Author Produced

Oprettelsen af en tætte Transposon indsættelse bibliotek ved hjælp af bakteriel konjugation i Enterobacterial stammer som Escherichia Coli eller Shigella flexneri

Immunology and Infection
 

ERRATUM NOTICE

Summary

Præsenteres her er en simpel metode til at skabe en high-density transposon indsættelse bibliotek i Escherichia coli eller Shigella flexneri ved hjælp af bakteriel konjugering. Denne protokol tillader oprettelsen af en samling af hundredvis af tusindvis af unikke mutanter i bakterier ved den tilfældige genomisk indsættelse af en transposon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Freed, N. E. Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. J. Vis. Exp. (127), e56216, doi:10.3791/56216 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transposon mutagenese er en metode, der giver mulighed for gen forstyrrelser via tilfældig genomisk indsættelse af et stykke DNA kaldet en transposon. Protokollen nedenfor skitserer en metode for højeffektiv overførsel mellem bakteriestammer af et plasmid husly en transposon indeholdende en kanamycin modstand markør. Plasmid-bårne transposase er kodet af en variant tnp gen, der indsætter transposon i genomet af den modtagende stamme med meget lav pattedyrsceller bias. Denne metode tillader således oprettelsen af store mutant biblioteker hvor transposoner er blevet indsat i unikke genomisk positioner i en modtagende stamme af enten Escherichia coli eller Shigella flexneri bakterier. Ved hjælp af bakteriel konjugering, i modsætning til andre metoder såsom elektroporation eller kemisk omdannelse, kan store biblioteker med hundreder af tusinder af unikke kloner oprettes. Dette giver high-density indsættelse biblioteker, med indsætninger forekommer så ofte som hver 4-6 base par i ikke-væsentlige gener. Denne metode er overlegen i forhold til andre metoder, da det giver mulighed for en billig, nem at bruge og høj effektivitet metode til etablering af et tæt transposon indsættelse bibliotek. Transposon-bibliotek kan bruges i downstream applikationer såsom transposon sekventering (Tn-FF.), for at udlede genetiske interaktion netværk, eller mere simpelt i mutationsmønstre (frem genetiske) skærme.

Introduction

Oprettelsen af transposon mutagenese biblioteker i bakterier er nyttige for en bred vifte af applikationer, lige fra opdagelser af virulens gener i bakterielle patogener1,2, at undersøgelser af væsentlige gener3, 4 , 5 , 6, identifikation af genetiske interaktion netværk7,8,9. Kritisk til disse undersøgelser er evnen til at skabe et stort bibliotek af mutanter. Brugen af transposoner (korte brudstykker af DNA, som indsætter tilfældigt i en genom) er et simpelt middel for at forstyrre genfunktion, da indsættelsen af en transposon inden for åben behandling ramme eller lovgivningsmæssige område af et gen vil ofte afbryde funktion eller udtryk af genet.

Skitseret her er en metode til oprettelse af en transposon bibliotek i enten E. coli eller S. flexneri ved bakteriel konjugering med plasmidet pJA110. Der er to vigtigste fordele ved at bruge denne plasmid. Den første fordel er at varianten af den Tn10 transposase udtryk fra pJA1 plasmid inducerbar og har lav indsættelse bias11,12, hvilket betyder at transposon tilfældigt vil integrere i genomet når Isopropyl Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) er føjet til medierne. Transposon indeholder kanamycin modstand markør, giver mulighed for valg af mutanter med transposon skær i kromosom af de modtagende stamme. Den anden fordel ved pJA1 plasmid er, at det indeholder et R6K mutant oprindelsen af replikering. R6K mutant oprindelsen af replikering kræver lambda pir gen i rækkefølge for vedligeholdelse af plasmid13. Som plasmidet ikke kan replikere i pir - stammer, vil det være tabt i den modtagende stamme (figur 1). Dette sikrer, at Tn10 transposase er fjernet fra cellen og er ikke længere aktiv, reducere yderligere mutationer efter hændelsen oprindelige gennemførelse.

Brugen af bakteriel konjugation at flytte pJA1 plasmid fra stamme, de donor til den modtagende stamme er fordelagtige for flere grunde. Konjugering er enkel og billig at udføre og behøver ikke speciel udstyr såsom en electroporator. Desuden, den høje effektivitet af bakteriel konjugation giver mulighed for et meget stort bibliotek (> 2 x 105 unikke indrykninger) skal opnås med et par milliliter (mL) af overnight bakteriekulturen6. Processen tager omkring to timer af hands-on tid sammen med tid til udrugning og vækst af bakterier. Langridge et al. 14 rapporteret udfører 130 electroporations at skabe en transposon mutagenese bibliotek af en størrelse svarende til, der beskrives her8, som er opnået med en enkelt konjugering. Brugen af 130 electroporations kræver arbejdskraft intensiv og tidskrævende forberedelse af electrocompetent celler og brugen af mange dyre materialer (fx, elektroporation kuvetter), til en pris på mere end $1.000 USD i forbrugsvarer alene. Andre undersøgelser10 har brugt lignende metoder, men med forskellige bakteriestammer, og opnåede langt mindre bibliotek størrelser (5 x 104 koloni danner enheder) end rapporteret her.

Noter på donor stamme: donor stamme bruges her er E. coli -stamme BW2076715 indeholdende pJA1 transposon plasmid16. Stamme BW20767 kan konjugat til andre stammer, foretager overførslen af pJA1 plasmid højeffektive. Også, ikke mindst BW20767 er lambda pir +. Som tidligere nævnt er plasmidet pJA1 kun kunnet opretholdes i stammer, der indeholder lambda pir genet. Denne stamme er kanamycin og ampicillin resistente. PJA1 plasmid indeholder ampicillin modstand markør, og kanamycin modstand markør er indeholdt i transposon. Denne stamme er vokset med udvælgelse på plasmidet bruge ampicillin på 100 µg/mL. Det er også værd at bemærke, at andre stammer husly constitutively udtrykt transposase gener er kendt for at være ustabil, og mens transposase bruges her er inducerbar kontrol, er der stadig en lav risiko for Utætte udtryk. Derfor foreslås det at passagen af denne stamme bør minimeres og en frisk streak bør tages fra en frossen kultur for hver ny bibliotek forberedelse. Donor stamme bruges her er tilgængelig fra vores lab efter anmodning.

Noter på stammen, der modtager: den modtagende stamme kan være en stamme af valg, såsom K12-afledte lab stammer af E. coli eller stammer af S.flexneri (også, se diskussion). Den modtagende stamme skal have en ekstra antibiotikaresistens markør, der ikke er kanamycin modstand, så donor stamme kan vælges mod. For den modtagende stamme, er en E. coli MG1655 stamme brugt her en indført spontane nalidixic syre mutation. Den spontane nalidixic syre mutant blev valgt af plating ud 2 mL af overnight kultur i 200 µL delprøver på plader der indeholder nalidixic syre på 30 µg/mL. En enkelt klon af MG1655 blev valgt, var resistente over for nalidixic syre til at blive den modtagende stamme. Derudover skal den modtagende stamme være lambda pir negative, som beskrevet ovenfor.

Oversigt: Når bakteriel konjugation har fundet sted og pJA1 plasmid er flyttet fra stammen, donor til den modtagende stamme, tilsætning af IPTG til medierne vil fremkalde udtryk for tnp -gen, som er under kontrol af IPTG-inducerbar lacIq/Ptac promoter (figur 1). Tnp gen på pJA1 er en mutant transposase, som har en lavere frekvens for indsættelse på Hotte steder6,10,11. Ved addition og induktion med IPTG, er transposon aktiveret og tilfældigt indsat i genomet. Plasmidet kan ikke opretholdes i lambda pir-modtageren stamme og går tabt.

Protocol

Advarsel: Hvis du bruger S. flexneri som en modtagende stamme, Bemærk at S. flexneri er en menneskelig patogen, der kan forårsage mave-tarmsygdom. Eksperimenter, der involverer S. flexneri skal udføres med passende biosikkerhed forholdsregler (udpeget BSL-2 i Europa og USA eller PC2 i New Zealand). Alle eksperimenter udført i den video, der er forbundet med denne protokol blev gjort ved hjælp af den godt karakteriseret modtager stamme af ikke-sygdomsfremkaldende E. coli MG1655 i PC1 omgivelser. Blev tidligere udført arbejde med Shigella flexneri i BSL-2 lab på Biozentrum i Basel, som beskrevet i 6.

Bemærk: den følgende eksperiment er effektivt gjort to gange. Den første del (trin 1.1 - trin 4.5) udføres for at finde den bedste fortynding for plating bibliotek, hvor målet er at finde en fortynding af den konjugering, som giver mange enkelte kolonier pr. plade, men ikke så mange, at en græsplæne former. Dette er for at reducere konkurrencen mellem mutanter med betydeligt reduceret fitness og dem med mere robust fitness. Den anden del (trin 5.1-7,4) er oprettelsen af den endelige bibliotek, hvor mange plader er spredt af en passende fortynding af biblioteket.

1. at udarbejde én dag forud for eksperiment

  1. Inoculate, fra en frossen bestand, donor stamme i 2 mL af LB bouillon, møllere opskrift (NaCl på 10 g/L) medier indeholdende ampicillin på 100 µg/mL. Donor stamme bruges her er E. coli-stamme BW20767 15 husly pJA1 plasmid 11. Brugen af ampicillin fastholder udvalg for pJA1 plasmid.
  2. Inoculate, fra en enkelt koloni eller frosne materiel, den modtagende stamme i 2 mL af LB medier med en modstand markør end ampicillin eller kanamycin. Den modtagende stamme bruges her er E. coli " vildtype " stamme MG1655 17 , 18 med en spontan modstand mutant til nalidixic syre. Det er vokset i 30 µg/mL nalidixic syre.
  3. Forberede 20 Luria bouillon indeholdende 1,5% agar plader (i 90 mM petriskåle, ca. 12,5 mL). Agar plader mangler antibiotika kan opbevares ved 4 ° C for flere måneder indtil brug.
  4. Forberede 20 Luria bouillon indeholdende 1,5% agar plader (i 90 mM petriskåle, ca. 12,5 mL) der indeholder både nalidixic syre på 30 µg/mL og kanamycin på 50 µg/mL (LBA Nal30 Kan50). Agar plader der indeholder antibiotika kan opbevares i mørke ved 4 ° C for flere måneder indtil brug.
  5. Forberede 200 mL sterilt LB medier. LB medier kan opbevares ved stuetemperatur i flere måneder.
  6. Forberede 1 mL 100 mm sterile bestand af IPTG, ifølge producenten ' s instruktioner.

2. Bakteriel parring eller konjugering

  1. Centrifuge 1 mL af overnight kultur af donor-stamme i 1 minut ved 14.000 x g ved stuetemperatur. Kassér vækst medier. Dette trin er gjort for at fjerne alle vækst medier indeholdende antibiotika.
  2. Resuspenderes celle i 110 µL af LB (ikke indeholdende antibiotika), således at koncentrere kulturen.
  3. Ved hjælp af steril pincet, placere en steril nitrocellulose filter (alternativt et sterilt stykke trækpapir kan anvendes, se materialer liste) på midten af en LBA plade (ikke indeholdende antibiotika). Label pladen " negativ kontrol: Donor ".
  4. Ved hjælp af en pipette, drop 50 µL af den koncentrerede donor kultur ind på filteret.
  5. Gentag trin 2.1-4 for den modtagende stamme, mærkning pladen " negativ kontrol: modtageren. "
  6. For biblioteket, drop 50 µL af donor (fra trin 2.2) og 50 µL af den modtagende stamme (fra trin 2,5) på en enkelt sterile filter på en LBA plade (disse plader ikke skal indeholde antibiotika). Mærke denne plade " biblioteket. " parring opstår fordi donor og modtager er i tæt fysisk kontakt på filteret.
  7. Placer agar plader der indeholder filtre ved 37 ° C i 6 h.

3. Aktivering af pJA1 Transposon af IPTG induktion af Transposase

  1. Forbered tre 15 mL konisk hætteglas indeholdende 2 mL af LB med IPTG i en endelig koncentration på 1 mM (dvs., 20 µL af 100 mM bestanden af IPTG). Label hver: Donor kontrol, modtageren kontrol og bibliotek.
  2. Fjerne pladerne fra rugemaskinen efter 6 h vækst ved 37 ° C (fra trin 2.4). Nogle bakterievækst skal være synlige under filteret.
  3. Ved hjælp af steril pincet, fjerne filterpapir fra kontrolelementet donor og placere den i 15 mL konisk hætteglasset mærket Donor kontrol (fra trin 3.1). Gør det samme for modtageren kontrol og bibliotek.
  4. Tryk på rør for at få filtrerpapir til bunden af 15 mL konisk hætteglas og sikre, at det er fuldt neddykket i lb
  5. Vortex rør til mindst en fuld minut på høj fjerne tilknytningen bakterierne i filteret nitrocellulose. LB bliver overskyet med bakterieceller ( figur 2).
  6. Ved hjælp af steril glasperler eller en steril spreader, plade 200 µL af vortexed bakterier suspension fra kontrolelementet donor på LBA Nal30 Kan50 tallerkener mærket " Donor kontrol, 200 µL ".
  7. Gentag trin ovenfor (3.6) for de modtagende kontrol, mærkning pladerne " modtager kontrol, 200 µL ".
  8. Gentag trin ovenfor (3.7) for biblioteket, mærkning pladerne " bibliotek, 200 µL ".
  9. Gøre yderligere fortyndinger (dvs., 1:5, 1:10 og 1: 100 fortyndinger, ved hjælp af LB ikke indeholdende antibiotika som et fortyndingsmiddel) af biblioteket. Plade 200 µl af ufortyndet bibliotek og yderligere fortyndinger på behørigt mærket LBA Nal30 Kan50 plader.
  10. Sted plader til 37 ° C inkubator for 18 h. kloner med transposoner indsat i et gen, der medfører et stort tab af fitness kan tage længere tid at vokse og vises på pladen. Der bør være en række koloni størrelser ( figur 3). Donor og recipient stamme plader skal have ingen kolonier på dem..

4. Vælg den passende fortynding af bibliotek skal bruges til den endelige Mutant bibliotek

  1. Bestem en fortynding af biblioteket fra trin 3.9, der giver mange kolonier af varierende størrelser der er passende fordelt. Formålet er at få så mange kolonier som muligt på én plade, men ikke så mange, at kolonierne flette ind i hinanden og konkurrere om ressourcer. Dette tal bør være ca 500-2.000 kolonier pr. plade. Et eksempel på passende koloni tætheder på en plade er vist i figur 3.
  2. Registrere antallet af kolonier på pladerne.
  3. Beregne hyppigheden af konjugation (antallet af conjugants pr. modtager celle). Dette bør i rækken af 1 x 10 -4 til 1 x 10 -6 19.
  4. Bestemmer antallet af mutanter ønskede i den endelige bibliotek baseret på downstream applikationer. Mange brugere blot kræver et bibliotek med så mange mutanter som muligt. Til at generere så mange transposon indsætninger som teoretisk muligt (en indsættelse hvert base par), sigter til omtrentligely det samme antal kolonier som basepar i genomet (dvs., ~4.5 x 10 6 for E. coli) til fuldt mætte genomet med alle mulige transposon indsættelser. Det er vigtigt at bemærke, mange mutanter husly indsættelser i væsentlige eller funktionelt vigtige gener vil ikke kunne inddrives, som disse mutationer vil være fatalt at modtageren.
  5. Beregne, hvor meget mængden af det oprindelige bibliotek er nødvendig for at skabe et bibliotek af den ønskede størrelse. For eksempel har ønskede bibliotek fylder 5 x 10 4 mutanter. Fortynding med den bedste afstand af kolonier fra trin 3.9 var 200 µL af en 1:10 fortynding. Antallet af kolonier på denne plade er anslået til at være cirka 2.000 kolonier. Hvis 5 x 10 4 mutanter er nødvendige og hver plade har 2.000 kolonier, så 25 plader vil være behov for i denne fortynding.

5. Oprettelsen af den endelige Mutant bibliotek

  1. Gentag trin 1 til 3.8, justere antallet af plader på trin 1.4 efter behov (Se trin 4.4).
  2. På trin 3.9, plade fortynding valgt i skridt 4.1 ind på så mange plader efter behov for at oprette biblioteket i den ønskede størrelse (Se trin 4.4).

6. Anslå bibliotek tæthed

  1. tælle hvor mange kolonier der er pr. plade, og derved få et groft skøn over, hvor tætte biblioteket er. For eksempel: 2 x 10 5 kolonier alt er forgyldt. E. coli MG1655 genom er ca 4,5 x 10 6 basepar. Derfor, et bibliotek med omkring 2 x 10 5 indsætter betyder, at der er en Indsæt i gennemsnit hver 22 basepar og at hvert gen bør være muteret omkring 45 gange, givet at et gen er ca 1 x 10 3 basepar. Indsættelser i væsentlige gener er tilbøjelige til at være meget underrepræsenterede i dette bibliotek, og dermed tæthed i ikke-væsentlige gener er tilbøjelige til at være større end dette. Denne form for beregningen giver en med en bred vurdering af transposon tæthed.

7. Samle Transposon bibliotek og opbevaring

  1. efter optælling af kolonier, der tilsættes 1 mL af LB (eller mere, efter behov) på biblioteket pladen og bruge en steril sprederen til at skrabe ud bakterier fra pladen. Fjernes bakteriel suspension og sted i en 50 mL eller 15 mL konisk hætteglas. Gentag for alle plader.
  2. Vortex poolede bakterier suspension for en fuld minut at homogenisere suspensionen.
  3. Tilføje steril glycerol til en endelig koncentration på 20%.
    1. Forberede let re-vækst 100 x 20 µL delprøver i 0,25 mL rør.
    2. Forberede mindst to eller flere 1 mL alikvot i cryovials.
  4. Gemme alle alikvoter ved-80 ° C

Representative Results

Efter 18 timers vækst, plader skal indeholde mange kolonier med en række koloni størrelser (figur 3). Forskellige koloni størrelser angiver kloner af varierende fitness, og er et godt tegn, at protokollen har arbejdede. Kontrolelementerne donor og modtager skal have nogen vækst på pladerne. Ved hjælp af ovenstående protokollen bør give langt over 2 x 105 koloni danner enheder (CFU). Optrapning af protokollen til fem Repliker bøjninger på én gang skal give ca 1 x 106 CFU. I tidligere arbejde, analyse ved hjælp af næste generation sequencing anført, at sådan en skaleret op bibliotek burde give > 2 x 105 unikke indsætninger6. Ved meget høj CFU (dvs., 1 x 106 CFU) forventes satsen for unikke indsætninger at plateau, som alle tilgængelige (ikke-dødelige) indsætninger blive repræsenteret.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk af bakteriel konjugering og indsætning af transposon i kromosomet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Billede af filtre nedsænket i LB media før og efter vortexing. Før vortexing, celler sidder fast til filteret og medierne er klar. Efter vortexing bliver medierne uklar som celler er kommet ud af filteret og er i medierne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : (A) repræsentative plade af transposon bibliotek efter 18 h af vækst. (B) tæt op af kolonien størrelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Protokollen beskrevet her giver mulighed for opførelse af en tætte indsættelse bibliotek. Denne metode giver mulighed for oprettelse af en transposon bibliotek med over 2 x 105 unikke transposon mutanter bruger under 5 mL af kultur bind6. Det er relativt let at udføre, bruger reagenser findes i mest grundlæggende Mikrobiologi labs, er skalerbar og kræver lidt i vejen for dyrt udstyr eller forbrugsmaterialer såsom elektroporation kuvetter.

En væsentlig fordel ved denne metode er, at i teorien, har brugeren vidt spillerum i valget af enterobacterial modtager stammer. Dette papir, såvel som andre11, bruge E. coli som en modtagende stamme, men pJA1 plasmid har været anvendt med succes med andre enterobacterial modtager arter som Shigella flexneri6 og Salmonella enterica serovar Typhimurium stamme SL134410. Teoretisk, γ oprindelsen af replikering (oriR6Kγ) i pJA1 tillader denne plasmid skal opretholdes i en bred host range19, tillade, at den modtagende stamme er pir +. For nylig, nye metoder er blevet beskrevet som giver mulighed for opførelse af den pir + i en række enterobacterial stammer20, hvilket giver ekstra fleksibilitet. Derudover tillader regionen300 basepar mob fra RP4 plasmid i pJA1 konjugering overførsel af denne plasmid til en bred vifte af gram negative bakteriestammer19. Simpelthen sætte, denne metode kan teoretisk bruges med en bred vifte af modtagerens stammer, så længe flere betingelser er opfyldt: stammen, der er pir+, og er mærket med en antibiotisk resistens end kanamycin og donor stamme.

Et kritisk trin i protokollen ligger i estimeringen af ordentlig antallet af celler til plade ud i trin 4.1. Hvis kolonier er fordelt for tæt, de konkurrerer om næringsstoffer på pladen og mindre fit mutanter er outcompeted. Dette kan føre til en reduktion i det samlede antal af mutanter. Alternativt, hvis kolonier er fordelt alt for langt fra hinanden, vil der være for få kolonier på pladen, og det samlede antal agar plader for at opnå et stort bibliotek bliver belastende. Derfor, at opnå den rette balance med hensyn til kolonien antallet pr. plade er vigtigt.

Det er vigtigt at udføre den kontrol, der er anført i protokollen til at sikre trinene arbejder som beskrevet. Især, når du bruger nalidixic syre som en Counter markering mod donor stamme, er det vigtigt at sikre negative donor kontrol plader er gratis af kolonier. Dette skyldes, at der kan være en lav sats (ca 1 x 10-10)21 af spontan modstand mod nalidixic syre, giver falske positiver. Typisk, er konjugering og gennemførelse af ca 2 x 10-4 19. Derfor, er konjugering og gennemførelse af flere størrelsesordener større end satsen for spontan modstand mod nalidixic syre. Derfor, antallet af falske positiver i forhold til sande gennemførelse begivenheder er meget lav og anses for ubetydelig, når protokollen er i orden. Men hvis satserne for konjugation eller gennemførelse er væsentligt reduceret, (fra lav parring effektivitet og/eller mangel på induktion af transposase-gen med IPTG) og protokollen er skaleret til at kompensere for dette, så antallet af falske positiver (kloner, har ikke transposon indsat) kan også øge.

Nogle ændringer kan foretages til inkubation times i trin 3.2 og 3.10. Trin 3,2 stater, der konjugation bør forekomme i 6 timer, men vores erfaring, denne gang trin kan være varieret (dvs.4-7 h) uden at ændre resultaterne betydeligt. Derudover i trin 3.10, kan varigheden af kolonierne inkuberes på agar plader også justeres. Dette kan varieres afhængigt af den gennemsnitlige fordobling tid eller vækst rate af den modtagende stamme. Derudover er vores erfaring givet 18 h en række koloni størrelser, der angiver et bibliotek af forskellige fitness. Dog kolonier med stærkt reducerede fitness kan tage længere tid at vokse og dermed muligvis ikke synlige efter 18 h. Hvis denne metode anvendes til at finde kloner af ekstremt nedsatte fitness, kan længere inkuberingstider og færre kolonier på pladen til at reducere trængslen (dvs., 48 h, 50-300 kolonier) anvendes.

Yderligere faldgruber ved denne metode omfatter at det ikke er muligt at bruge en modtagende stamme, der er allerede kanamycin resistente. Det kan være muligt at bytte ud kanamycin modstand markør i pJA1 plasmid for en alternativ valgbar markør, såsom chloramphenicol modstand til at overvinde denne forhindring. Det kan også være værd at bemærke, at i teorien, det er muligt at bruge en modtagende stamme, der er resistent over for ampicillin, som pJA1 plasmid som indeholder ampicillin modstand markør er tabt kort efter overtagelsen.

Oprettelsen af et tæt transposon bibliotek i den genetiske baggrund for valg er potentielt fordelagtig for mange downstream applikationer. For eksempel, kunne en tætte transposon bibliotek bruges til at identificere auxotrophic mutanter ved hjælp af replica plating22 eller at identificere mutanter, der er defekt i oprettelse af en infektion1,2. For nylig, da DNA-sekventering omkostninger er faldet og nye teknologier som næste generation sequencing er blevet hverdagskost, transposon biblioteker har været anvendt med dyb DNA-sekventering for at få indsigt i gen væsentlighed, genfunktion, og genetiske interaktioner. Nogle af disse metoder er gennemgået i 23 og omfatter metoder såsom transposon-instrueret indsættelsen site sekventering (TraDIS), transposon sekventering (Tn-FF.), høj overførselshastighed indsættelse sporing af dyb sekventering (HITS), og indsættelse sekventering ( INSeq). Alle disse downstream metoder stole på opførelsen af tætte transposon indsættelse biblioteker. Mens andre vektorer kan skal bruges til særlig downstream metoder, giver protokollen beskrevet her en oversigt over de vigtigste proceduremæssige punkter til følge.

Disclosures

Forfatteren har intet at videregive.

Acknowledgments

Tak George kirken Lab for den slags gave af pJA1 plasmid. Jeg takker Fabienne Hamburger og Alex Boehm fra Urs Jenal Lab på Biozentrum i Basel for at få hjælp med bakteriel konjugering og for at give BW20767 stammen. Jeg takker også Olin Silander for nyttige redigeringer. Finansieringen af denne forskning blev leveret af midler fra Massey University i New Zealand og den schweiziske initiativ i systembiologi (projekt "Slaget X" tildeles Dirk Bumann) på universitetet i Basel, Schweiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) Millipore HAWP02500 Alternatively blotting paper can be used (listed below)
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm 3030-917 Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)
Metal Forceps, sterile VWR/Global Science New Zealand MURRE009/01
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL working volume. Interlab New Zealand 2303-1090
Sterile glass spreaders VWR/Global Science New Zealand NZNZSPREADER Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)
Sterile glass beads VWR/Global Science New Zealand HERE1080603 Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)
Nalidixic acid (optional) GoldBio.com N-015-250
Ampicillin sodium salt BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA0839.0025 prepare according to manufacturer recommendation
Kanamycin sulfate BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)  Thermofisher New Zealand FMTR0393
Difco Agar granulated Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand 214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) Thermofisher 12795-084
Glycerol bidistilled 99,5 % VWR/Global Science New Zealand VWRC24388.320
15 ml polypropelene sterile conical vials  VWR/Global Science New Zealand CORN430791
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable VWR/Global Science New Zealand AXYGMCT-175-C
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile VWR/Global Science New Zealand BDAA352070
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubator at 37C
Autoclave for sterilizing media 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol. 34, (2), 257-267 (1999).
  2. Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection. Science. 269, (5222), 400-403 (1995).
  3. Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. Essential genes of a minimal bacterium. PNAS. 103, (2), 425-430 (2006).
  4. Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 186, (23), 7926-7935 (2004).
  5. Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis. PNAS. 95, (15), 8927-8932 (1998).
  6. Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality. BMC Microbiology. 16, (1), 1-14 (2016).
  7. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6, (10), 767-772 (2009).
  8. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  9. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. PNAS. 106, (38), 16422-16427 (2009).
  10. Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice. Infect and Immun. 73, (9), 5438-5449 (2005).
  11. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
  12. Bender, J., Kleckner, N. IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition. The EMBO Journal. 11, (2), 741-750 (1992).
  13. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258, (7), 4083-4090 (1983).
  14. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  15. Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35, (1), 1-13 (1996).
  16. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
  17. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, (0), 135-140 (1981).
  18. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277, (5331), 1453-1462 (1997).
  19. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160, (1), 59-62 (1995).
  20. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5, (1), 157 (2012).
  21. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461, (7268), 1243-1247 (2009).
  22. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100, (24), 14339-14344 (2003).
  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11, (7), 435-442 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  4. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  5. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  6. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Great video! Very helpful. Thanks so much for it.

    Reply
    Posted by: Nathaniel J.
    February 1, 2018 - 1:12 PM
  2. Thank you so much for sharing your protocol. I am wondering how I can get the E. coli BW2767 including pJA1. Could you let me know from where you got them?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Mona A.
    March 14, 2019 - 3:48 PM
  3. Hi Mona,
    You are welcome to email me at n.freed@massey.ac.nz to request the strain (this is stated in the paper as well).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 18, 2019 - 6:13 PM
  4. Hello, I have a question, when you transform the donor strain with the transposon library, how can you know if there is a sufficient abundance of donor cells to perform the mating with the acceptor strain (organism of interest). Or there is no efficient way to determine this amount until after the conjugation event

    Reply
    Posted by: Miguel Angel m.
    March 12, 2020 - 3:03 PM
  5. Hi Miguel, thank you for your interest. I'm not sure I fully understand the question or I think you do not fully understand the method. The donor strain is provided by my lab. It contains the plasmid pJA1 with the transposon. The mating takes place using overnight cultures of both the donor (harboring the pJA1 plasmid/transposon) and the acceptor strain. Typically both strains are at a high density after overnight growth. If you are concerned, you can plate out a dilution of the overnight cultures to count how many cells per mL there are and to ensure you have enough donor. If you have further questions, simply email me at n.freed@massey.ac.nz.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 16, 2020 - 9:08 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics