أساليب للأس الهيدروجيني "التصوير داخل الخلايا" من "سلالة الخلايا الجذعية جريب" في "أنسجة المبيض" المورفولوجية لايف

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نحن نقدم بروتوكولا للتصوير pH داخل الخلايا النسب طلائي الخلايا الجذعية في أنسجة المبيض المورفولوجية حية. يصف لنا طرق لتوليد الذباب وراثيا معربا عن بيوسينسور درجة الحموضة، mCherry::pHluorin، والصورة بيوسينسور استخدام imaging fluorescence الكمية وتوليد المنحنيات القياسية، وتحويل قيم الكثافة الأسفار لقيم الأس الهيدروجيني.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tatapudy, S., Benitez, M., Nystul, T. Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue. J. Vis. Exp. (127), e56316, doi:10.3791/56316 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التغيرات في درجة الحموضة داخل الخلايا (pHi) دوراً هاما في تنظيم العديد من الوظائف الخلوية، بما في ذلك التمثيل الغذائي وانتشار والتمايز. عادة، يتم تحديد ديناميات pHi في الخلايا المستزرعة، وقابلة للقياس والتلاعب pHi تجريبيا. ومع ذلك، مؤخرا تطوير الأدوات والمنهجيات الجديدة جعلت من الممكن لدراسة ديناميات pHi داخل أنسجة سليمة، ويعيش. للبحوث المورفولوجية ، وكان أحد التطورات الهامة توليد خط المحورة وراثيا تحمل biosensor pHi، mCherry::pHluorin. هنا، يمكننا وصف بروتوكول التي نستخدمها بشكل روتيني للتصوير أوفاريوليس المورفولوجية حية لقياس pHi في نسب الخلايا الجذعية (FSC) جريب الظهارية في خطوط المعدلة وراثيا البرية نوع mCherry::pHluorin؛ ومع ذلك، الأساليب الموصوفة هنا يمكن تكييفها بسهولة للأنسجة الأخرى، بما في ذلك أقراص الجناح وظهاره العين. يصف لنا تقنيات للتعبير عن mCherry::pHluorin في النسب منتدى التعاون الأمني، المحافظة على أنسجة المبيض أثناء التصوير، والعيش واكتساب وتحليل الصور للحصول على قيم pHi.

Introduction

كشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا بدور للتغييرات في pHi خلال الخلوي والتمايز وخلل التنسج في فيفو1،2. تبين هذه الدراسات أن pHi يتسق ملحوظ في الخلايا من نفس النوع في نفس المرحلة من التمايز، ولكن أن يتحول كما الخلايا الانتقال من مرحلة إلى أخرى. وفي بعض الحالات، منع التغييرات في pHi جزئيا يعطل التمايز، مما يوحي بأن التغيير في pHi ليس فقط كنتيجة للتغييرات في مصير الخلية ولكن بدلاً من ذلك يساعد على تشجيع التغيير في مصير الخلية، ربما من خلال الآثار على الأس الهيدروجيني الحساسة التنظيمية بروتينات أو التفاعلات الكيميائية المطلوبة للمفاضلة. دراسات المستقبل لديها القدرة على الكشف عن مزيد من التبصر في أدوار مختلفة كثيرة من pHi الديناميات في فيفو. ومع ذلك، واحداً من التحديات لدراسة pHi أثناء التفريق في فيفو هو الحصول على قياسات دقيقة من pHi. خلافا للميزات الأخرى من التمايز، مثل التغييرات في مورفولوجيا الخلوية والتعبير الجيني، وهو pHi خاصية كيميائية مجا الخلية التي لا يتم الاحتفاظ في الخلايا التي تم إصلاحها وبيرميبيليزيد مع الأساليب القياسية. وبالإضافة إلى ذلك، قد لا يكون pHi مستقرة في الخلايا التي هي أكد أو يموتون نتيجة للتلاعب التجريبية. وبالتالي، من المهم إبقاء الخلايا حية وصحية قدر الإمكان عند قياس pHi. تتوفر العديد من الأصباغ الحيوية أن تعمل بشكل جيد لقياس أي الخلايا في ثقافة3، ولكن في كثير من الحالات أنها ليست مناسبة للدراسات في فيفو نظراً لأنها لا تخترق الأنسجة العميق أو بالتساوي بما يكفي لتوفير قياسات دقيقة .

للالتفاف على مشكلة اختراق صبغ الفقيرة، نحن وآخرون قد استخدمت تحقيق وراثيا مرمزة، mCherry::pHluorin4،5،،من67، التي يمكن التعبير عنها على وجه التحديد في الخلية أنواع الفائدة والمصورة في الأنسجة الحية. فلورين هو البديل للتجارة والنقل مع pKa أعلى (~ 7.0 مقابل ~ 4.0) أن يطوي بسهولة أكبر على درجة الحموضة أعلى؛ حتى يزداد كثافة fluorescence الإجمالية المنبعثة من أن جزيئات فلورين في الخلية مع تزايد pHi8. الأهم من ذلك، الفلورية الخطية داخل نطاق القيم pHi سيتوسوليك العادية. وفي المقابل، الأسفار مشري (pKa ~ 4.5) هو حساس لتغيرات درجة الحموضة داخل النطاق سيتوسوليك. هذه اثنين من الصحفيين تساهمي ترتبط معا بروتين تشيميريك واحد، مرمزة بواسطة إطار قراءة مفتوحة واحدة، حيث تكون دائماً موجودة بكميات متساوية. ولذلك، يوفر نسبة فلورين إلى مشري fluorescence كثافة قياس pHi هو تطبيع لتركيز التحقيق في كل خلية. ثم يمكن تحويل النسب إلى تقديرات القيم pHi استخدام منحنى قياسية التي يتم إنشاؤها بواسطة الحصول على فلورين نسب مشري من الأنسجة التي قد تم اكويليبراتيد لقيم الأس الهيدروجيني المعروفة.

هنا، يمكننا وصف الأساليب لاستخدام mCherry::pHluorin لقياس pHi سلالة FSC الظهارية في المبيض المورفولوجية . قد استخدمت هذا النسيج تتسم جيدا لنموذج العديد من الجوانب المختلفة للبيولوجيا الظهارية، مثل الخلايا الجذعية الذاتي تجديد والتمايز9،10،11، الهجرة الجماعية الخلية12 ، وتطوير وصيانة الخلية القطبية13،14. ظهارة جريب ينتج اثنين التابعة الموجودة في الحافة الأمامية للأنسجة في بنية تسمى ال15،جيرماريوم16. انقسام هذه الخلايا بشكل منتظم خلال مرحلة البلوغ تجديد نفسها وتنتج ذرية، تسمى خلايا بريفوليكلي (pFCs)، الذي يمكنه إعادة إدخال المكانة وتصبح منتدى التعاون الأمني أو تفرق في واحدة من ثلاثة أنواع الخلايا جريب مختلفة: الخلايا القطبية، وساق الخلايا، أو خلايا الجسم الرئيسي جريب. أظهرنا سابقا أن في الأنسجة wildtype، pHi يزيد مطردا خلال المراحل المبكرة من التمايز، من pHi حوالي 6.8 في التابعة إلى 7.0 في الهيدروكربون المشبع بالفلور، إلى 7.3 في جريب الخلايا2. حظر هذه الزيادة بواسطة [رني] ضربة قاضية مبادل الصوديوم/بروتون أعرب عن أوبيكويتوسلي، DNhe2، شدة يضعف التمايز الهيدروكربون المشبع بالفلور، بينما زيادة pHi overexpression من DNhe2 الأسباب تفريق الزائد خفيف النمط الظاهري. تبين هذه النتائج أن pHi ثابت يحتفظ في النسب منتدى التعاون الأمني مبكرا، وأنه يمكن أن يكون تجريبيا تزيد أو تنقص في فيفو. يمكن استخدام الأساليب المذكورة هنا لقياس pHi في الأنسجة wildtype أو أشكال مختلفة من الأنسجة متحولة، بما في ذلك [رني] ضربة قاضية أو أوفيريكسبريسيون باستخدام Gal4 الفائدة، واستنساخ الانقسامية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: لقياس pHi في النسب منتدى التعاون الأمني، حساب نسبة كثافة fluorescence فلورين إلى مشري في التابعة، والهيدروكربونات المشبعة بالفلور، والخلايا جريب في الظروف الفسيولوجية، وتحويل القيم pHi مع معيار النسب منحنيات المعايرة لكل خلية اكتب 7. وتجري تجارب التصوير الأولى، ويعيش لقياس كثافة fluorescence فلورين ومشري في تشريح في المخزن مؤقت الذي يحتوي على ناكو 3، الذي يحاكي الظروف الفسيولوجية 1 ، جيرماريا 7-المنحنيات القياسية التالية، ويتم إنشاؤها بواسطة قياس كثافة fluorescence فلورين ومشري في غ ++ المخزن المؤقت الذي يحتوي على نيجيريسين ionophore الحرة، تعديل لقيم الأس الهيدروجيني مختلفة اثنين، 6.5 و 7.5. حضور نيجيريسين، اكويليبراتيس pHi مع الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت عبر غشاء البلازما، مما تسبب في pHi لتتناسب مع درجة الحموضة خارج الخلية. وأخيراً، تستخدم المنحنيات القياسية لتحويل فلورين إلى نسب مشري على القيم المقدرة pHi.

1. المرحلة التمهيدية: "التحضير قبل قياس" pHi في فيفو

ملاحظة: لقياس pHi في فيفو، يجب أن يعبر عنه التحوير mCherry::pHluorin في الخلية نوع من الفائدة. وفيما يلي بعض الطرق الشائعة لتوليد فلورين المعدلة وراثيا الذباب في النسب منتدى التعاون الأمني. توليد استنساخ mCherry::pHluorin مفيد بشكل خاص لتحديد التابعة، التي تقع على الحافة الأمامية استنساخ منتدى التعاون الأمني. الأنسجة mCherry::pHluorin محددة التعبير مفيد لقياس pHi عبر الأنسجة كامل، وهو أيضا أكثر ملاءمة عند الجمع بين التعبير [رني] أو التحوير.

  1. جيل فلورين المعدلة وراثيا الذباب
    1. mCherry::pHluorin المسمى منتدى التعاون الأمني عبر استنساخ
      1. جعل mCherry::pHluorin منتدى التعاون الأمني استنساخ، UAS-mCherry::pHluorin 1 إلى flipout Gal4 قانون الأوراق المالية أو غيرها الأسهم مع Gal4 إيندوسيبلي حزب العمل الفيجي/FRT.
      2. جعل هياتشوك استنساخ إيندوسيبلي، هياتشوك F1s الكبار لمدة يومين بعد اكلوسيون في قنينة فارغة ح 1 في حمام مائي 37 درجة مئوية، أربع مرات تقريبا كل 12 حاء
      3. لضمان النمو الطبيعي والمعدلات القصوى لتكون البويضات خلال هذه الفترة، الحفاظ على الذباب بتوفير الخميرة الرطبة العذبة (أجزاء متساوية تقريبا جاف بيكر ' s الخميرة والماء) يوميا لمدة 6 أيام على الأقل بعد استنساخ التعريفي.
    2. الأنسجة محددة mCherry::pHluorin التعبير
    3. عبور UAS-mCherry::pHluorin 1 جريب خلية محددة السائق، ذ 1 ث *؛ ف {جوب} 10930/سيو (معرف بلومينغتون: 7023).
    4. جمع 3 أيام بعد بدء الذباب اكلوسينج، ووضعها في قارورة تحتوي على الخميرة الرطبة، على الأقل 24 ساعة قبل التشريح.
  2. مما يجعل الحلول
    ملاحظة: من المهم إعداد المخازن المؤقتة التالية في يوم التجربة لأن تركيزات الأس الهيدروجيني والمذاب في المخزن المؤقت يمكن أن تتغير بمرور الوقت.
    1. تحضير بيكربونات، نيجيريسين، وتشريح المخازن المؤقتة. إضافة المكونات بالترتيب المسرودة لتجنب تشكيل رواسب (انظر الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3)-

2. المحاكمة: قياس pHi في "النسب منتدى التعاون الأمني"

ملاحظة: التشريح، المتصاعدة، وتصوير الخطوات للمخزن المؤقت بيكربونات والشرطين المخزن المؤقت نيجيريسين لايف قد تحتاج إلى إجراء مرتين: مرة واحدة لتحديد المجهر إعدادات ومرة ثانية لجمع البيانات التجريبية. انظر في القسم 2-2 أدناه للحصول على مزيد من المعلومات.

  1. تشريح وتركيب
    ملاحظة: للمواد المطلوبة للقيام بهذه الخطوة يرجى الرجوع إلى الشكل 1 و الجدول للمواد. للدوائر 3D التركيب المطبوعة، ويتم توفير ملفات الطابعة ثلاثية الأبعاد تكميلية ملف 1 و 2 ملف إضافي.
    1. تشريح:
      1. تحضير تركيب الدوائر بتطبيق طبقة رقيقة من فراغ الشحوم إلى جانب تملق 3D طباعة الدائرة المتصاعدة. وضع هذا الجانب على ساترة 22 × 40 مم لختم ساترة إلى الدائرة المتصاعدة.
    2. تشريح المبيض من الإناث الذباب الكبار في 500 ميليلتر تشريح العازلة (العازلة بيكربونات أو نيجيريسين، الجدول 3)
      1. تخدير الذباب 3-4 استخدام غاز CO 2 ونقل الذباب على منصة يطير perfused مع شركة 2 الغاز-
      2. تلتقط الطيران أنيسثيتيزيد مع الملقط ومكان في وسائط الإعلام التشريح.
      3. قرصه الصدر ذبابة مع فورسيب واحد، بينما تشيد على الطرف في البطن حتى يتم كشفها في المبيضين.
      4. بعد فصل المبايض من الأجهزة الأخرى، ندف أربا أوفاريوليس استخدام إبر الحقن 1/2 22. منفصلة بعناية عضلة غمد من المبايض وأوفاريوليس الفردية منفصلة من مجموعة أوفاريوليس. أسلوب فعال لعزل غمد العضلات باستخدام إبرة حقنه واحدة لعقد مجموعة أوفاريوليس في مكان في نهايته الأمامية، والسكتة الدماغية نزولا على طول واحد أوفاريوليس-
      5. احتضان المبايض تشريح في وسائل الإعلام تشريح لمدة 10 دقائق بالضبط قبل الشروع في خطوة متصاعدة حتى لا يكون هناك ما يكفي من الوقت لأي الخلايا لحجته تماما مع الرقم الهيدروجيني لوسائط الإعلام تشريح نيجيريسين.
        ملاحظة: تأكد من أن تتم إزالة غمد العضلات من أوفاريوليس. غمد العضلات قد تخفف إشارة الأسفار، مما يجعل من الصعب تحديد خلايا فردية باستخدام كونكانافيلين-A، وقد تسبب أوفاريوليس للتحرك تلقائياً أثناء تصوير حية.
    3. تصاعد
      1. وضع قطره صغيرة من الوسائط التشريح إلى ساترة زجاجية داخل الدائرة المتصاعدة.
      2. نقل فصل استخدام الملقط أوفاريوليس.
      3. فصل الدوائر البيض مرحلة لاحقة من جيرماريا المرتبطة بدوائر البيض المرحلة السابقة، وفي محاولة لضمان أن جيرماريا تشريح وضع في مركز لإسقاط وسائل الإعلام التشريح.
      4. إضافة نقطتين صغيرة من طلاء الأظافر على طرفي نقيض من ساترة ملم 12 جولة وأتركها في الهواء الجاف لحوالي 10 س.
      5. فصل ساترة
      6. مكان الجولة على قطره من تشريح الوسائط التي تحتوي على جيرماريا أن تواجه هذا الجانب مع طلاء الأظافر والاتصال بوسائط الإعلام تشريح. اضغط لأسفل على الأجزاء من الحافة مع طلاء الأظافر تسطيح وتأمين جيرماريا في الموقف. نوصي باستخدام طلاء الأظافر كبار السن نظراً لأنها مسحات أقل على سطح ساترة كما أنه يجري تأمين في مكان-
      7. ملء الدائرة المتصاعدة مع وسائل الإعلام تشريح إضافية. يمكن استخدام حالة المخزن المؤقت المحدد يحتوي على صبغ كونكانافالين A لملء الدائرة.
        ملاحظة: الوقت الإجمالي المستغرق تشريح وتركيب ينبغي أن لا تتجاوز 15 دقيقة. وهذا مهم للتقليل إلى أدنى حد من آثار الضرر الأنسجة والخلية الموت.
  2. تصوير مباشر:
    ملاحظة: في هذه الخطوة، الأولى جمع الصور من الشرط بيكربونات والشرطين نيجيريسين لتحديد إعدادات مناسبة مجهر؛ وضبط إعدادات المجهر عند الاقتضاء، ومن ثم جمع الصور للبيانات التجريبية. استخدام مجهر [كنفوكل] قادرة على تصوير في 3 قنوات: التجارة والنقل (الانبعاثات 475 الإثارة/509)، متشيري (575 الانبعاثات الإثارة/610)، واستعملنا (633 الإثارة/647 الانبعاث).
    ملاحظة: تعيين "إعدادات المجهر": سوف يمكن تحديدها كمياً كثافة بكسل للصور التي تم جمعها لتحديد تقديرات pHi، ولذلك فمن المهم أن قيم الكثافة للإشارات في كل مجموعة صورة منخفضة جداً لا مشبعة. يتم تعريف نطاق كثافات الذي يمكن التقاطه في صورة بعمق بت الصورة. في كثير من الحالات، يتم إنشاء صور 8-بت بشكل افتراضي، ولكن نوصي بالحصول البيانات كالصور 16-بت، والتي لديها مجموعة ديناميكية أوسع نطاقا. من المهم ضمان مصغراً الحديث المتبادل بين القنوات الفلورسنت، وحيث يجب ضبط الإعدادات حتى الطيف الانبعاثات التي يتم جمعها من كل فلوروفوري لا يتراكب. لاختبار هذه الإعدادات، تأخذ صورة عينة باستخدام الطيف الإثارة للتجارة والنقل وجمع في طيف انبعاث مشري و العكس بالعكس. إذا تم تعديل الإعدادات بشكل صحيح، ينبغي أن تكون هناك أي إشارة في أي من الحالتين. تعيين إعدادات المجهر (أي الجهد على المسح الليزر [كنفوكل], إعدادات حجم القوة والثقب الليزر) حيث تكون كثافة بكسل من الإشارة في جميع صورة ثلاث مجموعات داخل النطاق الديناميكي لملف الصورة. لكل تجاربنا، استخدمنا ليزر ضوء أبيض المسح مجهر [كنفوكل] مع هدف 40 x للحصول على الصور 16-بت في تنسيق × 1,024 1,024، بينما نحن الأمثل كسب الجهد لكل تجربة حسب الحاجة. على سبيل المثال، في تجربة واحدة، حددنا كسب الجهد للتجارة والنقل، مشري، واستعملنا 37.8 في المائة و 72.9 في المائة و 260 في المائة، على التوالي.
    1. صورة أوفاريوليس في المخزن المؤقت لتشريح نيجيريسين على درجة الحموضة 6.5، وضبط الإعدادات بكثافة بكسل الصور فلورين ومشري منخفضة، ولكن لا تقل حدود الكشف عن الكاميرا.
    2. صورة مجموعة أخرى من أوفاريوليس في المخزن المؤقت لتشريح نيجيريسين على درجة الحموضة 7.5 وضبط الإعدادات مثل كثافة بكسل الصور فلورين ومتشيري عالية، ولكن غير مشبعة.
    3. صورة المبيض في تشريح بيكربونات المخزن المؤقت، وضمان أن كثافة بكسل الصور فلورين ومشري غير المشبعة مع الإعدادات التي يتم اختيارها. إذا المشبعة بكسل، قم بضبط الإعدادات حسب الضرورة.
      ملاحظة: مجهر معلمات الإعداد قد تختلف استناداً إلى الإعداد المجهر الدقيق ويجري استخدامها، ويجب أن يكون الأمثل لكل تجربة. بعد أن تم تعيين إعدادات المجهر، ليس تغييرها لما تبقى من هذه التجربة. ينبغي أن تكون إعدادات متسقة عبر التحكم والظروف التجريبية. في تجاربنا pHi الأولى، إنشاء منحنيات المعايرة نيجيريسين نقطة 2 و 3، والعثور على لا يوجد فرق كبير بين pHi المحسوبة باستخدام أي من الطريقتين. ومع ذلك، يتوقع إضافة المزيد من النقاط في منحنى المعايرة بشكل عام، لتحسين دقة. ولذلك، نوصي بإنشاء منحنيات مع أرقام مختلفة من النقاط تحديد كم هناك حاجة لمجموعة معينة من الظروف التجريبية.
  3. جمع البيانات:
    1. إجراء التشريح، المتصاعدة، والتصوير من العينات في ظروف المخزن المؤقت بيكربونات ونيجيريسين. بعد التشريح والتركيب، الحد الأقصى للوقت المستهلك التصوير مجموعة واحدة من عينات لا ينبغي أن تتجاوز 45 دقيقة لضمان أن قياسات كثافة fluorescence في الأنسجة الحية وصحية-
    2. لكل حالة، والحصول على صور لمالا يقل عن 5 جيرماريا-

3. بعد انتهاء المحاكمة: تحليل الصور

  1. تدبير الأسفار الكثافات في التابعة والهيدروكربون المشبع بالفلور، والخلايا جريب
    1. خلفية الطرح:
      1. فتح الصور في فيجي مع كل قناة في (نافذة منفصلة غير المجهزة الشكل 4)-
      2. استخدام الأداة مستطيل لرسم منطقة للفائدة (ROI) في إطار قناة فلورين في جزء من الصورة دون إشارة.
      3. الخطوة
      4. اختياري: تعيين الحد الأدنى للحد الأدنى بحيث تستبعد بكسل مع قيم الكثافة أدناه معلومات أساسية وتعيين الحد الأعلى من الحد الأدنى إلى الحد الأقصى. عندما يتم تعيين العتبة بهذه الطريقة، مجالات الصورة دون إشارة معظمهم من الأزرق وهو الإشارة واضحة للعيان ( الشكل 4A).
      5. قياس كثافة fluorescence يعني في العائد على الاستثمار. إذا تم تعيين العتبة في الخطوة 3، تأكد من تحقق من " الحد الأقصى لعتبة " في مربع الحوار "تعيين قياسات".
      6. طرح خلفية قياس الكثافة من كل قناة وشريحة من الصورة باستخدام الدالة استقطاع، وجدت في العملية → القائمة الرياضيات.
      7. كرر الخطوات 3.1.1.2-6 لنافذة القناة مشري فيما عدا ذلك، في خطوة 3.1.1.2، بدلاً من رسم مستطيل جديدة باستخدام أداة المستطيل، استخدم الدالة اختيار الاستعادة، وجدت في التحرير → اختيار القائمة، لإضافة مستطيل بنفس الأبعاد وموضع في الصورة-
    2. "تحديد التابعة" والهيدروكربون المشبع بالفلور، والخلايا جريب:
      1. تحديد التابعة، والهيدروكربونات المشبعة بالفلور، والخلايا جريب مورفولوجيا والموقع باستخدام تلطيخ كونكانافالين A للعثور على حدود الخلية ( الشكل 2).
      2. التابعة خلايا الثلاثي رقيقة تقع على حافة جيرماريوم على الحدود 2a/2b المنطقة. إذا كان يتم التعبير عن mCherry::pHluorin في استنساخ منتدى التعاون الأمني، يمكن أيضا تحديد منتدى التعاون الأمني كخلية معظم الأمامي للاستنساخ.
      3. الهيدروكربون المشبع بالفلور هي الخلايا على شكل غير النظامية في المنطقة 2b، فورا بجوار والمتلقين للمعلومات من التابعة.
      4. جريب الخلايا هي خلايا مربعة أو عمودية التي تحيط بالكيس الخلية الجرثومية في المنطقة 3.
    3. الحصول على الأسفار نسب كثافة
      1. اختر شريحة واحدة أو أكثر التي قد خلية الفائدة أعلى كثافة fluorescence في قناة مشري، وتأكد من أن تلطيخ كونكانافالين A، ينظر في قناة استعملنا، وفي لجنة مسؤولي المنتدى لنا داخل الشريحة المحددة.
      2. "دوروا رسم" حول كل منتدى التعاون الأمني وقياس كثافة fluorescence يعني فلورين ومشري في جميع شرائح المختار للقياسات-
      3. تقسيم شدة الأسفار يعني القناة فلورين بشدة الأسفار يعني القناة متشيري لحساب نسبة فلورين للأسفار متشيري.
  2. PHi استخلاص القيم وتوليد الصور بسيودوكولوريد
    1. استخلاص قيم pHi
      1. في جميع الحالات، يجب إنشاء منحنى الانحدار الخطي باستخدام المبيض من الذباب من نفس النمط الوراثي على حد سواء التجريبية والسيطرة على الأوضاع. إنشاء منحنى انحدار خطي لكل نوع من الخلايا باستخدام البيانات من شرطين المخزن المؤقت نيجيريسين ( الشكل 3). في Excel، يمكن ذلك برسم البيانات على الرسم بياني، وإضافة خط اتجاه خطي. بدلاً من ذلك، انظر:
      2. استخدام الميل والتقاطع y منحنى الانحدار الخطي محسوبة من شروط نيجيريسين ومعادلة خط (y = mx + b) لتحويل فلورين إلى مشري نسبة القيم المحسوبة من العينات في البيكربونات شرط لقيم الأس الهيدروجيني. في هذه المعادلة، تحل محل النموذج المنحدر (التقاطع y) ب ووضع قيمة نسبة في العاشر، وحل ليوسف
    2. توليد صورة بسيودوكولوريد التي تعكس قيم نسبة في فيجي.
      1. اتبع الإجراء أعلاه لخلفية الطرح (الخطوة 3.1-1 والشكل 4)-
      2. تقسيم القناة فلورين من قناة مشري استخدام وظيفة "الحاسبة الصورة"، وجدت في القائمة عملية. تأكد من " إنشاء نافذة جديدة " و " النتيجة 32-بت (عدد عشري) " خانات الاختيار يتم التحقق على حد سواء. تغيير جدول البحث (لوط)، وجدت ضمن القائمة صورة، الحرارية أو طرفية المستعملين المحليين من الاختيار. انظر الشكل 4 لخيارات أخرى مناسبة.
      3. في مربع الحوار ضبط السطوع والتباين (صورة → ضبط →/السطوع)، انقر فوق " تعيين " زر. عرض مجموعة الحد الأدنى القيمة إلى 0 والحد الأقصى لعرض القيمة بنسبة أفضل يلتقط البيانات، عادة 1.0 2.0 ( الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا لقد قمنا بوصف عملية قياس pHi في ظهارة جريب، التي تنطوي على عدة خطوات. أولاً، يتم تشريح المبيض من الذباب من النمط الوراثي المناسب باستخدام أدوات تشريح وتركيب (الشكل 1). يتم تصويرها في أوفاريوليس ثم استخدام مجهر الأسفار الكمية ويتم تحليل الصور للحصول على قياسات pHi. لكل صورة، يتم تعريف أنواع الخلية من الفائدة كما هو موضح في القسم 3.1 (الشكل 2). يتم تحويل نسبة شدة الأسفار في قنوات التجارة والنقل ومشري pHi القيم باستخدام منحنى قياسي (الشكل 3A) كما هو موضح في القسم 3-2. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا أن pHi يزيد مع التمايز في وقت مبكر منتدى التعاون الأمني النسب، من 6.8 في التابعة، إلى 7.0 في الخلايا بريفوليكلي، إلى 7.3 في جريب الخلايا (الشكل 3B). القيم pHi لكل نوع من الخلايا يمكن أن تمثل بيانيا، كما هو الحال في الشكل 3 (ب)، أو كصورة مجهرية بسيودوكولوريد أن يوضح الاختلافات في فلورين إلى نسب مشري (الشكل 4 و الشكل 5). في هذه الصور، يتم عرض الاختلافات في فلورين إلى نسب مشري كالاختلافات في اللون، حسب تعريف طرفية المستعملين المحليين. من المهم تحديد طرفية وقيم الحد الأدنى والحد الأقصى للنطاق من الألوان لإنتاج صورة التي الأكثر تمثيلاً للبيانات. على الرغم من ذلك، وبصفة عامة، اختيار إعدادات طرفية المستعملين المحليين ومجموعة سوف لا تعطي مظهر الخلافات التي لم تكن موجودة في الصورة، قد يحجب خياراً أقل ملاءمة من طرفيات المستعملين المحليين pHi الاختلافات الموجودة في صورة مجهرية (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: المواد لتشريح وتركيب المورفولوجية أوفاريوليس. (أ) صورة تبين: طلاء الأظافر (1)؛ (2) الفراغ نصيحة الشحوم والكأس وبيبيت المستخدمة لتطبيق الشحوم؛ (3) 23-قياس المحاقن الإبر؛ (4) دومون "اينوكس" الملقط، حجم 5؛ (5) 3D طباعة الدائرة المتصاعدة؛ (6) 22 × 40 ملم الزجاج كوفيرسليبس؛ (7) جولة "الزجاج كوفيرسليبس"، قطرها 12 مم، 0.13-0.16 سمك مم؛ وتشريح (8) 9-كذلك الزجاج الطبق. (ب) الصورة عن قرب من 3D طباعة الدائرة المتصاعدة. (ج) صورة تبين زوج تشريح المبايض wildtype. (د) صورة تبين أوفاريوليس جيدا المنفصلين عن ذويهم. صورة (ه) دائرة ثلاثية الأبعاد مع المبايض تشريح شنت تحت ساترة زجاجية جولة. النقاط السوداء قطرات طلاء الأظافر يستخدم للاحتفاظ ساترة جولة في المكان. (و) صورة لتشريح أوفاريوليس تحت جولة ساترة الزجاج بعد التركيب. المربع الأسود يشير إلى منطقة من الصورة مع أوفاريولي تشريح واحدة. مقياس القضبان تمثل حوالي 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحديد التابعة والهيدروكربون المشبع بالفلور، والخلايا جريب. ملطخة مثالين من جيرماريا مع UAS-mCherry::pHluorin و 10930-Gal4 كونكانافيلين-ألف. دوروا توجز منتدى التعاون الأمني ومن الهيدروكربون المشبع بالفلور، وخلية جريب يرد في كل صورة. كثافات fluorescence يعني في قنوات فلورين ومشري المستخدمة لحساب فلورين إلى نسب مشري. مقياس القضبان تمثل حوالي 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: pHi يزيد من خلال التمايز في النسب FSC. الممثل النتائج المأخوذة من أولمشنيدير et al. عرض 2 : المنحنى (A) انحدار خطي نموذجية المستخدمة لحساب قيم الأس الهيدروجيني من فلورين إلى نسب مشري؛ والقيم (ب) pHi المحسوبة مع فواصل الثقة 95% للتابعة والهيدروكربون المشبع بالفلور، والخلايا جريب. وهذا الرقم تم تكييف بعد الحصول على إذن، من أولمشنيدير et al. 2- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: استخدام فيجي لتوليد صورة راتيوميتريك بسيودوكولوريد- (أ) الصور عرض نتائج كل خطوة في عملية الطرح الخلفية. بدءاً بصورة غير المجهزة (لوحات الأيسر)، الخطوة الأولى لتعيين حدود العتبة حيث تستبعد بكسل مع قيم الكثافة أدناه معلومات أساسية. يتم تعيين الحد الأعلى من الحد الأدنى إلى الحد الأقصى. فيجي سوف لون بكسل المستبعدة الأزرق، أسفر عن صورة مع خلفية زرقاء وجيرماريوم واضحة للعيان (لوحات الأوسط). ملاحظة هذه الخطوة اختيارية. والخطوة الثانية لرسم العائد على الاستثمار في جزء من الصورة دون إشارة (مربعات حمراء في لوحات الأوسط)، قياس كثافة fluorescence يعني العائد على الاستثمار، واستقطاع هذا المبلغ من الصورة بأكملها، أسفر عن خلفية طرح الصورة (لوحات الحق). الخطوة الثالثة استخدام الدالة حساب الصورة لتقسيم الصورة في قناة فلورين بالصورة في القناة مشري. وسوف تكون النتيجة صورة عرض مع جدول البحث غرايز وتعيين قيم عرض الصورة لتغطي كامل النطاق الديناميكي المقدمة من عمق بت الصورة. الخطوة الأخيرة هي لضبط إعدادات عرض الصورة على طائفة أكثر ملاءمة، وحدد جدول بحث. (ب) عرض عينة من الصور تظهر نتيجة لحساب الصورة مع الحد الأدنى قيمة تعيين إلى 0 وقيمة العرض الأقصى تعيين إلى 2.5 استخدام أربعة جداول بحث مختلفة. يظهر المستطيل الموجود بجانب كل صورة الألوان المستخدمة عبر النطاق الديناميكي لكل جدول البحث. لاحظ أن لحلو، 16 لون، والحرارية، تستخدم ألوان مميزة كسل مع قيمة كثافة 0 أو كحد أقصى (مثلاً، زرقاء وحمراء، على التوالي، في حلو). وهذا يوفر مرجعاً سهلاً بصرية لحدود النطاق الديناميكي، يسمح للعارض أن نرى أن الإشارة ضمن النطاق الديناميكي. الشاشة (ج) إطلاق النار عرض الخيارات المحددة عند استيراد ملف إلى إيماجيج باستخدام "المكونات في استيراد" تنسيقات بيو-تمثل الأشرطة مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

معشوقة = fo:keep "jove_content"-together.within-صفحة = "1" >Figure 5
الرقم 5: إعداد الصورة قيم عرض الصور راتيوميتريك بسيودوكولوريد. يجب تعيين القيم العرض صورة الحد الأدنى والحد الأقصى حتى يتم الإشارة في الصور من الشرط بيكربونات فضلا عن كل الشروط نيجيريسين داخل النطاق الديناميكي. ولتوضيح هذه النقطة، تظهر صور اثنين من كل واحد من الشروط الثلاثة بأربعة إعدادات عرض الصورة مختلفة (0-0.5 و 0-1، 0-2، 5 و 0-5) باستخدام جدول البحث الحراري. لاحظ أن، لكل هذه الشروط الثلاثة التجريبية، عندما يتم عرض الصور مع تعيين الحد الأقصى للقيمة المعروضة إلى 0.5، الكثير من الإشارات في أو بالقرب من الحد الأقصى على مقياس قياس الألوان، وعندما يتم تعيين إلى 5.0، الكثير من الإشارات في أو بالقرب من الحد الأدنى على لون مقياس إيميتريك. في كلتا الحالتين، الاختلافات في فلورين إلى نسبة مشري عبر الأنسجة لا يمكن بسهولة موضع تقدير حتى هذه الإعدادات ليست مثالية. وفي المقابل، قيم عرض الحد الأقصى من 1.0 أو 2.5 أكثر ملائمة. مع هذه الإعدادات، يمكن بسهولة تقدير الاختلافات في نسب عبر الأنسجة، والإشارات في الصور من جميع الظروف التجريبية الثلاثة المعروضة في الألوان التي تقع داخل النطاق الديناميكي لمقياس قياس الألوان. مقياس القضبان تمثل حوالي 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يمكننا وصف طريقة لقياس أي الخلايا في النسب منتدى التعاون الأمني داخل الأنسجة wildtype. تم تطوير هذا البروتوكول وصقلها على مدى السنوات الخمس الماضية، منذ أن بدأنا أولاً بدراسة pHi في أنسجة المبيض المورفولوجية . وخلال ذلك الوقت، استخدمت بنجاح البروتوكول المحققين متعددة في لدينا مختبر ومالا يقل عن أربعة قرص مختلفة للغزل والليزر مجاهر المسح. إمكانية تكرار نتائج ملاحظتنا الأصلي، أن الزيادات pHi كالتفريق بين الخلايا في النسب منتدى التعاون الأمني من الخلايا الجذعية للهيدروكربون إلى جريب الدولة الخلية، وعبر هذه التجارب المتعددة يدل على حد سواء أن هذه الظاهرة البيولوجية قوي وأن المنهجية موثوق بها. ومع ذلك، في تجربتنا، هذا إجراء تحديا لسيد. وهي تتطلب اهتماما وثيقا بالتفصيل في كل خطوة، والتنفيذ السريع، وكفاءة عالية للتشريح، تركيب، وتصوير الخطوات. كما ورد في البروتوكول، إجراء تشريح وتركيب يشتمل حضانة 10 دقيقة، لكن لا ينبغي أن يتجاوز مجموع 15 دقيقة ويجب أن تكتمل عملية التصوير في 45 دقيقة. في ظروف مثالية، يمكن الحفاظ على أوفاريوليس المورفولوجية في الثقافة لتصل إلى 14 ح17، ولكن وجدنا أن الأنسجة يبدأ يموت أكثر سرعة في مخازن نيجيريسين المستخدمة لإنشاء المنحنيات القياسية. الإرشادات تكفل جمع كافة البيانات بينما الأنسجة لا يزال جيدا في إطار الوقت الذي يبدو شكلياً طبيعية وصحية. هذا لا يترك الكثير من الوقت لكل خطوة، على الرغم من ذلك فمن المهم تخطط للمستقبل للتأكد من أن كل شيء جاهز للانطلاق من خطوة واحدة إلى أخرى. وفي الواقع، أنها أكثر كفاءة بكثير إذا شخصين العمل سويا على التشريح، المتصاعدة، وتصوير إجراءات، مع شخص واحد تنفيذ خطوة بينما الشخص الآخر تستعد للخطوة التالية.

منذ pHi قد تكون حساسة للتلاعب التجريبية اللازمة للصورة في الأنسجة السابقين فيفو، مثل تكوين المخزن المؤقت لدرجة الحرارة، هذا الأسلوب أفضل السبل لتحديد التغيرات النسبية في pHi. ونظرا لأن التحقيق تتألف من اثنين من البروتينات الفلورية متميزة، خصائصها الأسفار مثل الغلة الكم، قد تتأثر خصائص طوال فترة الحياة، وقابلة للطي بطريقة مختلفة في أنواع مختلفة من الخلايا. ولذلك، من الضروري أن تدرج عينات تعامل مع شروط المخزن المؤقت نيجيريسين واستخدامها لإنشاء منحنى معايرة جديدة لكل نوع من أنواع الخلايا في كل محاكمة. من أجل تقليل مصادر إضافية للتغير، هو أكد إبقاء كافة الشروط متسقة وأثناء التصوير. ينبغي إعداد العينات في ظروف المخزن المؤقت نيجيريسين وتصويرها في اليوم نفسه كما في حالة المخزن المؤقت بيكربونات واقتناء جميع العينات إعداد والصورة ينبغي أن تظل متسقة قدر الإمكان. هذا مهم لأن القياسات pHi تستند مقارنة بين مجموعات الصور، التجريبية حتى الاختلافات التي تؤثر على الكشف عن مشري وفلورين في واحد أو أكثر من مجموعات الصور قد إنقاص دقة التقديرات pHi. عوامل مثل التغييرات في إعدادات الجهد من أنابيب ضوئي (في حالة استخدام ليزر مسح [كنفوكل]) أو مرات التعرض (في حالة استخدام قرص غزل [كنفوكل]) أو عدسة قذرة أن يقلل كمية الضوء التي تصل إلى الكاميرا، وسوف تؤثر بوضوح على النتائج . ولكن هناك عدد ضخم عوامل أكثر مكرا الأخرى التي قد تختلف عن اليومية ويمكن أيضا أن تؤثر على النتائج، مثل ما إذا كان الذباب تغذية جيدة، عمر الذباب، وكم الليزر قد قبل التصوير. إعداد وتصوير كل هذه الشروط الثلاثة في نفس اليوم يقلل من هذه الاختلافات، وهكذا سوف تنتج نتائج أكثر اتساقا. جدير بالذكر أن تحولنا إلى مجهر جديد كل مرة أو تم ترقية مكونات المجهر، من الضروري أن ريوبتيميزي الإعدادات على المعدات الجديدة. وهذا كثيرا ما أدت إلى حدوث تغيير في متوسط قيم القياسات الفردية، لكن طالما تم إنشاؤها منحنيات المعايرة الجديدة مع كل محاكمة، التغييرات في المعدات أثر الحد أدنى في التقديرات pHi. وباﻹضافة إلى ذلك، المقارنة ذات الصلة غالباً ما بين أنواع الخلايا المختلفة داخل النسيج نفسه (مثلاً، التابعة، خلايا الهيدروكربون المشبع بالفلور والمسام) وهكذا يتم داخليا يخضع للاختلافات التجريبية.

على الرغم من أن هذا البروتوكول قد ركز على قياس pHi wildtype الأنسجة، المنهجية التي متوافقة مع معيار الطرق المورفولوجية للتلاعب بالجينات، مثل التعبير عن [رني] أو التحوير استخدام UAS/Gal4، وتحليل فسيفساء. منذ mCherry::pHluorin تحركها مروج UAS، سوف يكون دائماً عن المشاركة مع [رني] أو التحوير، وماركم18 يمكن استخدامها لتوليد الحيوانات المستنسخة متحولة متماثل مع mCherry::pHluorin كعلامة الاستنساخ. للأسباب المذكورة أعلاه، يجب أن يتم تحليل الأنسجة wildtype كعنصر تحكم جنبا إلى جنب مع كل المحاكمة مع وراثي المسخ. وأخيراً، يمكن تطبيق المبادئ العامة المذكورة هنا باستخدام mCherry::pHluorin لقياس pHi في الأنسجة الأخرى، وكذلك. وفي الواقع، تم تكييف هذا البروتوكول من بروتوكول لاستخدام mCherry::pHluorin لقياس pHi في العين المورفولوجية 7، وإننا قد استخدمت منهجية مماثلة للصورة mCherry::pHluorin في الدماغ اليرقات. إجمالاً، الأدوات والأساليب الموصوفة هنا توفر فرصاً جديدة للتحقيق في العديد من الوظائف المتنوعة من pHi في فيفو داخل الأنسجة الحية، وسليمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر براين أولمشنيدير لجمع التبرعات للبروتوكول والحلاق ديان من اقتراحات بشأن المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من معهد وطني للصحة منحة GM116384 نيستول آثاريا والحلاق D.L..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO Bloomington Stock Center 7023
Act-Gal4 flipout stock Bloomington Stock Center 4409
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl Sigma Aldrich S5886
KCl Sigma Aldrich P-3911
glucose Mallinckrodt 4912
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310
MgSO4 Thermo Fisher Scientific M63
CaCl2 Sigma Aldrich C-5080
HCO3 Sigma Aldrich S-5761
MgCl2 Sigma Aldrich M-9272
NMDG+ Sigma Aldrich M-2004
K2HPO4 Mallinckrodt 7088 Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4 Thermo Fisher Scientific BP362 Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher Scientific C21421 0.25 mg/ml dilution
Nigericin Thermo Fisher Scientific N1495
Name Company Catalog Number Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5) Thermo Fisher Scientific NC9473431
2 23-gauge syringe needles Sigma Aldrich Z192457
9-well glass dissecting dish Thermo Fisher Scientific 13-748B
Vacuum Grease Dow Corning 1018817
22 X 40 mM glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness Ted Pella, Inc. 26023
3-D mounting chamber custom manufactured .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name Company Catalog Number Comments
Other equipment
pH meter Thermo Fisher Scientific 13-620-183A Model: Accumet AB15
Dissection microscope Olympus Corporation 0H11436 Model: SZ2-ST
Confocal Microscope Leica Biosystems SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
  2. Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215, (3), 345-355 (2016).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110, (5), 2709-2728 (2010).
  4. Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188, (4), 547-563 (2010).
  5. Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202, (6), 849-859 (2013).
  6. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591, (7), 1691-1706 (2013).
  7. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
  8. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  9. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17, (1), 15-25 (2007).
  10. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  11. Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21, (1), 159-171 (2011).
  12. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
  13. St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141, (5), 757-774 (2010).
  14. Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
  15. Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121, (11), 3797-3807 (1995).
  16. Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1, (3), 277-285 (2007).
  17. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, (11), 2207-2215 (2011).
  18. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24, (5), 251-254 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics