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चूहा प्रत्यारोपण भ्रूण से स्टेम सेल लाइनों के व्युत्पत्ति

Developmental Biology

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Summary

यह आलेख वर्णन करता है कि एक प्रोटोकॉल कुशलता से प्राप्त करने के लिए और संस्कृति pluripotent ब्लास्टोसिस्ट मंच पर माउस भ्रूण से स्टेम सेल लाइनों ।

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Vila-Cejudo, M., Ibañez, E., Santalo, J. Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56171, doi:10.3791/56171 (2017).

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Abstract

माउस भ्रूण स्टेम सेल (mESC) व्युत्पत्ति प्रक्रिया है जिसके द्वारा pluripotent कोशिका लाइनों आरोपण भ्रूण से स्थापित कर रहे हैं । इन पंक्तियों को या तो स्वयं को नवीनीकृत करने या विशिष्ट परिस्थितियों के तहत अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने । इन गुणों के कारण, mESC अपक्षयी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग, और ऊतक इंजीनियरिंग की पढ़ाई में एक उपयोगी उपकरण हैं । यह आलेख उच्च व्युत्पत्ति क्षमता (60-80%) के साथ mESC लाइनों को प्राप्त करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है संवर्धन blastocysts द्वारा फीडर कोशिकाओं पर स्वतंत्र माउस उपभेदों से निर्धारित माध्यम ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक के साथ पूरक । प्रोटोकॉल भी कुशलतापूर्वक गैर स्वतंत्र माउस उपभेदों से mESC लाइनों प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है, व्युत्पत्ति मध्यम (2i माध्यम) के लिए दो छोटे-अणु अवरोधकों के एक कॉकटेल के सरल अलावा द्वारा । तैयारी और फीडर कोशिकाओं, संग्रह और माउस भ्रूण की संस्कृति, और व्युत्पत्ति और mESC लाइनों की संस्कृति की संस्कृति पर विस्तृत प्रक्रियाओं प्रदान की जाती हैं । इस प्रोटोकॉल विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है और बुनियादी स्तनधारी सेल संस्कृति विशेषज्ञता के साथ किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है ।

Introduction

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESC) pluripotent भ्रूण, जो या तो स्व-नवीनीकरण या विशिष्ट शर्तों के तहत अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने से व्युत्पंन है1। इन गुणों के आधार पर, ESC अपक्षयी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग, और ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण बन गए हैं2.

ESC पहली बार आरोपण माउस भ्रूण से व्युत्पंन किए गए थे, कम सफलता3,4के साथ माउस ESC (mESC) लाइनों उद्भव । साल के लिए, व्युत्पत्ति क्षमता कम बने रहे इन विट्रो मेंpluripotency बनाए रखने की कठिनाई के कारण । फीडर कोशिकाओं की उपस्थिति के अलावा5, जो व्युत्पत्ति दक्षता में सुधार, कॉलोनी लगाव को बढ़ावा देने, और karyotypic स्थिरता को बढ़ाने6, प्रोटोकॉल के कई संशोधनों pluripotency रखरखाव में एक सुधार करने के लिए सीसा । सबसे महत्वपूर्ण लेकिमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) के अलावा mESC संस्कृति मध्यम7,8, 129S2 स्वतंत्र पृष्ठभूमि9 से भ्रूण के उपयोग और माध्यम से पूरक के साथ mESC की संस्कृति थे परिभाषित सीरम, संभावित भेदभाव कारकों से मुक्त10। हाल ही में, सम्मोहक सबूत दिखाया गया है कि mESC संस्कृति माध्यम (2i के रूप में जाना जाता है) के लिए संकेत रास्ते के दो छोटे-अणु मॉडुलन के एक कॉकटेल के अलावा pluripotency बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा है. 2i कॉकटेल खल्क अवरोध करनेवाला PD0325901 का एक संयोजन के होते हैं, जो mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (MAPK) मार्ग, और GSK3β अवरोधक CHIR99021, जो कम घनत्व पर सेल अस्तित्व को बढ़ाता है को बाधित करके भेदभाव संकेतों को कम कर देता है Wnt मार्ग को सक्रिय करके11.

वर्तमान आलेख में, हम कुशलता से माउस blastocysts से mESC रेखाओं को प्राप्त करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन है । हम मानक प्रक्रियाओं, व्युत्पत्ति माध्यम में फीडर कोशिकाओं पर स्वतंत्र उपभेदों से संवर्धन भ्रूण लिफ और एक सीरम प्रतिस्थापन12के साथ पूरक का पालन करें । इस प्रोटोकॉल के बाद, mESC लाइनों 2i माध्यम में प्राप्त उन लोगों के बराबर क्षमता के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इसके बावजूद, 2i pluripotency रखरखाव या गैर स्वतंत्र उपभेदों के साथ काम करने के साथ संभावित समस्याओं से बचने के लिए जोड़ा जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नीचे दिए गए अनुभागों में वर्णित पशुओं के उपयोग को Universitat औत & #242 के पशु और मानव अनुसंधान पर आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है; noma de बार्सिलोना और Departament d & #39; Agricultura, रामदेरिया, पेसका i Generalitat de Catalunya (प्रोटोकाल #8741) के Alimentaci & #243;

< p class = "jove_title" > 1. फीडर सेल निष्क्रियता और भंडारण

< p class = "jove_content" > नोट: मानव चमड़ी fibroblasts (HFF-1) पहले ठंड के 1 मिलीलीटर में जमे हुए थे ९०% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) से मिलकर समाधान और 10% dimethyl sulfoxide ( DMSO) और तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत जब तक उपयोग.

  1. गल एक क्रायोजेनिक शीशी HFF-1 (1 एमएल) की शीशी में डुबोकर एक ३७ & #176; ग जल स्नान ।
  2. क्रायोजेनिक शीशी की गल गई सामग्री को पूर्व उष्ण Dulbecco & #39 में जोड़ें; s संशोधित ईगल & #39; एस मध्यम (DMEM) 10% FBS के साथ पूरक एक 1:10 कमजोर पड़ने बनाने के लिए ।
  3. बीज पतला कोशिकाओं (10 मिलीलीटर) एक T75 कुप्पी और संस्कृति में उन्हें ३७ & #176; C और 5% सह 2 .
  4. अगले दिन
  5. , DMSO अवशेषों को खत्म करने के लिए यम को बदल दें । मध्यम निकालें और 10% FBS.
  6. के साथ पूरक पूर्व गर्म DMEM के 10 मिलीलीटर जोड़ें
  7. कल्चर को एचएफएफएस और मीडियम को हर ४८ ज में बदलने तक संस्कृति धाराप्रवाह मुकाम तक पहुंचती है. यह लगभग 7 से 10 दिन लग सकते हैं ।
  8. को निष्क्रिय समाधान तैयार करने के लिए, मीतोमयसीं C को पतला DMEM में 10% FBS के साथ पूरक 10 & #181; g/एमएल की अंतिम एकाग्रता में 3 एच के लिए निष्क्रियता समाधान के साथ कोशिकाओं की मशीन पर ३७ & #176; ग र 5% सह 2 .
  9. सक्रियण समाधान निकालें और मीतोमयसीं C अवशेष को समाप्त करने के लिए हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 2 मिलीलीटर के साथ तीन बार कोशिकाओं कुल्ला ।
  10. निष्क्रिय कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पूर्व गर्म Trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़-EDTA समाधान और 5 मिनट के लिए ३७ & #176; C और 5% कं 2 .
  11. एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को देखने के लिए सुनिश्चित करें कि वे (०.३ संख्यात्मक एपर्चर या ना के साथ 10x उद्देश्य) अलग कर रहे हैं । यदि वे नहीं कर रहे हैं, उंहें एक जोड़ी अधिक मिनट के लिए ३७ & #176; सी और 5% सह 2 । उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत फिर से कोशिकाओं की जाँच करें.
  12. पिपेट एक पाश्चर पिपेट के साथ समाधान के क्रम में कोशिका के झुरमुट अलग.
  13. 10% FBS और reसस्पेंड के साथ पूरक DMEM के 4 मिलीलीटर जोड़कर एंजाइमी समाधान बेअसर.
  14. सेल सस्पेंशन का aliquot लें और HBSS में 1:100 कमजोरियां बनाएं । कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करने के लिए, लोड 10 & #181; एल कमजोर पड़ने के एक Neubauer & #39; एस चैंबर में । एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत चैंबर के बड़े वर्गों में से एक में स्थित कोशिकाओं गिनती (एक ०.४५ ना के साथ 20x उद्देश्य).
    1. चार बड़े चौकों की कुल गिनती में दोहराएं । कक्षों की कुल संख्या (n) के रूप में परिकलित करें n = गणना की गई कक्षों की औसत संख्या x कुल मात्रा x कमजोर पड़ने x 10 4 .
  15. २०० x जी पर 5 मिनट के लिए नमूने के बाकी केंद्रापसारक supernatant त्यागें और 10 6 कोशिकाओं के प्रति एक एकाग्रता पर ठंड समाधान के साथ गोली reसस्पेंड ।
  16. Aliquot क्रायोजेनिक शीशियों में 10 6 कोशिकाओं (1 एमएल) प्रत्येक के साथ निलंबन । क्रायोजेनिक शीशियों को फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और फ्रीज-८० & #176; C.
  17. अगले दिन
  18. , तरल नाइट्रोजन में क्रायोजेनिक शीशियों का संग्रह करें ।
< p class = "jove_title" > 2. फीडर सेल संस्कृति

  1. एक से चार दिन पहले व्युत्पत्ति प्रक्रिया शुरू करने, गल एक क्रायोजेनिक शीशी युक्त 1 x 10 6 निष्क्रिय HFF-1 कोशिकाओं में एक जल स्नान में ३७ & #176; C.
  2. HFF-1 के 1:6 कमजोर पड़ने से पूर्व में गरम DMEM 10% FBS के साथ पूरक और तापमान ३७ पर रखने के लिए & #176; C.
  3. 4-वेल प्लेट के हर कुआं को ५०० & #181 के साथ भरें; सुअर स्किन से प्री-वार्म ०.२% जिलेटिन की एल और प्लेट को ३७ & #176 पर रखें, 10 min.
  4. के लिए C
  5. निकाल द ५०० & #181; कुएं से जिलेटिन की एल और जोड़ ५०० & #181; l एचएफएफएस कमजोर पड़ने के. धीरे कुओं के तल पर एचएफएफएस के एक समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए थाली रॉक । परिपत्र आंदोलनों से बचें, अंयथा कोशिकाओं को अच्छी तरह के केंद्र पर ध्यान देना होगा ।
  6. मशीन को ३७ & #176 पर थाली कम 24 ज; ग और 5% कं 2 के monolayer प्राप्त करने के लिए एक अच्छी तरह से निष्क्रिय एचएफएफएस ।
  7. अगले दिन, एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण (०.३ NA के साथ 10x उद्देश्य) और जाँच करें कि वे संलग्न और homogeneously वितरित कर रहे हैं. DMSO अवशेष को समाप्त करने के लिए माध्यम बदलें । मध् यम निकालें और जोड़ें ५०० & #181; पूर्व उष्ण DMEM का L 10% FBS.
  8. के साथ पूरक
< p class = "jove_title" > 3. भ्रूण संग्रह और संस्कृति

  1. चार दिन पहले भ्रूण संग्रह, प्रशासन 5 गर्भवती घोड़ी की IU & #39; एस सीरम गोनॉडोट्रॉफिन द्वारा intraperitoneal इंजेक्शन से 6-12 सप्ताह पुरानी मादा चूहे.
    नोट: हम 129S2 या B6CFAF1 उपभेदों से महिलाओं का इस्तेमाल किया है, हालांकि अंय माउस उपभेदों से महिलाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है । फिर भी, जब गैर से महिलाओं के साथ काम कर स्वतंत्र उपभेदों ( जैसे CBA), मध्यम 2i के साथ पूरक होना चाहिए के रूप में ४.२ कदम में वर्णित है ।
  2. के बाद ४८ ज, intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन के 5 IU प्रशासन, और पुरुषों के साथ महिलाओं के दोस्त, एक 1:1 के अनुपात में कम से कम 8 सप्ताह पुराना है । अगले दिन पुरुषों से महिलाओं को अलग ।
  3. भ्रूण संग्रह से पहले दिन
  4. , ३५ एमएम सेल कल्चर पेट्री डिश तैयार करें जिसमें कई ४० & #181; KSOMaag मीडियम के एल ड्रॉप्स 4 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ पूरक है और पूरी बूंदों को कवर करने के लिए खनिज तेल के साथ प्लेट भरें । ३७ पर पकवान मशीन & #176; ग और 5% कं 2 को equilibrate करने के लिए मध् यम.
  5. भ्रूण हेरफेर पिपेट तैयार करने के लिए, एक लंबे समय से इत्तला ग्लास पाश्चर पिपेट एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर के पतले हिस्से गर्मी । एक बार नरम, लौ से इसे वापस लेने और दो सिरों के अलावा खींच । यह इच्छित लंबाई के लिए तोड़ । नोक पर भीतरी व्यास होना चाहिए 100-150 & #181; m.
  6. Euthanize मादा चूहों द्वारा ग्रीवा विस्थापन 45-48 ज पद-coitum (पीसी).
  7. टुकड़े चूहों को त्वचा के साथ घुमावदार चिकनी तेज कैंची और सीधे तेज कैंची से आँख काट कर उदर गुहा को बेनकाब करने के लिए. संदंश के साथ एक गर्भाशय पकड़ो, सीधे तेज कैंची का उपयोग कर ओवीडक्ट काट, और यह Hepes में जगह-बफ़र्ड CZB मीडियम (HCZB) < सुप क्लास = "xref" > 13 at ३७ & #176; C. अन्य ओवीडक्ट को निकालने के लिए प्रक्रिया दोहराएँ.
  8. एक 1 मिलीलीटर घड़ीसाज़ संदंश द्वारा जगह में आयोजित HCZB के साथ भरी हुई सिरिंज के साथ oviducts फ्लश 2-सेल भ्रूण इकट्ठा ।
    नोट: निस्तब्धता सुई तैयार करने के लिए एक 30 ग्राम hypodermic सुई ले, अंत में कटौती, और एक घर्षण पत्थर पर एक कुंद टिप करने के लिए जमीन.
  9. मुंह पिपेट तंत्र का उपयोग कर, भ्रूण उठाओ, उंहें HCZB में धोने और संस्कृति उंहें पहले से तैयार ३७ & #176 में संस्कृति पकवान, सी और 5% सह 2 मंच तक । ५० तक प्रत्येक ४० में भ्रूण संस्कृति किया जा सकता है & #181; एल ड्रॉप । निगरानी भ्रूण विकास हर 24 एक stereomicroscope.
    के तहत एच नोट: वैकल्पिक रूप से, भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट मंच पर एकत्र किया जा सकता है में छोटा करने के लिए इन विट्रो भ्रूण संस्कृति । इस मामले में, euthanize में महिलाओं को ३.५-४.५ पीसी, गर्भाशय टुकड़े । और इसे HCZB.
  10. के साथ फ्लश करें
< p class = "jove_title" > 4. स्टेम सेल व्युत्पत्ति

  1. भ्रूण सीडिंग के दिन व्युत्पत्ति प्लेटों
    1. को तैयार करना, व्युत्पत्ति मीडियम को सप्लीमेंट करके DMEM मीडियम की तैयारी १०० & #181; M 2-& #946; mercaptoethanol, 1x गैर-आवश्यक अमीनो अम्ल , सीरम प्रतिस्थापन के 20%, और 10 3 यू/एमएल लिफ.
    2. अगर इि है, तो भी 1 & #181; m के खल्क अवरोधक PD0325901 और 3 & #181; मी के GSK3 अवरोधक CHIR99021 के एक 2i माध्यम प्राप्त करने के लिए.
    3. की monolayer के साथ 4-वेल प्लेट ले कर निष्क्रिय एचएफएफएस (step २.६) से इनक्यूबेटर. मध् यम निकालें और प्रत् येक अच् छी तरह से पूर्व उष्ण व्युत्पत्ति मध् यम के ८०० & #181; L को जोड़ें । मशीन के लिए थाली लौटें ।
  2. Zona pellucida निर्मूलन तथा भ्रूण सीडिंग
    1. एक ३५ एमएम सेल कल्चर पेट्री डिश तैयार करने के साथ ३ ३० & #181, अम्लीय Tyrode के एल ड्रॉप्स & #39; s solution < सुप वर्ग = "xref" > 14 and ३ ३० & #181; L drops of व्युत्पत्ति मीडियम. खनिज तेल के साथ बूंदों को ढक कर रखें और पकवान ३७ & #176; C.
    2. मशीन से भ्रूण संस्कृति पकवान ले लो । एक के बाद एक, blastocysts संस्कृति से स्थानांतरण एक अंलीय Tyrode के लिए बूंदें & #39; एस समाधान ड्रॉप एक भ्रूण हेरफेर पिपेट का उपयोग कर । यदि संभव हो, तो केवल विस्तृत blastocysts व्युत्पत्ति प्रक्रिया को प्रारंभ करने के लिए का चयन करें ।
    3. stereomicroscope के तहत पाचन pellucida zona को मॉनीटर करते हैं । जैसे ही zona pellucida गायब हो जाता है, ब्लास्टोसिस्ट को एक व्युत्पत्ति मीडियम ड्रॉप पर ट्रांसफर कर दें ताकि अम्लीय Tyrode & #39; s solution को धो सके.
    4. मशीन और बीज एक zona से 4 अच्छी तरह से व्युत्पत्ति प्लेट ले एक अच्छी तरह से फीडर कोशिकाओं पर मुक्त ब्लास्टोसिस्ट ।
    5. वापसी 4-well व्युत्पत्ति प्लेट मशीन और संस्कृति को ३७ & #176; ग र 5% सह 2 .
  3. निगरानी स्टेम सेल विकास और मध्यम परिवर्तन
    1. की निगरानी संस्कृतियों हर 24 एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत एच (20X उद्देश्य के साथ ०.४५ ना) । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि क्या स्टेम सेल विभेद के संकेत हैं, जैसे सूजन अपवर्तन कोशिकाओं के आसपास या यहां तक कि फीडर कोशिकाओं को एक तरफ धकेलने के रूप में ।
    2. हर दूसरे दिन
    3. , संस्कृति के माध्यम को बदलें । मशीन से 4-अच्छी तरह से थाली ले लो, एक अच्छी तरह से माध्यम से दूर है, और जोड़ने के ८०० & #181; लिफ और 2i के साथ पूरक पूर्व गर्म व्युत्पत्ति मध्यम के एल, अगर इस्तेमाल किया. वृद्धि (6-8 दिन) मनाया जाता है जब तक संस्कृति को बनाए रखने.
< p class = "jove_title" > 5. स्टेम सेल संस्कृति और रखरखाव

  1. तैयार Kolle की तरह संभालती है और स्टेम सेल हेरफेर पिपेट । 250-300 & #181 की नोक पर एक भीतरी व्यास के साथ स्टेम सेल हेरफेर पिपेट तैयार करने के लिए कदम ३.४ का पालन करें; m. Kolle की तरह हैंडल तैयार करने के लिए खींची पाश्चर पिपेट के दूसरे भाग का प्रयोग करें । गर्मी और यह एक हुक प्राप्त करने तक आकार ।
  2. मशीन से बाहर 4 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली ले और एक stereomicroscope के तहत वृद्धि का पता लगाने । दूर विभेदित कोशिकाओं और भक्षण कि विकास के चारों ओर धकेलने के लिए संभाल का उपयोग करें ।
    नोट: वृद्धि के अंतिम विभेद से बचने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि बाहर निकलने के किनारे से सभी विभेदित कोशिकाओं को दूर करने के लिए ।
  3. महाप्राण एक स्टेम सेल हेरफेर पिपेट के साथ विकास और यह एक ५० में एक नई डिश में जगह & #181; L trypsin-EDTA ड्रॉप.
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए कई भागों में वृद्धि में कटौती के क्रम में यह दोनों यांत्रिक और enzymatically ।
  5. सीधे दूर, trypsin कार्रवाई बेअसर करने के लिए व्युत्पत्ति माध्यम की एक ताजा बूंद में वृद्धि टुकड़े हस्तांतरण ।
  6. फीडर के एक monolayer के साथ एक नया 4-अच्छी तरह से प्लेट के लिए वृद्धि टुकड़े स्थानांतरण । प्रति कुआं 10 अंशों तक स्थानांतरण करें और उन्हें व्युत्पत्ति माध्यम से संस्कृति ३७ & #176; C और 5% कं 2 .
  7. स्टेम सेल को बनाए रखने के लिए mESC लाइन की स्थापना पर विचार करने से पहले कम से कम छह सप्ताह के लिए संस्कृतियों की तरह । मध्यम हर दूसरे दिन बदलें और उंहें सप्ताह में एक बार उपसंस्कृति ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के बाद, वृद्धि के गठन के ९५% से अधिक संस्कृति के पहले सप्ताह के बाद प्राप्त किया जाना चाहिए (चित्र 1a) । छह मार्ग के बाद mESC लाइनों की स्थापना प्रयोगात्मक दोहराने के बीच चर, 60-80% की एक औसत सफलता के साथ है । 2i के अलावा इस तरह के एक 129S2 पृष्ठभूमि के साथ उन लोगों के रूप में स्वतंत्र माउस उपभेदों के साथ काम करते समय परिणामों में सुधार नहीं है, लेकिन यह आवश्यक है जब गैर स्वतंत्र उपभेदों के साथ काम कर रहे ।

माउस ESC कालोनियों एक फ्लैट आकार और परिभाषित किनारों के साथ एक नियमित आकृति विज्ञान मौजूद होना चाहिए जब उपचार के बिना संस्कृति (आंकड़ा 1b-C) या 2i (चित्र 1 d) के साथ कल्चरित । परिधीय विभेद संकेत पेश कालोनियों (चित्रा 1Eएफ) छोड़ दिया जाना चाहिए । यदि व्युत्पत्ति प्राप्त की क्षमता मूल्यों की तुलना में कम कर रहे हैं, mESC कालोनियों और उपसंस्कृति के विकास पर नियंत्रण उंहें अधिक बार अधिक से अधिक वृद्धि से बचने के लिए, के रूप में इस सेल मौत का कारण बन सकता है और भेदभाव को बढ़ावा देने होगा (चित्रा 1G-एच) ।

Figure 1
चित्र 1 : संस्कृति में mESC कालोनियों के प्रतिनिधि छवियां । () संस्कृति के पहले सप्ताह के बाद एक ब्लास्टोसिस्ट से व्युत्पंन (ख, ग) 10 बीतने पर कई mESC कालोनियों परिभाषित किनारों और एक फ्लैट आकार पेश किया । (D) mESC लाइंस से कालोनियों 2i के साथ इलाज किया । (E, F) परिधीय विभेदक लक्षण पेश अर्द्ध विभेदित mESC कालोनियों के उदाहरण (डैश्ड दीर्घवृत्त के साथ हाइलाइट किया गया) । (G, H) एक बुरा आकृति विज्ञान और भेदभाव के संकेत पेश mESCed कालोनियों ऊंचा के उदाहरण । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

संस्कृति के छह सप्ताह के बाद प्राप्त ख्यात mESC लाइनों के तने को सत्यापित करने के लिए, pluripotency और विभेदक मार्कर की उपस्थिति का आकलन किया जाना चाहिए । mESC लाइंस को Oct4 और Sox2 (figure 2 A-B) जैसे pluripotency मार्कर्स के लिए पॉजिटिव होना चाहिए । इसके अलावा, संवर्धन 10% FBS के साथ पूरक DMEM में फीडर कोशिकाओं के बिना 10 दिनों के लिए कोशिकाओं के द्वारा सहज भेदभाव के प्रेरण के बाद, mESC लाइनों बाह्यत्वक मार्कर β-tubulin वर्ग III के लिए सकारात्मक होने की उम्मीद कर रहे हैं (Tuj1) (चित्रा 2c), त्वक मार्कर α-चिकनी मांसपेशी Actin (αSMA) (चित्रा 2d) और अन्तः मार्कर अल्फा-भ्रूणप्रोटीन (एएफपी) (चित्रा 2E) । केवल पांच मार्करों मूल्यांकन के लिए सकारात्मक लाइनों सच mESC लाइनों पर विचार किया जाना चाहिए और इस तरह व्युत्पत्ति दक्षता की गणना के लिए इस्तेमाल किया । आमतौर पर, यह लगभग सभी mESC वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पंन लाइनों से मेल खाती है ।

Figure 2
चित्र 2 : pluripotency और विभेद मार्करों के खिलाफ प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस। mESC (A) Oct4 (green) (B) और Sox2 (red) एक्सप्रेस । विभेदित mESC कालोनियां एक्सप्रेस () Tuj1 (हरा), (D) αSMA (हरा) और (E) एएफपी (हरा) । सभी छवियों में परमाणु सामग्री Hoeschst (नीला) के साथ counterstained है । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

हालांकि mESC लाइन व्युत्पत्ति एक अच्छी तरह से ज्ञात प्रक्रिया नियमित रूप से कई प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है, अपनी क्षमता के रूप में उच्च नहीं है हमेशा के रूप में कई कारकों है कि pluripotency रखरखाव परेशान कर सकते है के कारण की उंमीद है । वर्तमान लेख में हम दिखाने के लिए, कदम से कदम है, कैसे उच्च एक सरल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल का उपयोग कर क्षमता के साथ mESC लाइनें स्थापित करने के लिए । ये क्षमताएं साहित्य में रिपोर्ट करने वालों के समान हैं ।

अधिकतम दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, यह दैनिक या हर दूसरे दिन कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, संकेत के बाद से समय अंक सिर्फ गाये जाते हैं. यह कालोनियों के अधिक से अधिक वृद्धि से बचने के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह सेल मौत और भेदभाव को बढ़ावा देता है । यह भी महत्वपूर्ण है कि अपनी उपसंस्कृति के दौरान कॉलोनियों के एक्सपोजर को trypsin-EDTA के रूप में यथासंभव कम कर सकें, क्योंकि इससे कोशिका व्यवहार्यता भी कम हो सकती है.

एक और निर्णायक कारक फीडर कोशिकाओं और उनकी संस्कृति का स्रोत है । कई अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि HFF, माउस भ्रूण Fibroblasts (MEF) और माउस STO Fibroblasts समान रूप से ESC व्युत्पत्ति और संस्कृति15का समर्थन करने में सक्षम हैं । हालांकि, HFF दो बार संस्कृति16में MEF और STO की तुलना में अधिक टिकाऊ तक कर रहे हैं, mESC बढ़ने के लिए और अधिक समय की अनुमति । इस प्रकार HFF का प्रयोग अतिरिक्त mESC उपसंस्कृतियों को टाल जाता है.

यदि व्युत्पत्ति प्राप्त की क्षमता परिणाम रिपोर्ट से कम हैं, यह ध्यान से व्युत्पत्ति माध्यम के सभी घटकों, विशेष रूप से सीरम प्रतिस्थापन की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । सीरम प्रतिस्थापन के विभिंन बैचों व्युत्पत्ति क्षमता17,18में महत्वपूर्ण अंतर में परिणाम कर सकते हैं । इसलिए, प्रत्येक नए बैच इसके उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए ।

यह कहना है कि mESC व्युत्पत्ति के लिए एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया भ्रूण की आनुवंशिक पृष्ठभूमि भी काफी व्युत्पत्ति क्षमता को प्रभावित कर सकते है महत्वपूर्ण है । वास्तव में, माउस उपभेदों स्वतंत्र उपभेदों में वर्गीकृत किया गया है (जैसे 129S2 और C57BL6 के रूप में) और गैर स्वतंत्र उपभेदों (जैसे CBA, मंजूरी और FVB के रूप में) मानक शर्तों के तहत mESC लाइनों उपज की क्षमता के अनुसार9,19। प्रोटोकॉल यहां की रिपोर्ट सफलतापूर्वक उपभेदों के दोनों प्रकार से भ्रूण के लिए लागू किया जा सकता है जब तक 2i कॉकटेल व्युत्पत्ति माध्यम में शामिल है जब गैर से भ्रूण स्वतंत्र उपभेदों के साथ काम कर रहा है । 2i मध्यम pluripotency बनाए रखने के लिए mESC लाइनों के संकेत पैटर्न का नियमन करने में सक्षम है, चाहे आनुवंशिक पृष्ठभूमि6। मुख्य सीमा है कि, मजबूत संकेतन संस्कृति20के दौरान अधिग्रहीत पैटर्न के कारण, mESC 2i में प्रसंस्कृत लाइनों भेदभाव के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं । इस सीमा को दूर करने के लिए, mESC लाइनों 2i के बिना कम एक मार्ग के लिए भेदभाव के प्रेरण से पहले प्राप्त करने के लिए संकेत अधिग्रहण को कमजोर करने के लिए प्रसंस्कृत किया जाना चाहिए ।

कुल मिलाकर, इस काम के रूप में बस संभव के रूप में कदम दिखा रहा है और मुख्य कठिनाइयों पर इशारा करते हुए और कैसे उंहें दूर करने के द्वारा mESC व्युत्पत्ति के अभ्यास को कम कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम जोनाटन लुकास फ़ीड सेल संस्कृति, Servei Estabulari de la UAB के लिए पशु देखभाल और Domènec मार्टिन वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए के साथ अपने तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । इस काम Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R और Generalitat de Catalunya २०१४ SGR-५२४ द्वारा समर्थित किया गया है । MVC एक PIF-UAB फैलोशिप के लाभार्थी है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sryringe BD  309628
2-β-mercaptoethanol Life Technologies 31350-010
4-well plate Thermo Scientific Nunc 176740
Acidic Tyrode's solution  Home-made See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. 
BSA Sigma A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 Molecular Probes - Invitrogen A-21200 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. 
CHIR990212 Axon Medchem  1386 Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. 
CryoTube Thermo Scientific Nunc 3754518
DMSO Sigma 41640
DMEM BioWest L0107
FBS BioWest S1810 Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle BD  304000 Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin Fluka 48724 Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Molecular Probes - Invitrogen A-11037 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. 
HBSS BioWest L0611
Hepes-buffered CZB  Home-made See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin Divasa-Farmavic Veterin-Corion 3000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Human foreskin fibroblasts ATCC ATCCSCRC-1041 For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement Life Technologies  10828-028 Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.   
KSOMaag Evolve Zenith Biotech ZEKS-050 Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor Merk Millipore ESG1106
Mice  Charles River/Harlan It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. 
Mineral oil Sigma M8410 Embryo tested. Photosensitive. 
Mitomycin C Serva 2980501 Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. 
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) Biolegend MMS-435P 1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA Sigma A5228 1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP R&D Systems MAB1368 1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4  Santa cruz Sc-5279 1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140-035
PD0325901 Axon Medchem  1408 Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm) Thermo Scientific Nunc 153066
Petri dish (60mm) Thermo Scientific Nunc 150288
Pregnant mare's serum gonadotropin Foligon Foligon-1000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Rabbit policlonal anti-Sox2 Merck Millipore AB5603 1:200 dilution
T75 falcon Thermo Scientific 130190
Trypsin-EDTA 10x BioWest X0930 Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution

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References

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