Induktion af lammelse og visuelle System skade i mus af T celler specifik for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at fremkalde lammelser og opticospinal betændelse af overførsel af aquaporin-4 (AQP4)-specifikke T-celler fra AQP4- / - mus til WT mus. Derudover viser vi hvordan serie optisk kohærens tomografi til at overvåge visuelle system dysfunktion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A., Spencer, C. M., Ho, P. P., Steinman, L., Green, A. J., Sobel, R. A., Zamvil, S. S. Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (126), e56185, doi:10.3791/56185 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mens det er anerkendt at aquaporin-4 (AQP4)-specifikke T-celler og antistoffer deltage i patogenesen af neuromyelitis optica, (NMO), en menneskelig centralnervesystemet (CNS) autoimmune demyeliniserende sygdom, oprettelsen af en AQP4-målrettet model med både klinisk og histologisk manifestationer af CNS autoimmunitet har bevist udfordrende. Immunisering af wild-type (WT) mus med AQP4 peptider fremkaldte T celleproliferation, selv om T cellerne ikke kunne overføre sygdommen naive recipient mus. For nylig, to roman AQP4 T celle epitoper, peptid (p) 135-153 og p201-220, blev identificeret ved at studere immunrespons til AQP4 i AQP4-mangel (AQP4- / -) mus, hvilket tyder på T-celle reaktivitet til disse epitoper styres normalt af thymic negative valg. AQP4- / - Th17 polariseret T celler primet til enten p135-153 eller p201-220 induceret lammelse i modtagerens WT mus, der var forbundet med overvejende leptomeningeal betændelse af rygmarv og synsnerverne. Betændelse omkringliggende synsnerverne og inddragelse af de indre nethinde lag (IRL) blev manifesteret ved ændringer i serie optisk kohærens tomografi (OCT). Her, illustrere vi metoderne bruges til at oprette denne nye i vivo model af AQP4-målrettet CNS autoimmunitet (ATCA), som kan nu anvendes til at studere mekanismer, der tillader udviklingen af patogene AQP4-specifikke T-celler og hvordan de kan samarbejde med B celler i NMO patogenese.

Introduction

Neuromyelitis optica, (NMO) er en centralnervesystemet (CNS) autoimmune inflammatorisk demyeliniserende sygdom, der forårsager tilbagevendende episoder af lammelse og visuelle tab fører til permanent neurologiske handicap1. NMO anses i øjeblikket primært at være en lun autoimmun sygdom2 , da det er forbundet med antistoffer (Igs) målretning aquaporin-4 (AQP4), en vand kanal udtrykt rigeligt på astrocytter3,4. CNS betændelse er imidlertid en forudsætning for CNS indtastning af AQP4 Ig5,6. Således har det ikke været muligt at etablere en model af NMO ved overførsel af anti-AQP4 Igs alene. Resultaterne at (1) patogene AQP4-specifikke Igs i NMO patienter er IgG11,2, en T-celle-afhængige Ig underklasse7 (2) T celler er identificeret i NMO læsioner8,9 (3) NMO er forbundet med visse MHC II gener (fx HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10, og (4) proinflammatoriske AQP4-reaktiv DR-begrænset Th17 celler er udvidet i NMO patienter11,12 alle viser, at AQP4-specifikke T-celler har en nøglerolle i NMO patogenese. Det er således vigtigt at udvikle dyremodeller for at afgøre, hvordan AQP4-specifikke T-celler kan bidrage til NMO patogenese.

Flere år siden, blev flere AQP4 T celle epitoper identificeret i wild-type (WT) mus13,14 og rotter15. Mens det blev observeret, at AQP4-reaktiv T celler kan inducere opticospinal inflammation i naive modtager rotter15,16, blev betydelig klinisk tegn på CNS sygdom ikke overholdt. På samme måde direkte immunisering af WT mus med peptider indeholdende AQP4 T celle epitoper14,17, eller overførsel af proinflammatoriske T-celler rettet mod disse determinanter17, ikke forårsage kliniske tegn eller histologiske dokumentation af CNS autoimmunitet.

For nylig, det blev observeret at immunisering af C57BL/6 AQP4-mangel (AQP4- / -) mus med AQP4 peptid (p) 135-153 eller p201-220, to determinanter forudsagt for at binde MHC II (-Ab) med høj affinitet18, fremkaldte stærke CD4 + T-celle svar17. Derimod fremkaldte disse to peptider kun beskedne proliferativ svar i WT mus. Yderligere, T-celle receptoren (TCR) repertoire bruges til anerkendelse af disse determinanter af T-celler fra AQP4- / - mus var enestående. Kollektivt, viser disse resultater, at T-celle anerkendelse af AQP4 er reguleret af thymic negative valg. AQP4 p135-153 - eller p201-220-specifikke Th17 celler fra AQP4- / - donor mus induceret lammelse i næsten 100% af naive modtager WT mus; Det var forbundet med opticospinal infiltrater af T-celler, B-celler og monocytter. Seriel opticospinal kohærens tomografi (OCT) påvist dynamiske visuelle system inddragelse. Mus med T-celle-medieret AQP4-målrettet CNS autoimmunitet (ATCA) inddrives fra lammelse og visuelle system skade. I modsætning til EAE induceret af myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) p35-55-specifikke T-celler, hvilket førte til vedvarende klinisk sygdom, var ATCA induceret af T-celler alene ikke forbundet med cytoskeletale tab eller reduktion af retinal ganglion celler (RGCs). Vores resultater har klart vist, at der er flere patogene AQP4 T celle determinanter. Denne nye model af ATCA er nyttigt for at studere mekanismer styrer udviklingen af patogene AQP4-specifikke T-celler, lære hvordan disse celler inducerer CNS betændelse og hvordan de kan samarbejde med AQP4-specifikke B-celler og antistoffer til at fremme NMO patogenese .

