Author Produced

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vila-Cejudo, M., Ibañez, E., Santalo, J. Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56171, doi:10.3791/56171 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

העכבר בתאי גזע עובריים (mESC) נגזרת הוא התהליך על ידי pluripotent אשר נקבעו שורות תאים מעוברים. קווים אלה שומרים על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים. בשל תכונות אלו, mESC הם כלי שימושי ב רפואה רגנרטיבית, מידול המחלה ולימודי הנדסת רקמות. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט להשיג mESC קווים עם יעילות גבוהה נגזרת (60-80%) מאת culturing blastocysts מן העכבר מתירניות זני מזין בתאים במדיום מוגדר עם לוקמיה מעכבות פקטור. הפרוטוקול ניתן גם ליישם ביעילות שואבים mESC קווים העכבר מתירני זנים, תוספת פשוטה של קוקטייל של שני מעכבי מולקולה קטנה למדיום נגזרת (2i בינוני). הליכים מפורטים על ההכנה ועל התרבות של תאים מזין, איסוף של תרבות של העכבר עוברי, נגזרת של התרבות mESC קווים הינם מסופקים. פרוטוקול זה אינו מצריך ציוד מיוחד, יכול להתבצע במעבדה כלשהי עם מומחיות תרבות בסיסיים בתרבית של תאים.

Introduction

תאי גזע עובריים (ESC) הם תאים pluripotent נגזר של עוברי, אשר לשמור על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים1. בהתבסס על מאפיינים אלה, ESC הפכו להיות כלי שימושי עבור רפואה רגנרטיבית מידול המחלה, לימודי הנדסת רקמות2.

ESC נשאבו בפעם הראשונה מעוברים עכבר של, שמקורם קווים העכבר ESC (mESC) עם3,הצלחה נמוך4. במשך שנים, היעילות נגזרת נשאר נמוך בשל הקושי של שמירה על pluripotency חוץ גופית בתוך. חוץ מזה הנוכחות של מזין תאים5, אשר לשפר את יעילות נגזרת, לקדם את המושבה המצורף, לשפר את יציבות karyotypic6, מספר שינויים ההפניה פרוטוקול על שיפור בתחזוקת pluripotency. החשוב ביותר היה התוספת של לוקמיה מעכבים מקדם (LIF) mESC תרבות בינוני7,8, השימוש של העוברים רקע מתירניות 129S29 ומוגדר התרבות של mESC בינונית בתוספת סרום, ללא פוטנציאל התמיינות גורמים10. לאחרונה, ראיות משכנעות הראו כי תוספת של קוקטייל של שני מאפננים מולקולה קטנה של איתות המסלולים למדיום תרבות mESC (המכונה 2i) הוא הטוב ביותר לשמור על pluripotency. 2i קוקטייל כוללת שילוב של החומר המדכא MEK PD0325901, אשר מפחית את האותות בידול על ידי עיכוב מסלול מופעל mitogen חלבון קינאז (MAPK), החומר המדכא GSK3β CHIR99021, אשר משפר הישרדות cell-צפיפות נמוכה על ידי הפעלת מסלול ונ ט11.

במאמר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ביעילות לנבוע mESC קווים העכבר blastocysts. אנו עוקבים אחר הליכים סטנדרטיים, culturing העוברים מן מתירניות זני מזין בתאים נגזרת בינוני עם LIF, החלפת סרום12. בעקבות זה לפרוטוקול, שורות mESC יכולות לנבוע עם היעילות מקבילה לאלו שהושגו 2i בינוני. למרות זאת, ניתן להוסיף 2i כדי למנוע בעיות אפשריות עם pluripotency תחזוקה או בעת עבודה עם זנים שאינם מתירניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש של בעלי החיים המתוארים בסעיפים שלהלן אושרה על ידי ועדת האתיקה על חיות והמחקר האנושי של ברצלונה דה Autònoma Universitat ועל ידי Departament d ' פסקה חקלאיות וציוד, Ramaderia, אני Alimentació של Generalitat דה קטלוניה (פרוטוקול #8741).

1. מזין תאים איון ואחסון

הערה: העורלה האנושי fibroblasts (HFF-1) היו בעבר קפוא 1 מ"ל של הקפאה פתרון בהיקף של 90% סרום שור עוברית (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד ( דימתיל סולפוקסיד) והם מאוחסנים חנקן נוזלי עד שימוש.

  1. להפשיר בקבוקון קריוגני HFF-1 (1 מ"ל) במועט המבחנה באמבט מים 37 ° C.
  2. להוסיף את תכולת המבחנה קריוגני המופשרים ומחוממת מראש Dulbecco ' s נשר שונה ' s בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS לעשות 1:10 דילול.
  3. זרע התאים מדולל (10 מ"ל) בבקבוקון T75 ואת תרבות אותן ב- CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  4. למחרת, לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.
  5. תרבות HFFs את ולשנות את המדיום כל 48 שעות עד התרבות מגיע השלב confluent. פעולה זו עשויה להימשך כ- 7 עד 10 ימים.
  6. להכין את הפתרון איון, לדלל מיטומיצין C ב- DMEM בתוספת 10% FBS-ריכוז סופי של 10 µg/mL. דגירה התאים עם הפתרון איון עבור h 3-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2.
  7. להסיר הפתרון איון ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) כדי לסלק שאריות מיטומיצין C.
  8. כדי לנתק את התאים מוחלש, להוסיף 1 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA ומחוממת מראש ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  9. לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח שהן מנותק (10 x המטרה עם מפתח נומרי או נה 0.3). אם הם לא, דגירה אותם במשך עוד כמה דקות-CO 37 ° C ו-5% 2. בדוק את התאים שוב תחת המיקרוסקופ הפוך.
  10. Pipette את הפתרון עם פיפטה פסטר על מנת לבטל כגיהנום תא.
  11. לנטרל את הפתרון אנזימטי על-ידי הוספת 4 מ ל בתוספת 10% FBS ו resuspend DMEM.
  12. לקחת את aliquot של התליה תא ולעשות לדילול בטחונות ב- HBSS. כדי לקבוע את מספר התאים, טען µL 10 של הדילול נויבאואר ' s קאמרית. לספור את התאים הממוקם באחד הריבועים הגדול של התא תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 x המטרה עם נה 0.45).
    1. לחזור על הספירה סך של ארבעה ריבועים גדולים. לחשב את המספר הכולל של תאים (N) כמו N = מספר ממוצע של תאים ספרתי x הנפח הכולל x דילול x 10 4.
  13. Centrifuge לשאר המדגם למשך 5 דקות ב 200 x ג' להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם מקפיא פתרון ריכוז 10 6 תאים לכל mL-
  14. Aliquot התליה של מבחנות הקפאה עם 10 6 תאים (1 מ"ל) כל. מקם את הבקבוקונים קריוגני במיכל ההקפאה ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס
  15. למחרת, לאחסן את הבקבוקונים הקפאה בחנקן נוזלי.

2. תרבית תאים מזין

  1. 1-4 ימים לפני התחלת תהליך נגזרת, הפשרה בקבוקון קריוגני המכיל 1 x 10 6 להשבית HFF-1 תאים בתוך אמבט מים ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. לגרום לדילול 1:6 המופשרים HFF 1-מראש חימם DMEM בתוספת 10% FBS ולשמור הטמפרטורה ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. מלא בכל טוב של צלחת 4-ובכן עם 500 µL של ג'לטין מראש ומחוממת 0.2% מן העור חזירי ולשמור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות
  4. להסיר את µL 500 של ג'לטין מן הבארות ולהוסיף 500 µL של דילול HFFs. רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח התפלגות אחידה של HFFs על החלק התחתון של הבארות. להימנע בתנועות סיבוביות, אחרת התאים יתרכז במרכז הבאר.
  5. דגירה את הצלחת לפחות 24 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי להשיג של טפט של HFFs לא מופעל כל היטב.
  6. למחרת, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה (10 X המטרה עם נה 0.3) ולבדוק כי הם מחוברים, homogeneously מבוזרת. לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 500 µL של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.

3. אוסף העובר ותרבות

  1. 4 ימים לפני אוסף העובר, לנהל 5 IU של סוסה הרה ' s גונדוטרופין סרום בזריקה בקרום הבטן לעכברים נקבה שבוע 6-12.
    הערה: השתמשנו נקבות 129S2 או זנים B6CFAF1, למרות נקבות מפני זנים אחרים העכבר יכול לשמש. ובכל זאת, כאשר עובדים עם הנקבות ממתירני זנים (למשל כקבוצת), בינוני יש להשלימה עם 2i כאמור בשלב 4.2.
  2. לאחר 48 שעות, לנהל 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי על-ידי הזרקת בקרום הבטן, חבר הנקבות עם גברים, זקנים, ביחס של 1:1 לפחות 8 שבועות. להפריד בין הנקבות מן הזכרים למחרת.
  3. יום לפני איסוף העובר, להכין תרבות 35 מ מ תא צלחת פטרי עם מספר 40 טיפות µL בינוני KSOMaag בתוספת 4 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA), למלא את הצלחת עם שמן מינרלי כדי כיסוי מלא הטיפות. דגירה המנה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי equilibrate של המדיום.
  4. להכין את העובר מניפולציה פיפטות, מחממים את חלק רזה זכוכית ארוך שקצהו פיפטה פסטר באמצעות מבער בונזן. ברגע רכים, מסירים אותה מן הלהבה ו להפריד את שני הקצוות. לשבור את זה עד לאורך הרצוי. הקוטר הפנימי בקצה צריך להיות 100-150 מיקרומטר.
  5. המתת חסד העכברים נקבה על ידי נקע בצוואר הרחם 45-48 h פוסט-coitum (p.c.).
  6. לנתח העכברים לחשוף את חלל הבטן על ידי חיתוך העור עם מספריים חדות מעוקלים חלקה ו של הצפק עם מספריים חדות ישר. תפוס את הרחם אחת עם מלקחיים, לחתוך את oviduct באמצעות מספריים חדות ישר, ולמקם אותו בינוני (HCZB) CZB Hepes באגירה 13-37 ° C. חזור על התהליך כדי להסיר את oviduct אחרים.
  7. סומק oviducts עם מזרק 1 מ"ל עמוסה HCZB שנערך במקום על ידי שען מלקחיים כדי לאסוף את העוברים 2-תא.
    הערה: כדי להכין לקחת מחט שטיפה מחט תת-עורית 30 גרם, לחתוך את הקצה על הקרקע עד קצה קהה על אבן שוחקים.
  8. באמצעות המנגנון פיפטה בפה, לאסוף את העוברים, לכבס אותם במים HCZB, תרבות אותם בצלחת תרבות העובר מוכן קודם לכן ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 עד לשלב הבלסטוציסט. עד 50 עוברי יכול להיות בתרבית בתוך כל טיפה 40 µL. לעקוב אחר התפתחות העובר בכל 24 שעות תחת stereomicroscope.
    הערה: לחלופין, העוברים ניתן לאסוף בשלב הבלסטוציסט כדי לקצר במבחנה העובר תרבות. במקרה זה, המתת חסד הנקבות ביום 3.5-4.5 p.c., לנתח את הרחם. מדובר עם HCZB.

4. תא גזע נגזרת

  1. הכנה של הלוחות נגזרת
    1. ביום של העובר זריעה, להכין המדיום נגזרת על ידי שכשהם DMEM בינוני עם 100 מיקרומטר 2-β mercaptoethanol, 1 x חומצות אמינו שאינם חיוניים , 20% של החלפת סרום ו- 10 3 U/mL LIF.
    2. במידת הצורך, גם להוסיף 1 מיקרומטר של המדכא MEK PD0325901 ו-3 מיקרומטר של המדכא GSK3 CHIR99021 כדי לקבל מדיום 2i.
    3. לוקח את הצלחת 4-ובכן עם טפט של HFFs מוחלש (שלב 2.6) מ חממה. להסיר את המדיום ולהוסיף µL 800 נגזרת מראש ומחוממת בינוני כל טוב. להחזיר את הצלחת החממה.
  2. העובר זריעה וניקוי Zona pellucida
    1. הכנת תרבית תאים של 35 מ מ צלחת פטרי עם µL 30 שלוש טיפות של Tyrode חומצי ' s פתרון 14 ו- µL 30 שלוש טיפות של גזירת בינוני. לכסות את הטיפות עם שמן מינרלי ולשמור את המנה ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. קח את הצלחת תרבות העובר מן החממה. אחד אחרי השני, להעביר blastocysts את הטיפות התרבות Tyrode חומצי ' s פתרון טיפה באמצעות פיפטה מניפולציה של העובר. אם אפשר, בחר רק את blastocysts מורחבת כדי להתחיל את תהליך הערכת.
    3. לפקח על העיכול zona pellucida תחת stereomicroscope. ברגע pellucida zona נעלמת, להעביר את הבלסטוציסט ירידה בינונית נגזרת על מנת לשטוף את Tyrode חומצי ' פתרון s.
    4. לוקח את הצלחת 4-ובכן נגזרת מן החממה ואת זרע אחד נטול zona הבלסטוציסט במזין תאים היטב לכל.
    5. להחזיר את הצלחת נגזרת 4-ובכן חממה והתרבות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  3. בינוני וצמיחה של תאי גזע ניטור לשנות
    1. לפקח על התרבויות כל 24 שעות תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 X המטרה עם נה 0.45). חשוב לשים לב אם קיימים סימנים של התמיינות תאי גזע, כגון נפוחות השבירה תאים המקיפים את תוצר או אפילו שדחקו את המזין תאים הצידה.
    2. בכל יום אחר, לשנות את המדיום של התרבות. לוקח את הצלחת 4-ובכן מן החממה, להסיר את המדיום מכל קידוח ולהוסיף µL 800 בינוני נגזרת מראש ומחוממת עם LIF ו- 2i, אם נעשה שימוש. לשמור על התרבות עד outgrowths שנצפו (6-8 ימים).

5. תא גזע תרבות ותחזוקה

  1. הכנת Kolle כמו ידיות, פיפטות מניפולציה תאי גזע. בצע צעד 3.4 להכין את תאי הגזע פיפטות מניפולציה בקוטר הפנימי בקצה של 250-300 מיקרומטר. השתמש החלק השני של פיפטה פסטר משך כדי להכין את הידית, כמו Kolle. מחממים ולעצב אותו עד קבלת וו.
  2. לוקח את הצלחת. ובכן 4 תרבות מתוך החממה ואתר את תוצר תחת stereomicroscope. להשתמש בידית כדי להרחיק את התאים הבדיל ומזינים את המקיפים את תוצר.
    הערה: כדי להימנע בסופו של דבר הבידול של תוצר, חשוב להסיר את כל התאים הבדיל מהקצה של תוצר.
  3. וארוקן את תוצר עם פיפטה מניפולציה תאי גזע ולמקם אותו תבשיל חדש בטיפה טריפסין-EDTA 50 µL-
  4. השימוש באזמל לחתוך את תוצר בכמה חלקים על מנת disaggregate זה מכנית והן enzymatically.
  5. מיד, להעביר את שברי תוצר לתוך טיפה טריים של גזירת בינוני לנטרל טריפסין פעולה.
  6. להעביר השברים תוצר צלחת 4-ובכן חדשה עם טפט של מזינים. להעביר עד 10 קטעים מפוצלים טוב ואת תרבות אותם עם נביעה בינוני-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  7. לשמור על התרבויות תאי גזע דמוי לפחות שישה שבועות לפני בהתחשב הקו mESC הוקמה. לשנות המדיום. כל יום, תת-תרבות אחרים אותם פעם בשבוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות פרוטוקול זה, מעל 95% תוצר היווצרות צריך להיות מושגת לאחר השבוע הראשון של תרבות (איור 1 א'). הקמת קווי mESC לאחר 6 מעברים הוא משתנה בין משכפל ניסיוני, עם הצלחה ממוצע של 60-80%. התוספת של 2i לא באופן משמעותי לשפר את התוצאות בעת עבודה עם עכבר מתירניות זנים, כגון אלה עם רקע 129S2, אבל זה הכרחי בעת עבודה עם זנים שאינם מתירניות.

ESC העכבר מושבות צריך להציג מורפולוגיה רגיל צורה שטוחה, מוגדר קצוות כאשר תרבותי ללא טיפול (איור 1B-C) או תרבותי עם 2i (איור 1D). מושבות המציג בידול היקפיים סימנים צריכים להיות שנמחקו (איור 1E-F). אם היעילות נגזרת שהושג נמוך יותר לערכים הצפויים, לשלוט בצמיחה של מושבות mESC של תת-תרבות אותם יותר לעתים קרובות כדי להימנע יתר, זה יכול לגרום מוות של תאים, תקדם את הבידול (איור 1 ג'י-H).

Figure 1
איור 1 : להחליפן בתמונות של המושבות mESC בתרבות. תוצר (A) נגזר של הבלסטוציסט לאחר השבוע הראשון של תרבות (B, C) mESC מספר מושבות-קצוות מוגדרים המציג מעבר 10 ו צורה שטוחה. (ד) מושבות משורות mESC שטופלו 2i. (E, F) דוגמאות mESC למחצה הבדיל מושבות מציג סימנים בידול היקפיים (מודגשים עם אליפסות מקווקו). (G, H) דוגמאות mESC מגודל מושבות מציג סימנים רעים מורפולוגיה ובידול. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי לוודא את stemness של קווי mESC בשם שהושג לאחר שישה שבועות של תרבות, וצריך להעריך את הנוכחות של סמנים pluripotency ובידול. הקווים mESC צריכים להיות חיוביים עבור סמני pluripotency כגון Oct4 ו- Sox2 (איור 2 א-ב). יתר על כן, לאחר אינדוקציה של בידול ספונטנית על ידי culturing התאים במשך 10 ימים ללא מזין בתאים DMEM בתוספת 10% FBS, קווים mESC צפויים להיות חיובי עבור המחלקה β-טובולין סמן האאקטודרם השלישי (Tuj1) (איור 2C), והמזודרם מרקר α-החלקה שריר אקטין (αSMA) (איור דו-ממדי) ו- the marker האנדודרם Alpha-Fetoprotein (AFP) (2E איור). צריך להיות נחשב קווים mESC האמיתי, ובכך המשמשים לחישוב נגזרת ליעילות רק חיובי עבור הסמנים חמש העריכו את הקווים. בדרך כלל, זה מקביל כמעט כל הקווים mESC שנוצר באמצעות פרוטוקול הנוכחי.

Figure 2
איור 2 : Immunofluorescence ייצוגית נגד סמנים pluripotency ובידול. mESC המושבות לבטא (א) Oct4 (ירוק) (B), Sox2 (אדום). הבדיל מושבות mESC לבטא (ירוק) Tuj1 (ג), (ד) αSMA (ירוק) ו- (E) AFP (ירוק). בתמונות כל החומר הגרעיני הוא counterstained עם Hoeschst (כחול). גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות mESC קו נגזרת היא הליך ידועים בשימוש שגרתי במעבדות רבות, היעילות שלה אינה גבוהה כמצופה לאור הגורמים מרובים יכולים להפריע pluripotency תחזוקה תמיד. במאמר הנוכחי אנו מציגים, צעד אחר צעד, כיצד להקים קווי mESC עם יעילות גבוהה באמצעות פרוטוקול פשוטה ואמינה. היעילות אלה דומים לאלה שדווחו בספרות.

כדי להבטיח יעילות מרבית, חשוב לשלוט התאים כל יום או כל יום אחר, מאז הפעם נקודות המצוין הם רק להמחשה. זה חיוני כדי למנוע את צמיחת יתר של מושבות, מאז זה מעודד את מות תאים ובידול. חשוב גם להפחית ככל האפשר החשיפה של המושבות טריפסין-EDTA במהלך תת-תרבות שלהם, כי זה יכול גם להפחית תא הכדאיות.

גורם מרכזי נוסף הוא מקור מזין תאים ואת התרבות שלהם. מספר מחקרים הראו כי fibroblasts STO HFF, העכבר מתחלקים Fibroblasts (MEF) ועכבר הם באותה מידה מסוגלים לתמוך ESC נגזרת של תרבות15. עם זאת, HFF הם עד עמיד שתי פעמים יותר מאשר MEF STO תרבות16, לאפשר יותר זמן mESC לגדול. לפיכך, השימוש HFF מונע mESC נוסף תת תרבות.

אם היעילות נגזרת שהושג נמוך יותר מאשר התוצאות המובאות, חשוב לבדוק היטב כל הרכיבים של המדיום נגזרת, במיוחד סרום חלופי. קבוצות שונות של החלפת סרום יכול לגרום הבדלים משמעותיים הערכת היעילות17,18. לכן, כל אצווה חדשה חייב להיבדק לפני השימוש בו.

חשוב לציין כי את הרקע הגנטי של העוברים משמש מקור עבור mESC נגזרת משמעותי גם יכול להשפיע על יעילות נביעה. אכן, העכבר זנים מסווגים לתוך זנים מתירניות (כגון 129S2 ו C57BL6), זנים שאינם מתירניות (כגון כקבוצת, הנד, FVB) על פי יכולתם להניב קווים mESC תחת תנאים סטנדרטיים9,19. פרוטוקול דיווח כאן ניתן בהצלחה ליישם העוברים מ בשני סוגי זנים כל עוד 2i קוקטייל כלולה המדיום נגזרת בעת עבודה עם העוברים בין זנים שאינם מתירני. המדיום 2i היא היכולת לווסת את התבנית איתות של קווי mESC כדי לקיים את pluripotency, ללא קשר הרקע הגנטי6. המגבלה העיקרית היא כי, התבנית איתות חזק שנרכש במהלך תרבות20, שורות mESC בתרבית ב- 2i להיות עמידים בפני בידול. כדי להתגבר על מגבלה זו, קווי mESC צריך להיות מחונן בלי 2i למעבר אחד לפחות לפני אינדוקציה של בידול להחליש את האיתות רכשה

בסך הכל, עבודה זו יכולה להקל על המנהג של גזירת mESC על-ידי הצגת השלבים פשוט כמו אפשרי, מצביע על הקשיים העיקריים וכיצד להתגבר עליהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים יונתן לוקאס לסיוע טכני שלו עם תרבית תאים מזין, Servei Estabulari de la UAB עבור טיפול בבעלי חיים, מרטין Domènec עבור הקלטת הוידאו. עבודה זו היא נתמכה על ידי y Ministerio דה Economia Competitividad AGL2014-52408-R ו- Generalitat דה קטלוניה 2014 SGR-524. MVC הוא המוטב של מלגת PIF-UAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sryringe BD  309628
2-β-mercaptoethanol Life Technologies 31350-010
4-well plate Thermo Scientific Nunc 176740
Acidic Tyrode's solution  Home-made See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. 
BSA Sigma A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 Molecular Probes - Invitrogen A-21200 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. 
CHIR990212 Axon Medchem  1386 Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. 
CryoTube Thermo Scientific Nunc 3754518
DMSO Sigma 41640
DMEM BioWest L0107
FBS BioWest S1810 Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle BD  304000 Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin Fluka 48724 Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Molecular Probes - Invitrogen A-11037 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. 
HBSS BioWest L0611
Hepes-buffered CZB  Home-made See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin Divasa-Farmavic Veterin-Corion 3000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Human foreskin fibroblasts ATCC ATCCSCRC-1041 For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement Life Technologies  10828-028 Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.   
KSOMaag Evolve Zenith Biotech ZEKS-050 Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor Merk Millipore ESG1106
Mice  Charles River/Harlan It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. 
Mineral oil Sigma M8410 Embryo tested. Photosensitive. 
Mitomycin C Serva 2980501 Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. 
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) Biolegend MMS-435P 1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA Sigma A5228 1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP R&D Systems MAB1368 1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4  Santa cruz Sc-5279 1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140-035
PD0325901 Axon Medchem  1408 Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm) Thermo Scientific Nunc 153066
Petri dish (60mm) Thermo Scientific Nunc 150288
Pregnant mare's serum gonadotropin Foligon Foligon-1000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Rabbit policlonal anti-Sox2 Merck Millipore AB5603 1:200 dilution
T75 falcon Thermo Scientific 130190
Trypsin-EDTA 10x BioWest X0930 Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16, (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72, (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9, (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94, (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82, (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25, (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3, (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58, (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38, (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7, (2), 177-191 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics