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Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Immunology and Infection
 

ERRATUM NOTICE

Summary

Apresentado aqui é um método simples para criar uma biblioteca de inserção alta densidade transposon em Escherichia coli ou Shigella flexneri usando conjugação bacteriana. Este protocolo permite a criação de uma coleção de centenas de milhares de mutantes exclusivos nas bactérias através da inserção de genômica aleatória de um transposon.

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Freed, N. E. Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. J. Vis. Exp. (127), e56216, doi:10.3791/56216 (2017).

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Abstract

Mutagênese Transposon é um método que permite a interrupção do gene através da inserção de genômica aleatória de um pedaço de DNA chamado um transposon. O protocolo abaixo descreve um método para transferência de alta eficiência entre cepas bacterianas de um plasmídeo abrigando um transposon contendo um marcador de resistência canamicina. O transposase transmitidas por plasmídeo é codificada por um gene variante tnp que insere o transposon o genoma da estirpe destinatário com viés insercional muito baixa. Este método permite, assim, a criação de grandes bibliotecas mutantes no qual transposões foram inseridos em posições genômicas exclusivas em um destinatário cepa de bactérias ou Escherichia coli ou Shigella flexneri . Por meio de conjugação bacteriana, ao contrário de outros métodos, como electroporation ou transformação química, grandes bibliotecas com centenas de milhares de clones exclusivos podem ser criadas. Isso resulta em bibliotecas de inserção de alta densidade, com inserções ocorrem como frequentemente como cada 4-6 pares de base em genes não essenciais. Este método é superior aos outros métodos, pois permite um método de baixo custo, fácil de usar e alta eficiência para a criação de uma biblioteca de inserção densa transposon. A biblioteca de transposon pode ser usada em aplicações a jusante como transposon sequenciamento (Tn-Seq), para inferir as redes de interação genética, ou mais simplesmente, mutacional (frente genética) telas.

Introduction

A criação de bibliotecas de mutagénese transposon em bactérias é útil para uma grande variedade de aplicações, que vão desde as descobertas de genes de virulência de patógenos bacterianos1,2, para estudos de genes essenciais3, 4 , 5 , 6, para a identificação de interação genética redes7,8,9. Crítica para estes estudos é a capacidade de criar uma grande biblioteca de mutantes. O uso de transposões (curtos fragmentos de DNA que inserem aleatoriamente em um genoma) é um meio simples de perturbar a função do gene, como a inserção de um transposon dentro do frame de leitura aberto ou região reguladora de um gene frequentemente irá interromper a função ou a expressão do gene.

Descritas aqui, é um método para a criação de uma biblioteca de transposon em e. coli ou S. flexneri por conjugação bacteriana usando o plasmídeo pJA110. Existem duas principais vantagens de usar este plasmídeo. A primeira vantagem é que a variante do transposase Tn10 expressado do plasmídeo pJA1 é inducible e tem baixa inserção viés11,12, significando que o transposon integrará aleatoriamente no genoma quando isopropílico Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) é adicionado para a mídia. O transposon contém um marcador de resistência de canamicina, permitindo a seleção de mutantes com as inserções de transposon para o cromossomo da estirpe destinatário. A segunda vantagem do plasmídeo pJA1 é que contém uma origem de replicação R6K do mutante. A R6K mutante origem de replicação requer o gene de pir lambda em ordem para a manutenção do plasmídeo13. Como o plasmídeo não pode replicar em pir - tensões, ele vai perder a tensão destinatário (Figura 1). Isso garante que o Tn10 transposase é removido da célula e não está mais ativo, reduzindo ainda mais as mutações após o evento inicial da transposição.

O uso de conjugação bacteriana para mover o plasmídeo pJA1 da estirpe dos doadores para a destinatário estirpe é vantajoso, por vários motivos. Conjugação é simples e barato para executar e não precisa de equipamentos especiais, como um electroporator. Além disso, a alta eficiência de conjugação bacteriana permite uma biblioteca muito grande (> 2 x 105 inserções exclusivas) para ser alcançado com apenas alguns mililitros (mL) de uma noite de cultura bacteriana6. O processo leva cerca de duas horas de tempo hands-on, juntamente com o tempo de incubação e crescimento das bactérias. Et al . Langridge 14 relatada realizar 130 electroporations para criar uma biblioteca de mutagénese transposon de tamanho semelhante ao descrito aqui8, que é conseguido com uma conjugação única. O uso de 130 electroporations requer trabalho intensivo e demorada preparação de células de electrocompetent e o uso de muitos materiais caros (por exemplo, cubetas de eletroporação), a um custo de mais de US $1.000 USD em consumíveis sozinhos. Outros estudos10 utilizaram métodos semelhantes, mas com diferentes estirpes de bactérias e alcançado distante menor biblioteca tamanhos (5 x 104 unidades de formação de Colônia) que relataram aqui.

Notas sobre a tensão do doador: A tensão de doador usada aqui é a cepa de Escherichia coli BW2076715 contendo o plasmídeo de transposon pJA116. BW20767 de tensão pode conjugar para outras tensões, procede à transferência do plasmídeo pJA1 altamente eficiente. Também, importante, BW20767 é lambda pir +. Como mencionado anteriormente, o plasmídeo pJA1 só é capaz de ser mantida em linhagens contendo o gene de pir lambda. Esta tensão é canamicina e resistente à ampicilina. O plasmídeo pJA1 contém marcador de resistência a ampicilina, e um marcador de resistência de canamicina está contido dentro o transposon. Esta variedade é cultivada com seleção sobre o plasmídeo usando ampicilina 100 µ g/ml. Também é interessante notar que outras estirpes abrigando constitutivamente expressa transposase genes são conhecidos por ser instável e enquanto o transposase usado aqui é sob inducible controle, ainda há um baixo risco de expressão gotejante. Por esta razão, sugere-se que a passagem desta estirpe deve ser minimizada e uma raia fresca deve ser tirada uma cultura congelada para cada nova preparação de biblioteca. A tensão de doador usada aqui é disponível a partir do nosso laboratório mediante pedido.

Notas sobre a tensão do destinatário: A cepa de destinatário pode ser uma variedade de escolha, como cepas de laboratório K12-derivado de e. coli ou estirpes de S.flexneri (Veja também, a discussão). A estirpe de destinatário deve ter um marcador de resistência aos antibióticos adicionais que não é resistência de canamicina, para que a tensão do doador pode ser selecionada contra. Para o tipo de destinatário, uma estirpe de MG1655 de e. coli é usada aqui com uma mutação introduziu o ácido nalidíxico espontânea. O mutante espontâneo ácido nalidíxico foi selecionado pelo chapeamento 2 ml da cultura durante a noite em 200 alíquotas µ l em placas contendo ácido nalidíxico 30 µ g/ml. Um único clone de MG1655 foi selecionado que era resistente ao ácido nalidíxico, tornar-se o destinatário estirpe. Além disso, a tensão do destinatário deve ser lambda pir negativo, conforme descrito acima.

Visão geral: Uma vez que a conjugação bacteriana foi realizada e o plasmídeo pJA1 mudou-se da estirpe dos doadores para a cepa de destinatário, a adição de IPTG à mídia irá induzir a expressão do gene do tnp , que está sob o controle de IPTG-inducible lacIq/Ptac promotor (Figura 1). O gene do tnp na pJA1 é uma transposase mutante que tem uma baixa frequência de inserção em pontos quentes6,10,11. A adição e indução com IPTG, o transposon é ativado e aleatoriamente inserido no genoma. O plasmídeo não pode ser mantido na estirpe de pir-destinatário do lambda e é perdido.

Protocol

atenção: se usar S. flexneri como uma estirpe de destinatário, por favor, note que a S. flexneri é um patógeno humano que pode causar doenças gastrointestinais. Experimentos envolvendo S. flexneri devem ser realizados com as precauções apropriadas de biossegurança (designadas BSL-2 na Europa e EUA ou PC2 na Nova Zelândia). Todos os experimentos realizados no vídeo associado a este protocolo foram feitos usando a tensão destinatário bem caracterizada do não-patogênicas de Escherichia coli MG1655 em uma configuração de PC1. Trabalho com Shigella flexneri anteriormente foi realizado em um laboratório BSL-2 o Biozentrum em Basileia, conforme descrito em 6.

Nota: O seguinte experimento efetivamente é feito duas vezes. A primeira parte (etapa 1.1 - passo 4.5) é realizada para descobrir a melhor diluição para o chapeamento da biblioteca, onde o objetivo é encontrar uma diluição de conjugação que dá muitas colónias individuais por placa, mas não tantos que formulários um gramado. Isto é para reduzir a competição entre os mutantes com aptidão significativamente reduzido e aqueles com aptidão mais robusto. A segunda parte (etapas 5.1-7,4) é a criação da biblioteca de final, onde muitas placas estão espalhadas de diluição apropriada da biblioteca.

1. para preparar um dia antes da experiência

  1. inóculo, de um estoque congelado, a estirpe de doador em 2 mL de caldo LB, mídia de receita (NaCl a 10 g/L) de moleiros contendo ampicilina 100 µ g/ml. A tensão de doador usada aqui é a cepa de Escherichia coli BW20767 15, abrigando o plasmídeo de pJA1 11. O uso de ampicilina mantém a seleção para o plasmídeo pJA1.
  2. Inóculo, de uma única colônia ou estoque congelado, a estirpe de destinatário em 2 mL de LB mídia com um marcador de resistência diferente de ampicilina ou canamicina. O destinatário estirpe usada aqui é a Escherichia coli " tipo selvagem " Coe MG1655 17 , 18 com um mutante de resistência espontânea ao ácido nalidíxico. É cultivada em 30 µ g/mL de ácido nalidíxico.
  3. Placas de preparar 20 Luria caldo contendo ágar 1,5% (em pratos de petri de 90 mM, aproximadamente 12,5 mL). Placas de ágar falta antibiótico podem ser armazenadas a 4 ° C por vários meses até o uso.
  4. Placas de 1,5% de ágar contendo preparar caldo de Luria de 20 (em pratos de petri de 90 mM, aproximadamente 12,5 mL) contendo tanto ácido nalidíxico 30 µ g/ml e canamicina em 50 µ g/mL (LBA Nal30 Kan50). Placas de ágar contendo antibióticos podem ser armazenadas no escuro a 4 ° C por vários meses até o uso.
  5. Preparar 200 mL de estéril LB mídia. LB mídia pode ser armazenada em temperatura ambiente por vários meses.
  6. Prepare-se 1 mL de 100mm estoque estéril de IPTG, de acordo com o fabricante ' instruções de s.

2. Acasalamento ou conjugação bacteriana

  1. centrífuga 1 mL da cultura durante a noite da estirpe dos doadores para 1 minuto em 14.000 x g à temperatura ambiente. Descarte a mídia de crescimento. Este passo é feito para remover todos os meios de crescimento, contendo antibióticos.
  2. Ressuspender as células em 110 µ l de LB (não contendo antibióticos), concentrando-se, assim, a cultura.
  3. Usando pinça estéril, coloque um filtro de nitrocelulose estéril (alternativamente um estéril pedaço de papel mata-borrão pode ser usada, consulte materiais lista) no meio de uma placa LBA (não contendo antibióticos). Rotular a placa " controlo negativo: doador ".
  4. Usando uma pipeta, cair 50 μL da cultura concentrado doador para o filtro.
  5. Repita os passos 4-2.1 para o tipo de destinatário, rotulando a placa " controlo negativo: destinatário. "
  6. Para a biblioteca, passe 50 µ l do doador (da etapa 2.2) e 50 µ l da estirpe destinatário (da etapa 2.5) em um único filtro estéril em um prato LBA (essas placas não devem conter antibióticos). Rotule esta placa " biblioteca. " acasalamento ocorre porque o dador e o receptor estão em contato físico no filtro.
  7. Colocar as placas de ágar contendo os filtros a 37 ° C, durante 6 h.

3. Ativação do Transposon pJA1 por IPTG indução do Transposase

  1. preparar três frascos cônicos de 15 mL contendo 2 mL de LB com IPTG em uma concentração final de 1 mM (ou seja, 20 µ l de estoque de 100 mM de IPTG). Cada etiqueta: controle do doador, controle do destinatário e a biblioteca.
  2. Remover as placas de incubadora após 6 h de crescimento a 37 ° C (da etapa 2.4). Algum crescimento bacteriano deve ser visível no filtro.
  3. Usando pinça estéril, remova o papel de filtro do controle de doador e colocá-lo no frasco 15ml cónico rotulado controle do doador (da etapa 3.1). Faça o mesmo para o controle do destinatário e a biblioteca.
  4. Toque os tubos para obter o papel de filtro no fundo do frasco 15ml cónico e certifique-se de que está totalmente submersa em lb
  5. Vortex tubos pelo menos um minuto no máximo para desassociar as bactérias do filtro de nitrocelulose. O LB deve tornar-se nublado com células bacterianas ( Figura 2).
  6. Usando esferas de vidro estéril ou um espalhador estéril, placa 200 µ l de suspensão de bactérias de vortexed do controle de doador em placas LBA Nal30 Kan50 rotulado " controle de doador, 200 µ l ".
  7. Repita o passo acima (3.6) para controle do destinatário, rotulando as placas " controle de destinatário, 200 µ l ".
  8. Repita o passo acima (3.7) para a biblioteca, rotulando as placas " biblioteca, 200 µ l ".
  9. Fazer diluições adicionais (ou seja, 1:5, diluições 01:10 e 1: 100, com LB não contendo antibióticos como diluente) da biblioteca. Placa de 200 µ l de biblioteca não diluída e diluições adicionais para adequadamente rotulados placas LBA Nal30 Kan50.
  10. Incubadora de
  11. placas de lugar para a 37 ° C por 18 h. Clones com transposões inserido em um gene que causa uma grande perda de aptidão pode levar mais tempo para crescer e aparecer na chapa. Deve haver uma variedade de tamanhos de Colônia ( Figura 3). Doador e placas de estirpe destinatário não devem ter nenhuma colônias neles.

4. Escolher a diluição apropriada da biblioteca a ser usado para a biblioteca de mutante Final

  1. determinar uma diluição da biblioteca de passo 3.9 que rende muitas colônias de tamanhos variados que são adequadamente espaçados. O objetivo é conseguir colônias como muitos como possível em um prato, mas não tantos que as colônias mesclagem em um outro e competem por recursos. Este número deve ser aproximadamente de 500-2.000 colônias por placa. Um exemplo de densidades de colônia apropriado em uma placa é mostrado na Figura 3.
  2. Gravar o número de colônias nas placas.
  3. Calcular a frequência de conjugação (o número de conjugants por célula destinatário). Isto deve ser na faixa de 1 x 10 -4 a 1 x 10 -6 19.
  4. Determinar o número de mutantes desejado na biblioteca final baseada em aplicações a jusante. Muitos usuários simplesmente exigem uma biblioteca com mutantes tantos quanto possível. Para gerar inserções de transposon como muitos como teoricamente possíveis (uma inserção cada par de base), Mire aproximadaly o mesmo número de colônias como pares de bases no genoma (i.e., ~4.5 x 10 6 em e. coli) para saturar completamente o genoma com todas as inserções de transposon possível. É importante notar, muitos mutantes abrigando inserções em essenciais ou genes funcionalmente importantes não será capazes de ser recuperado, como estas mutações será fatais para o destinatário.
  5. Calcular quanto volume de biblioteca inicial é necessária para criar uma biblioteca do tamanho desejado. Por exemplo, o tamanho da biblioteca desejada é 5 x 10 4 mutantes. A diluição com o melhor espaçamento das colônias de passo 3.9 era 200 µ l de uma 01:10 diluição. O número de colônias neste prato é estimado em aproximadamente 2.000 colônias. 5 x 10 4 mutantes são necessários e cada placa tem 2.000 colônias, se 25 placas serão necessários a esta diluição.

5. Criação da biblioteca de mutante Final

  1. repita os passos 1 a 3,8, ajustando o número de placas na etapa 1.4 conforme necessário (ver passo 4.4).
  2. a passo 3.9, placa a diluição escolhida na etapa 4.1 em tantas placas conforme necessário para criar a biblioteca do tamanho desejado (consulte a etapa 4.4).

6. Estimar a densidade de biblioteca

  1. contar quantas colônias lá são por placa e, assim, obter uma estimativa aproximada de densa como a biblioteca é. Por exemplo: um total de 2 x 10 5 colônias são banhados. O Escherichia coli MG1655 genoma é cerca de 4,5 x 10 6 pares de bases. Portanto, uma biblioteca com cerca de 2 x 10 5 insere significa que há uma inserção em média cada 22 pares de bases e que cada gene deve ser mutado cerca de 45 vezes, dado que um gene é de aproximadamente 1 x 10 3 pares de bases. Inserções em genes essenciais são prováveis ser muito sub-representados nessa biblioteca, e, portanto, a densidade de genes não essenciais é provável que seja maior que isso. Este tipo de cálculo fornece uma com uma ampla estimativa da densidade de transposon.

7. Pool de armazenamento e biblioteca de Transposon

  1. após a contagem de colônias, adicione 1 mL de LB (ou mais, conforme necessário) para a placa de biblioteca e usar um espalhador estéril para raspar as bactérias da placa. Remover a suspensão bacteriana e coloque em um frasco de Erlenmeyer 50 mL ou 15 mL. Repita para todas as placas.
  2. Vortex a suspensão de bactérias em pool por um minuto para homogeneizar a suspensão.
  3. Adicionar glicerol estéril para uma concentração final de 20%.
    1. Preparar alíquotas de 100 x 20 µ l em tubos de 0,25 mL para fácil re-crescimento.
    2. Preparar pelo menos dois ou mais 1 mL de alíquota em cryovials.
  4. Armazenar todas as alíquotas a -80 ° C

Representative Results

Depois de 18 horas de crescimento, as placas devem conter muitas colônias com uma variedade de tamanhos de colônia (Figura 3). Tamanhos diferentes de colônia indicam clones de fitness variados e são um bom sinal que o protocolo tem trabalhado. Os controles do dador e o receptor não devem ter nenhum crescimento nas placas. Usando o protocolo acima deve render bem mais de 2 x 105 unidades formadora de Colônia (UFC). Intensificação do protocolo para cinco conjugações replicar uma vez deve produzir aproximadamente 1 x 106 UFC. Em trabalho anterior, análise utilizando a próxima geração de sequenciamento indicado que deve produzir uma escala acima biblioteca > 2 x 105 inserções exclusivo6. UFC muito alta (ou seja, 1 x 106 UFC) a taxa de inserções exclusivas é esperada para planalto, todos disponíveis (não-fatais) inserções tornam-se representada.

Figure 1
Figura 1 : Esquemático da conjugação bacteriana e inserção de transposon no cromossomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imagem de filtros submergidas na LB mídia antes e depois da utilização do vortex. Antes num Vortex, células estão preso ao filtro e a mídia é clara. Após a utilização do vortex, a mídia torna-se nublado como células vieram fora o filtro e estão na mídia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : (A) placa representativa da biblioteca de transposon após 18 h de crescimento. (B) Close-up de tamanhos de colônia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo descrito aqui permite a construção de uma biblioteca de inserção densa. Este método permite a criação de uma biblioteca de transposon com mais de 2 x 105 mutantes de transposon exclusivo usando abaixo dos 5 mL de cultura volume6. Isso é relativamente fácil de executar, utiliza reagentes disponíveis nos laboratórios de microbiologia mais básicos, é escalável e requer pouco em termos de equipamento caro ou consumíveis como cubetas de eletroporação.

Um benefício significativo deste método é que, em teoria, o usuário tem ampla latitude na escolha de cepas de destinatário entérobactérienne. Este papel, assim como outros11, usar Escherichia coli como uma estirpe do destinatário, no entanto o plasmídeo pJA1 tem sido usado com sucesso com outras espécies de destinatário entérobactérienne como Shigella flexneri6 e Salmonella typhi sorovar Typhimurium estirpe SL134410. Teoricamente, a origem de replicação (oriR6Kγ) em pJA1 do γ permite este plasmídeo a ser mantida em um anfitrião ampla gama19, permitindo que o destinatário estirpe é pir +. Recentemente, têm sido descritos novos métodos que permitem a construção do pir + em uma variedade de cepas entérobactérienne20, dando flexibilidade adicional. Além disso, a região de300 pares de base máfia desde o plasmídeo RP4 em pJA1 permite a transferência conjugativo deste plasmídeo para uma ampla gama de gram negativo estirpes bacterianas19. Simplificando, esse método poderia teoricamente ser usado com uma variedade de cepas do destinatários, enquanto várias condições: a tensão é pir+ e é marcado com uma resistência aos antibióticos, além de canamicina e diferente da estirpe de doador.

Um passo crítico no protocolo encontra-se em estimar o número adequado de células para fora da placa na etapa 4.1. Se colônias são espaçadas muito de perto, eles competem por nutrientes no prato e menos aptos mutantes são outcompeted. Isso pode levar a uma redução do número total de mutantes. Como alternativa, se colônias são espaçadas muito muito distante, haverá muito poucas colônias na placa e o número total de placas de ágar, necessários para a realização de uma grande biblioteca torna-se onerosa. Portanto, alcançar o equilíbrio em termos de números de colônia por placa é importante.

É importante executar os controles listados no protocolo para garantir que os passos estão funcionando conforme descrito. Nomeadamente, quando usando ácido nalidíxico como uma Counter-seleção contra a estirpe do doador, é importante assegurar que as placas de controle negativo doador estão livres das colônias. Isso ocorre porque pode haver uma taxa baixa (aproximadamente 1 x 10-10)21 de resistência espontânea ao ácido nalidíxico, gerando falsos positivos. Normalmente, a taxa de conjugação e transposição é aproximadamente 2 x 10-4 19. Portanto, a taxa de conjugação e transposição é várias ordens de magnitude maiores que a taxa de resistência espontânea ao ácido nalidíxico. Portanto, a taxa de falsos positivos em comparação com eventos de transposição de verdade é muito baixa e considerado negligenciável quando o protocolo está funcionando. No entanto, se as taxas de conjugação ou transposição são significativamente reduzidas, (de baixa eficiência de acasalamento e/ou falta de indução do gene transposase com IPTG) e o protocolo é dimensionado compensar isto, então o número de falsos positivos (clones que Não tenho o transposon inserido) também pode aumentar.

Algumas modificações podem ser feitas para tempos de incubação em 3.2 etapas e 3.10. Etapa de 3,2 Estados que conjugação deve ocorrer para 6 h, mas em nossa experiência, passo este tempo pode ser variado (isto é, 4-7 h) sem alterar os resultados significativamente. Além disso, na etapa 3.10, o comprimento de tempo que as colônias são incubadas sobre as placas de ágar também pode ser ajustado. Isto pode ser variado dependendo a média dobrando a taxa de crescimento ou tempo da estirpe destinatário. Além disso, em nossa experiência, 18 h produziu uma variedade de tamanhos de colônia, indicando uma biblioteca da aptidão diversa. No entanto, colônias com aptidão bastante reduzida podem levar mais tempo a crescer e, portanto, podem não ser visíveis após 18 h. Se esse método está sendo usado para encontrar clones de fitness extremamente reduzida, tempos de incubação mais longos e menos colônias na placa para reduzir a aglomeração (i.e., 48 h, 50-300 colônias) podem ser utilizadas.

Armadilhas adicionais deste método incluem o que não é possível usar uma cepa de destinatário que já é resistente a canamicina. É possível trocar o marcador de resistência de canamicina no plasmídeo pJA1 para um marcador selecionável alternativo, tais como a resistência de cloranfenicol para superar este obstáculo. Também pode ser interessante notar que, em teoria, é possível usar uma cepa de destinatário que é resistente à ampicilina, como o pJA1 o plasmídeo contendo o marcador de resistência a ampicilina é perdido logo após a transposição.

A criação de uma biblioteca de transposon densa no fundo genético de escolha é potencialmente vantajosa para muitas aplicações a jusante. Por exemplo, uma biblioteca de transposon densa pode ser usada para identificar os mutantes auxotróficos usando réplica chapeamento22 ou para identificar os mutantes que estão com defeito no estabelecimento de uma infecção1,2. Mais recentemente, como custos de sequenciamento de DNA caíram e tornaram-se novas tecnologias como a sequenciação de próxima geração comum, bibliotecas de transposon têm sido utilizadas com profundo sequenciamento de DNA para ganhar a introspecção em essencialidade do gene, função do gene e genética interações. Alguns desses métodos são revistos em 23 e incluem métodos, tais como sequenciamento de local de inserção do transposon-dirigido (TraDIS), sequenciamento de transposon (Tn-seq), inserção alta produtividade monitorando pelo sequenciamento profundo (HITS) e sequenciamento de inserção ( INSeq). Todos esses métodos a jusante dependem a construção de bibliotecas de inserção densa transposon. Enquanto outros vetores podem precisar de ser usado por determinados métodos a jusante, o protocolo descrito aqui fornece uma visão geral dos pontos mais salientes processuais a seguir.

Disclosures

O autor não tem nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradeço-o laboratório de Igreja de George pelo amável presente o plasmídeo pJA1. Agradeço Fabienne Hamburger e Alex Boehm do laboratório Jenal Urs no Biozentrum em Basileia para ajuda com conjugação bacteriana e para fornecer a tensão de BW20767. Agradeço também Olin Silander edições úteis. Financiamento para esta pesquisa foi fornecido pelos fundos da Universidade de Massey, na Nova Zelândia e a iniciativa Suíça em biologia de sistemas (projeto "Batalha X" atribuído ao Dirk Bumann) na Universidade de Basileia, Suíça.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) Millipore HAWP02500 Alternatively blotting paper can be used (listed below)
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm 3030-917 Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)
Metal Forceps, sterile VWR/Global Science New Zealand MURRE009/01
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL working volume. Interlab New Zealand 2303-1090
Sterile glass spreaders VWR/Global Science New Zealand NZNZSPREADER Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)
Sterile glass beads VWR/Global Science New Zealand HERE1080603 Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)
Nalidixic acid (optional) GoldBio.com N-015-250
Ampicillin sodium salt BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA0839.0025 prepare according to manufacturer recommendation
Kanamycin sulfate BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)  Thermofisher New Zealand FMTR0393
Difco Agar granulated Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand 214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) Thermofisher 12795-084
Glycerol bidistilled 99,5 % VWR/Global Science New Zealand VWRC24388.320
15 ml polypropelene sterile conical vials  VWR/Global Science New Zealand CORN430791
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable VWR/Global Science New Zealand AXYGMCT-175-C
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile VWR/Global Science New Zealand BDAA352070
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubator at 37C
Autoclave for sterilizing media 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  9. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. PNAS. 106, (38), 16422-16427 (2009).
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  11. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
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  14. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  15. Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35, (1), 1-13 (1996).
  16. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
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  18. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277, (5331), 1453-1462 (1997).
  19. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160, (1), 59-62 (1995).
  20. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5, (1), 157 (2012).
  21. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461, (7268), 1243-1247 (2009).
  22. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100, (24), 14339-14344 (2003).
  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11, (7), 435-442 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  4. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  5. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  6. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Great video! Very helpful. Thanks so much for it.

    Reply
    Posted by: Nathaniel J.
    February 1, 2018 - 1:12 PM
  2. Thank you so much for sharing your protocol. I am wondering how I can get the E. coli BW2767 including pJA1. Could you let me know from where you got them?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Mona A.
    March 14, 2019 - 3:48 PM
  3. Hi Mona,
    You are welcome to email me at n.freed@massey.ac.nz to request the strain (this is stated in the paper as well).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 18, 2019 - 6:13 PM
  4. Hello, I have a question, when you transform the donor strain with the transposon library, how can you know if there is a sufficient abundance of donor cells to perform the mating with the acceptor strain (organism of interest). Or there is no efficient way to determine this amount until after the conjugation event

    Reply
    Posted by: Miguel Angel m.
    March 12, 2020 - 3:03 PM
  5. Hi Miguel, thank you for your interest. I'm not sure I fully understand the question or I think you do not fully understand the method. The donor strain is provided by my lab. It contains the plasmid pJA1 with the transposon. The mating takes place using overnight cultures of both the donor (harboring the pJA1 plasmid/transposon) and the acceptor strain. Typically both strains are at a high density after overnight growth. If you are concerned, you can plate out a dilution of the overnight cultures to count how many cells per mL there are and to ensure you have enough donor. If you have further questions, simply email me at n.freed@massey.ac.nz.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 16, 2020 - 9:08 PM

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