I den foreliggende betænkning beskriver vi de protokoller, der bruges til at fremkalde og evaluere T-celle-induceret ATCA. Vi begynder med de teknikker, der anvendes for immunisering, T-cellekultur og Th17 polarisering for at generere patogene AQP4-specifikke T-celler flow flowcytometri analyse at bekræfte polarisering og adoptiv overførsel af disse T-celler. Vi derefter beskrive metoder, der anvendes til at vurdere klinisk og histologisk sygdom og brug af serielle OLT til at overvåge visuelle system skade i modtagerens mus.

Protocol

alle de dyr der blev udført i overensstemmelse med eksperimentelle retningslinjer godkendt af University of California, San Francisco institutionelle Animal Care og brug udvalget. C57BL/6 (H-2 b) hunmus, 8 uger gammel, blev købt og C57BL/6 AQP4 - / - mus blev leveret af A. Verkman.

1. immunisering af mus med AQP4 peptider

  1. forberede komplet Freund ' s adjuvans (CFA) arbejder stock.
    1. Fint male en udtørret forberedelse af M. tuberkulose (H37Ra) ved hjælp af en morter og pistil.
    2. Tilføj jorden H37Ra at ufuldstændige Freund ' s adjuvans til en endelig koncentration på 4 mg/mL. CFA kan opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder.
  2. Opløse frysetørret antigen (Ag) AQP4 peptid i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til en endelig koncentration på 1 mg/mL. Vedligeholde ved 4 ° C eller på ice.
  3. Forberede samling af 2 luer-lock sprøjter, forenet med en stophane, der indeholder CFA/peptid emulsion.
    1. Vedhæft et glas luer-lock sprøjte uden stemplet til en 3-vejs nylon stophane med 2 mandlige luer-lock forbindelser. Luk hanen ved at skifte løftestang mod sprøjten. Placer den åbne ende af sprøjte op, så sprøjten til at fungere som et reagensglas. Placere denne i en tube rack for ekstra stabilitet.
    2. Vortex CFA arbejder lager og Ag løsning. Tilføje en 1:1 volumen af peptid / CFA at åbne sprøjten. 200 µL af CFA/Ag (4 x 50 µL) er påkrævet per mus.
      Bemærk: Typisk, ca. 1 mL af forberedelse er tabt i hanen, hvilket vil reducere det beløb, der er tilgængelige for immunisering. Derfor er det vigtigt at indarbejde dette i beregning af det samlede volumen kræves.
      Eksempel: For immunisering af 5 mus: (200 µL/dyr x 5 dyr) + 1 mL ekstra volumen = 2 mL samlede CFA/Ag kræves.
    3. Indsætte glas stemplet ind i sprøjten og samtidig holder den på plads, invertere sprøjten, således at hanen er rettet opad. Skifte stophane løftestang til ubrugte kvindelige forbindelsen. Omhyggeligt gælde pres for glas stemplet for at fjerne overskydende luft fra sprøjten. Væsken fylder den anden mandlige luer-lock forbindelse af hanen.
    4. Tillægger den anden mandlige luer-lock forbindelse af hanen en anden glas sprøjte (stemplet fuldt indsat). Dette bør være et lukket system med 2 glas sprøjter forbundet med en stophane indeholdende som lille overskydende luft som muligt.
    5. Til at oprette en emulsion, mix ved at skubbe udstikkere til at passere flydende skiftevis mellem de 2 sprøjter for ca. 2 min. Chill sprøjter på isen for ca. 10 min. Gentag den nedkøling og blande indtil der er en tydelig ændring i viskositeten af præparatet , hvilket resulterer i en meget stiv, hvid emulsion. Opbevares i køleskab sprøjter indeholdende emulsion ved 4 ° C eller opretholde på ice.
  4. Overføre alle emulsion til et glas luer-lock sprøjte, fjerne tomme glas sprøjte og erstatte det med en 1 mL luer-lock sprøjte til injektion. Fyld den nye sprøjte med emulsion, fjerne det fra hanen og vedhæfte en nål (25G x 5/8).
  5. " vand-test " emulsion til konsistens. Udvise en dråbe af emulsionen i en lille skål med vand. Emulsion ikke bør sprede sig, hvilket betyder at det er egnet til injektion.
    1. Hvis emulsion spreder, det er ikke klar til injektion; overførsel væske tilbage i glasset sprøjter og fortsætte med at blande og derefter chill igen indtil emulsionen er stiv.
    2. Tester emulsionen igen indtil den rette konsistens er opnået.
  6. Indsprøjtes donor AQP4 - / - mus subkutant (s.c.) med emulsion indeholdende AQP4 peptid. Hver mus modtager 4 x 50 µL s.c. injektioner (200 µL total (100 µg peptid)). De 4 steder omfatter begge sider af underlivet, som løbe ind i lyskelymfeknuder lymfeknuder (LN), og begge sider af den mediale til hver armhule, brystvæg, som flyder ind i akselstillede LN. Adoptiv overførsel vil kræve 1-2 immuniserede donor mus pr. modtager mus.

2. T-cellekultur og Proinflammatory T celle polarisering

  1. 10-12 dage efter immunisering, indsamle LN fra mus.
    1. i en Isbak, forberede 60 mm petriskåle monteret med en celle si (mesh størrelse 70 µm) og som indeholder kølet RPMI medier med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS) og 100 U/mL penicillin-100 µg/mL streptomycin (pen-strep) (RFP'ER).
    2. Aflive mus af eksponering til CO 2, efterfulgt af cervikal dislokation. Fordyb mus i 70% ethanol og derefter pin hver footpad til en dissektion bord.
    3. Skære en midterlinjen hud indsnit fra lysken til halsen og ned hvert ben. Trække huden væk fra bughinden og pin det stramt til bestyrelsen. Dissekere lyskebrok og aksillær LN og placere i petriskålen indeholdende RFP'ER, på is. 19
    4. til adoptiv overførsel forsøg, kombinere LN fra alle dyr i den samme immunisering gruppe. Flow cytometric analyser af Vβ skik, adskille LN fra individuelle dyr.
  2. Sted celle sien indeholdende LN på et 50 mL centrifugeglas indeholdende RFP'ER. Brug den flade ende af en steril 5 mL sprøjte stemplet til at trykke på LN celler gennem sien, vask med 20-30 mL af RFP'ER til at lette inddrivelsen af cellerne. Vedligeholde LN celler på is i hele behandlingen indtil tidspunktet for kultur.
  3. Håndvask dobbelt, centrifugering ved 393 x g i 5 min. Efter den anden vask, resuspend LN celler i T-celle medier (TCM). TCM indeholder RPMI med 10% varme-inaktiverede FBS, 292 µg/mL L-glutamin, 110 µg/mL natrium pyruvat, og 55 µM 2-mercaptoethanol og pen-strep. Typisk, en volumen på 5 mL TCM per donor musen bruges.
  4. Tæller LN celler. Forventet udbytte er ca 3-6 x 10 7 LN celler pr. immuniserede mus donor. Der er afsat 3-4 x 10 6 for en spredning assay (Se afsnit 3 nedenfor).
  5. Opsætning af polariserende kulturer for adoptiv overførsel (afsnit 6).
    1. Forberede en Th17 polariserende kultur af 5 x 10 6 LN celler pr. mL med 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL rekombinant mus interleukin (IL)-23 og 10 ng/mL rekombinant mus IL-6 i TCM.
    2. Alternativt til Th1 polarisering, forberede en kultur af 5 x 10 6 LN celler pr. mL med 10 µg/mL Ag og 10 ng/mL rekombinant mus IL-12 i TCM.
    3. Tilsættes 2 mL (1 x 10 7 celler) pr. brønd af polariserende kultur blandingen ind i en 12-godt plade. LN celler fra 2-4 donor mus vil fylde en 12-godt plade. Vedligeholde kulturer i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2 til 72 h.
    4. Kontrollere visuelt LN celler i kultur for aktivering på 48 timer og 72 h. aktiveret celler vil danne omfattende klynger og T-celler øges i størrelse, bliver mere polymorfe. Stigningen i metabolisme vil medføre en sænkning af pH-værdien i medierne, skiftende fra peach til orange. Hvis pH er lav nok til at slå medierne gul, tilsættes 1 mL frisk TCM at forhindre toksicitet for cellerne i de resterende 24 h.
    5. Fortsæt til afsnit 6 for adoptiv overførsel. Polarisering effektivitet kan verificeres af intracellulære cytokin farvning (ICS), som described i afsnit 5.
  6. Oprettet kulturer ved hjælp af LN fra individuelle mus for flow cytometric analyse af overflade Vβ udtryk (afsnit 4).
    1. Forberede 5 x 10 6 LN celler pr. mL med 10 µg/mL Ag i TCM.
    2. Tilsættes 2 mL (1 x 10 7 celler) af kultur pr. brønd i en 12-godt plade. Kulturer bør opretholdes i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2 i 10 dage. Gå til afsnit 4.

3. Spredning analyse

NOTE: dette fortsætter fra afsnit 2.4.

  1. Forberede 3-4 mL af LN celler i et rør, på 2 x 10 6 celler pr. mL i TCM.
  2. Forsigtigt blandes cellerne ved at vende røret flere gange, og derefter overføre til en steril lavpunktet.
  3. Bruge en mulitkanalpipette til plade 100 µL af celler pr. brønd i en 96-brønd runde vævskultur bundplade. Typisk, plade 15 brønde til tredobbelt test af 4 Ag koncentrationer og ingen Ag reference.
  4. Fortyndes Ag i TCM ved forskellige koncentrationer, typisk 80, 20, 5, 1 og 0 µg/mL (for 2 x bestande). Tilsæt 100 µL af hver koncentration i tre eksemplarer til en endelig koncentration på 40, 10, 2,5. 0,5 og 0 µg/mL. Inkuber i ca 72 timer ved 37 ° C.
    Bemærk: trin 3.5 gennem 3.7 inddrage radioaktive materialer. Korrekt anvendelse, overvågning og bortskaffelse af radioaktivt materiale bør gennemføres efter institutionelle og statslige regulativer.
  5. Udarbejde en stock brugsopløsning af 3 H-thymidine (40 µCi/mL) ved at tilføje 1 mCi 3 H-thymidine til 25 mL RPMI, og gemme det på 4 ° C. afpipetteres 0,5 mL brugsopløsning i en steril lavpunktet.
  6. Tilføje 25 µL af 3 H-thymidine (1 µCi) pr. brønd med en multikanal pipette. Inkuber i et yderligere 18 timer ved 37 ° C.
  7. Høst celler på et glas filter måtten ved hjælp af en 96-brønd celle mejetærsker og skyl med 70% ethanol. Efter tørring, skal du forsegle filter måtten i en plast prøve pose med 5 mL scintillation væske. Foranstaltning radioaktivitet i hver brønd med en scintillation counter.

4. Flow flowcytometri analyse for celle overfladen TCR Vβ udtryk

NOTE: dette fortsætter fra punkt 2.6. Antistoffer for musen TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 og 5.2, 6, 7, punkt 8.1 og 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14 og 17a findes kommercielt til afprøvning udtrykket TCR Vβ.

  1. Til påvisning af TCR Vβ, løsne T celler fra kultur plade af pipettering flere gange og Overfør celler til en tube.
  2. Vaskes med FACS buffer (FB) indeholdende 2% FBS, 0,1% natriumazid og 2 mM EDTA i PBS.
  3. Overførsel celler til en V-bund 96-brønd plade med en tæthed på 1 x 10 5 til 3 x 10 6 celler pr. brønd. Hvis panelet hele Vβ er ved at blive testet, cellerne skal fordeles i flere brønde (et godt pr. Vβ testes).
  4. Udelukke døde celler fra flow cytometric analyse ved farvning med en LIVE/døde levedygtighed farvestof, der reagerer med frie aminer udsat af nekrotiske celler. Følg fabrikantens ' s instruktioner til centrifugering og resuspension i levedygtighed farvestof. Der inkuberes i isbad i 10-20 min. i hele cellen farvning procedurer, beskytte celler fra lys og holde på ice.
  5. Efter inkubation, vaske pladen engang i FB. For at registrere TCR Vβ, suspendere celler i 100 µL af FB indeholdende en 1: 100 fortynding af antistoffer til CD4 (klon RM4-5) og TCR Vβ. Inkuber i 15-60 min på ice.
  6. Vaske pladen engang i FB og lave cellerne ved at tilføje 200 µL af 4% PARAFORMALDEHYD fortyndes i PBS. Ruger i 20 min. på is. Vask pladen i FB og analysere ved flowcytometri.

5. Flow Cytometric analyse for intracellulære cytokin produktion

  1. For intracellulære cytokin farvning (ICS), behandle T cellekulturer med en 1:1,000 fortynding af protein transport hæmmer reagens (f.eks. GolgiPlug) i TCM, 4 h før ICS til at forhindre cytokin sekretion. På tidspunktet, aktivere T celler med 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) og 500 ng/mL ionomycin for at fremkalde proteinproduktionen.
  2. Efter 4 h af kultur ved 37 ° C, løsne celler fra kultur plade af pipettering op og ned, og overføres til et centrifugeglas (15-50 mL).
  3. Vask med FB. Resuspend celler i FB og overførsel til en V-bund 96-brønd plade med en tæthed på 5 x 10 5 til 3 x 10 6 celler pr. brønd.
  4. Plet celler med levedygtighed farvestof som beskrevet ovenfor (afsnit 4.2). Efter inkubation, vaske pladen engang i FB.
  5. Tilføje antistoffer til påvisning af celleoverflademarkører som følger:
    1. til påvisning af celleoverflademarkører, suspendere celler i 100 µL af FB indeholdende en 1: 100 fortynding af antistof til CD4 (klon RM4-5).
    2. Eventuelt medtage antistoffer for B220 (klon 30-F11) og CD11b (klon M1/70) i en 1: 100 fortynding at forbedre gating af B-celler og monocytter/makrofager, henholdsvis. Generelt, PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 og PerCP-Cy5.5 anti-CD11b fungerer godt. Valg af antistof/fluorokrom konjugater bør være styret af konfigurationen af flow forskellige anvendes til analyse, og optimal koncentrationer af antistoffer bør fastsættes empirisk.
    3. Inkuber i 15-60 min på ice.
  6. Vaske pladen med FB og resuspend celler i 200 µL af fiksering/Permeabilization løsning for 20 min på is. Dette vil lave cellerne og permeabilize membraner.
  7. For at opretholde permeabilization af cellemembraner under intracellulær farvning bruge Perm/vaskebuffer (PW) (fortyndet 1:10 af 10 X bestanden) i stedet for FB. Vaske brønde i 200 µL af PW.
  8. For ICS, forberede en 1: 100 fortynding af antistoffer for interferon (IFN)-γ og IL-17A ved hjælp af 1 x PW. Én mulighed er APC anti-IFN-γ (klon XMG1.2) og PE anti-IL-17A (klon eBio17B7) som virker godt. Resuspend celler i 100 µL af de intracellulære antistof cocktail og derefter inkuberes i mindst 15 min. Det er også muligt at fortsætte den farvning natten over ved 4 ° C.
  9. Vaske brønde i 200 µL af PW og resuspension i FB til flowcytometri.
  10. Parallelt, forberede en unstained prøve (celler i FB uden antistoffer) til at optimere detektor spændinger og single-farvede prøver for hver enkelt fluorokrom (dvs., celler eller kompensation perler farvet med kun én antistof/fluorokrom) til bestemme kompensation spillover værdier.
  11. Ved hjælp af en flow forskellige erhverve ≥ 10.000 celler (begivenheder), gating på levedygtige (LIVE/DEAD-negative) CD4 + celler. For at sikre korrekt gating af T-celler, udelukke B220 + og CD11b + celler (B-celler og monocytter/makrofager, henholdsvis). Inden for CD4 + T celle delpopulation, bestemme procentdelen af celler, der udtrykker IFN-γ (Th1 afstamning) eller IL-17A (Th17 afstamning).

6. Adoptiv overførsel af patogene AQP4-specifikke T celler

Bemærk: dette trin følger fra afsnit 2.5: T-celle kultur og proinflammatoriske T-celle polarisering.

  1. Genoprette polariseret celler fra 12-godt plader af pipettering op og ned for at løsne, og overføre dem til en 50 mL tube. Maintain på is indtil injektioner.
  2. Tælle cellerne, vaskes to gange i kolde PBS og der forberedes en suspension af 1 x 10 8 celler/mL i PBS. Generelt, injicere celler inden for en time.
  3. Forsigtigt blandes cellerne af hvirvlende og overføre til en 1 mL sprøjte på tidspunktet for indsprøjtning. Administrere 200 µL af cellerne (2 x 10 7) intravenøst (i.v.) til hver musen gennem halen vene.
  4. Indsprøjtes hver recipient mus i.p. med 200 ng af B. pertussis toksin opløses i 200 µL af PBS dag og 2 dage senere. Overvåge mus dagligt for kliniske sygdomstegn.

7. Klinisk vurdering af ATCA

  1. undersøge recipient mus dagligt for kliniske tegn på CNS autoimmunitet. I almindelighed, vil mus vise tegn på CNS autoimmunitet 5-8 dage efter adoptiv overførsel af AQP4-specifikke T-celler. Musene vil vise kliniske symptomer på neurologiske dysfunktion. Det er nyttigt at udføre vurderingerne på en naiv mus til at definere en mus normale evne.
  2. Evaluer mus for tab af hale tone. Holde mus forsigtigt på bunden af halen og løfte oprejst. En hale, droops kontinuerligt er beskrevet som tab af hale tone (score på 1). Tab af hale tone er ofte det første tegn på klinisk sygdom.
  3. Test for oprettende refleks ved at placere musen på ryggen på en flad overflade. Langsom oprettende er et tegn på truncus isammenhæng (score 2). En naiv mus vil helt modstå ethvert forsøg på at placere den på ryggen, så nogen langsommelighed i evne til højre er scorede som en dysfunktion. Det er typisk at teste mus 3 - 4 gange for denne refleks.
  4. Evaluer kropsholdning og ambulation. Mus begynder at vise en ændring i arbejdsstillinger resulterer i en nedsættelse eller trække af hofterne under ambulation (score på 2,5). Yderligere sygdom resulterer i monoplegia, komplet lammelse af en hind lemmer (score på 3,0) og paraplegi, fuld lammelse af begge bagben lemmer (score på 3,5). Moderat quadraparesis, svaghed for alle fire ekstremiteter, resulterer i meget langsom bevægelse fremad (score på 4). Svær quadraparesis giver næsten ingen bevægelse fremad (score på 4,5). Endelig, med svær sygdom kan de blive døende eller dø (score på 5).
  5. Administrere at mus, der mister muligheden for at erhverve flydende eller fast food 1 mL 5% glukose i saltvand i.p. Alternativt, brug tilskud med væske gel kopper, høj kaloriefattige gel og bacon softies til at modvirke dehydrering og mad afsavn. Aflive døende mus.

8. Væv forberedelse og histologi

  1. bedøver mus med 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin, og derefter pin hver footpad til en dissektion bord.
  2. Åbne op brystet, udsætter hjertet. Incise leveren til at tillade blodet udstrømning. Vedhæfte en sommerfugl nål til rør af en miniflow variabel hastighed pumpe ved hjælp af en separat reservoir for PBS og 10% formalin. Indsætte nålen ind i venstre hjertekammer af hjertet og perfuse med 5 mL PBS, efterfulgt af 25 mL 10% formalin.
  3. Fjerne hovedet og derefter øjnene. Proces øjne og nethinder som tidligere beskrevet 20. På tværs af øjet stikkontakter, indsætte saks på næsen og skære kraniet forreste posterior på hver side.
    1. Fjerne kraniet, udsætte synsnerverne, skær den optiske chiasm og sted i en kassette mellem 2 skum puder.
    2. Fordyb i 10% formalin (24 h), og derefter 50% ethanol (24 h) og derefter overføre til 70% ethanol.
  4. Fjerne hjernen og rygsøjlen og placere i 10% formalin. Seriefremstillede afsnit hjerner i den koronale flade; afsnit spinal snore i sagittal (omkring halvdelen) og serial koronale fly (ca 20 tværsnit pr. mus).
  5. Proces CNS prøver rutinemæssigt for integrering af paraffin. Pletten 8 µm tykt afsnit med hæmatoxylin og eosin (synsnerven) eller Luxol hurtig blå-hæmatoxylin og eosin (hjerne og rygmarv).
  6. Evaluere synsnerverne for tilstedeværelse af betændelse i nerve og omkringliggende meninges (optisk neuritis) eller overvejende i de omkringliggende meninges (optiske perineuritis).
  7. Tæller meningeal og parenkymalt inflammatoriske foci (> 10 grupperet mononukleære celler) i hjernen og rygmarven prøver for hver mus.

9. In Vivo Retinal Imaging af optisk kohærens tomografi (OCT)

Bemærk: spektrale domæne OCT retinal billeddannelse af mus udføres ved hjælp af kommercielle udstyr (f.eks. Spectralis med TruTrack øjet tracker) at opnå ensartet okulær orientering og reducere bevægelse artefakter.

  1. Fem min. før imaging, spile elever med 1% tropicamid (en dråbe pr. øje) og placerer musen til at blive afbildet i anæstesi induktion kammer, hvilket giver en konstant strøm af 2 liter / min (1,5% isofluran). Tænd varme mat og forberede efter anæstesi opsving bur.
  2. Placer musen på imaging cylinderen og omdirigere anæstesi flow i overensstemmelse hermed. Beskyt øjnene med 0,3% hydroxypropyl methylcellulose at holde øje fugtig og sikre refraktion kontinuitet. Placere en brugerdefineret linse på øjet undersøges.
  3. Guided af infra-røde fundus billedet, direkte laser for øje, at sikre strålen er centreret på synsnerven hoved. Lodrette og vandrette OCT scanninger bør bekræfte, at nethinden lægger vinkelret til laser.
  4. Udføre 25 B-scanninger i høj opløsning tilstand og rasterisere fra 30 gennemsnit A-scanninger.
  5. Efter imaging begge øjne, fjerne kontaktlinse og anvende oftalmologiske gel. Lad musen i varm opsving bur.

10. Behandling og analyse af OLT

  1. Brug den modulære imaging software til automatiseret segmentering.
    1. Manuelt korrekte segmenter svarer til den inderste begrænsning membran (ILM) og indre plexiform lag (IPL), der repræsenterer begrænsninger af den indre nethinde lag (IRL) 21.
    2. Kontroller, at det retinale nerve fiber lag (RNFL) og ganglion cellelag (GCL) Opholde sig inden for rammerne af IRL og ikke overlapper.
  2. Beregne IRL tykkelser ved hjælp af tidlig behandling diabetisk retinopati undersøgelse (ETDRS) 2 gitter med diameter på 1, 2 og 3 mm centreret på den optiske disk, og eksport til en regnearksfil. Softwaren beregner tykkelsen af hvert retinal lag af gennemsnit sektorvis gitter. Derfor, den centrale målgruppe, svarende til synsnerven hovedet, er udelukket.
  3. Analysere statistiske forskelle mellem grupperne for hver tidspunkt. Analysere begge øjne for hver mus, ved hjælp af generaliseret estimering ligninger med en udskiftelig korrelationsmatrix og justeringer for intra underlagt Inter øje korrelationer 21.

Representative Results

I denne protokol brugte vi donor T celler fra C57BL/6 AQP4- / - mus. Subkutane immunisering af disse mus med AQP4 p135-153 eller p201-220, der indeholder sygdomsfremkaldende T celle epitoper, fremkaldte stærke proliferativ T-celle respons i afdrypning lymfeknuder (figur 1), disse to peptider fremkaldte meget svagere T-celle spredning i WT mus. I sammenligning, vaccination med AQP4 p91-110, som indeholder en ikke-sygdomsfremkaldende AQP4 T celle determinant13eller MOG p35-55, en myelin peptid, der aktiverer T-celler, der forårsager eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE)22,23 ,24, induceret lignende omfanget af T celle spredning i AQP4- /- og WT mus. Analyse af TCR udnyttelse af flow flowcytometri farvning for individuelle Vβ eller Vβ familier, viste, at p135-153 - og p201-220-specifikke T celler fra AQP4- / - mus udnyttet unikke TCR repertoirer. Selektiv hyper-spredning af AQP4 p135-153 og p201-220 AQP4- / - mus, samt den unikke TCR udnyttelse (figur 2), anført, at patogene T celle svar til disse determinanter normalt er reguleret af thymic negative udvalg, understregning af betydningen for ved hjælp af AQP4- / - donor T celler i denne protokol.

Før adoptiv overførsel til induktion af ATCA, var lymfeknude celler fra AQP4 peptid-pulverlak mus kulturperler in vitro-Th17 - eller Th1-polariserende forhold i tre dage. Omfanget af polarisering af donor CD4+ T celler blev bekræftet af intracellulære cytokin farvning (ICS) og målt ved flowcytometri (figur 3). Naive recipient mus var injiceres intravenøst med 2 x 107 donor AQP4 peptid-specifikke T-celler. Efter omkring seks dage udviklet næsten 100% af modtagerens mus kliniske tegn på CNS autoimmune sygdom, herunder halte hale og hind lemmer lammelse (figur 4). Th17-polariseret AQP4-specifikke T-celler inducerede mere alvorlig klinisk sygdom end Th1-polariseret AQP4-specifikke T-celler. En repræsentativ mus, der modtog Th17 AQP4-peptid-specifikke og udviklet komplet hind lemmer lammelse (paraplegi) er vist i Video 1. I modsætning til mus, der udviklede EAE efter administration af MOG-specifikke Th17 celler, recipient mus inddrives fra klinisk sygdom fremkaldt af AQP4-specifikke Th17 celler. EAE induceret af MOG p35-55-specifikke Th17 celler, klinisk sygdom fremkaldt af AQP4 p135-153-specifikke eller p201-220-specifikke Th17 celler var forbundet med infiltration af mononukleære celler i CNS parenkym og meninges (figur 5). Læsioner var mere rigelige i meninges end i parenkym for CNS autoimmunitet induceret af AQP4-specifikke Th17 celler.

Synsnerven involvering blev demonstreret ved histologisk vurdering og af serielle OCT. AQP4-specifikke og MOG-specifikke Th17 celler både induceret synsnerven betændelse, som var karakteriseret ved tilstedeværelsen af mononukleære celler. AQP4-specifikke Th17 celler som følge fiberoptisk perineuritis, inducerede MOG-specifikke Th17 celler svær optisk neuritis (figur 5). Brug seriel OCT, synsnerven betændelse fremgik af hævelse og øget indre retinal (IRL) lagtykkelse for klinisk sygdom fremkaldt af AQP4-specifikke eller MOG-specifikke Th17 celler (figur 6). For AQP4 Th17-induceret CNS autoimmunitet, IRL tykkelse vendte tilbage til baseline som mus inddrives fra klinisk sygdom. Derimod persistens af EAE induceret af MOG-specifikke Th17 svarede med IRL udtynding, og som vi viste tidligere17, var forbundet med tab af retinal ganglion celler.

Figure 1
Figur 1 : AQP4 p135-153 og p201-220 fremkalde robust T celledelingen i AQP4- / - mus, men ikke WT mus. Mus blev immuniseret s.c. med de angivne peptider i CFA. Elleve dage senere, blev lymfeknuder fjernet, og derefter kulturperler med enten ingen antigen eller peptid bruges til vaccination. Spredning blev målt af 3H-thymidine vedtægter (gennemsnit ± SEM, repræsentant for 5 forsøg). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : AQP4-specifikke T-celler fra AQP4- / - mus udnytte unikke TCR repertoirer. AQP4- /- og WT mus blev immuniseret med de angivne peptider. Elleve dage senere, blev lymfeknuder fjernet og kulturperler med peptid bruges til vaccination. Celler er høstet. TCR Vβ udnyttelse blev analyseret ved flowcytometri (betyde ± SEM, n = 5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Proinflammatoriske polarisering af donor AQP4-specifikke T celler. 11 dage efter vaccination med AQP4 p135-153 eller p201-220, blev lymfeknude celler høstet og kulturperler med peptid anvendt til immunisering i ikke-polariserende forhold, Th1 - eller Th17-polariserende forhold. Th17 eller Th1 polarisering blev undersøgt af ICS og flow flowcytometri for IL-17 eller IFN-γ, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Th17-polariseret AQP4-specifikke T-celler inducerer lammelse i WT recipient mus. WT recipient mus modtaget 2 x 107 donor Th17-polariseret AQP4 p135-153 eller p201-220-specifikke T-celler fra AQP4- / - mus. Th17-polariseret MOG-specifikke T-celler fungerede som positiv kontrol. Resultaterne er repræsentative for 8 eksperimenter (n = 5/gruppe). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : AQP4-specifikke Th17 celler inducerer opticospinal inflammation i WT mus. Recipient mus modtaget 2 x 107 donor Th17 AQP4 p135-153 - eller p201-220-pulverlak Th17 celler fra AQP4- / - mus eller Th17 MOG p35-55-specifikke celler og blev ofret 10 dage senere. Rygmarven og optiske nerve væv blev forberedt og plettet med H & E/LFB at evaluere for tegn på betændelse og demyelinering, henholdsvis. Resultaterne er repræsentative for 5 mus/gruppe. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Synsnerven betændelse fremkaldt af AQP4-specifikke Th17 celler kan blive overvåget af langsgående retinal okt WT recipient mus modtaget 2 x 107 donor Th17-polariseret AQP4 p201-220-specifikke eller MOG p35-55-specifikke T-celler på dag 0. De blev undersøgt af OCT på dag 0 (før administration af T-celler) og derefter på dage 4, 7, 8, 9 10, 11 14 og 21. IRL tykkelse var målte (gennemsnit ± SEM). Statistikkerne viser en sammenligning med naive kontrol. Resultaterne er repræsentative for 3 forsøg (5 mus/gruppe). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

AQP4 blev identificeret som det primære mål i NMO IgG i 20053. Derefter blev det anerkendt at det ville være vigtigt at etablere en AQP4-målrettet dyremodel af CNS autoimmunitet. Sådan en model kunne være nyttigt at undersøge, hvordan AQP4-specifikke T- og B-cellerne deltage i udviklingen af CNS autoimmunitet og at teste kandidat therapeutics for NMO. Selv om identifikation af AQP4-specifikke T celle epitoper i wild-type mus blev først rapporteret i 201013, T celler reagerer på disse epitoper ikke forårsage sygdom kliniske eller histologiske14,17. Manglende evne til at generere en model af CNS autoimmunitet baseret på immun reaktivitet til AQP4 forblev en gåde indtil 2015 når Jones, et al. 25 opdagede, at donor AQP4 p135-153-pulverlak T celler fra AQP4- / - mus var i stand til at forårsage klinisk og histologisk tegn på CNS autoimmunitet i WT mus. Af interesse, er AQP4 p135-153 forudsagt til at binde MHC II (-Ab) med høj affinitet17. Kun én anden AQP4 aminosyresekvens, 201-220, er forudsagt til at binde-Ab med lignende høj affinitet. Tværtimod konstaterede vi, at AQP4 p135-153 og p201-220 begge fremkalde robust spredning i AQP4- / -, men ikke WT, mus. Her har vi vist hvordan man kan isolere og udvide encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - og p201-220-reaktiv T celler fra AQP4- / - mus. Når overført til WT recipient mus, inducerede donor AQP4-reaktive Th17 celler lammelse, som var ledsaget af mononukleære celler infiltrater i rygmarven og synsnerven. Afferente visuelle system skade er velkendt hos patienter med AQP4-seropositive NMOSD26. Her, observerede vi, synsnerven betændelse fremkaldt af AQP4-reaktive og MOG-reaktive Th17 celler var adskilte. AQP4-specifikke Th17 celler fremkaldte fiberoptisk perineuritis, inducerede MOG-specifikke Th17 celler svær synsnervebetændelse. Vi har også beskrevet de teknikker, der anvendes til at overvåge synsnerven betændelse fremkaldt af AQP4-specifikke og MOG-specifikke T celler OLT-serie. Andre efterforskere bør nu være i stand til at anvende de protokoller er beskrevet her for at fremme deres egne undersøgelser fokuseret på patogene mekanismer af ATCA.

Man kan nemt undgå tre potentielle faldgruber i vores protokol. Første, adoptiv overførsel af ATCA kræver brug af AQP4-specifikke T-celler fra AQP4- / - donor mus. Specifikt, donor WT AQP4 p135-153-specifikke T celler ikke forårsage ATCA i modtagerens WT mus. For det andet er det vigtigt at udføre en "vand-test" med en dråbe af peptid/CFA emulsion før immunisering af AQP4- / - mus (protokol trin 1,5). Emulsion bør ikke sprede i vand, når det er egnet til s.c. injektion. Hvis emulsion spreder, bør en Bland emulsion endnu, chill igen og Gentag vand-test. Endelig inducerer aktiveret donor CNS antigen-specifikke T-celler CNS autoimmunitet mere effektivt end hvile T-celler. Man bør visuelt inspicere disse kulturer under lysmikroskop før høst donor T celler for adoptiv overførsel. Hurtigt dividere celler kan danne klynger, som let kan identificeres. Også, når kulturer indeholder mange aktiverede T-celler, medierne kan overgang fra pink orange eller gul, på grund af fald i pH. Man kan også vurdere aktivering af donor AQP4-pulverlak lymfeknude T celler for spredning af 3H-thymidine vedtægter, som beskrevet i protokollen trin 3.

Vores opdagelse at de to patogene AQP4 T celle epitoper (1) forventes at binde MHC II med høj affinitet og (2) fremkalde potent proliferativ svar i AQP4- / -, men ikke WT, mus tyder på, at T-celler rettet mod disse determinanter er normalt kontrolleret af thymic negative valg17. De TCR repertoirer udnyttet for anerkendelse af AQP4 p135-153 og p201-220 i AQP4- / - mus er unikke (figur 2), som er også i overensstemmelse med klonede sletning medieret af thymic medullær epitelceller. Andre tolerogenic mekanismer kan normalt dy immunrespons til AQP4. Efter vores første rapport17viste en anden gruppe også, at AQP4 p201-220 indeholder en encephalitogenic T-celle determinant27. Hvornår α/β (TCRα- / -) T-celle-mangelfuld mus var rekonstitueres med AQP4- / - CD4+ T celler, det var muligt at fremkalde en encephalitogenic AQP4-specifikke T-celle respons, men ikke en AQP4-specifikke humorale respons, hvilket indebærer, at der i WT mus AQP4-specifikke B-celle svar, svarende til AQP4-specifikke T-celle svar, er omfattet af negative valg. Faktisk kan tab af rygmarven axoner og RGCs, der ikke blev observeret i WT mus med ATCA induceret af AQP4-specifikke T-celler alene, kræve deltagelse af patogene AQP4-specifikke antistoffer. Det er klart, at musemodeller af AQP4-målrettet CNS autoimmunitet fortsat vil udvikle sig som vi lærer mere om de tolerogenic mekanismer normalt kontrollere AQP4-specifikke T celler og B-celle immunitet.

Andre modeller af AQP4-målrettet CNS autoimmunitet er også ved at blive udviklet6,16,28,29,30. Hver enkelt kan tilbyde fordele for at studere særlige aspekter, der er relevante for NMO patogenese. AQP4-specifikke T-celler er blevet identificeret i WT rotter6,16,29. Disse AQP4-specifikke T-celler forårsaget histologiske ændringer af CNS autoimmunitet, men ligner observationer i mus, WT rotte AQP4-specifikke T-celler forårsager ikke betydelig kliniske sygdomstegn. Mekanismer af tolerance begrænser T celler og B-celle AQP4-specifikke immunrespons i WT mus er derfor også operationelle i rotter. Uanset hvad, bør man ikke undervurdere magten i brug af musemodeller for at studere mekanismer involveret i patogenesen af sygdommen. Rigdommen af knock-out, transgene og reporter mus kan være en fordel. Det bør også anerkendes, at flere grundlæggende opdagelser i autoimmunitet blev foretaget ved hjælp af musen EAE modeller. For eksempel, demonstration at T celle kloner specifikke for en self-antigen kan mægle autoimmun sygdom31,32, identifikation af T-celle costimulation i autoimmunitet33 rolle og opdagelsen af den udviklingsmæssige pathway for Th17 differentiering34 blev først beskrevet ved hjælp af musen EAE modeller. Ved hjælp af ATCA, som vi har udviklet musemodel, har man nu mulighed for at studere udvikling og regulering af patogene AQP4-specifikke immunrespons in vivo, som bør give vigtig indsigt vedrører NMO patogenese.

Disclosures

S.A. Sagan, A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green og RA Sobel givet rapport ingen oplysninger. S.S. Zamvil er stedfortrædende redaktør af Neurology, Neuroimmunology og Neuroinflammation og er medlem af advisory board for det internationale samfund af Neuroimmunology. Han har tjent på redaktionen af Journal of Clinical Investigation, The Journal af immunologi og The Journal of neurologiske Sciences, og har været et charter medlem af grant anmeldelse til de nationale kontorer Health (NIH) kliniske Neuroimmunology og hjerne tumorer (CNBT) studere sektion og National dissemineret sklerose samfundet (Kreditværdigheden). Han har fungeret som konsulent og modtaget honorarer fra Biogen-baseret, EMD Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech og Teva Pharmaceuticals, Inc., og har tjent eller serverer på Data sikkerhed overvågning Boards til Lilly, biom, Teva og Opexa Therapeutics. Dr. Zamvil modtager i øjeblikket, forskning tilskud fra NIH, Kreditværdigheden, The Maisin Foundation, Biogen og Celgene.

Acknowledgements

Blev ydet støtte til S.S.Z. af National Institute of Health (RO1 AI073737 og RO1 NS092835-01), National dissemineret sklerose samfundet (RG 4768, RG 5179 og RG 5180), Maisin Foundation og Guthy Jackson velgørenhedsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M. tuberculosis H37Ra BD Difco 231141 Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant BD Difco 263910
AQP4 peptide p135-153 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55 Genemed / Auspep Custom Synthesis Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock Kimble 420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) GE Healthcare Life Sciences SH30071
Recombinant Mouse IL-23 R&D Systems (BioTechne) 1887-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D Systems (BioTechne) 406-ML
Recombinant Mouse IL-12 R&D Systems (BioTechne) 419-ML
Thymidine [Methyl-3H] PerkinElmer NET027
Glass Fiber Filtermats PerkinElmer 1450-421
Anti-mouse antibodies eBioscience (Affymetrix) [various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel BD Biosciences 557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain ThermoFisher Scientific [various]
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug BD Biosciences 555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Iomomycin (calcium salt) Sigma-Aldrich I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis List Biological Laboratories 181
10% Formalin VWR 89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular Fisher Scientific 22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP) Henry Schein Animal Health 050033 NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Akorn NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform Heidelberg Engineering

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, T. A., et al. Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 15, (9), 967-981 (2016).
  2. Lennon, V. A., et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet. 364, (9451), 2106-2112 (2004).
  3. Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. J Exp Med. 202, (4), 473-477 (2005).
  4. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2, (1), 62 (2015).
  5. Bennett, J. L., et al. Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica. Ann Neurol. 66, (5), 617-629 (2009).
  6. Bradl, M., et al. Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo. Ann Neurol. 66, (5), 630-643 (2009).
  7. Nurieva, R. I., Chung, Y. Understanding the development and function of T follicular helper cells. Cell Mol Immunol. 7, (3), 190-197 (2010).
  8. Lucchinetti, C. F., et al. The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica. Brain Pathol. 24, (1), 83-97 (2014).
  9. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2, (4), 110 (2015).
  10. Brum, D. G., et al. HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, (1), 21-29 (2010).
  11. Varrin-Doyer, M., et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter. Ann Neurol. 72, (1), 53-64 (2012).
  12. Vaknin-Dembinsky, A., et al. T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO). Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).
  13. Nelson, P. A., et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica. PLoS One. 5, (11), 15050 (2010).
  14. Kalluri, S. R., et al. Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica. PLoS One. 6, (1), 16083 (2011).
  15. Pohl, M., et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4. Acta Neuropathol. 122, (1), 21-34 (2011).
  16. Zeka, B., et al. Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS. Acta Neuropathol. 130, (6), 783-798 (2015).
  17. Sagan, S. A., et al. Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (51), 14781-14786 (2016).
  18. Vita, R., et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).
  19. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, (1-2), 170-174 (2008).
  20. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry. J Vis Exp. (82), e51018 (2013).
  21. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86, (24), 2303-2309 (2016).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol. 25, (7), 1951-1959 (1995).
  23. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  24. Molnarfi, N., et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 210, (13), 2921-2937 (2013).
  25. Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol Commun. 3, 28 (2015).
  26. Oertel, F. C., et al. Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD. Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72 (2017).
  27. Vogel, A. L., et al. Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice. Eur J Immunol. (2017).
  28. Zhang, H., Verkman, A. S. Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59. J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).
  29. Zeka, B., et al. Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD. Acta Neuropathol Commun. 4, (1), 82 (2016).
  30. Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G. J Neuroinflammation. 13, (1), 275 (2016).
  31. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317, (6035), 355-358 (1985).
  32. Zamvil, S. S., et al. Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition. J Exp Med. 162, (6), 2107-2124 (1985).
  33. Kuchroo, V. K., et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80, (5), 707-718 (1995).
  34. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, (7090), 235-238 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics