Author Produced

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Immunology and Infection
 

ERRATUM NOTICE

Summary

המובאת כאן היא שיטה פשוטה ליצירת ספריית ההכנסה transposon בצפיפות גבוהה ב- Escherichia coli או שיגלה flexneri באמצעות קוניוגציה. פרוטוקול זה מאפשר היצירה של אוסף של מאות אלפי מוטציות ייחודיות של חיידקים על ידי החדרת גנומית אקראי transposon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Freed, N. E. Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. J. Vis. Exp. (127), e56216, doi:10.3791/56216 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מוטגנזה מכוונת transposon היא שיטה המאפשרת שיבוש גנטי באמצעות החדרת גנומית אקראי פיסת דנ א בשם transposon. להלן הפרוטוקול מתווה שיטה להעברת יעילות גבוהה בין זני חיידקים של פלסמיד מחסה של transposon המכילה סמן ההתנגדות kanamycin. Transposase בעקיצות פלסמיד מקודד על ידי גנים variant tnp מוסיף את transposon לתוך הגנום של המתח. הנמען עם הטיה insertional נמוך מאוד. שיטה זו ובכך מאפשר היצירה של ספריות מוטציה גדול שבו טרנספוזונים מוכנס לתוך עמדות גנומית ייחודיים זן הנמען של חיידקים או Escherichia coli או שיגלה flexneri . באמצעות קוניוגציה, לעומת שיטות אחרות כגון אלקטרופורציה או שינוי כימי, ניתן ליצור ספריות גדולות עם מאות אלפי שיבוטים ייחודי. זה מניב ההכנסה בצפיפות גבוהה ספריות, עם הוספות המתרחשים בתדירות כל 4-6 בסיסים בגנים שאינם חיוניים. שיטה זו עדיפה בשיטות אחרות כמו זה מאפשר שיטה זול, קל לשימוש, ויעילות גבוהה עבור היצירה של ספריה ההכנסה transposon צפופה. ספריית transposon יכול לשמש במורד יישומים כגון transposon רצף (Tn-Seq), להסיק רשתות האינטראקציה הגנטית, או בפשטות, בכל mutational (קדימה גנטי) המסכים.

Introduction

יצירת ספריות מוטגנזה מכוונת transposon של חיידקים הוא שימושי עבור מגוון רחב של יישומים, החל גילויים של התקפה אלימה גנים פתוגנים חיידקיים1,2, מחקרים של גנים חיוניים3, 4 , 5 , 6, לזיהוי של האינטראקציה הגנטית רשתות7,8,9. קריטי ללימודים אלה הוא היכולת ליצור ספריה גדולה של מוטציות. השימוש טרנספוזונים (קצר שברי DNA להוסיפו באופן אקראי לתוך הגנום) היא פשוט אמצעי לשיבוש תפקוד הגן, כמו החדרת transposon בתוך מסגרת קריאה פתוחה או אזור הרגולציה של גנים לעיתים קרובות ישבש את הפונקציה או ביטוי של הגן.

שמפורטות כאן היא שיטה להקמת ספרייה transposon e. coli או flexneri ס על ידי קוניוגציה באמצעות פלסמיד pJA110. ישנם שני יתרונות עיקריים באמצעות פלסמיד הזה. היתרון הראשון הוא כי הווריאציה של transposase Tn10 ביטוי של פלסמיד pJA1 זה inducible ויש ההכנסה נמוכה הסטייה11,12, כלומר transposon ישתלבו באופן אקראי לתוך הגנום כאשר איזופרופיל Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) מתווסף התקשורת. Transposon מכיל סמן ההתנגדות kanamycin, המאפשר הבחירה של מוטציות עם התוספות transposon לתוך הכרומוזום של המתח. הנמען. היתרון השני של פלסמיד pJA1 הוא שהוא מכיל בדר מוטציה R6K של שכפול. המקור R6K מוטציה של שכפול דורש את הגן פיר למדא בצו לשם קיום פלסמיד13. כמו פלסמיד אין אפשרות לבצע שכפול בפיר - זנים, זה יאבדו בנימה הנמען (איור 1). זה מבטיחה Tn10 transposase יוסר התא אינה פעילה, הפחתת מוטציות נוספות לאחר האירוע טרנספוזיציה הראשונית.

השימוש קוניוגציה כדי להעביר את פלסמיד pJA1 המתח התורם המתח. הנמען הוא יתרון מכמה סיבות. ההטיה הוא פשוט וזול לבצע, לא צריך ציוד מיוחד כמו electroporator. בנוסף, מאפשר יעילות גבוהה של קוניוגציה ספרייה גדולה מאוד (> 2 x 105 הוספות ייחודי) להיות מושגת עם רק כמה מיליליטר (מ"ל) של התרבות חיידקי לילה6. התהליך לוקח בסביבות שעתיים של זמן על הידיים יחד עם זמן דגירה וגידול של החיידקים. . לנגרידג '. et al. 14 דיווח על ביצוע 130 electroporations ליצור ספריה מוטגנזה מכוונת transposon בגודל דומה לזה שמתואר כאן8, אשר מושגת עם ההטיה יחיד. השימוש 130 electroporations דורש הכנה אינטנסיבית ולגזול העבודה של תאים electrocompetent ושימוש בחומרים יקרים רבים (למשל, אלקטרופורציה וואקום), בעלות של יותר מ $1,000 דולר במתכלים לבד. מחקרים אחרים10 השתמשו בשיטות דומות, אבל עם זני חיידקים שונות וגדלי מושגת עד כה קטנים הספרייה (5 x 104 המושבה ויוצרים יחידות) מאשר דווח כאן.

הערות על המתח התורם: המתח התורם המשמש כאן הוא המתח e. coli BW2076715 המכיל את פלסמיד transposon pJA116. זן BW20767 יכול נזווג זנים אחרים, שהופך את העברת פלסמיד pJA1 יעילים ביותר. כמו כן, חשוב, BW20767 היא למדא פיר +. כאמור, pJA1 פלסמיד רק הוא מסוגל תישמר ב זנים המכילים את הגן פיר למדא. זן זה הוא kanamycin אמפיצילין עמיד. פלסמיד pJA1 מכילה דה מרקר ההתנגדות אמפיצילין, סמן ההתנגדות kanamycin מוכלת את transposon. זן זה גדל עם בחירה פלסמיד באמצעות אמפיצילין µg 100/mL. זה גם ראוי לציין כי זנים אחרים מסתירים צורונים הביע transposase גנים ידועים להיות לא יציב, ובזמן את transposase בשימוש הנה תחת inducible שליטה, נותר סיכון נמוך של ביטוי דולפים. מסיבה זו, הוא הציע כי המעבר של זן זה צריך להיות ממוזער, פס טריים יש לנקוט מתרבות קפואה להכנה בכל ספריה חדשה. המתח התורם המשמש כאן זמין מהמעבדה שלנו על פי בקשה.

הערות על המתח. הנמען: המתח. הנמען יכול להיות מאמץ של בחירה, כמו מעבדה K12-derived זנים של החיידק או זנים של S.flexneri (כמו כן, ראה דיון). המתח. הנמען חייב להיות סמן עמידות לאנטיביוטיקה נוסף שאינו ההתנגדות kanamycin, כך שניתן לבחור את המתח התורם נגד. לזן של הנמען, זן MG1655 e. coli משמש כאן עם מוטציה חומצה nalidixic ספונטנית הציג. המוטציה חומצה nalidixic ספונטנית נבחר על ידי ציפוי בחוץ 2 מ"ל של תרבות לילה ב- 200 aliquots µL על גבי לוחות המכילים חומצה nalidixic-30 µg/mL. שיבוט יחיד של MG1655 נבחר שהיו עמידים בפני חומצה nalidixic להפוך המתח. הנמען. בנוסף, המתח. הנמען חייב להיות למדא פיר שלילי, כפי שתואר לעיל.

סקירה: ברגע קוניוגציה התרחש פלסמיד pJA1 עבר מהמאמץ תורם המתח. הנמען, התוספת של IPTG למדיה יניעו את הביטוי של הגן tnp , הנמצא תחת שליטה של IPTG inducible יזם lacIq/Ptac (איור 1). הגן tnp על pJA1 הוא transposase מוטציה יש תדירות נמוכה של ההכנסה נקודות חמות6,10,11. בנוסף ועל אינדוקציה עם IPTG, transposon הופעל, הוכנס באופן אקראי הגנום. פלסמיד אינה יכולה להישמר בנימה פיר-נמען למדא, והוא אבוד.

Protocol

שים לב: אם משתמש flexneri ס כמו זן הנמען, אנא שימו לב כי ס flexneri פתוגניות שיכולים לגרום מחלות במערכת העיכול. בניסויים המערבים flexneri ס חייב להתבצע עם הזהירות המתאימה אבטחה (המיועד BSL-2 ב אירופה, ארה ב או PC2 בניו-זילנד). כל הניסויים שבוצעו וידאו הקשורים עם פרוטוקול זה נעשו באמצעות מזן הנמען מאופיין היטב פתוגניים שאינם e. coli MG1655 באווירה PC1. עבודה עם flexneri שיגלה בעבר בוצע במעבדה BSL-2 בבית Biozentrum בבאזל, כמתואר ב- 6-

הערה: הניסוי הבאות ביעילות מתבצעת פעמיים. החלק הראשון (שלב 1.1 - שלב 4.5) מבוצע כדי לגלות דילול הטוב ביותר עבור ציפוי הספרייה, שבו המטרה היא למצוא לדילול של הבניין אשר נותן הרבה מושבות נפרדות לכל צלחת, אבל לא כל כך הרבה זה טפסים על הדשא. זה כדי להפחית את התחרות בין מוטנטים עם כושר מופחתת באופן משמעותי ואלה עם כושר עמידים יותר. החלק השני (שלבים 5.1-7.4) הוא היצירה של הספרייה הסופי, שבו מתפשטים הצלחות רבות של דילול המתאים של הספרייה.

1. כדי להכין אחד היום לפני הניסוי

  1. Inoculate, ממניה קפוא, המתח התורם ב 2 מ ל מרק ליברות, מילר מתכון (NaCl ב 10 גרם/ליטר) מדיה המכיל אמפיצילין-µg 100/mL. המתח התורם המשמש כאן הוא המתח e. coli BW20767 15 מחסה פלסמיד pJA1 11. השימוש אמפיצילין שומרת על הבחירה עבור פלסמיד pJA1.
  2. Inoculate, מושבה בודדת או מניות קפוא, המתח. הנמען ב 2 מ של המדיה ליברות עם סמן ההתנגדות אמפיצילין או kanamycin. המתח. הנמען המשמש כאן הוא e. coli " פראי סוג " זן MG1655 17 , 18 עם מוטציה התנגדות ספונטנית ליצירת חומצה nalidixic. הוא גדל בחומצה nalidixic 30 µg/mL.
  3. להכין מרק לוריא 20 המכילה אגר 1.5% הצלחות (90 מ מ פטרי, כ מ"ל). פלטות אגר חסר אנטיביוטיקה שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים עד שימוש.
  4. להכין מרק לוריא 20 המכילה אגר 1.5% הצלחות (90 מ מ פטרי, כ מ"ל) המכיל חומצה nalidixic-30 µg/mL הן והן kanamycin ב 50 µg/mL (lba של Nal30 Kan50). פלטות אגר אנטיביוטיקה ניתן לאחסן בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים עד שימוש.
  5. להכין 200 מ של מדיה LB סטרילי. LB מדיה שניתן לאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.
  6. להכין 1 מ"ל של 100 מ מ מלאי סטרילי של IPTG, על פי היצרן ' הוראות s.

2. חיידקי הזדווגות או ההטיה

g
  1. צנטריפוגה 1 מ"ל של תרבות לילה של המתח התורם במשך דקה אחת ב- 14,000 x בטמפרטורת החדר. למחוק את הצמיחה מדיה. שלב זה נעשה כדי להסיר את כל המדיה צמיחה המכילה אנטיביוטיקה.
  2. Resuspend בגדר תא לתוך µL 110 של ליברות (לא מכיל אנטיביוטיקה), ולכן ריכוז התרבות.
  3. באמצעות מלקחיים סטרילי, מיקום מסנן סטרילי ניטרוצלולוזה (לחלופין פיסת נייר סופג סטרילי יכול לשמש, ראה חומרים רשימה) אל אמצע צלחת LBA (לא מכיל אנטיביוטיקה). לתייג את הצלחת " בקרה שלילית: התורם ".
  4. באמצעות פיפטה, ירידה µL 50 של התרבות התורם מרוכז על המסנן.
  5. חזור על השלבים 2.1-4 לזן של הנמען, תיוג את הצלחת " בקרה שלילית: הנמען. "
  6. של הספריה, ירידה 50 µL של µL ו- 50 התורם (מתוך שלב 2.2) של המתח הנמען (מתוך שלב 2.5) על גבי מסנן סטרילי בודד בצלחת LBA (הצלחות האלה אין לכלול אנטיביוטיקה). תווית זו צלחת " הספריה. " הזדווגות מתרחשת כיוון התורם ואת המטופל נמצא במגע פיזי קרוב מסנן.
  7. מקם את הצלחות אגר המכיל את המסננים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-אייץ

3. הפעלה של pJA1 Transposon על ידי IPTG אינדוקציה של Transposase

  1. להכין שלוש 15 מ"ל חרוט מבחנות שמכילות 2 מיליליטר ליברות עם IPTG-ריכוז סופי של 1 מ מ (כלומר, µL 20 מ מ 100 מניות של IPTG). תווית אחד: התורם שליטה, שליטה הנמען, וספריית.
  2. להסיר את הצלחות של החממה לאחר 6 שעות של צמיחה ב 37 מעלות צלזיוס (מתוך שלב 2.4). התפתחות חיידקים מסוימים צריך להיות גלוי על המסנן.
  3. באמצעות מלקחיים סטרילי, מסירים את נייר סינון מהפקד התורם ומניחים אותו בבקבוקון חרוט 15 מ"ל שכותרתו התורם שליטה (מתוך שלב 3.1). לעשות את אותו הדבר עבור נמען שליטה והספרייה-
  4. הקש על הצינורות כדי לקבל נייר הסינון לתחתית המבחנה חרוט 15 מ"ל ולהבטיח כי זה מלא שקוע ב- LB.
  5. וורטקס צינורות במשך לפחות דקה גבוה כדי לבטל שיוך של החיידק מהמסנן ניטרוצלולוזה. LB צריך להיות מעונן עם תאים חיידקיים ( איור 2).
  6. באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים או מפזר סטרילי, צלחת µL 200 של ההשעיה חיידקים vortexed מהפקד התורם על גבי לוחות LBA Nal30 Kan50 הנקרא " התורם שליטה, 200 µL ".
  7. חזור על השלב מעל (3.6) עבור הפקד הנמען, תיוג הלוחות " נמען שליטה, 200 µL ".
  8. חזור על השלב מעל (3.7) של הספריה, תיוג הלוחות " ספריה, 200 µL ".
  9. להפוך דילולים נוספים (כלומר, 1:5, 1:10 ו- 1: 100 דילולים, באמצעות LB אשר אינו מכיל אנטיביוטיקה כמו diluent) של הספרייה. צלחת 200 µl ספריית מדולל ו דילולים נוספים על גבי תווית כראוי צלחות lba של Nal30 Kan50.
  10. חממה
  11. המקום צלחות לתוך 37 ° C עבור ה 18 שיבוטים עם טרנספוזונים מוכנס גן שגורם לאובדן כושר גדול עלול לקחת יותר זמן לגדול, מופיעים על הצלחת. צריך להיות מגוון של גדלי המושבה ( איור 3). התורם וצלחות זן הנמען צריך אין מושבות עליהם.

4. לבחור דילול המתאים של הספרייה שישמש עבור ספריית מוטנטים הסופי

  1. לקבוע לדילול של הספרייה מ- 3.9 שלב המניבה מושבות רבות בגדלים שונים זה ירווחו כראוי. המטרה היא להשיג מושבות רבות ככל האפשר בצלחת, אבל לא כל כך הרבה כי המושבות למזג לתוך אחד לשני, להתחרות על המשאבים. מספר זה צריך להיות כ 500-2000 מושבות לכל צלחת. דוגמה של צפיפויות המושבה המתאים על צלחת מוצג באיור 3.
  2. לרשום את מספר מושבות על הלוחות.
  3. לחשב את התדירות של ההטיה (מספר conjugants לכל תא הנמען). זה צריך להיות בטווח של עונה 1 פרק 10 -4 עונה 1 פרק 10 -6 19.
  4. לקבוע את מספר מוטציות הרצוי בספריה סופי המבוסס על יישומים במורד הזרם. משתמשים רבים פשוט דורשים ספרייה עם מוטציות רבות ככל האפשר. כדי להפיק כמה שיותר transposon הוספות כמו תיאורטית אפשרית (הכניסה אחד כל זוג בסיסים), כוון משוערly אותו מספר של המושבות בסיסים בגנום (כלומר, ~4.5 x 10 6 עבור e. coli) מלא עיתוני הגנום עם כל הוספות transposon אפשרי. חשוב לציין, מוטציות רבות מחסה הוספות ב חיוני או גנים חשיבות תפקודית לא יוכלו להיות התאושש, כמו מוטציות אלה יהיה קטלני אל הנמען.
  5. לחשב כמה נפח של הספרייה הראשונית יש צורך ליצור ספריה בגודל הרצוי. לדוגמה, גודל הספרייה הרצוי הוא 5 x 10 4 מוטציות. הדילול עם המרווח הטוב ביותר של מושבות של 3.9 שלב היה 200 µL של 1:10 דילול. מספר מושבות על הצלחת הזו מוערך כ- 2,000 מושבות. 5 x 10 4 מוטציות נדרשים ואת כל צלחת יש מושבות 2,000, אם יהיה צורך 25 צלחות-דילול זה.

5. הקמת ספריית מוטנטים הסופי

  1. חזור על שלבים 1 עד 3.8, התאמת מספר צלחות בשלב 1.4 כנדרש (ראה שלב 4.4).
  2. שלב 3.9, צלחת דילול שבחרת בשלב 4.1 על גבי לוחות רבים לפי הצורך כדי ליצור את הספריה בגודל הרצוי (ראה שלב 4.4).

6. להעריך את ספריית צפיפות

  1. לספור כמה מושבות הם לפי הלוח, ובכך לקבל הערכה גסה של הספריה היא כמה הוא צפוף. לדוגמה: סך של 2 x 10 5 מושבות הם מצופים. הגנום MG1655 e. coli הוא בערך 4.5 x 10 6 בסיסים. לכן, ספרייה עם 2 x 10 בערך 5 מוסיף כלומר יש הוספה בממוצע כל 22 זוגות בסיס, כי כל הגן צריכה להיות מוטציה כ- 45 פעמים, נתן את אחד הגנים הוא כ 1 x 10 3 בסיסים. הוספות בגנים חיוניים עשוי להיות מאוד underrepresented בספריה זו, ולכן הצפיפות בגנים שאינם חיוניים היא עשויה להיות גדולה מזו. חישוב מסוג זה מספק אחד עם הערכה רחבה של צפיפות transposon.

7. איגוד ואחסון של ספריית Transposon

  1. לאחר ספירת מושבות, להוסיף 1 מ"ל ליברות (או יותר, לפי הצורך) לצלחת בספריה ולהשתמש מפזר סטרילי כדי לגרד את חיידקים מהצלחת. הסר את המתלים חיידקי ולמקם בקבוקון חרוט 50 מ ל או 15 מ"ל. חזור על כל הצלחות.
  2. המערבולת ההשעיה חיידקים במאגר דקה שלמה homogenize ההשעיה.
  3. להוסיף גליצרול סטרילי ריכוז סופי של 20%-
    1. Aliquots µL 100 x 20 0.25 mL צינורות להתכונן מחדש בקלות את הצמיחה.
    2. להכין לפחות שניים או יותר 1 מ"ל aliquot ב cryovials.
  4. אחסן aliquots כל ב-80 מעלות צלזיוס

Representative Results

אחרי 18 שעות של צמיחה, צלחות צריך להכיל מושבות רבות עם מגוון של גדלי המושבה (איור 3). בגדלים שונים המושבה מצביעים על שיבוטים של כושר בדרגות שונות, ויש סימן טוב שעבד הפרוטוקול. הפקדים התורם ואת המטופל צריך אין צמיחה על הלוחות. באמצעות הפרוטוקול הנ ל אמור להניב יותר מ 2 x 105 יחידות ויוצרים מושבה (CFU). קנה מידה את הפרוטוקול ההטיות שכפל חמש בבת אחת אמור להניב כ עונה 1 פרק 106 CFU. בעבודה הקודמת, ניתוח באמצעות רצף הדור הבא ציינו כי כזו ספרייה מדורגים במעלה אמור להניב > 2 x 10-5 -הוספות ייחודי-6. ב CFU גבוהה מאוד (קרי, עונה 1 פרק 106 CFU) שיעור ייחודי הוספות צפוי מישור, כמו כל הוספות (לא קטלני) זמין להיות מיוצג.

Figure 1
איור 1 : סכימטי של קוניוגציה ואת הכניסה של transposon לתוך הכרומוזום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : התמונה של מסנני submersed בתקשורת LB לפני ואחרי vortexing. לפני vortexing, תאים תקוע. המסנן, התקשורת היא ברורה. לאחר vortexing, התקשורת הופכת מעונן כמו תאים לבוא ממני המסנן הם בתקשורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : (א) לוחית נציג של ספריית transposon לאחר 18 h של צמיחה. (B) מקרוב בגדלים המושבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשרת הקמת ספרייה ההכנסה צפופה. שיטה זו מאפשרת היצירה של ספריה transposon עם למעלה מ- 2 x 105 מוטציות transposon ייחודי באמצעות מתחת לגיל 5 מ של תרבות כרך6. זה יחסית קל לביצוע, משתמשת ריאגנטים הזמינות במעבדות מיקרוביולוגיה הבסיסיים ביותר, מדרגי, ודורש מעט ציוד יקר או מתכלים כגון אלקטרופורציה וואקום.

יתרון משמעותי של שיטה זו הוא כי, תיאורטית, למשתמש יש חופש בחירה של זנים הנמען enterobacterial. זה נייר, כמו גם אחרים11, השתמש e. coli כמו זן הנמען, אולם פלסמיד pJA1 שימש בהצלחה עם מינים אחרים הנמען enterobacterial כגון שיגלה flexneri6 ו- סלמונלה enterica serovar Typhimurium זן SL134410. באופן תיאורטי, המקור γ של שכפול (אוריR6Kγ) ב- pJA1 מאפשר פלסמיד זו תישמר המארחת רחב טווח19, ומאפשר זה המתח. הנמען פיר +. לאחרונה, שיטות חדשות תוארו המאפשרים בניית פיר + במגוון זנים enterobacterial20, נותן גמישות נוספת. בנוסף, באזור300 זוג בסיסים ההמון פלסמיד RP4 ב pJA1 מאפשר העברה conjugative של פלסמיד זו מגוון רחב של גראם שליליים זני חיידקים19. במילים פשוטות, שיטה זו באופן תיאורטי ניתן להשתמש עם מגוון רחב של זנים הנמען, כל עוד מספר תנאים: המתח הוא פיר+, והוא מסומן עם עמידות לאנטיביוטיקה, מלבד kanamycin, מלבד המתח התורם.

שלב קריטי בפרוטוקול טמון להערכת מספר תקין של תאים על צלחת את שלב 4.1. אם המושבות ירווחו מקרוב, הם מתחרים על חומרים מזינים בצלחת, פחות מתאים המוטציות הן outcompeted. זה עלול להוביל לירידה המספר הכולל של מוטציות. לחלופין, אם המושבות ירווחו גם רחוקים, יהיו גם כמה מושבות על הצלחת, והופך המספר הכולל של פלטות אגר צריך להשיג את ספריה גדולה מעיק. לכן, להשגת איזון נכון מבחינת מספרים המושבה לכל צלחת הוא חשוב.

חשוב לבצע מהפקדים הרשומים בפרוטוקול כדי להבטיח שהשלבים עובדים כמתואר. ראוי לציין, כאשר באמצעות חומצה nalidixic כמו מבחר שכנגד נגד המתח התורם, חשוב להבטיח שהצלחות שליטה התורם שלילית חופשיים של המושבות. זה כי אולי יש שיעור נמוך (כ 1 x 10-10)21 של התנגדות ספונטנית חומצה nalidixic, מניב תוצאות חיוביות שגויות. בדרך כלל, קצב ההטיה, טרנספוזיציה הוא כ 2 x 10-4 19. לכן, שיעור ההטיה, טרנספוזיציה הוא במספר סדרי גודל גדול יותר מקצב התנגדות ספונטנית nalidixic חומצה. לכן, הקצב של תוצאות חיוביות שגויות לעומת אירועים טרנספוזיציה האמיתי הוא נמוך מאוד, ייחשב זניח כאשר הפרוטוקול פועל. עם זאת, אם המחירים של ההטיה או טרנספוזיציה מופחתים באופן משמעותי, (מתוך יעילות ההזדווגות נמוכה ו/או חוסר אינדוקציה של הגן transposase עם IPTG), הפרוטוקול תוגדל כדי לפצות על זה, ואז את מספר תוצאות חיוביות שגויות (שיבוטים זה אם אין את transposon מוכנס) עלול גם להגדיל.

ניתן לבצע מספר שינויים הדגירה פעמים ב 3.2 שלבים ו- 3.10. צעד הברית 3.2 המתרחשות ההטיה במשך 6 שעות, אך מניסיוננו, שלב זה הזמן יכולים להיות מגוונים (כלומר, 4-7 h) מבלי לשנות את התוצאות באופן משמעותי. בנוסף, בשלב 3.10, משך הזמן שהמושבות מודגרת על לוחות אגר יכול גם להיות מותאם. זה יכולים להיות מגוונים בהתאם לממוצע הכפלת קצב זמן או גדילה של המתח. הנמען. בנוסף, מניסיוננו, 18 h הניב מגוון של גדלי המושבה, המציינת את ספריה של כושר מגוונות. עם זאת, מושבות בעלות כושר מופחתת באופן משמעותי עשויה להימשך זמן רב לגדול, וכך אולי לא יהיה גלוי לאחר 18 h. אם שיטה זו משמשת כדי למצוא שיבוטים של כושר מאוד מופחתת, זמן הדגירה פעמים ועל מושבות פחות בצלחת כדי להפחית את הצפיפות (קרי, 48 שעות, מושבות 50-300) יכול לשמש.

מלכודות נוספות של שיטה זו כוללים כי לא ניתן להשתמש זן נמענים אשר כבר kanamycin עמיד. ייתכן שתהיה אפשרות להחליף את ההתנגדות kanamycin הסמן בתוך פלסמיד pJA1 של סמן לבחירה חלופיים, כגון התנגדות כלורמפניקול להתגבר על המשוכה הזו. זה יכול להיות גם ראוי לציין כי, תיאורטית, זה ניתן להשתמש זן נמענים אשר עמיד אמפיצילין, כמו pJA1 פלסמיד המכיל את סמן ההתנגדות אמפיצילין הוא איבד זמן קצר לאחר טרנספוזיציה.

הקמת ספריה transposon צפופה הרקע הגנטי של הבחירה הוא שעשוי להיות יתרון עבור יישומים רבים במורד הזרם. לדוגמה, ספרייה transposon צפוף יכול לשמש כדי לזהות מוטציות auxotrophic באמצעות עותק משוכפל ציפוי22 או כדי לזהות מוטציות שאינן פגום. בהקמת1,זיהום2. לאחרונה, הפיל את עלויות רצפי DNA, טכנולוגיות חדשות כגון רצף הדור הבא הפכו להיות דבר שבשגרה, ספריות transposon השתמשו עם רצפי DNA עמוק כדי לזכות בתובנה ג'ין essentiality, תפקוד הגן, גנטיים אינטראקציות. חלק משיטות אלה נבדקות 23 וכוללים שיטות כגון רצף האתר מכוון transposon ההכנסה (טרדיס), רצף transposon (Tn-seq), הכניסה תפוקה גבוהה מעקב על ידי רצף עמוק (להיטים), ו (רצף הכניסה INSeq). כל השיטות במורד הזרם להסתמך על הקמת ספריות ההכנסה transposon צפופה. בעוד וקטורים אחרים ייתכן צריך לשמש עבור שיטות במורד הזרם מסוים, הפרוטוקול המתואר כאן נותן סקירה של הנקודות הבולטות פרוצדורלי לעקוב.

Disclosures

המחבר אין לחשוף.

Acknowledgments

תודה למעבדה כנסיית ג'ורג על מתנת פלסמיד pJA1 סוג. אני מודה פביאן המבורגר, אלכס בם מן המעבדה Jenal אורס-Biozentrum בבזל לקבלת עזרה קוניוגציה ולסיפוק המתח BW20767. אני גם מודה אולין Silander על עריכות מועילות. מימון עבור מחקר זה סופק על ידי קרנות אוניברסיטת מייסי בניו זילנד, היוזמה שוויצרי במערכות ביולוגיות (פרוייקט "קרב X" מוענק דירק Bumann) ב אוניברסיטת בזל, שוויץ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) Millipore HAWP02500 Alternatively blotting paper can be used (listed below)
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm 3030-917 Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)
Metal Forceps, sterile VWR/Global Science New Zealand MURRE009/01
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL working volume. Interlab New Zealand 2303-1090
Sterile glass spreaders VWR/Global Science New Zealand NZNZSPREADER Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)
Sterile glass beads VWR/Global Science New Zealand HERE1080603 Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)
Nalidixic acid (optional) GoldBio.com N-015-250
Ampicillin sodium salt BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA0839.0025 prepare according to manufacturer recommendation
Kanamycin sulfate BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)  Thermofisher New Zealand FMTR0393
Difco Agar granulated Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand 214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) Thermofisher 12795-084
Glycerol bidistilled 99,5 % VWR/Global Science New Zealand VWRC24388.320
15 ml polypropelene sterile conical vials  VWR/Global Science New Zealand CORN430791
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable VWR/Global Science New Zealand AXYGMCT-175-C
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile VWR/Global Science New Zealand BDAA352070
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubator at 37C
Autoclave for sterilizing media 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol. 34, (2), 257-267 (1999).
  2. Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection. Science. 269, (5222), 400-403 (1995).
  3. Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. Essential genes of a minimal bacterium. PNAS. 103, (2), 425-430 (2006).
  4. Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 186, (23), 7926-7935 (2004).
  5. Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis. PNAS. 95, (15), 8927-8932 (1998).
  6. Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality. BMC Microbiology. 16, (1), 1-14 (2016).
  7. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6, (10), 767-772 (2009).
  8. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  9. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. PNAS. 106, (38), 16422-16427 (2009).
  10. Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice. Infect and Immun. 73, (9), 5438-5449 (2005).
  11. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
  12. Bender, J., Kleckner, N. IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition. The EMBO Journal. 11, (2), 741-750 (1992).
  13. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258, (7), 4083-4090 (1983).
  14. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  15. Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35, (1), 1-13 (1996).
  16. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
  17. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, (0), 135-140 (1981).
  18. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277, (5331), 1453-1462 (1997).
  19. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160, (1), 59-62 (1995).
  20. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5, (1), 157 (2012).
  21. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461, (7268), 1243-1247 (2009).
  22. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100, (24), 14339-14344 (2003).
  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11, (7), 435-442 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  4. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  5. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  6. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Great video! Very helpful. Thanks so much for it.

    Reply
    Posted by: Nathaniel J.
    February 1, 2018 - 1:12 PM
  2. Thank you so much for sharing your protocol. I am wondering how I can get the E. coli BW2767 including pJA1. Could you let me know from where you got them?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Mona A.
    March 14, 2019 - 3:48 PM
  3. Hi Mona,
    You are welcome to email me at n.freed@massey.ac.nz to request the strain (this is stated in the paper as well).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 18, 2019 - 6:13 PM
  4. Hello, I have a question, when you transform the donor strain with the transposon library, how can you know if there is a sufficient abundance of donor cells to perform the mating with the acceptor strain (organism of interest). Or there is no efficient way to determine this amount until after the conjugation event

    Reply
    Posted by: Miguel Angel m.
    March 12, 2020 - 3:03 PM
  5. Hi Miguel, thank you for your interest. I'm not sure I fully understand the question or I think you do not fully understand the method. The donor strain is provided by my lab. It contains the plasmid pJA1 with the transposon. The mating takes place using overnight cultures of both the donor (harboring the pJA1 plasmid/transposon) and the acceptor strain. Typically both strains are at a high density after overnight growth. If you are concerned, you can plate out a dilution of the overnight cultures to count how many cells per mL there are and to ensure you have enough donor. If you have further questions, simply email me at n.freed@massey.ac.nz.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 16, 2020 - 9:08 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics