apicale transmembraan eiwit oligopeptide transporter KWN246 (pha-1(e2123) III, rnyEx133[opt-2(aa1-412)::
GFP) + pha-1(+)]
)
AQP-4 apicale transmembraan eiwit water kanaal
ERM-1 apicale brushborder membraan – cytoskelet linker ERM1
ACT-5 apicale brushborder cytoplasmatische actine (3)
IFB-2 apicale brushborder Intermediaire filamenten component MH33
EPS-8 apicale brushborder Human-Epidermal-growth-factor-receptor-kinase-Substrate-8 ortholog
PAR-6 apicale membraan apicale polariteit complexe component
SLCF-1 basolaterale transmembraan eiwit monocarboxylate transporter
AQP-1 basolaterale transmembraan eiwit water kanaal
LAAT-413 basolaterale membraan Krabbel homologe, adapter en polariteit determinant LET413
HMP-1 apicale junction (CCC4) Α-catenine, cadherine-catenine complexe component FT1609 (unc-119(ed3) III; xnIs528 [hmp-1p::hmp-1::
GFP + unc-119(+)]
)
HMR-1 apicale junction (CCC) E-cadherine, cadherine-catenine complexe component HMR1
AJM-1 apicale junction (DAC5) Junction integriteit molecuul, DLG-1/AJM-1complex component MH27 SU159 (jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)])
DLG-1 apicale junction (DAC) Schijven-grote homologe, MAGUK eiwit, DLG-1/AJM-1complex component DLG1
RAB-11 blaasjes endosomal mensenhandel6 RT311 (III unc-119 (ed3), pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119(+)])
RAB-5 blaasjes endosomal mensenhandel RT327 (III unc-119 (ed3), pwIs72 [pvha6::gfp::rab-5, Cbunc-119(+)])
RAB-7 blaasjes endosomal mensenhandel RT476 (III unc-119 (ed3), pwIs170 [vha6p::gfp::rab-7, Cbunc-119(+)])
RAB-10 blaasjes endosomal mensenhandel RT525 (III unc-119 (ed3), pwIs206 [pvha6::gfp::rab-10 Cbunc-119(+))
MANS Golgi Α-mannosidase II RT1315 (III unc-119 (ed3), pwIs503 [pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
1 Voorbeelden zijn geselecteerd uit bronnen die worden vermeld in tabel3.
2 Developmental Studies Hybridoma Bank.
3 Antilichamen tegen gewervelde actine cross-react.
4 CCC: cadherine-catenine complex; Lokaliseert het apicaal deel van de apicale kruising; overeenkomt met adherens junction (AJ).
5 DAC: DLG-1/AJM-1complex; Lokaliseert het basale deel van de apicale kruising; overeenkomt met strakke junction (TJ).
6 Zie voor extra vesikel-geassocieerde moleculen uitgedrukt in de darm ref (22).
Opmerking: niet alle moleculen zijn getest als fusie-eiwitten onder hun eigen initiatiefnemers of door antilichamen.
Tabel 2 : Voorbeelden van C. elegans darm-specifieke initiatiefnemers en tijd van meningsuiting1.
Initiatiefnemers Expressie fase
ELT-2 expressie in de 2 E cel fase begint en blijft bestaan in de volwassenheid
VHA-6 expressie begint in de late embryo en blijft bestaan in de volwassenheid
GES-1 expressie begint stadium ongeveer de 4E cel en blijft bestaan in de volwassenheid
einde-1 expressie begint na 1E cel etappe en daalt tijdens latere embryogenese
1 Voorbeelden zijn geselecteerd uit middelen die zijn vermeld in tabel 3.
Tabel 3: Middelen te vinden C. elegans darm-specifieke moleculen, labeling reagentia/spanningen en antilichamen.
1. Caenorhabditis genetica Center (CGC)42 voor beschikbaar reagentia en stammen
2. Wormbase43 voor informatie over darm-specifieke moleculen, stammen en antilichamen
3. Informa
tion over darm-specifieke moleculen20,44 4. Transgeneome website45 voor translationeel GFP fusion constructies 5. C. elegans expressie patroon46 voor transcriptionele GFP fusion constructies 6. nationale BioResource Project (NBRP)::C.elegans47 voor meer informatie over darm-specifieke initiatiefnemers 7. developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)48 voor C. elegans antilichamen 8. voor secundaire antilichamen en kleurstoffen zie referentie27,28

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe te combineren met standaard verlies-van-functie genetische/RNAi en (labeling en microscopische) benaderingen om te profiteren van het intestinaal epitheel van C. elegans als een model voor de visuele en moleculaire dissectie van in vivo imaging gepolariseerde membraan en lumen biogenese.

Labelen

Dit protocol richt zich op het antilichaam kleuring. In situ labeling door antilichamen is een zeer specifieke alternatieve benadering labelen door fluorescerende fusion eiwitten (beschreven in het begeleidende document op de biogenese van organellen uitscheidingsmechanisme kanaal)2. Hoewel antilichaam kleuring kan geen levende imaging, kan deze voorschrijven bevestiging voor de lokalisatie van een proteïne van belang (noch labeling methode doet geen fail). Vragen met betrekking tot voedselproductie en/of de subcellular localisatie van een eiwit kunnen bovendien, vaak in vaste dieren worden beoordeeld. Immunokleuring is handig voor double en meerdere labeling en kan worden gecombineerd met het labelen door fluorescerende fusion eiwitten als deze gevrijwaard te door de vereiste procedures voor fixatie en permeabilization blijven kunnen. De hier geschetste protocol staat meestal deze (Figuur 2). In situ labeling van vaste dieren door antilichamen of chemische vlekken kan ook voordelen bieden voor super-resolution microscopische technieken zoals STORM (stochastische optische wederopbouw microscopie). Immunofluorescentie detecteert het endogene antigeen en kan worden aangepast, bijvoorbeeld om te onderscheiden van specifieke posttranslationele proteïne wijzigingen. Het kan produceren snelle resultaten als antilichamen beschikbaar, een keer zijn in situ kleuring technieken - niet als eenvoudig in C. elegans exemplaren zoals in de cultuur van de cel - zijn vastgesteld.

De generatie van een nieuwe antilichaam (hier niet beschreven) is echter tijdrovend. Helaas, de selectie van verkrijgbare C. elegans primaire antilichamen blijft vrij klein en niet alle zijn kundig voor speurder het antigeen in situ (Zie tabel 1 voor voorbeelden van antilichamen aangetoond detecteren van intestinale antigenen in situ, en tabel 3 voor aanvullende bronnen). Meeste antilichamen tegen gewervelde antigenen gegenereerd zal niet cross-react met hun C. elegans homologen. De selectie van secundaire antilichamen moet rekening worden gehouden met de soort van het eerste antilichaam (besproken in algemene immunofluorescentie protocollen27,,28). Grote selecties zijn commercieel verkrijgbaar met fluorescente kleurstoffen (b.v. Alexa-Fluor kleurstoffen) continu te verbeteren. Voor geoptimaliseerd kleuring, kleurstoffen kunnen worden geselecteerd voor hun vermogen om te voldoen aan de Microscoop gebruikt voor imaging, bijvoorbeeld de laser van de confocal microscoop, of, als super resolutie microscopie is ook gepland, hun vermogen om te "blink"37. Direct gelabelde primaire antilichamen of chemische vlekken (bijvoorbeeld fluorescently label phalloidin) zijn ook verkrijgbaar en zijn vooral nuttig voor dubbele kleuring.

De moeilijkheid voor in situ antilichamen tegen vlekken in C. elegans is de ondoordringbaarheid van de embryo's eierschaal en de larvale/volwassene cuticle dat beide chemische en/of mechanische verstoring van toegang van het antilichaam aan het weefsel vereisen. Hoewel complexe vloeibare antilichaam kleuring protocollen zijn ontwikkeld om op te lossen dit probleem27,28, bevatten de meeste collagenase voor permeabilization, die de neiging om het te onderzoeken weefsel schade. De hier beschreven methode van bevriezing-crack is daarentegen een eenvoudige manier om van de worm nagelriemen of eierschalen te openen. Het is uitgevoerd direct op het glas schuif waar de specimens worden verzameld (en waar de rest van de kleuring ook wordt uitgevoerd) en werkt bijzonder goed voor de eitjes en larven die stok best op glas dia's (dat wil zeggen de stadia overwegend onderzocht in tubulogenesis studies). Het ook interfereert niet met het behoud van fluorophore-label fusie-eiwitten. De techniek vereist enige handigheid, als de juiste druk op het dekglaasje aan (vóór flicking) en het vermijden van shear druk zijn van cruciaal belang voor het behoud van het model (zoals zachte behandeling en pipetteren gedurende de gehele procedure van de kleuring).

Fixatie voorwaarden wellicht worden empirisch bepaald en aangepast voor de structuur/antigeen dat moet worden gekleurd (besproken in27). Milder (b.v. formaldehyde gebaseerde) fixatie technieken kunnen beter bewaren van antigenicity, hoewel dit moet worden afgewogen tegen de noodzaak om weefsel morfologie, kritisch voor de analyse van de voedselproductie. Milder fixatie voorwaarden ook hulp voor het behoud van fluorescerende fusion eiwitten in dubbele labeling experimenten. Het bedrag van het blokkeren van de agent (bijvoorbeeld melk of boviene serum albumine/BSA) en afwasmiddel in de wash-oplossing vereist ook empirische aanpassing aan het evenwicht van de achtergrond met een specifieke kleuring. Informatie over algemene aspecten van immunofluorescentie technieken, bijvoorbeeld een bespreking van verschillende kleuring technieken, ontwerp van de passende controles en tips voor het optimaliseren van deze procedures voor worm darmen (bijvoorbeeld intestinale minimaliseren autofluorescence) kan worden gevonden in het algemeen en C. elegans specifieke immunofluorescentie protocollen, waarnaar wordt verwezen in de gehele.

Interferentie met genfunctie en evaluatie van tubulogenesis fenotypes

Dit protocol hoogtepunten specifieke RNAi benaderingen die nuttig zijn bij de beoordeling van genen met vroege en alomtegenwoordige en essentiële functies, waarvan gedeeltelijke (in plaats van volledige) verlies meest informatief, is zoals het geval voor de meeste tubulogenesis genen (ons genoom-brede scherm op ERM-1::GFP-gelabelde darmen gesuggereerd dat interferentie met de oorzaken van dergelijke genen > 90% van alle informatieve tubulogenesis fenotypen in deze bepaalde instelling12). De vele voordelen die C. elegans voor genetische manipulaties biedt (b.v. haar korte generatietijd) en de verschillende benaderingen genfunctie door vooruit (beginnend met de functie/fenotype) erover en reverse (beginnen met de Gene) genetische benaderingen worden besproken in de algemene C. elegans literatuur31,38. De beschikbaarheid van verkrijgbare genoom-brede RNAi voederen bibliotheken ook maakt het mogelijk om het gebruik van deze omgekeerde genetische techniek als een instrument naar voren genetische screening (Zie Tabel van materialen voor resources). De specifieke voordelen van RNAi voor de analyse van tubulogenesis omvatten de capaciteit: voor het genereren van een aantal fenotypen gelijkwaardig is aan een mutant allèlique reeks (dit meestal werkt goed voor dosisafhankelijk morfogenese genen); verwijderen van maternale RNAs (meestal betrokken in de vroege genuitdrukking/tubulogenesis); fase-specifiek mengen (nuttig voor de beoordeling van effecten op de biogenese van organellen gepolariseerde tijdens postmitotic larval groei).

Informatie over algemene aspecten van RNAi procedures worden besproken in de refs (26,s = "xref" > 31). Sleutel voor de analyse van dodelijke tubulogenesis fenotypen is de mogelijkheid om het moduleren van RNAi voorwaarden te verhogen van het spectrum van fenotypen. Informatieve tubulogenesis fenotypen kunnen meestal worden gegenereerd op een wild-type achtergrond zonder de behoefte aan darm-specifieke RNAi stammen39. Zijn beschikbaar als dit mislukt echter dergelijke stammen en kunnen ook worden gebruikt om te onderscheiden cel-autonome uit niet-zelfstandige effecten. Verschillende benaderingen voor het moduleren van de kracht van RNAi zijn gemeld, bijvoorbeeld de titratie van IPTG concentraties voor inductie van dsRNA, een aanpak die de meest reproduceerbare resultaten30kan produceren. Echter, kwantitatief exacte titratie kan niet nodig zijn bij het streven het genereren van een spectrum van verschillende fenotypes. Over het algemeen het succes van deze analyse is niet zozeer afhankelijk van het maximaliseren van het effect van RNAi aangezien er over het bepalen van RNAi voorwaarden die het genereren van een informatieve spectrum van fenotypen (die kunnen vaak het resultaat van suboptimaal (bijvoorbeeld milder) RNAi voorwaarden).

Voor de visuele beoordeling van tubulogenesis fenotypen geïnduceerd door RNAi is het belangrijk om te bepalen van de optimale venster voor fenotypische evaluatie. Het is het beste om te beginnen met het evalueren van de platen vroeg (bijvoorbeeld twee dagen na het plukken van de dieren aan hun RNAi platen onder standaardomstandigheden RNAi) en om ze lang genoeg zijn voor mogelijke late effecten te volgen. Een ontwikkelingstoxiciteit tijdsverloop van een verslechterende polariteit defect, bijvoorbeeld, moet betrekking hebben op 3-7 dagen in de typisch gearresteerd larven. Voorwaarden voor de analyse van gepolariseerde biogenese van organellen in postmitotic niet-delende cellen van de larvale darm kunnen verder worden verbeterd bij het gebruik van mutanten of RNAi dieren met vertraagd groei (zoals, bijvoorbeeld, let-767(RNAi) of mutant dieren 12, Figuur 5). Een tijdsverloop moet worden afgebroken als F2 dieren verschijnen (kunt verwijderen L4s in experimenten, waar de meeste maar niet alle dieren als larven arresteren). Elk experiment vereist de gelijktijdige evaluatie van passende positieve en negatieve controles (bijvoorbeeld bacteriële RNAi klonen die veroorzaken een gedefinieerde tubulogenesis fenotype en lege vector of gecodeerde RNAi klonen, respectievelijk). Een ander vereiste voor evaluatie is een voldoende brood grootte (minstens 50). Als niet wordt voldaan, kunnen andere voorwaarden (bijvoorbeeld voorwaardelijke) RNAi worden geprobeerd. Tot slot enkele bijzonder interessante tubulogenesis fenotypen optreden bij lage doordringendheid, dus een voldoende aantal dieren moet worden geëvalueerd.

Microscopie

Lage tot matige vergroting ontrafeling van fluorescent microscopie en hoge vergroting confocale microscopie, de twee imaging standaardprocedures hier beschreven, volstaan meestal te karakteriseren van de fundamentele aspecten van een buis of lumen fenotype in de C.elegans darm en kan ook worden gebruikt om visueel scherm grotere soorten dieren in voorwaartse schermen. Ontrafeling van de fluorescentie microscopie toelaat: in vivo imaging van dieren op hun platen (echter levende dieren, Transient geïmmobiliseerd door verdoving, kunnen ook worden verhaald mounts na confocal of DIC imaging); screenen van grote sets van dieren; bijhouden van ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen (bijvoorbeeld de verplaatsing en vervanging van een gepolariseerde markering tijdens membraan uitbreiding); het volgen van specifieke expressiepatronen (sommige patronen en asymmetrieën beter onderscheiden zich bij lagere vergroting); selecteren en plukken van fluorescerende wormen geschikt voor verdere analyse (bijvoorbeeld confocale microscopie) of voor onderhoud van extrachromosomal transgenen. Visualisatie op hoge vergroting door confocale microscopie vliegvergunningen karakteriseren het fenotype de eencellige als subcellular niveau. Dit protocol beschrijft imaging met een laser confocal microscoop dat de beste confocality over alternatieven, zoals een draaiende schijf confocal microscoop biedt scannen. Een draaiende schijf confocal microscoop is echter de Microscoop van keuze voor dynamische en time-lapse studies omdat het minder fototoxiciteit induceert (Zie refs (34,35) voor verdere bespreking van lage en hoge vergroting microscopie in C. elegans). Roman, alsmede conventionele microscopische technieken bieden extra voordelen en toestaan dat beeldvorming op hogere resolutie in het bereik van de nanoschaal (bijvoorbeeld transmission electron en super resolutie microscopie; besproken in37, 40).

Wanneer imaging C. elegans darmen onder een confocal microscoop, is montage en immobilisatie cruciaal. Onder verschillende chemische stoffen voor immobilisatie werkt natriumazide - hoewel giftige - meeste betrouwbaar als onmiddellijk scannen gebeurt. Levamisole, produceert hoewel niet giftig, hypercontraction die soms met de evaluatie van de morfogenese fenotypen interfereert. Sommige verdoving membraan-geassocieerde fluorescente proteïnen kunnen verstoren en artefacten die als polariteit gebreken uitzien misschien kunnen produceren. C. elegans is een dikke specimen en dus 3D analyse (segmentering) is essentieel om te profiteren van de specifieke kracht van de intestinale tubulaire epitheel waarmee uitstekende visualisatie van apicale kruispunten en de laterale membraan (niet gemakkelijk toegankelijk in platte epitheel). Confocale instellingen moeten worden aangepast voor elke dia en de doelstelling om goede kwaliteitsbeelden, met inbegrip van parameters zoals bracketing, gemiddeld, laser macht, winst, gaatje en helderheid. Een specifiek probleem voor intestinale imaging is van dit orgel inhoud van autofluorescent van de groen/gele korrels (lysosoom gerelateerde organellen (LROs)) die kunnen interfereren met de interpretatie van resultaten, met name bij de beoordeling van de verplaatsing van GFP-geëtiketteerden endo - en plasma-membraan bijbehorende onderdelen. Dit probleem goed wordt herkend in het veld en kan worden aangepakt door verschillende benaderingen (afhankelijk van Microscoop), met inbegrip van de DAPI uitsluiting spectrale vingerafdrukken en empirische scanner instellingen13,41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij danken Mario de Bono (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, USA), Michel Labouesse (Institut de Biologie Parijs Seine, Université Pierre et Marie Curie, Parijs, Frankrijk), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Frankrijk) en de CGC, gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440), voor spanningen en antilichamen. Dit werk werd gesteund door subsidies NIH GM078653, MGH IS 224570 en 223809 van de stabilisatie-en associatieovereenkomst te V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody staining
poly-L-lysine Sigma P5899
Methanol Fisher Scientific A452-4
Acetone Fisher Scientific A949SK-4
Tween Fisher Scientific 50-213-612
Permount Fisher Scientific SP15-100
Powdered milk Sigma MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
Microscope slides Fisher Scientific 4448
Microscope coverslips (22x22-1) Fisher Scientific 12-542-B
C. elegans related see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates see reference29 for protocols.
Tryptone Acros Organics 611845000
Yeast Extract BD Biosciences 212750
NaCl Sigma S7653
Bacto Agar BD Biosciences 214040
Ampicillin Sigma A0116
Tetracycline Fisher Scientific BP912
M9 Medium see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
KH2PO4 Sigma P0662
Na2HPO4 Sigma S7907
MgSO4 Sigma M2773
NGM plates see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
RNAi plates see reference30 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
IPTG US Biological I8500
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
NaOH Fisher Scientific SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
Imaging related
Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
Equipment
dissecting microscope Nikon SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (11), 887-901 (2008).
  2. Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE. (2017).
  3. Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, (4), 225-242 (2014).
  4. Mellman, I., Nelson, W. J. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (11), 833-845 (2008).
  5. Nelson, W. J. Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity. Nature. 422, 766-774 (2003).
  6. Goldstein, B., Macara, I. G. The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization. Dev. Cell. 13, (5), 609-622 (2007).
  7. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Organization of vesicular trafficking in epithelia. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, (3), 233-247 (2005).
  8. Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends Cell Biol. 13, (4), 169-176 (2003).
  9. Tepass, U. The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).
  10. Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. Polarity and endocytosis: reciprocal regulation. Trends Cell Biol. 20, (8), 445-452 (2010).
  11. Bryant, D. M. A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen. Nat. Cell Biol. 12, (11), 1035-1045 (2010).
  12. Zhang, H. Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis. Nat. Cell Biol. 13, (10), 1189-1201 (2011).
  13. Zhang, H. Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis. Development. 139, (11), 2071-2083 (2012).
  14. Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes. PLoS Genet. 12, (4), e1005950 (2016).
  15. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Dev. Biol. 216, (1), 114-134 (1999).
  16. Altun, Z. F., Hall, D. H. Alimentary system, intestine. WormAtlas. (2009).
  17. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, (1), 110-156 (1977).
  18. Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract. Dev. Cell. 14, (4), 559-569 (2008).
  19. Maduro, M. F. Gut development in C. elegans. Seminars in cell & developmental biology. (2017).
  20. McGhee, J. D. The Caenorhabditis elegans intestine. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2, (3), 347-367 (2013).
  21. Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  22. Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  23. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6, (6), 865-873 (2004).
  24. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, (4), 276-287 (2010).
  25. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  26. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, (1-2), 103-112 (2001).
  27. Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).
  28. JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  29. T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  30. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, (1), RESEARCH0002 (2001).
  31. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  32. Simmer, F. Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, (15), 1317-1319 (2002).
  33. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427, (6975), 645-649 (2004).
  34. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  35. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  36. Netherlands, S. Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. Springer. Netherlands. (2008).
  37. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).
  38. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).
  39. Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions. Cell Cycle. 15, (5), 654-666 (2016).
  40. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).
  41. Shi, A., Grant, B. D. In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).
  42. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  43. Wormbase. http://www.wormbase.org/ (2017).
  44. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2007).
  45. Transgeneome website. https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). http://dshb.biology.uiowa.edu (2017).
  49. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, (4), 313-321 (2003).
  50. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, (6920), 231-237 (2003).
  51. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, (10B), 2162-2168 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics